Source: https://www.pardell.es/microscopia-atomica.html
Timestamp: 2019-01-23 21:55:04+00:00

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Microscopía Atómica - Apuntes de Electromedicina Xavier Pardell
Desde que en los años 50 Richard Feynman pronunciara su célebre frase “there’s plenty of room at the bottom”, la nanociencia y la nanotecnología se han convertido en dos de los pilares fundamentales de la ciencia moderna. La nanotecnología, gracias a su naturaleza interdisciplinar, se ha extendido y se extiende rápidamente en multitud de disciplinas como pueden ser la ingeniería, la física, la química y las ciencias de la vida.
Aunque hay una cierta tendencia general a pensar que la palabra “nano” se restringe al campo de la investigación más teórica, hay una gran variedad de productos de la vida cotidiana que se benefician de esta aproximación revolucionaria a la ciencia y la tecnología. La microelectrónica es quizá el campo que se ha beneficiado de manera más inmediata, ya que todos conocemos las mejoras introducidas en los microprocesadores y otros componentes electrónicos, cada vez más pequeños y potentes.
Sin embargo, las ciencias de la vida, la medicina y la cosmética, por citar solamente unos casos, están introduciendo de manera exitosa nanopartículas en productos tan comunes como protectores solares o tratamientos antiedad. En este sentido, es importante destacar que este tipo de productos se han convertido en foco de atención del ojo público debido a que no han sido testados de manera intensiva sobre seres humanos y, por tanto, sus efectos a largo plazo permanecen desconocidos .
El diámetro nanométrico de las partículas utilizadas les permite penetrar la piel y entrar en el flujo sanguíneo, hecho que las vuelve proclives a generar ciertos tipos de cáncer. En esta situación tan incierta, las industrias relacionadas con la nanotecnología esgrimen sus argumentos para publicitar los beneficios de sus productos y para introducirlos en los mercados globales, hecho que cambiará el mundo de los artículos de consumo de una manera definitiva. El estudio de la naturaleza en el rango nanométrico experimentó un auge muy relevante desde la invención y desarrollo de las Microscopías de Sonda Próxima (SPMs).
El primer miembro de esta prolífica familia de instrumentos fue la Microscopía de Efecto Túnel (STM), desarrollada en los años 80 en los laboratorios centrales de IBM Zurich y famosa por ser la técnica mediante la cual se obtuvo la primera imagen con resolución atómica de una superficie (Binnig y Rohrer, los padres de las SPMs, ganaron el premio Nobel en 1986 por el desarrollo de estas técnicas). Esta tecnología se convirtió rápidamente en la piedra de toque en lo referente al estudio de la catálisis y la ciencia de superficies gracias a su resolución topográfica nunca vista anteriormente.
Sin embargo, su uso estaba restringido a muestras eléctricamente conductoras, limitación que desapareció rápidamente con el desarrollo de la Microscopía de Fuerzas Atómicas (AFM) , técnica mediante la cual todo tipo de muestras, esto es, aislantes y conductoras, podían ser investigadas. Pese a que la resolución topográfica de las imágenes obtenidas mediante AFM era menor que en el caso de las obtenidas por STM, era todavía suficientemente buena como para proporcionar imágenes con detalles subnanométricos en altura (dimensión vertical de las muestras) y su obvia versatilidad extendió en gran manera el número de aplicaciones de estas técnicas a todo tipo de campos científicos.
Ahora ya era posible obtener imágenes con una mínima preparación de muestra, tato en aire como en vacio o en una gran variedad de medios líquidos, principalmente acuosos. Hoy en día, mediante el desarrollo de accesorios específicos, es incluso posible realizar medidas topográficas en un rango de temperaturas que van desde los 4K (en condiciones de ultra-alto vacío, UHV) hasta 250 oC. Sin embargo, el AFM es mucho más que una manera de obtener imágenes de la superficie de todo tipo de muestras; debe ser considerado como una plataforma instrumental desde la que podemos acceder al nanomundo con una resolución nunca vista hasta ahora.
En el campo de la ciencia de materiales, por citar un ejemplo, el AFM puede ser usado como un indentador clásico con la particularidad de permitir controlar la fuerza vertical ejercida sobre la muestra (Fv) con una resolución en el rango de los picoNewtons. Estas nuevas posibilidades son extremadamente importantes, por ejemplo, para caracterizar las propiedades mecánicas de capas delgadas y de los recubrimientos tecnológicos avanzados usados en el diseño y producción de los llamados Sistemas Micro y Nano Electro Mecánicos (MEMs y NEMs).
Sin duda, este control de fuerza tan preciso representa una auténtica revolución en el campo de la biofísica, ya que ahora son accesibles las propiedades mecánicas de células individuales, proteínas y membranas celulares de manera experimental . El AFM también es capaz de modificar la superficie de las muestras realizando rascados y oxidaciones locales, permite caracterizar eléctrica o incluso magnéticamente las muestras y aplicar nano-gotas de disoluciones moleculares sobre superficies de manera selectiva para crear patrones funcionalizados sobre todo tipo de sustratos.
Debido a todas estas razones, el AFM debe ser considerado como una plataforma para explorar el nanomundo, como el núcleo de un sistema que constantemente es actualizado con nuevos modos de trabajo, la implementación de los cuales está demoliendo de manera paulatina e inexorable las barreras que todavía separan la química, la física la biología y la ingeniería.
El AFM se basa en el contacto mecánico entre una sonda (punta) microfabricada y la superficie de la muestra de estudio (Fig. 1). Al tratarse de una técnica de barrido, la punta escanea la superficie de la muestra y resuelve sus detalles superficiales a nivel subnanométrico gracias a que el extremo de la punta es realmente pequeña (alrededor de 5 nanómetros de radio). En cierto modo, su operación se asemeja a la de un tocadiscos de vinilo, en el que la aguja resigue los surcos gravados en el plástico. A medida que el piezoeléctrico procede al escaneado en los ejes XY, la palanca que sostiene la punta se deflexiona arriba o abajo (eje Z) y esta deflexión es detectada mediante un láser que finalmente incide sobre la superficie de un fotodetector, el cual se encarga de seguir la evolución de la sonda del microscopio. Usualmente, el piezoeléctrico encargado del escaneado está situado debajo de la muestra, aunque existen ciertos modelos de microscopio en los que la sonda es la encargada del escaneado y la muestra permanece quieta durante el experimento. Los piezoeléctricos instalados en los AFMs modernos permiten escanear regiones superficiales que pueden ir desde cientos de nanómetros cuadrados hasta áreas de 200 micras de lado.
Figura 1. Esquema de un AFM. La sonda se mantiene en contacto con la superficie de la muestra, lacual se mueve con gran precisión en el eje XY gracias a un escáner piezoeléctrico. La deflexión de la palanca de la sonda es seguida mediante un láser que es reflejado sobre un fotodetector, el cual permite detectar sus movimientos verticales con una precisión subnanométrica.
En este modo topográfico, la sonda del AFM se encuentra en contacto íntimo con la superficie de la muestra, manteniendo una deflexión de palanca constante, esto es, aplicando una fuerza vertical constante sobre la muestra. A partir de este momento inicial de contacto, el sistema de retroalimentación mantiene esta deflexión invariable mientras la sonda escanea la superficie de la muestra en el plano XY mediante el movimiento del piezoeléctrico en el eje Z. De hecho, esta respuesta del eje Z del piezoeléctrico corresponde a la topografía de la muestra.
Este modo de trabajo permite obtener las imágenes de AFM con la máxima resolución pero, debido a este contacto tan directo entre ambas interficies, puede resultar demasiado agresivo y deformar la superficie de la muestra, creando desperfectos superficiales o artefactos topográficos de todo tipo. Además, el radio de la punta crece rápidamente debido a las fuerzas de fricción establecidas durante el escaneado. Todo esto conlleva una degradación paulatina de la calidad de las imágenes obtenidas. Por estas circunstancias, el modo de contacto está indicado solamente para la obtención imágenes en las que la resolución vertical es absolutamente fundamental, principalmente en casos en los que las medidas se realicen sobre materiales duros (polímeros, metales, óxidos) o bien ciertas muestras biológicas muy determinadas que presenten una gran ordenación superficial (cristales de proteínas en dos dimensiones o canales iónicos en membranas celulares, por citar un par de ejemplos).
Modo de contacto intermitente
El modo de contacto intermitente es quizá el modo topográfico más comúnmente empleado debido a que permite interactuar de manera muy suave con la muestra, manteniendo su integridad y la de la sonda de AFM (Fig. 2b). Además, la consistencia de los datos obtenidos, gracias a la mínima deformación de muestra, es notable (Fig. 3e, f). En este modo topográfico, la sonda de AFM oscila a su frecuencia de resonancia en el eje Z a una amplitud de vibración constante, la cual es controlada por el sistema de retroalimentación. Así, el extremo de la sonda contacta de manera intermitente con la superficie de la muestra y obtiene su perfil topográfico. La naturaleza de este contacto intermitente es suficiente para que la sonda sea capaz de seguir la topografía de la muestra y obtener imágenes con gran resolución vertical mientras aplica una fuerza vertical muy baja sobre la superficie de estudio. Debido a estas bondades, este modo puede ser usado para todo tipo de especímenes y es fundamentalmente indicado para material biológico, tanto en aire como en medio líquido. Varias tentativas están en curso para combinar este modo topográfico con otras técnicas que puedan aportar información química de la muestra, como podrían ser la Espectroscopía de Infrarojo (IR), Espectroscopía Raman o la Microscopía Elipsométrica de Barrido de Campo Cercano (SNEM).
Una de las principales desventajas del AFM es la falta de información composicional de la muestra de estudio. Sin embargo, el Modo de Fase, un modo secundario derivado del contacto intermitente (Fig. 3d), puede proporcionar información cualitativa en este sentido; este modo secundario, obtenido de manera paralela a la imagen de contacto intermitente, se basa en la diferente cantidad de energía disipada por la muestra a medida que la sonda de AFM “golpea” su superficie en cada ciclo de oscilación. En este sentido, los materiales más blandos absorben (disipan) más energía que los materiales más rígidos, hecho que se materializa en un diferente desplazamiento de la fase de la oscilación en cada uno de los casos.
Figura 2. Los dos modos básicos topográficos de AFM. a) en el mode de contacto, la sonda resigue la superficie de la muestra en contacto íntimo mientras el lazo de retroalimentación mantiene la deflexión de la palanca de la sonda constante. b) En el modo de contacto intermitente, la sonda oscila de manera sinusoidal en el eje Z y solamente contacta con la muestra de manera esporádica. En este caso, el lazo de retroalimentación actúa, no sobre la deflexión de la palanca sino sobre la amplitud de la oscilación de la misma. Esta magnitud es también registrada por el fotodetector mediante el seguimiento del movimiento del láser sobre el mismo.
Modo Peak Force®
En este modo topográfico la sonda de AFM contacta la superficie de la muestra y se separa de la misma a una frecuencia de 0.5 a 2 KHz. En cada ciclo, la fuerza vertical ejercida por la sonda sobre la superficie de la muestra se controla de manera muy precisa para maximizar la duración de la sonda y reducir al mínimo la deformación y el daño ocasionado a la muestra. Ya que este control está totalmente implementado en el software y se efectúa de manera automática, el modo Peak Force® es extremadamente interesante para usuarios noveles y expertos que precisan de una alta resolución topográfica. Además, la calidad de imagen sin precedentes proporcionada por este modo debida al bajo desgaste al que es sometida la sonda lo convertirán en un nuevo estándar en el campo de la metrología mediante AFM. Un ejemplo ilustrativo de estas virtudes se puede apreciar en la Fig. 3a) y b), en la cual se muestran imágenes de nanopartículas con un diámetro de 10 nanómetros depositadas sobre silicio. La imagen a) corresponde a datos capturados en el modo de contacto intermitente y b) corresponde a la imagen obtenida mediante Peak Force®. En el caso b), las partículas aparecen significativamente más pequeñas que en a), a pesar de estar escaneándose exactamente la misma muestra; esta diferencia es debida a que la resolución lateral (en el plano XY) de las imágenes de AFM depende en gran medida del radio de la sonda utilizada. Inicialmente, las sondas empleadas en ambos modos tienen el mismo radio pero el modo de contacto intermitente es más agresivo y desgasta el extremo de la sonda rápidamente desde los 2 nanómetros iniciales a un valor alrededor de 5 nanómetros simplemente después de unas pocas líneas de escaneado. El modo Peak Force® es más suave y mantiene el radio inicial durante mucho más tiempo. Como resultado, la resolución lateral de las imágenes obtenidas en este segundo modo es mayor y el diámetro de las nanopartículas medido experimentalmente es mucho más cercano a su valor real.
Figura 3. Imágenes topográficas obtenidas mediante AFM en muestras poliméricas, derivadas de la industria microelectrónica y de la biología. Tamaño de las imágenes: a) y b) 500x500nm2; c) y d) 30x30μm2; e) 50x50 μm2; f) 12x12μm2. Las imágenes a) y b) corresponden a la misma muestra, demostrando que el modo Peak Force® está menos influenciado por el radio de la sonda de AFM usada, lo cual resulta en partículas con un diámetro mucho más cercano a la realidad. Las imágenes c) y d) fueron obtenidas simultáneamente; la imagen de fase mostrada en d) ejemplifica un contraste composicional que es imposible de detectar en la imagen topográfica c).
Espectroscopia de Fuerzas
La sonda de AFM puede ser usada como un nanoindentador para testear la respuesta mecánica de todo tipo de muestras. Su principal ventaja es que las medidas pueden realizarse con una resolución espacial en los ejes XY en el rango nanométrico y que la fuerza vertical aplicada sobre la muestra puede ser tan pequeña como unas decenas denanoNewtons. Consideremos un caso práctico en el que tengamos una matriz polimérica con nanopartículas embebidas en la misma; un indentador clásico sería capaz de obtener el módulo de Young de una región superficial en el rango milimétrico, mientras que el AFM es capaz de realizar nanoindentaciones locales de manera independiente en la matriz y en las nanopartículas. Además, la profundidad de muestra testeada puede mantenerse también en el rango nanométrico, mientras que en el caso del indentador clásico no es posible separar las propiedades superficiales de las del material en bulk. Este hecho es realmente interesante en el campo de la biología, donde las muestras usualmente tienen grosores en el rango de las micras y donde es extremadamente difícil obtener información nanomecánica cuantitativa mediante otras técnicas (Fig. 4). En los CCiTUB, se han medido valores de E de agregados de proteínas depositados sobre mica de manera cuantitativa, aunque nuestro principal sector de actuación ha sido la caracterización de membranas de fosfolípidos y nanomateriales. En este campo, se ha caracterizado de manera cuantitativa la fuerza vertical necesaria para indentar membranas celulares en una gran variedad de medios líquidos y condiciones salinas, diferentes valores de pH y diferentes composiciones fosfolipídicas. En lo que concierne a monocapas, se han realizado experimentos en los que se ha demostrado que los ácidos grasos y los tioles se deforman de una manera cuantizada y progresiva bajo la presión ejercida por la sonda de AFM, aportando valiosa información acerca del empaquetamiento bidimensional de estas estructuras. En lo que refiere a los materiales duros, la exploración y comparación de los valores de E obtenidos por métodos clásicos y mediante AFM están llevando a la comprensión de las diferentes propiedades mecánicas mostradas por los materiales en función del volumen de interacción entre indentador y muestra (profundidad de la huella). Otros parámetros que pueden extraerse de estos experimentos nanomecánicos, también llamados curvas de fuerza, son la fuerza de adhesión entre sonda y muestra, la fuerza vertical necesaria para deformar de manera permanente la superficie de estudio y la fuerza necesaria para desencadenar una transición elastoplástica.
Figura 4. Medidas nanomecánicas realizadas mediante AFM. a) Cuando una muestra es comprimida mediante una sonda de AFM, se obtiene una curva de fuerza. En el caso de materiales mono/muticapas, es posible cuantificar de manera muy precisa la fuerza vertical necesaria para indentar la muestra (esta rotura se muestra como una discontinuidad en la curva de aproximación (roja) mostrada en la figura 4a. b) Imágenes de proteínas globulares obtenidas mediante AFM en la superficie de las cuales se han realizado curvas de fuerza. Un mapa del valor de E se ha añadido a las imágenes topográficas. c) La nanomecánica de las membranas fosfolipídicas puede ser caracterizada, al igual que la fuerza de rotura de las membranas en función de la longitud de las cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos depositados sobre un sustrato (en este caso, su longitud varía entre 14 y 20 carbonos).
Gracias al modo de trabajo Quantitative NanoMechanics® (QNM) derivado de la tecnología Peak Force® desarrollada por Bruker, todos los parámetros mecánicos citados en este capítulo se pueden obtener de manera cuantitativa y a tiempo real mientras se captura una imagen topográfica de la superficie de la muestra (Fig. 5). El rango de valores de E accesibles mediante este tipo de medidas va desde las decenas/centenares de KPa (muestras biológicas blandas, monocapas, proteínas) hasta 100GPa (metales, óxidos, recubrimientos duros).
Figura 5. Cristales de sal depositados sobre una superficie de mica y analizados mediante QNM. Este modo nanomecánico permite obtener información muy precisa sobre parámetros nanomecánicos de las muestras que aportan detalles sobre las propiedades fisicoquímicas de la superficie de las mismas. Tamaño de la imagen mostrada: 20x20μm2.
Microscopia de Fuerzas de Fricción (FFM, LFM)
El modo FFM es capaz de cuantificar las propiedades nanotribológicas de una gran variedadde muestras. Este tipo de medidas tienen un gran interés cuando es preciso estudiarespecímenes provenientes del campo de la ciencia de materiales y es especialmente útil para caracterizar el rendimiento de capas delgadas y recubrimentos avanzados. En los últimos años, el modo FFM también se ha aplicado a capas orgánicas, tanto en aire como en líquido, llegando a obtener información que había sido imposible abordar hasta la fecha con otras técnicas. El principio de operación de la FFM es el siguiente: la muestra es escaneada por la punta de AFM en la dirección que es perpendicular al eje principal de la palanca de la sonda de AFM (Fig. 6a). De esta manera, se crea una torsión lateral de la palanca que puede ser experimentalmente detectada siguiendo el movimiento del láser en un fotodetector provisto de cuatro cuadrantes. Esta desviación lateral del láser es proporcional a la fuerza de fricción (Ff) establecida entre la sonda y la superficie de la muestra, que a su vez es proporcional a la fuerza vertical ejercida por la sonda de AFM sobrela muestra (cuantificada como el desplazamiento vertical del láser en el fotodetector). Ff se puede medir de manera cuantitativa en el rango de fuerzas comprendido entre las decenas de picoNewtons y los centenares de nanoNewtons en función de la rigidez de la sonda de AFM usada. La Fig. 6b) muestra una vista frontal de la palanca y de la punta de la sonda de AFM y como el movimiento de escaneado durante el experimento de FFM crea una torsión lateral de la palanca, la cual a su vez es transducida como una desviación lateral en el fotodetector.
Figura 6. Principio de operación del FFM. a) La dirección de escaneado perpendicular al eje principal de la palanca de la sonda de AFM crea un momento de torsión que es proporcional al valor de Ff establecido entre la sonda y la muestra. b) La respuesta de fricción puede medirse en función de la fuerza vertical aplicada por la sonda sobre la superficie de la muestra para obtener parámetros nanomecánicos tan importantes en el mundo del diseño industrial como el coeficiente de fricción o la energía disipada durante el deslizamiento.
AFM de Conducción (C-AFM)
El C-AFM es un modo de trabajo secundario derivado del modo topográfico de contacto que caracteriza las variaciones de conductividad en muestras tanto de baja como de alta conductividad. El principio de operación es muy simple: se aplica una diferencia de potencial entre una sonda de AFM recubierta con un film conductor y la muestra; cuando ambas interficies están en contacto, una determinada intensidad de corriente eléctrica (I) fluye a través de la interfase. Gracias al diseño del preamplificador de alta ganancia, valores de intensidad tan pequeños como decenas de femtoAmperios pueden ser detectados y medidos cuantitativamente. De hecho, el tipo de información final obtenida es un mapa superficial de I juntamente a una imagen topográfica. La posibilidad de realizar este tipo de medidas es de especial importancia para la industria fotovoltaica y microelectrónica pero también para el desarrollo de nuevos nanomateriales como nanotubos y grafeno, donde la conductividad de componentes extremadamente pequeños debe ser medida con gran precisión. Las variaciones del valor de I obtenidas en los mapas indica la presencia de defectos en los materiales semiconductores, el control y caracterización de los cuales es de vital importancia en los procesos de fabricación. Además, la posibilidad de controlar la posición de la sonda de AFM en el rango nanométrico permite al usuario emplazar la sonda sobre un punto específico de la superficie de la muestra, ejercer una determinada fuerza vertical y aplicar simultáneamente una rampa de potencial determinada para realizar un experimento de Intensidad vs. Voltaje en el rango nanométrico.
Microscopia de fuerzas Magnéticas (MFM)
El MFM es un modo de trabajo secundario derivado del contacto intermitente que permite al usuario mapear gradientes de campo magnético generados por la superficie de la muestra. Gracias al uso de una sonda de AFM recubierta con un film magnético, la imagen topográfica y de gradiente magnético de la superficie pueden obtenerse de manera simultánea. Así, la resolución espacial de esta técnica ha permitido por vez primera abordar el estudio de imanes moleculares de manera individual y de capas delgadas magnéticas deforma extremadamente local (Fig. 7).
Para poder operar en este modo de trabajo, es necesario utilizar una sonda de AFM recubierta con un film ferromagnético. Mientras se desarrolla el escaneo de la muestra en modo contacto intermitente de la manera usual, la interacción magnética establecida entre la sonda y la superficie de la muestra induce pequeñas variaciones en la fase de la vibración de la palanca, señal que se considera como proporcional a las variaciones del campo magnético superficial de la muestra. Esta técnica se utiliza para examinar materiales que presentan magnetismo de manera natural pero también estructuras en las que se ha escrito información magnética de manera deliberada (Fig. 7a y 7b).
Medidas de Potencial Superficial (SP)
El SP es un modo de trabajo secundario derivado del contacto intermitente que permite alusuario mapear los cambios en el potencial superficial de la muestra de estudio. Para ello, esnecesario utilizar una sonda que sea sensible a las cargas eléctricas, siendo común el uso de una sonda convencional recubierta con un film conductor, como podría ser diamante dopado (muy adecuado por presentar una alta resistencia al desgaste). Cabe destacar que no es necesario que la muestra sea conductora, ya que una muestra aislante también puede mostrar cargas superficiales. En este sentido, el modo no se basa en la medida de la intensidad de corriente que fluye a través del circuito sonda-muestra (como sería el caso del C-AFM) porque no se aplica ninguna diferencia de potencial entre ambas superficies. Esta técnica, por ejemplo, puede aplicarse para detectar las sutiles diferencias de carga generadas por la formación de monocapas orgánicas sobre un sustrato o para identificar diferentes dominios composicionales en una bicapa de fosfolípidos de varios componentes. Cabe destacar que una técnica ligeramente más refinada llamada Microscopia de Fuerzas de Potencial Superficial (SPFM) es capaz de detectar interacciones de la misma naturaleza pero operando en auténtico no-contacto. Por tanto, el SPFM es capaz de obtener imágenes de nano-gotas de líquidos depositadas sobre superficies, siendo de especial interés para el estudio de lubricantes en dos dimensiones y para estudios de corrosión.
Figura 7. Los granos de ferrita presentes en la superficie de una cinta de vídeo analógico se pueden detectar topográficamente a) de manera simultánea a los dominios magnéticos b) mediante el uso del MFM. De la comparación de las dos imágenes obtenidas cabe destacar que no existe ningún tipo de correlación entre las dos señales obtenidas, es decir, no hay ningún tipo de interferencia entre ambas señales.. Las figuras c) y d) corresponden a la topografía y a la señal de carga superficial (SP) de una muestra metálica. El análisis de estas dos imágenes muestra que, aunque la topografía es relativamente plana, la señal de SP es capaz de discernir dominios que pueden ser relacionados con gradientes composicionales reales.
SPM. Scanning Probe Microscope
STM. Scanning Tunnelling Microscope
AFM. Atomic Force Microscope
UHV. Ultra High Vacuum . Vertical Force
Fv. vertical Force
MEMs. MicroElectroMechanical Systems
NEMs. NanoElectroMechanical Systems
SNEM. Scanning Near Field Ellipsometer Microscopy
E. Young’s modulus
QNM. Quantitative Nanomechanical Property Mapping
Fł. Friction Force
FFM o LFM. Friction Force Microscopy (o Lateral Force Microscopy)
C-AFM. Conductive AFM
I. Current Intensity
V. Potential
SP. Surface Potential
SPFM. Surface Potential Force Microscopy
Microscopía de fuerzas atómicas (AFM)
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References: resolución 
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