Source: https://edoc.pub/guias-microbiologia-de-alimentos-unicordoba-pdf-free.html
Timestamp: 2020-05-29 00:30:30+00:00

Document:
Guias Microbiologia de Alimentos Unicordoba - PDF Free Download
Author: Cristian Camilo Cuello Gomez
12 downloads 253 Views 977KB Size
Livro de microbiologia de Alimentos. 1. Importância dos Microrganismos nos Alimentos Bernadette D.G.M. Franco 2. Fatores Intrínsecos e Extrínsecos que Controlam o Desenvolvimento Microbia…Descrição completa
Microbiologia de Alimentos Informe 1
pruebas microbiologicas en alimentos
Informe de Practicas Microbiologia de Alimentos
practicas microbiologicas
Hongos o mohos Diferencias:     Poseen una pared celular rígida que contiene quitina, glucano, manano y otros polisacáridos La membrana plasmática es rica en estereolos Su citoplasma present...Full description
Microbiologia Dos Alimentos - Bernadete Franco Mariza Landgraf
Livro de Microbiologia de AlimentosDescrição completa
Descripción: Métodos usados para la deteccion de Salmonella sp. en alimentos. Descripcion, fundamento, interpretacion y demas.
Descripción: Descripcion del metodo de recuento de enterobacterias totales, fundamento e interpretacion de la prueba.
Descripción: Practica realizadas en el curso de microbiologia de alimentos I, en esta se desarrollaron los lineamientos para la buena toma de muestra, porcedimentos, precauciones y demás generalidades.
Descripción: Métodos utilizados para el control microbiologico en leche. Parámetros utilizados, procedimientos, fundamentos e interpretación.
Descrição: Microbiologia Básica
Elaborado por: Mónica María Simanca Sotelo. Ingeniera de Alimentos. Alba Manuela Durango Villadiego. MSc.
TABLA DE CONTENIDO Pàgina 1. INTRODUCCIÓN 2. GUÍA Nº 1: Técnica Ecométrica. 3. GUÍA Nº 2: Estudio microbiológico a manipuladores, utensilios y medio superficies, ambiente. 4. GUÍA Nº 3: Cuantificación de microorganismos por el método de recuento en placa. 5. GUÍA Nº 4: Técnica del número más probable (NMP). 6. GUÍA Nº 5: Recuento de mesófilos aerobios y facultativos viables. 7. GUÍA Nº 6: NMP de coliformes totales y fecales en alimentos de origen animal o vegetal. 8. GUÍA Nº 7: Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 9. GUÍA Nº 8: Recuento de Mohos y levaduras. 10. GUÍA Nº 9: Investigación de Salmonella en alimentos. 11. GUÍA Nº 10: Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor. 12. GUÍA Nº 11: Recuento de Bacillus cereus. 13. GUÍA Nº 12: Investigación de Listeria monocytogenes. 14. GUÍA Nº 13: Investigación de Vibrio parahaemolytico. 15. GUÍA Nº 14: Control microbiológico de conservas no alteradas. 16. GUÍA Nº 15: Recolección de muestras de agua para Análisis acteriológico. 17. GUÍA Nº 16: Cuantificación de microorganismos por el método de filtración por membrana. 18. GUÍA Nº 17: Número más probable de Pseudomona aeruginosa. 19. GUÍA Nº 18: Presencia-ausencia de coliformes en muestras de agua (método del sustrato definido). 20. GUÍA Nº 19: Prueba del tiempo de reducción del azul de metileno (T.R.A.M.). 21. GUÍA Nº 20: Microbiología de leche y derivados. 22. GUÍA Nº 21: Microbiología de cárnicos. 23. GUÍA Nº 22: Microbiología de ovoproductos. 24. GUÍA Nº 23: Microbiología de pescados y mariscos. 25. GUÍA Nº 24: Microbiología de frutas y hortalizas. 26. GUÍA Nº 25: Microbiología de cereales y panificación. 27. GUÍA Nº 26: Microbiología de bebidas. 28. GUÍA Nº 27: Microbiología de aguas. 29. ANEXOS
1 2 7 14 22 31 33 36 39 41 44 47 50 53 56 59 63 67 69 71 73 76 79 82 85 88 91 94 96
LISTA DE TABLAS Pàgina 1. TABLA No.1: Tabla de NMP y límites de confianza cuando se usan 5 tubos con 10 ml de muestra. 2. TABLA No. 2 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras puras. 3. TABLA No. 3 Tabla de NMP cuando se usan 9 tubos para muestras diluidas.
LISTAS DE FIGURAS Pàgina 1. 2. 3. 4. 5.
Figura No. 1: Técnica Ecométrica. Figura No. 2 Diluciones decimales. Figura No. 3: Siembra en Profundidad. Figura No. 4: Siembra en Superficie. Figura No. 5: Técnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras líquidas) 6. Figura No. 6: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras líquidas). 7. Figura No. 7: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas líquidas o sólidas)
5 19 20 21 28. 29 30
LISTA DE ANEXOS Pàgina Anexo A: División laboratorio de alimentos y bebidas alcohólicasLaboratorio de Microbiología de Alimentos INVIMA. Anexo B: Normatividad relacionada con alimentos.
INTRODUCCION La calidad de los alimentos está constituida por tres áreas de estudio, las cuales son: calidad microbiológica, calidad fìsico-química y calidad sensorial. Entre estas áreas la que revista mayor importancia es la calidad microbiológica, puesto que a través de esta se puede determinar la inocuidad de los alimentos, es decir, su capacidad de no producir daño (enfermedad) a las personas que lo consumen. Para llevar a cabo el análisis microbiológico de los alimentos es necesario disponer de un laboratorio especializado donde solo se manipulen materias primas y aditivos alimentarios, productos procesados, materiales de insumo (envases, empaques) y muestras provenientes de la instalaciones de la empresas de alimentos (manipuladores, superficies y ambiente). En el laboratorio de Microbiología de Alimentos se deben contar con una dotación mínima de equipos, entre los cuales cabe mencionar incubadoras, baños termostatados, autoclave, microscopios, balanzas, centrifuga, pHmetro; con una dotación de medios de cultivo y reactivos, los cuales se deben encontrar en óptimas condiciones de uso y con suficiente cantidad de material de vidriería. El laboratorio además debe contar con un sistema de calidad en el cual se contemplen los procedimientos de preparación de medios de cultivo y reactivos, los procedimientos de limpieza y desinfección de materiales, equipos y áreas y se debe definir el personal de apoyo que labore en el mismo, el cual debe contar con una formación en el área donde se desempeñará. En el presente manual se muestran los procedimientos para llevar a cabo el análisis microbiológico de los alimentos.
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 1: TECNICA ECOMETRICA 1. INTRODUCCIÓN En el laboratorio de Microbiología de Alimentos se debe realizar una evaluación sistemática de los medios de cultivo no selectivos y selectivos preparados en el laboratorio y aún los comerciales, ya que éstos varían ampliamente según su composición, modo de preparación, etc. Es muy importante el control que se tenga sobre los medios de cultivo, porque de ellos depende la exactitud de los resultados. Para establecer la calidad de los medios de cultivo se ha desarrollado una técnica sencilla y confiable, cuyo fundamento es comprobar el crecimiento efectivo en los medios de cultivo, de los microorganismos buscados y la inhibición de la flora acompañante. Esta técnica se ha denominado ecométrica porque evalúa la susceptibilidad de los medios de cultivo a la colonización por cepas interferentes. Esta técnica implica una siembra por estría con ayuda de un asa bacteriológica, obteniéndose Unidades Formadoras de Colonias (UFC) en número decreciente, como sucede en la siembra por agotamiento. En la figura Nº 1 se ilustra muy bien como se debe realizar la siembra. Todos los microorganismos que se suponen crecen en el medio de cultivo deben desarrollar colonias visibles, aún en la estría central. En cambio los microorganismos que se suponen son inhibidos en el medio de cultivo ensayado no deben formar colonias mas allá del primer cuadrante, a lo sumo en el segundo cuadrante (Ver figura 1). 2. OBJETIVO Evaluar la selectividad de los diferentes medios de cultivo selectivos mediante la técnica ecométrica. 3. MATERIALES Medios de cultivo 6 cajas de agar selectivo ( EMB, hektoen, BPLS, salado manita, Baird Parker)
Reactivos y cepas 3 suspensiones de cepas de microorganismos que deben crecer en el medio de cultivo 3 suspensiones de cepas de microorganismos que no deben crecer en el medio de cultivo
* Algodón y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO
Materiales* asas bacteriológicas incubadora Mecheros Cinta enmascarar
1. Tomar 6 cajas del medio a analizar. 2. Dividir con el asa bien caliente cada caja en cuatro cuadrantes, como se observa en la figura 1. 3. Marcar tres cajas con el nombre de los microorganismos que supuestamente crecen y forman colonias en ese medio de cultivo. 4. Marcar las tres cajas restantes con el nombre de los microorganismos que supuestamente no deben crecer en ese medio de cultivo. 5. Sembrar cada caja con el microorganismo correspondiente, haciendo 5 estrías en cada cuadrante y una estría central (Ver figura 1), sin quemar el asa y tomando inóculo sólo una vez. 6. Incubar a 37ºC por 24-48 horas. 5. RESULTADOS 1. Se procede a observar el crecimiento o no de cada uno de los cuadrantes de cada caja. 2. El resultado se expresa como un número de 6 cifras. Se anota un número de 0 a 5 según el crecimiento en cada cuadrante, incluyendo la estría central considerada como la quinta. 3. Se debe anotar cada uno de los resultados de cada cuadrante, igualmente el microorganismo utilizado. 4. Al final se informará un número de 6 cifras. 6. INTERPRETACIÓN Y REPORTE Las tres primeras cifras indican los sectores positivos de los microorganismos que deben crecer y las tres últimas cifras los sectores positivos de crecimiento por parte de las cepas cuyo desarrollo no debe producirse. Así un medio selectivo perfecto daría un resultado de 555000, pero en la práctica se acepta la fórmula 55001 o aún otra más desfavorable. Se reporta según las indicaciones de la hoja de informe. 7. BIBLIOGRAFÍA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD (OMS). Manual de Bioseguridad. Editorial Ginebra. 2ª edición, 1994. 4. MOSSEL, A. y MORENO, B. Microbiología de los alimentos. Fundamentos ecológicos para garantizar y comprobar la inocuidad y la calidad de los alimentos. Editorial Acribia. 5. MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994. 3 8. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO
Todos los grupos deben traer:    
Fósforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar Marcador.
CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO TÉCNICA ECOMETRICA INFORME
1. Nombre del medio de cultivo:____________________________________ 2. Fundamento del medio de cultivo:________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ No de caja 1 2 3 4 5 6
Sectores positivos _______________ _______________ _______________ _______________ _______________ _______________
Microorganismo ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ ___________________
La fórmula final obtenida será: _____________________________________ Conclusión: ____________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________
Figura No. 1: Técnica Ecométrica
Microorganismos que SI crecen
Microorganismos que NO crecen
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 2: ESTUDIO MICROBIOLOGICO A MANIPULADORES, SUPERFICIES, UTENSILIOS Y MEDIO AMBIENTE. 1. INTRODUCCIÓN Para asegurar la calidad de los alimentos debe prestarse atención tanto a los microorganismos patógenos como a los alterantes, que pudieran llagar a las materias primas o al alimento terminado, a partir del hombre (manipulador), de los equipos, tuberías, superficies, aire, etc. Según el Ministerio de la Protección Social se denomina manipulador a toda persona que trabaje a cualquier título y aunque sea ocasionalmente, en un local o establecimiento o en el comercio ambulante donde se produzcan, procesen, almacenen, distribuyan, transportan o expendan alimentos o materias primas para alimentos. En una planta procesadora de alimentos, el manipulador juega un papel importante en la fabricación de sus productos, ya que se puede convertir en una fuente de contaminación. Muchos sitios del cuerpo humano albergan una carga microbiana normal, los sitios de importancia donde residen los microorganismos saprófitos y que se constituyen en una fuente de contaminación para manipuladores de alimentos son la piel y el tracto respiratorio (fosas nasales y faringe). El microorganismo mas importante a analizar a partir de la piel, es el Staphylococus aureus, este microorganismo reside también en las fosas, tracto nasofaríngeo y la mayoría de las veces se encuentra asociado a furúnculos, heridas y lesiones de la piel. Debido a sus condiciones metabólicas, esta bacteria puede crecer y/o reproducirse en condiciones adversas; esto hace factible que contamine los alimentos y por su facilidad de aislarse en el laboratorio, ha sido utilizado como indicador de contaminación por manipuladores. La presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en los alimentos procesados indica contaminación a partir de piel, boca o nariz de los manipuladores. La importancia de identificar este microorganismo, radica en la propiedad que tiene de liberar una toxina termoestable en los alimentos y causar intoxicaciones alimentarias; Staphylococcus aureus coagulasa positiva es el agente bacteriano que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicación alimentaria, es por esto que el manipulador de alimentos se puede convertir en una fuente de contaminación. Otros microorganismos no pertenecientes a la flora normal de la piel, pueden transferirse al alimento debido a una pobre higiene corporal, un ejemplo son los coliformes totales y fecales, provenientes del tracto gastrointestinal, específicamente de la región anal, la presencia de estos también se investiga en las manos dedos y uñas de los manipuladores e indican contaminación de origen fecal. 7
Un manipulador debe cumplir con los siguientes requisitos: 1. No presentar heridas, ni afecciones cutáneas en brazos o manos. 2. No padecer enfermedades infectocontagiosas. 3. Practicar buena higiene personal. 4. Durante su trabajo debe usar uniforme y gorro, en las áreas de envasado se hace indispensable el uso de mascarilla. 5. Recibir capacitación sobre manejo higiénico de alimentos. Los equipos, utensilios y superficies, utilizados en el procesamiento, fabricación o preparación de alimentos, deben estar diseñados, construidos, instalados y mantenidos de tal forma que se evite la contaminación del alimento y se facilite el proceso de limpieza y desinfección de los mismos. Igualmente es importante el estudio microbiológico del aire (ambiente), ya que este se pone en contacto con los alimentos, por eso se debe estar seguro de trabajar en un ambiente adecuado, debidamente desinfectado o esterilizado. 2. OBJETIVOS 1. Detectar la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en fosas nasales y zona faríngea de los manipuladores, mediante la realización de frotis y cultivos. 2. Establecer la eficacia del lavado de manos, mediante la comparación del número de UFC antes y después del lavado. 3. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales a partir de las manos, dedos y uñas de los manipuladores, mediante frotis y cultivos. 4. Identificar la presencia de coliformes totales y fecales en utensilios, equipos y las superficies. 5. Evaluar la contaminación del ambiente. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos A. Baird Parker / A.S.M. Colorantes Gram A. Ogy Aceite de inmersión A. Plate count Plasma fresco A. EMB Reactivo de Kovacs A. Púrpura Bromocresol Caldo BHI Caldo Brilla Caldo Indol Caldo lactosado * Algodón y alcohol al 70%
Materiales* Escobillones estéril Baja lengua estéril Gasa estéril Portaobjetos estériles Microscopio Incubadora Baño serológico Tubo taparosca estéril Asa bacteriológica
4.1.1. Fosas nasales y Faringe 1. Marcar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) como muestra faríngea y nasal respectivamente. 2. Inmovilizar la lengua con un bajalengua. 3. Frotar con un escobillón los pilares amigdalianos, realizar un frotis y sembrar en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 4. Introducir un escobillón en las fosas nasales y frotarlo suavemente en las paredes, realizar un frotis y sembrar inmediatamente en el Agar Baird Parker (Salado de Manitol). 5. Incubar por 24-48 horas a 37ºC. 6. Observar las cajas de Agar Baird Parker (Salado de Manitol) y buscar colonias negras brillantes con un halo blanco rodeadas de halos claros que contrastan con el medio (Colonias puntiformes amarillas con halos amarillos). 7. Realizar un frotis de cada caja a partir de las colonias de interés y colorearlos con Gram, se deben observar cocos grampositivos agrupados en racimos. 8. Tomar 3 colonias de cada caja y transferirlas a tubos con caldo infusión cerebro corazón (BHI), marcados respectivamente como fosas nasales y faringe. 9. Incubar por 24 horas a 37ºC. 10. Realizar la prueba de la coagulasa: transferir 0.3 ml de cultivo BHI + 0.3ml de plasma fresco, incubar a 37ºC en baño serológico por 4 horas observando cada hora la formación de coagulo. 4.1.2. Manos 4.1.2.1. 1. 2. 3. 4. 5.
Colocar la mano del manipulador en una caja con Agar Púrpura de Bromocresol. solicitar al manipulador que lave las manos como siempre lo hace. Colocar la otra mano del manipulador en otra caja con Agar Púrpura de Bromocresol. Incubar ambas cajas a 37ºC por 24-48 horas. Observar y contar el número de UFC en las cajas de Agar Púrpura de Bromocresol, antes y después del lavado.
1. Frotar un escobillón humedecido con caldo brilla las manos, dedos y uñas del manipulador. 2. Introducir el escobillón dentro de un tubo que contiene caldo brilla con tubo durham.
9 3. Tapar bien el tubo. 4. Incubar a 37ºC por 24-48 horas. 5. Realizar la lectura (turbidez y producción de gas indican presencia de coliformes totales). 6. Confirmar la presencia de coliformes Totales, sembrando en placas de Agar EMB. 7. Incubar a 37ºC durante 24 horas. 8. Realizar la lectura observando la presencia de colonias sospechosas de coliformes Totales (Colonias grandes verdosas con brillo metálico). 9. Transferir dos asadas del tubo positivo a un tubo con caldo brilla (con tubo durham) y a uno con caldo indol. 10. Incubar en baño serológico a 45ºC por 24-48 horas, asegurándose de que el nivel del agua cubra el medio de cultivo. 11. Adicionar 5 gotas del reactivo de Kovacs al tubo con caldo indol, para la determinación de indol. 12. Realizar la lectura (la turbidez y el gas en el tubo de brilla y la producción de indol en el caldo indol, indican la presncia de coliformes fecales). Recuerde que solo la positividad de ambos tubos, indican la presencia de Coliformes fecales. 4.2.
ESTUDIO MICROBIOLÓGICO SUPERFICIES.
Procedimiento de la esponja o gasa estéril. 1. Con la ayuda de una bolsa de plástico, a manera de guante, tomar la esponja estéril, evitando posibles contaminaciones. 2. Verter unos mililitros de caldo lactosado a la esponja y muestrear el utensilio, equipo o superficie seleccionada, frotando la esponja por toda el área. 3. Dejar la esponja en el interior de la bolsa, una vez finalice la operación y agregar el resto del caldo lactosado. 4. Cerrar y marcar la bolsa. 5. Exprimir la esponja varias veces, suavemente. 6. Incubar la bolsa con la espoja a 37ºC durante 24 horas. 7. Pipetear 1ml de caldo lactosado y transferirlo a un tubo con caldo brilla. 8. Incubar a 37ºC durante 24 a 48 horas. 9. Realizar la lectura observando la presencia de gas y turbidez. 10. Continuar como en el inciso 6 del numeral 4.1.2.2. 4.3.
ESTUDIO MICROBIOLOGICO AL AMBIENTE.
4.3.1. Evaluación de la Contaminación Bacteriana. 1. Abrir una caja de Agar Plate Count por 10 minutos. 2. Cerrar la caja e incubar a 37ºC por 24-48 horas. 3. Contar y reportar el número de colonias.
10 4.3.2. Evaluación de la Contaminación Fúngica. 4. Abrir una caja de Agar Ogy por 10 minutos. 5. Cerrar la caja e incubar por 3 a 5 días a 22ºC. 6. Contar y reportar el número de microorganismos. 5. INTERPRETACIÓN Y REPORTE 5.1. Fosas nasales y zona faringea La determinación del Staphylococcus aureus en estos casos es considerada una prueba de presencia o ausencia, se reporta como prueba positiva o negativa para Staphylococcus aureus coagulasa positiva. 5.2. Manos Evaluación del método de desinfección. Esta prueba sirve para establecer la eficacia del lavado de las manos en manipuladores y se reporta la diferencia entre las UFC antes y después del lavado. Evaluación de la contaminación fecal. La determinación de coliformes totales y fecales, en este caso es una prueba de presencia o ausencia, se reporta como presencia de coliformes totales o fecales; indican que el proceso de sanitización no es el ideal o contaminación de origen fecal. 5.3. Estudio microbiológico a utensilios, equipos o superficies. La presencia de coliformes totales o fecales, indican que el proceso de limpieza y desinfección no es el adecuado o contaminación de origen fecal. 5.4. Evaluación microbiológica al ambiente. Se reporta el número de colonias, que no debe ser mayor de 10 en 10 minutos, si es mayor indica que el ambiente está contaminado y se debe repetir el proceso de desinfección o esterilización del ambiente. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. KONEMAN, Elmer W. y Cols. Diagnóstico Microbiológico. Editorial Panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
11 4. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer:   
Fósforo para encender el mechero Toallas absorbentes Cinta para enmascarar
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 3: CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE RECUENTO EN PLACA. 1. INTRODUCCIÓN El recuento en placa es el método más utilizado y más recomendado por la Comisión Internacional sobre especificaciones Microbiológicas en los alimentos (ICMSF). El procedimiento se basa en la cuantificación de la población microbiana presente en los alimentos sólidos o líquidos, sembrando en profundidad o en superficie. La mayoría de los alimentos no son estériles, sino que contienen una población microbiana, que varía ampliamente en número, dependiendo del alimento. Es por esto que al alimento se le realizan diluciones para su cuantificación, ya que si se sembraran los alimentos sin diluir, presentarían un recuento tan alto que sería imposible realizar su conteo. Para eso se utilizan las diluciones logarítmicas en base 10 (10-1, 10-2, 10-3, 10-4), las cuales se pueden relacionar con el recuento de microorganismos multiplicando por el factor de dilución, que es el inverso de la dilución. La dilución inicial siempre será 1:10 (10+90; 25+225; 50+450; 100+900), la cantidad de muestra va a depender del tipo de alimento y de los parámetros que existan, pero lo importante que se guarde la relación: 1+9 o sea 1 parte de alimento y 9 partes de diluyente. 2. OBJETIVOS 1. Preparar correctamente homogenizados a partir de muestras de alimentos sólidos o líquidos. 2. Realizar diluciones logarítmicas en base 10 a partir de los homogenizados. 3. Sembrar en profundidad 1ml de las diferentes diluciones con agar plate count. 4. Sembrar en superficie 0.1ml de las diferentes diluciones en el agar correspondiente. 5. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la calidad de los controles y de las diluciones. 6. Informar el número de UFC/g ó ml de alimento. 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Plate count Agar leche Agar EMB Agar Tributirina
* Algodón y alcohol al 70%
Materiales* Homogenizador Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Contador de colonias Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Cajas petri estériles
4. PROCEDIMIENTO 4.4.
PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES
1. Si la muestra no se va a procesar inmediatamente, debe guardarse en refrigeración a 4ºC por un tiempo máximos de 24 horas. 2. Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento. 3. En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla como dilución 10-1. 4. Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilución 10-2 y dilución 10-3, adicionar a cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%. 5. Agitar unas 25 veces las muestras líquidas, formando un arco con el antebrazo de 30 cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si el recipiente no tiene espacio libre con el fin de homogenizar la muestra y tomar una parte representativa del producto. Para muestras sólidas pesar 10g de la muestra, tratando de tomar porciones de varias partes. 6. Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco que contiene los 90 ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta más de 10 veces, hasta homogenizar la mezcla; así se obtiene la dilución 10-1. 7. Tomar 1 ml de la dilución 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml de agua peptonada al 0.1% marcado con la dilución 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Esta es la dilución 10-2. 8. Tomar 1 ml de la dilución 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilución 10-3. Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. Así se obtiene la dilución 10-3. 9. De esta forma se tienen las diferentes diluciones, el número de ellas va ha depender del alimento y de los parámetros que existan, pero deben sembrarse por lo menos tres (3) diluciones. (Ver figura 2 ) 4.5.
PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD.
1. Tomar 5 cajas de petri estériles y marcarlas en la tapa como dilución 10-1, 10-2, 10-3, control del diluyente y control del medio; además escribir en cada una de ellas el Nº del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y el número de la muestra. 2. Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilución 10-1 y tomar 1ml de la dilución y adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), las diluciones deben sembrarse por duplicado. 3. Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilución 10-2, tomar 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilución 10-2.
4. Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilución 10-3, pipetear 1ml y adicionarlo en la caja marcada como dilución 10-3. El tiempo transcurrido entre la realización de las diluciones y la siembra en la última caja, no debe ser mayor de 20 minutos. 5. Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como control del diluyente. 6. Adicionar 15ml del agar fundido a 45ºC, a cada una de las cajas, incluyendo las cajas marcadas como control del diluyente y del medio. Según la temperatura de incubación, se obtienen los mesófilos aerobios a 37ºC, los termófilos cuando se incuban las cajas a 55ºC, los psicrófilos a 7ºC por 10 días. La temperatura elegida dependerá del objetivo que se pretenda con la realización del recuento. También dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesófilos aerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelíticos, utilizando agar leche; lipolíticos, utilizando al agar tributirina; coliformes, utilizando agar EMB o VRBD. Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio de cultivo, se pueden detectar loa mesófilos anaerobios y facultativos viables, utilizando agar cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones de anaerobiosis. a. Mesófilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC por 24 a 48 horas. b. Termófilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 55ºC por 24 a 48 horas. c. Psicrótrofos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 7ºC por 10 días. d. Proteolíticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 22ºC por 72 horas. e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45ºC a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC por 24 a 48 horas.
15 7. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en dirección de las manecillas del reloj y viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obtener una distribución homogénea de la muestra en el medio de cultivo. 8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37ºC de 24 a 48 horas. 4.6.
PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE.
1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del alimento, fecha, dilución y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del diluyente y otra como control del medio. 4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo. 5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC (ver figura 4). 7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias. 8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilución y por 10. 5. INTERPRETACIÓN Y REPORTE 1. Sacar las cajas de la incubadora. 2. Evaluar las cajas marcadas como control del diluyente y control del medio. 3. Organizar las cajas de la dilución menor a la mayor. 4. Evaluar el crecimiento secuencial y la calidad de las diluciones, el recuento debe ser 10 veces menos a medida que aumenta la dilución. 5. Proceder al recuento de las Unidades Formadoras de Colonia (UFC). 6. INFORMES DE RESULTADOS 1. Se reportan solamente dos dígitos, el primero y el segundo de izquierda a derecha, los otros dígitos deben reemplazarse por ceros. 2. No se reportan cifras decimales, sino que se redondea al mas próximo número si el tercer dígito es 5 o mayor y se quita si es menor de cinco. 3. Los recuentos estimados no se reportan para la aceptación o rechazo de un alimento, porque es útil solo como una aproximación primaria en la calidad bacteriológica de un alimento. 7. REGLAS PARA EL RECUENTO DE MICROORGANISMOS
1. Cajas entre 30 -300 UFC
Es la caja ideal (para siembras en profundidad), se cuentan las UFC y se multiplican por el inverso del factor de dilución. Ej: Dil: 10-1 >300 UFC Dil: 10-2 > 300 UFC Dil: 10-3 80 UFC -4 Dil: 10 10 UFC Resultado: 80x103 UFC /g o mL. Si las cajas se sembraron por duplicado, se promedia el valor y se multiplican por el factor de dilución. Se reporta Recuento Estándar en placa 80x103 UFC /g o mL Para siembras en superficie se recomienda escoger cajas que contengan entre 20 y 200 UFC, y para el recuento de mohos y levaduras cajas que contengan entre 20 y 100 UFC (Escobar, 1994, p 183 y 199). 2. Diluciones consecutivas entre 30-300 UFC. Se hace el recuento para cada dilución y se promedian los resultados. Ej: a) Si el conteo de una de las cajas es menos del doble del conteo de la otra caja, se informa el promedio de recuento. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC Dil: 10-2 300 UFC Dil: 10-3 38 UFC Dil: 10-4 10 UFC Resultado: 38000/30000= 1,27, lo que indica que el conteo de la dilución mayor es manos del doble de la dilución menor, entonces se reporta el promedio del recuento: (38000 + 30000)/2 = 34000 UFC ó 34x103. Se reporta Recuento Estándar en placa 34x103 UFC /g o mL b) Si el conteo de una de las cajas es el doble o más del conteo de la otra caja, se informa el recuento menor. Ejemplo: Dil: 10-1 >300 UFC Dil: 10-2 200 UFC Dil: 10-3 60 UFC Dil: 10-4 15 UFC Resultado: 60000/20000= 3, lo que indica que el conteo de la dilución mayor es mas del doble de la dilución menor, entonces se reporta la dilución menor o sea 20000UFC ó 20x103 UFC. Se reporta Recuento Estándar en placa 20x103 UFC/ g ó mL.
17 3. Ninguna caja entre 30 y 300 UFC En estos casos se elige la caja con el recuento más cercano a 300, se multiplica por el factor de dilución y se reporta como Recuento Estimado en Placa. 4. Todas las cajas tienen menos de 30 UFC. Se cuentan las colonias de la caja con menor dilución y se reporta como Recuento Estimado en placa. 5. Ninguna de las cajas presenta crecimiento. Después de estudiar los controles, evaluar que no haya presencia de sustancias inhibidoras en el medio de cultivo, se informa como menos de la dilución mas baja utilizada, menos de 101 UFC /g ó mL. o menos de 10 UFC /g ó mL ( para siembra en profundidad) y menos de 102 UFC /g ó mL o menos de 100 UFC /g ó mL ( para siembra superficial). Se reporta como Recuento Estimado en placa: <1x101 UFC /g ó mL o 102 UFC /g ó mL, respectivamente. 6. Todas las cajas presentan mas de 300 UFC a) Dividir la caja de la dilución mas alta en secciones radiales (2, 4, 8), contar todas las colonias de una sección y multiplicar ese resultado por el factor de dilución y se reporta como Recuento Estimado en placa. b) Si hay mas de 200 colonias en cada una de las 8 secciones, multiplicar por 1600 (200x8) y por el factor de dilución; expresar el resultado como mayor que el número resultante. Reportar Recuento Estimado en placa: > 16x105 UFC/g ó mL. 7. Presencia de Spreader Es el crecimiento de un microorganismo en forma de película, la cual puede ocupar toda la caja o parte de ella. Si cubre solo la mitad contar las colonias presentes en la otra mitad y reportar como Recuento Estimado en placa. Si cubre toda la caja se tiene que repetir el recuento y reportar presencia de spreader o accidente de laboratorio. 8. INVESTIGAR 1. ¿Cómo se realiza la dilución 10-1 en los alimentos o productos donde la contaminación es esencialmente superficial? 2. ¿Cómo se realiza la dilución 10-1 en los productos grasos y que se hace cuando el contenido graso es mayor del 20%? 3. ¿Qué precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir de alimentos congelados, deshidratados o pasteurizados? 4. ¿Cuál es la importancia y utilidad del recuento en placa?
18 9. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 10. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, Cinta para enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeño Grupo 4: 100 g de pulpa de fruta o una fruta fresca Grupo 5: 100 g de chorizo. Figura No. 2 Diluciones decimales
90 ml Agua peptona
9 ml Agua Pept.
1ml 9 ml Agua Pept.
19 Figura No. 3: Siembra en Profundidad
15 ml Agar 45ªC
Mezclar Y Solidificar
Figura No. 4: Siembra en Superficie
21 UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 4: TECNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) 1. INTRODUCCIÓN Esta técnica sirve para estimar la población de microorganismos viables en una muestra de alimento. En contraste con el recuento estándar en placa, el NMP es un método indirecto y solo da recuentos estimados de la población microbiana; es menos preciso que el recuento en placa cuando se trata de alimentos que contienen altas poblaciones microbianas, pero mas eficaz en poblaciones bajas porque permite el análisis de muestras de tamaño mas significativo. Se usa principalmente para la determinación de coliformes, pero variando el medio de cultivo también se puede utilizar para la cuantificación de Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, etc. La metodología de la técnica se basa en la siembra de volúmenes secuenciales de base 10 (10, 1, 0.1, 0.01 mL) de la muestra pura o 1 mL de la diluciones decimales. El número de diluciones dependerá del grado de contaminación del alimento y/o de los estándares microbiológicos establecidos para ese producto: La relación muestra pura o diluida debe ser de 1mL para 10 mL de medio de cultivo. Existen diferentes del NMP para coliformes, dependiendo del medio de cultivo utilizado: el norteamericano emplea el caldo laurel sulfato triptosa, seguida de la confirmación de los tubos positivos en caldo lactosa bilis verde brillante o siembra por estría en EMB; el británico solo utiliza caldo Mac-konkey; un tercer método emplea el caldo lactosa bilis verde brillante y confirman con agar cristal violeta rojo neutro bilis lactosa. La utilización del método dependerá del tratamiento a que ha sido sometido el alimento. 2. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la técnica del número más probable. 2. Sembrar muestras puras y diluidas por la técnica del NMP utilizando diversas modalidades y medio de cultivo. 3. Leer la positividad de los tubos en las tablas correspondientes. 4. Informar los resultados de la técnica del NMP. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Bilis verde brillante Coloración de gram lactosa con durham
Materiales* Homogenizador
A. EMB Agua peptona 0.1%
Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo
TECNICA CON 5 TUBOS PARA MUESTRAS LÍQUIDAS PURAS
1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo. 2. Marcar 5 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa a doble concentración. 3. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 4. Mezclar muy bien el alimento y adicionar 10mL en cada uno de los tubos (ver figura 5). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parámetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos y buscar en la tabla No. 1, que es una tabla que se usa cuando se utilizan 5 tubos con 10mL de muestra. El resultado del NMP se obtiene en 100mL, si el resultado se tiene que expresar por mL se divide entre 100. 4.2.
TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS LÍQUIDAS PURAS.
1. Desinfectar Con alcohol al 70% toda el área de trabajo. 2. Tomar 9 tubos que contienen 10mL cada uno de medio Bilis verde brillante lactosa, tres de los cuales están a doble concentración y los 6 restantes a concentración simple. 3. Marcar los tubos anteriores de la siguiente manera: con el número 10 los tres tubos que tienen doble concentración, con el número 1 tres tubos con concentración simple y con el número 0.1 los tres tubos restantes que también tienen una concentración normal o simple. 4. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 5. Mezclar muy bien el alimento y sembrar por triplicado 10mL, 1mL y 0.1 mL en cada uno de los tubos marcados respectivamente (ver figura 6). 6. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 7. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presenten estos parámetros o presente solamente uno de los dos.
23 8. Anotar los tubos positivos y confirmar la presencia del microorganismo a determinar usando pruebas complementarias. 9. Anotar los tubos que resultaron positivos en la prueba confirmatoria. 10. Buscar en la tabla No. 2, que es una tabla que se usa cuando se siembran 10mL de muestra en tres tubos, 1mL en otros tres tubos y 0.1mL de muestra en los últimos tres tubos. El resultado del NMP se da en 100mL, si el resultado se debe expresar por mL se divide entre 100. 4.3.
TECNICA CON 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS LÍQUIDAS O SÓLIDAS.
1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo. 2. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene el alimento a utilizar. 3. Mezclar muy bien el alimento y realizar tres diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 4. Sembrar por triplicado 1mL de cada uno de las diluciones en tubos que contengan 10mL de Bilis verde brillante lactosa preparados a concentración simple (ver figura 7). 5. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 6. Leer los tubos tubos: Positivos los que presenten gas y turbidez. Negativo los que no presentes estos parámetros o presente solamente uno de los dos. 7. Anotar los tubos positivos que dieron positivo la prueba confirmatoria (Ver figura 7). 8. Buscar en la tabla No. 3, que se usa cuando se siembra por triplicado 1mL de muestra en cada una de las diluciones. El NMP se expresa por mL. 4.4.
PROCEDIMIENTO DE PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
Estas pruebas se utilizan para comprobar si realmente se ha detectado el microorganismo buscado 4.4.1. Examen microscópico directo: 1. realizar frotis a partir de los tubos positivos. 2. Colorearlos con Gram. 3. Observar los microorganismos al microscopio con objetivo de 100X. Este método no es útil ya que no permite distinguir los microorganismos muertos de los vivos. 4.4.2. Subcultivos: 1. Realizar siembras de los tubos positivos en agar selectivo (EMB, macKonkey ó Endo). 2. Incubar por 24-48 horas a 37ªC. 3. Observar el crecimiento del microorganismo buscado e informar. 24
5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN. Los resultados se expresan como NMP = No. de bacteria/ g ó mL de alimento; hay veces dependiendo del alimentos se expresa como NMP = No. de bacterias / 100mL. Los resultados de un análisis de NMP, están directamente relacionados con la frecuencia con que se presentan una serie de resultados positivos, que son los mas probables que ocurran cuando un número dado de organismos están presentes en una muestra de alimentos. En caso de realizar más diluciones que las que posea la tabla empleada, se puede usar la siguiente fórmula para hallar el NMP por g ó mL: (NMP de la tabla x Factor de dilución intermedio de la lectura)/ 100 = Bact/g ó mL 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 3. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 4. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: 100 mL de leche cruda Grupo 2: 100 g de queso Grupo 3: 100 mL de suero costeño Grupo 4: 100 mL de jugo preparado en casa Grupo 5: 100 g de chorizo.
TABLA No. 1 TABLA DE NMP Y LÍMITES DE CONFIANZA CUANDO SE USAN 5 TUBOS CON 10 ML DE MUESTRA
NMP/100mL LIMITES DE CONFIANZA 95% Mínimo Máximo
2.2 2.2 5.1 9.2 10.0 16.0
0 0.1 0.5 1.6 3.0 8.0
6.0 12.6 19.2 29.4 52.9 Infinita
TABLA No. 2 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS PURAS
NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS 10mL 1mL 0.1mL
000 001 010 100 101 110 111 120 200 201 210 211 220 221 300 301 302 310 311 312 320 321 322 330 331 332 333
<3 3 3 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 110 210 240 460 1100 >2400
0.5 0.5 0.5 1 1 3 3 1 3 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150
9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 380 380 440 470 1300 2400 4800
TABLA NO. 3 TABLA DE NMP CUANDO SE USAN 9 TUBOS PARA MUESTRAS DILUIDAS
NÚMERO DE TUBOS POSITIVOS 10-1 10-2 10-3
000 010 100 101 110 120 200 201 210 211 220 300 301 310 311 320 321 322 330 331 332 333 Fuente: MAN (1975)
<3 3 4 7 7 11 9 14 15 20 21 23 40 40 70 90 150 210 200 500 1100 >2400
99% <1 23 <1 28 1 35 1 36 2 44 1 50 3 62 3 65 5 77 5 80 4 177 10 230 10 290 20 370 20 520 30 660 50 820 100 1900 100 3200 200 6400
95% <1 17 1 21 2 27 2 28 4 35 2 38 5 48 5 50 8 61 8 63 7 129 10 180 20 210 20 280 30 390 50 510 80 640 100 1400 200 2400 300 4800
De cada dilución se inoculan tres tubos de medio, cada uno con 1 mL. Para calcular el NMP de diluciones mayores que las que figuran en la tabla, multiplicar el NMP por el factor adecuado: 10, 100, 1000, etc. Por ejemplo, si los tubos seleccionados corresponden a las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, multiplicar por 10; si las diluciones son 10-3, 10-4, 10-5, multiplicar por 100.
Figura No. 5: Técnica de NMP para 5 tubos (Muestras puras líquidas)
10 ml (doble)
Figura No. 6: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras puras líquidas)
0.1 ml Litro 1 ml 10 ml
Figura No. 7: Técnica de NMP para 9 tubos (Muestras diluidas líquidas o sólidas)
1ml 90 ml Agua peptona 10-1 1ml
9 ml A.Pep 10-2
9 ml APep 10-3
UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS
GUÍA Nº 5: RECUENTO DE MESOFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES
1. INTRODUCCIÓN El número de microorganismos mesófilos aerobios encontrados en los alimentos por el método del recuento en placa es uno de los indicadores microbiológicos de la calidad de los alimentos mas frecuentemente usados. Este índice no es utilizado en productos alimenticios obtenidos por medio de procesos fermentativos como el queso y ciertos embutidos porque los recuentos de microorganismos son muy elevados. (Luna, 1991, p 49). Este recuento es utilizado para determinar si la limpieza, desinfección y el control de temperaturas durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento se han realizado de forma adecuada; también permite obtener información sobre alteraciones incipientes en los alimentos, la probable vida útil del producto, la descongelación incontrolada de los alimentos congelados o las fallas en el mantenimiento de las temperaturas de refrigeración en alimentos fríos. Además es el método utilizado para poner de manifiesto el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los alimentos. (Luna, 1991, p 49). El recuento en placa de mesófilos aerobios se puede desarrollar a través de cuatro métodos: 1. 2. 3. 4.
Método de recuento en placa profunda. (Mayor uso). Método de recuento en placa superficial. Método de recuento en placa por siembra de gotas en superficie. Método de recuento en placa por siembra con asa de platino calibrado (Para leche principalmente).
2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables a partir de alimentos de origen animal o vegetal. 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar plate count
Materiales* Homogenizador Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Cajas de petri
4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE MESÓFILOS AEROBIOS Y FACULTATIVOS VIABLES 1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No. del grupo. 3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del diluyente. 4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml del diluyente. 5. Verter 15ml de agar plate count fundido a 45ªC en cada una de las cajas. 6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. 7. Dejar solidificar. 8. Invertir las cajas e incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 9. Luego de cumplido el tiempo de incubación, sacar las cajas y evaluar el control del medio y del diluyente; posteriormente proceder al conteo de las cajas con las diluciones si no se presentan problemas en los controles y si se observa mayor población de microorganismos en las cajas menos diluidas. 5. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. LUNA CORTES, Gilma Yaneth, Manual operativo de análisis microbiológicos para alimentos. Fundación Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano, 1ª ed. I.S.B.N. 958-9029-00-0, Bogotá 1991. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 6: NMP DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMALO VEGETAL 1. INTRODUCCIÓN El término habitual de coliformes comprende E.coli y otras especies pertenecientes a otros géneros de la familia Enterobacteriaceae, son microorganismos ubicuitarios; se les puede encontrar ampliamente distribuidos en la naturaleza, el suelo, agua y también son carga normal del tracto intestinal del hombre y animales de sangre caliente (Escobar, 1994, p 66). En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienización eficaz que asegure su inocuidad al consumidor, está indicado por regla general, la determinación de coliformes totales o gérmenes del grupo coli-aerógenes, incubados a 37ªC, que fermentan la lactosa con producción de gas en el medio caldo lactosa bilis verde brillante (2%), su presencia no tiene necesariamente relación con una contaminación de origen fecal, y consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patógenos de naturaleza entérica, sino que es solo una indicación de deficiencias o fallos en el tratamiento industrial, recontaminaciones después del procesos de los alimentos y en última instancia de su calidad higiénica; mala calidad higiénica en el proceso, falta de higiene de los manipuladores. Ello es debido a la diversa procedencia de los miembros que integra este grupo de microorganismos (Escobar, 1994, p 66). E.coli es un germen cuyo habitat natural es el tracto entérico del hombre y los animales. La mayoría de las bacterias del grupo E.coli son comensales inocuos entéricos, pero algunas cepas pueden causarle daño a la salud humana o animal. Su presencia en un alimento indica generalmente una contaminación directa o indirecta de origen fecal y por consiguiente, existe el riesgo de que hayan podido llegar al alimento en cuestión microorganismos patógenos de procedencia entérica (Escobar, 1994, p 68). Resulta claro que E.coli es el indicador de contaminación fecal universal y de hecho es el marcador sanitario ideal en el análisis microbiológico de los alimentos crudos o que no han sido sometidos a ningún tratamiento para asegurar su inocuidad. Así por ejemplo, si este microorganismo se encuentra en alimentos tales como verduras, hortalizas, moluscos bivalvos, etc., puede inferirse que ha tenido lugar una contaminación de origen fecal y que por lo tanto, han podido llegar a estos alimentos microorganismos patógenos de procedencia entérica (Escobar, 1994, p 68). 33
2. OBJETIVOS 1. Determinar coliformes totales y fecales, a partir de productos de origen animal o vegetal. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Bilis verde brillante lactosa Coloración de gram con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Agua peptona 0.1% Agua triptona
Materiales* Homogenizador Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri
4. PROCEDIMIENTO 4.1. PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES TOTALES 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo y el recipiente que contiene la muestra a analizar. 2. Pesar 10 g o medir 10 ml de la muestra y realizar tres o más diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 3. Sembrar por triplicado 1 mL de cada una de las diluciones en tubos que contengan 10 ml de Bilis verde brillante lactosa con tubos durham preparados a concentración simple. 4. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 5. Leer a las 24 horas los tubos positivos, los negativos reincubarlos otras 24 horas. 6. Repicar mediante una asada todos los tubos positivos al agar EMB e incubar por 24 horas a 35-37ªC. 7. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento característico en agar EMB (colonias con brillo verde metálico). 8. Buscar en la tabla No.3 el resultado de NMP. 9. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Totales = No. de bacterias / g ó ml. 4.2.
PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES FECALES O TEST DE MACKENZEI.
1. Subcultivar todos los tubos positivos de coliformes totales en caldo Bilis verde brillante lactosa y agua triptona o medio SIM. 2. Incubar por 24-48 horas a 44.5ªC en baño serológico cuidando que el 34
nivel del agua cubra el contenido de los tubos. 3. Leer los tubos positivos de la siguiente forma: caldo Bilis verde brillante lactosa: se le por turbidez y gas. Medio SIM o agua de triptona: Se adicionan 5 gotas del reactivo de Kovacs y se lee por formación de un anillo rojo en la superficie del medio. Para que la prueba sea considerada positiva deben estar ambos tubos positivos. 4. Anotar todos los tubos positivos y buscar en la tabla del NMP. 5. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Fecales = No. de bacterias / g ó ml 5. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 7: RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVA 1. INTRODUCCIÓN La intoxicación estafilocócica se produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes, activas por vía oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento (Escobar, 1994, p 94). Los estafilococos enterotoxigénicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en los alimentos en el momento de su obtención, en especial en los de origen animal, o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de los manipuladores. Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras de S.aureus en fosas nasales y faringe, también se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobre todo en procesos cutáneos (acné, furúnculos, heridas infectadas) (Escobar, 1994, p 94). 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de alimentos de origen animal o vegetal. 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Baird –Parker Infusión cerebro corazón Agar azul de O-Toluidina DNA
Reactivos Coloración de gram Plasma fresco
* Algodón y alcohol al 70% 36
4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO POSITIVA
1. Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Baird-Parker con fecha, muestra, dilución y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas de petri que contienen agar Baird-Parker, una como control del medio y otra como control del diluyente. 4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio BairdParker. 5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas colonias características (negras, lustrosas, convexas, rodeadas de un halo claro dentro de anillos opacos). Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilución y por 10. 4.1.
CONFIRMACIÓN AUREUS.
4.1.1. Prueba de coagulasa. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Realizar la coloración de gram a varias colonias características (raíz cuadrada del total y no menos de 3 colonias). Observar al microscopio cocos grampositivos en racimos. Sembrar en igual número de tubos que contienen infusión cerebro corazón las colonias características y grampositivas. Incubar a 37 ªC por 24 horas. Transferir 0.3 ml de cada cultivo a tubos limpios y marcados como prueba de coagulasa que contienen 0.3ml de plasma fresco humano (o plasma de conejo). Incubar a 37 ªC por 4 horas, observar cada hora hasta la formación del coágulo. Si después de este tiempo da negativo, incubar hasta 24 horas. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y el número de confirmadas positivas, ejemplo: Total de colonias contadas en la dilución 10-2 = 30 3000 Colonias elegidas para realizar la prueba de la coagulasa = 7 Positivas en la prueba de la coagulasa= 5 Reporte de Staphylococcus aureus coagulasa positiva: 3000 x 5 X= = 2142 = 2 x 103 bacterias / g ó ml. 7 37
4.1.2. Determinación de termonuclesa. 1. Incubar las placas de Baird Parker positivas por 2 horas a 60ªC. 2. Adicionar sobre las placas de Baird Parker 15 ml de agar azul de OToluidina DNA fundido a 45ªC. 3. Incubar por 3 horas a 37 ªC. 4. Observar presencia de una zona rosada brillante sobre cada colonia de Staphylococcus aureus indica una prueba positiva. 5. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 8: RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS 1. INTRODUCCIÓN Los mohos y las levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo tanto se pueden encontrar como carga normal de los alimentos con bajo pH y Aw, alto contenido de sólidos como sal o azúcar, temperaturas bajas de almacenamiento o presencia de antibióticos, pues son capaces de desarrollarse en las condiciones mas adversas (Escobar, 1994, p 198). Estos microorganismos pueden utilizar sustratos complejos como: pectinas, hidratos de carbono, ácidos orgánicos, proteínas, lípidos, etc. Frecuentemente los mohos y levaduras son responsables del mal olor, sabor, decoloración o pigmentación de la superficie de los alimentos, son los grandes alteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tubérculos y granos (Escobar, 1994, p 198). 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de mohos y levaduras en productos de origen animal y vegetal 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Ogy
1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No. del grupo. 3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del diluyente. 4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml del diluyente. 5. Verter 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a 45ªC en cada una de las cajas. 6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. 7. Dejar solidificar. 8. Invertir las cajas e incubar a 22ªC por 5 a 7 días (envolver las cajas con papel Kraft). 9. Sacar las cajas, evaluar el control del medio y del diluyente. 10.Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso de la dilución. 5. INVESTIGACIÓN 1 Fundamento del agar OGY 2 Importancia de la determinación de mohos y levaduras y en qué tipo de alimentos se determinan. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 9: INVESTIGACIÓN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS 1. INTRODUCCIÓN Todas las Salmonellas deberían ser consideradas como potencialmente patógenas para el ser humano y los animales. La única forma de transmisión es la oral, por lo que es de suma importancia el análisis de los alimentos para detectar su presencia en ellos (Escobar, 1994, p 79). Los alimentos más contaminados son los de origen animal, incluye huevos crudos, ovoproductos, leche cruda y productos lácteos, carnes y derivados, aves. La infección se disemina en los animales por los alimentos concentrados para animales como por ejemplo harinas de pescado y de sangre (Escobar, 1994, p 79). El hombre, los animales domésticos y salvajes, incluidos las aves de corral, porcinos, bovinos, roedores y animales caseros como tortugas, polluelos, perros y gatos son reservorios importantes de Salmonellas (Escobar, 1994, p 79). 2. OBJETIVOS 1.
Investigar la presencia de Salmonella en alimentos de origen animal y en derivados vegetales (harinas de cereales)
3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona tamponada Agar Hecktoen Agar BPLS Caldo tetrationato de sodio Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Agar SIM Agar XLD * Algodón y alcohol al 70%
Reactivos Coloración de gram Reactivo de Kovacs Griess Alfa naftol KOH 40% Rojo de metilo Peroxido hidrogeno 3%
4. PROCEDIMIENTO 4.1. DETERMINACIÓN DE SALMONELLAS 4.1.1. Enriquecimiento no selectivo a. Pesar 25g del producto y disolverlo en 225 ml de caldo lactosado o agua peptonada tamponada. b. Mezclar e incubar a 37ªC por 18-24 horas. 4.1.2. Enriquecimiento selectivo 1. Pipetear 1ml del anterior cultivo en 10 ml de Caldo Selenite-Cistina e incubar en baño serológico a 43ªC por 24 horas. 2. Pipetar otro mililitro y adicionarlo en un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato verde brillante e incubar en baño sexológico a 43ªC por 24 horas. 4.1.3. Siembra en agar selectivo 1. Repicar en dos de los siguientes medios selectivo: agar Hecktoen / XLD / BPLS,a partir de los caldos de enriquecimiento selectivo 2. Incubar de 35 a 37ªC por 24-48 horas. 4.1.4. Identificación bioquímica 1. Observar las colonias típicas: en agar Hecktoen vedes con o sin centro negro oscuro, en BPLS rojas o rosadas con halos rosados. 2. Sembrar las colonias típicas de Salmonellas de cada uno de los agares en medio SIM, Kligler o TSI, LIA, Citrato, Caldo MR-VP, Urea, Nitrato y realizar la prueba de oxidasa. 3. Incubar las pruebas y buscar en las tablas de identificación bioquímica. 5. INVESTIGACIÓN 1 Importancia de la determinación de Salmonellas en los alimentos. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. 42
Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 10: RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO RESDUCTOR 1. INTRODUCCIÓN El género Clostridium se define como bacilos gram positivos, al menos en las etapas tempranas del crecimiento, usualmente móviles por flagelos peritricos, con excepción de Clostridium perfringes, presentan esporas termoresistentes ovoides subterminales que deforman el cuerpo del bacilo (Acosta y González, 1995, p 298). Son anaerobios estrictos y algunas cepas presentan aerotolerancia. Su temperatura óptima de crecimiento es 37ªC; crecen a pH entre 4,7 y 9,0 pero su óptimo es de 7,0. Se desarrollan a niveles de Aw entre 0,94 y 0,97 dependiendo de la cepa (Acosta y González, 1995, p 298). Clostridium perfringes es un bacilo corto, gram positivo inmóvil con esporas subterminal y oval, anaerobio y aerotolerante, fermenta rápidamente la glucosa y lactosa; tiene pH óptimo de 7,0, temperatura de 46ªC, nivel de Aw de 0,93 a 0,95 y resiste concentraciones de 3% de NaCl y 100 mg de nitrito de sodio (Acosta y González, 1995, p 299). Es un microorganismo proteolítico, sacarolítico productor de exotoxinas antigénicas de naturaleza proteica (Acosta y González, 1995, p 299). 2. OBJETIVOS 1. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos cárnicos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agua triptona Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar SIM Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina * Algodón y alcohol al 70%
Reactivos Coloración de gram Reactivo de Kovacs Griess Peróxido hidrógeno 3% Oxidasa
4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE ESPORAS CLOSTRIDIUM SULFITO REDUCTOR 4.1.1 Recuento en placa 1. Preparar las diluciones del homogenizado de igual que para el recuento en placa, tener cuidado de que al homogenizar no se aumente demasiado la temperatura. 2. Marcar tres (3) cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No del grupo. 3. Marcar dos (2) cajas, una como control del diluyente y otra como control del medio. 4. Pipetear en las cajas de petri 1ml de cada una de las diluciones y 1ml del diluyente en la caja marcada como control del diluyente. 5. Verter 15ml de agar SPS fundido a 45ªC en cada una de las cajas. 6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa. 7. Dejar solidificar. 8. Colocar las cajas con las tapas hacia arriba en la jara de anaerobiosis. 9. incubar a 37ªC por 48 horas. 10. Sacar las cajas y evaluar el control del medio y del diluyente. 11. Seleccionar las cajas entre 30 y 300 colonias y contar todas las colonias negras, calcular el número de esporas Clostridium sulfito reductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso de la dilución. 4.1.2. Recuento en tubo 1.
Preparar las diluciones del homogenizado de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres (3) tubos con fecha, muestra, dilución y No. del grupo. 3. Pipetear en los tubos 1ml de cada una de las diluciones. 4. Calentar en el baño serológico a 80ªC durante 10 minutos cada una de las diluciones. 5. Enfriar en un beaker con agua y hielo. 6. Verter 12 ml de agar SPS fundido a 45ªC en cada uno de los tubos. 7. Dejar solidificar. 8. Adicionar una segunda capa (de aproximadamente 3ml) de agar SPS fundido a 45ªC. 9. Dejar solidificar. 10. Incubar a 37ªC por 72 horas. 11. Seleccionar los tubos entre 30 y 300 colonias y contar todas las colonias negras, calcular el número de esporas Clostridium sulfito reductor por gramo o mililitro de alimento multiplicando por el inverso de la dilución.
4.1.3. Confirmación de las colonias de Clostridium perfringes 1. Elegir como mínimo tres (3) colonias características (negras) y sembrar cada una en tubos con caldo tioglicolato. 2. Incubar en baño setológico a 46ªC por 3-4 horas. 3. Realizar un extendido de cada uno de los cultivos y colorearlos con gram. 4. Observar al microscopio, bacilos grandes con extremos redondeados gram positivos con esporas subterminales. 5. Realizar la prueba de la catalasa a partir del cultivo de tioglicolato: tomar 3ml del cultivo y adicionarle 0.5 ml de peróxido de hidrógeno al 3%, mezclar y observar desprendimientos de burbujas de gas, lo que indica una reacción positiva. 6. Inocular a partir del cultivo de tioglicolato en SIM, caldo nitrato, agar gelatina y agar Kligler. 7. Incubar a 37ªC por 18-24 horas. 8. Considerar positivas las pruebas para Clostridium perfringes cuando se presentan los siguientes resultados: Catalasa Negativa Movilidad Negativa Nitratos Positiva Licuefacción de la gelatina Positiva Lactosa Positiva 9. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y el número de confirmadas positivas. Ejemplo: Total de colonias contadas en dilución 10-2 = 3 300 Elegidas para realizar las pruebas = 6 Colonias que resultaron positivas = 4 300 x 4 Reporte de Clostrium perfringes = = 200 bacterias / g ó ml 6 5. INVESTIGACIÓN 1. Fundamento del agar SPS. 2. Importancia de la determinación de Clostrium perfringes en alimentos. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 46
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 11: RECUENTO DE BACILLUS CEREUS 1. INTRODUCCIÓN Bacillus cereus, es un bastón aerobio esporulado, ubicuitario y habitualmente se le encuentra en alimentos crudos, secos y elaborados. Los alimentos no deben permanecer a temperatura ambiente una vez cocidos, ya que cerca del 50% de los alimentos e ingredientes alimentarios están contaminados hasta cierto punto (<10/g) por este organismo. La ingestión de alimentos que han sido conservados a temperatura ambiente después de su cocción, permite que las esporas, las cuales sobreviven la ebullición, germinen y se multipliquen a niveles altos y verter las toxinas al alimento, para que finalmente provoquen la intoxicación. (Escobar, 1994, p 147). 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de Bacillus cereus a partir de ovoproductos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Cereus según Mossel Agar Gelatina Agar Almidón Agar Citrato Simmons Agar Urea Agar SIM Caldo nitrato Caldo MR-VP Caldo MR-Glucosa (5%) Caldo MR-Xilosa (5%) Caldo MR-Arabinosa (5%) Caldo cerebro corazón * Algodón y alcohol al 70%
Reactivos Coloración de gram Reactivo de Kovacs Solución lugol Griess Alfa naftol 5% KOH 40% Rojo de metilo Peroxido hidrogeno 3% Oxidasa
4. PROCEDIMIENTO 4.1. RECUENTO DE BACILLUS CEREUS 47
Materiales* Homogenizador Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo
1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. 2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Cereus según Mossel con fecha, muestra, dilución y No. del grupo. 3. Marcar dos cajas que contienen agar Cereus según Mossel, una como control del medio y la otra como control del diluyente. 4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio agar Cereus según Mossel. 5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca. 6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC. 7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas colonias características (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares, con un halo denso a su alrededor debido a la lecitinasa). Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilución y por 10. 8. Tomar al menos tres UFC características, realizarles la prueba de la catalasa y la coloración de gram; si son catalasa positiva y a la coloración de gram se observan bastones gram positivos con extremos mas o menos cuadrados encadenas cortas o largas y entrelazadas con espora subterminal, central o elipsoidal que no deforman el cuerpo bacteriano realizar la identificación bioquímica. 4.2. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA DE BACILLUS CEREUS 1. Subcultivar tres colonias características en caldo cerebro corazón. 2. Realizar la siguientes pruebas bioquímicas:  Hidrólisis de la gelatina: Siembre dos líneas paralelas en agar gelatina e incubar a 37ª por 24 horas  Hidrólisis de almidón: Siembra dos líneas paralelas en agar almidón e incubar a 37ªC por 24 horas.  Agar Urea: Inocular el fondo por picadura y el bisel por estría e incubar 37ªC por 24 horas.  Agar Citrato Simmons: Inocular el fondo por picadura y el bisel en línea e incubar 37ªC por 24 horas.  Movilidad: Inocular el fondo (Agar SIM) por picadura e incubar 37ªC por 24 horas.  Reducción de nitratos: Caldo Nitrato  Producción acetoína: Caldo MR-VP  Fermentación de carbohidratos: Glusoca, Xilosa, Arabinosa 3. Comparar los resultados con las características bioquímicas de Bacillus cereus:  Hidrólisis de la gelatina: Zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con reactivo sublimado de Hg.  Hidrólisis de almidón: Zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con lugol.  Agar Urea: Tubos con reacción ácida (amarillos), urea-negativos.  Agar Citrato Simmons: medio de cultivo verde citrato negativo. 48
Movil: Crecimiento desplazado a través de la línea de siembra. Reducción de nitratos: Aparición de un color rojo después de agregar el reactivo Griess Producción acetoína: aparición de un color rojo luego de adicionar el alfa naftol y el hidróxido de potasio. Fermentación de carbohidratos (Glusoca, Xilosa, Arabinosa) por medio de viraje del medio a amarillo.
5. INVESTIGACIÓN 1. Fundamento del agar Cereus según Mossel. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 12: INVESTIGACIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES 1. INTRODUCCIÓN Listeria monocytogenes es un pequeño bastón de 0,5 a 2 µ, que se presenta en empalizada, no capsulado, no espurado, móvil, se multiplica a temperaturas entre 3 y 45ªC, crece a pH entre 5,6 y 9,6, se destruye por calor a 70ªC durante algunos segundos, catalasa positivo, oxidasa negativo y anaerobio facultativo (Escobar, 1994, p 224). Es un germen ubicuitario, se encuentra en el suelo, aire, vegetales, aguas residuales, afluentes, lodos, etc. El reservorio lo constituyen los mamíferos domésticos y silvestres, aves y el hombre infectados (Escobar, 1994, p 224). Se han notificado casos de listeriosis asociados a la ingestión de hortalizas contaminadas y productos lácteos en especial quesos supuestamente contaminados y leche cruda. También se ha aislado de carne y productos cárnicos. 2. OBJETIVOS 1. Realizar investigación de Listeria monocytogenes lácteos o cárnicos.
a partir de productos
3. MATERIALES Medios de cultivo Agar Mac Bride modificado Caldo de enriquecimiento EB Agar soya tripticasa (6% estrato levadura) caldo soya tripticasa (6% estrato levadura) Agar sangre Agar TSI Agar SIM Caldo MR-VP Caldo nitrato Agar Urea Caldo púrpura de bromocresol + 0.5% glusosa Caldo púrpura de bromocresol + 0.5% esculina Caldo púrpura de
Reactivos Coloración de gram Griess Peroxido hidrogeno 3%
Materiales* Homogenizador Balanza Cuchillos-cucharas
Alfa naftol 5% KOH 40% Rojo de metilo
Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo
bromocresol + 0.5% maltosa Caldo púrpura de bromocresol + 0.5% manitol Caldo púrpura de bromocresol + 0.5% ramnosa Caldo púrpura de bromocresol + 0.5% Xilosa * Algodón y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 4.1.
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO 1. 2. 3. 4.
Pesar o medir asépticamente 25 g o ml de la muestra. Agregar 225 ml de caldo de enriquecimiento EB. Homogenizar durante 1 minuto en estomacher. Incubar a 30ªC durante24 horas y reincubar hasta 7 días.
SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS 1. A partir del caldo de enriquecimiento EB aislar sobre la superficie de una placa de agar Mac Bride modificado. 2. Incubar a 37ªC durante 24 a 48 horas. 3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (las que observadas en microscopio con transiluminación oblicua se observan azuladas) y sembrar cada una en una placa de agar soya tripticasa (6% de extracto de levadura). 4. Incubar a 37ªC durante 24 a 48 horas. 5. Examinar bajo la luz oblicua, hacer Gram y catalasa a las U.F.C. típicas. 6. Comparar con los siguientes resultados: pequeños bastones gram positivos en empalizada y catalasa positivo. 7. A partir de las colonias típicas sembrar en caldo soya tripticasa (6% de extracto de levadura). 8. Incubar a 37ªC durante 24 horas para realizar pruebas bioquímicas y de fermentación.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS 1. Sembrar en Agar Urea a partir del caldo soya tripticasa (6% extracto de levadura), incubar a 37ªC durante 5 días y observar el viraje hacia un color amarillo que indica que el microorganismo no hidroliza la urea. 2. Sembrar en caldo nitrato, incubar a 37ªC durante 5 días y observar resultado negativo (no hay viraje hacia el color rojo). 3. Sembrar en agar SIM, incubar a 37ªC durante 48 horas y observar la 51
movilidad del microorganismo en forma de paraguas. 4. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, icubar a 37ªC durante 48 horas para la reacción del Voges proskauer y 5 días para el rojo de metilo (Listeria monocytogenes es MR positiva y VP positiva). 5. Sembrar en agar TSI, incubar a 37ªC durante 5 días y observar la fermentación de la glucosa y lactosa pero no la producción de gas y sulfuro. 6. Sembrar en tubos de caldo púrpura de bromocresol conteniendo 0.5% de los siguientes carbohidratos: glucosa, esculina, maltosa, manitol, ramnosa y xilosa; sembrar a 37ªC durante 7 días y observar la fermentación de la glucosa, esculina, maltosa y ramnosa por un viraje al amarillo del medio de cultivo. 7. Sembrar en agar sangre una cepa de S. aureus de manera vertical y sembrar en forma horizontal Listeria monocytogenes; incubar a 37ªC durante 24-48 horas y observar la hemólisis en la zona adyacente al S.aureus. 5. INVESTIGACIÓN 1. Fundamento del agar Mac Bride modificado. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 13: INVESTIGACIÓN DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICO 1. INTRODUCCIÓN V. parahaemolytico es un germen halófilo, gram negativo anaerobio facultativo de crecimiento rápido a temperaturas entre 15 y 43 ªC, a pH entre 5 y 9 y a concentraciones de sal entre 0.5 y 8% (Escobar, 1994, p 240). Es un enteropatógeno de origen marino. Su relación con enfermedades asociadas al consumo de alimentos fue descubierta en el Japón por Fujino en 1950 después del consumo de pescados y mariscos crudos (Escobar, 1994, p 240). 2. OBJETIVOS 1. Realizar investigación de Vibrio Parahaemolytico a partir de productos de origenmarino. 3. MATERIALES Medios de cultivo Caldo glucosa sal broth (GSTB) Agar TCBS Agar sangre
Reactivos teepol Coloración de gram
Griess Balanza Peróxido hidrogeno Cuchillos-cucharas 3% (6% Reactivo Kovacs Incubadora
Agar soya tripticasa NaCl) Agar TSI con 3% NaCl Caldo nitrato con 3% NaCl Agar SIM con 3% NaCl Caldo MR-VP con 3% NaCl Agar Hugo Leifson con 3% NaCl Agar LIA con 3% NaCl Caldo Indol con 3% NaCl Caldo soya tripticasa (0% NaCl) Caldo soya tripticasa (3% NaCl) Caldo soya tripticasa (6% NaCl) Caldo soya tripticasa (8% NaCl) Caldo soya tripticasa (10% NaCl) * Algodón y alcohol al 70%
Alfa naftol 5% KOH 40% Rojo de metilo 0.5% Oxidasa Aceite mineral
Pesar o medir asépticamente 25 g o ml de la muestra. Agregar 225 ml de caldo GSTB (glucosa sal teepol broth). Homogenizar durante 1 minuto en estomacher. Incubar a 30ªC durante18 a 24 horas.
SIEMBRA EN MEDIOS SELECTIVOS 1. A partir del caldo GSTB (glucosa sal teepol broth) aislar sobre la superficie de una placa de agar TCBS. 2. Incubar a 37ªC durante 18 a 24 horas. 3. Seleccionar al menos 3 UFC sospechosas (colonias pequeñas con centro verde azulado). 4.3.
1. Sembrar en el bisel de un tubo con agar soya tripticasa, incubar a 37ªC durante 24 horas y apartir de este cultivo realizar la prueba de oxidasa (V. parahaemolytico es oxidasa positivo). 2. Sembrar en agar TSI por picadura en el fondo y por estría en el bisel, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la fermentación de la glucosa (fondo ácido), pero no de la lactosa (bisel alcalino), ni la producción de gas y de H2S. 3. Sembrar en agar LIA por picadura en el fondo y por estría en el bisel, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la descarboxilación de la lisina (bisel y fondo alcalino). 4. Sembrar en agar nitrato, incubar a 37ºC durante 24 horas y observar la reducción de nitritos a nitratos. 5. Sembrar en agar SIM, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la movilidad positiva. 6. Sembrar en indol, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la producción de indol. 7. Inocular dos tubos de caldo MR-VP, incubar a 37ªC durante 48 horas para la reacción del Voges proskauer y 5 días para el rojo de metilo (Vibrio parahaemolytico es MR positiva y VP negativa). 8. Sembrar en dos tubos de agar Hugo Leifson por picadura profunda, agregar en uno de los tubos 1ml de aceite mineral estéril, incubar a 37ªC durante 48 horas y observar el metabolismo fermentativo 9. (cambio de color en ambos tubos de verde a amarillo) o el metabolismo oxidativo; Vibrio parahaemolytico tiene un metabolismo fermentativo con respecto a la glucosa. 10. Inocular un tubo de gelatina nutritiva a partir del TSI, incubar a 37ªC durante 1 a 7 días; refrigerar el medio durante 10 minutos, si el medio continua líquido, la gelatina es licuada, si ella se solidifica no lo es (Vibrio parahaemolytico licua rápidamente la gelatina). 54
11. Inocular un tubo con caldo soya tripticasa por suspensión, incubar en baño termostatado a 42ªC durante 24 horas y observar el crecimiento por turbidez del medio (Vibrio parahaemolytico crece a 42ªC). 12. Realizar el test de halofilismo sembrando en tubos con caldo soya tripticasa con 0, 6, 8 y 10% de NaCl, incubar a 37ªC durante 24 horas, observar el crecimiento positivo por turbidez del medio en las concentraciones de 6 y 8% de sal. 13. Sembrar en gar sangre a partir de un cultivo de soya tripticasa con 3% de NaCl, incubar a 37ªC durante 24 horas y observar la βhemólisis que se presenta como una zona transparente 5. INVESTIGACIÓN 1. Fundamento del agar TCBS. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual de técnicas y procedimientos. Programa Latinoamericano de microbiología e higiene de los alimentos. Universidad de Antioquia, Facultad de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 14: CONTROL MICROBIOLÓGICO DE CONSERVAS NO ALTERADAS. 1. INTRODUCCIÓN El enlatado (conserva) se define como la conservación de alimentos en recipientes cerrados y generalmente supone someterlos a un tratamiento térmico como principal agente que evita su alteración. El proceso térmico como método de conservación puede ser aplicado a cualquier producto alimenticio siempre que se envase en un recipiente adecuado. La principal exigencia es que el envase, una vez cerrado herméticamente no se deteriore durante la manipulación o el almacenamiento. La alteración de los alimentos que han sido sometidos a tratamiento térmico, puede ser debida a causas químicas o biológicas o a causas de ambos tipos. La alteración química más importante de los alimentos enlatados es el abombamiento por hidrógeno, consecuencia de la presión del hidrógeno liberado al actuar el ácido de un determinado alimento sobre el hierro de la lata. La acidez de los alimentos enlatados es importante para determinar el tratamiento térmico necesario para conseguir su esterilización y el tipo de alteración a esperar en caso de que el tratamiento térmico se insuficiente o de que se produzcan fugas. 2. OBJETIVOS 1. Realizar el control microbiológico a conservas no alteradas. 3. MATERIALES Medios de cultivo Infusión cerebro corazón
Reactivos Coloración de gram Parafina esteril Almidón Agua tibia
.. Algodón y alcohol al 70% 56
Materiales* Abrelatas Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Asa bacteriológica Cajas de petri Tubos estériles Toallas desechables
4. PROCEDIMIENTO 4.1. PRE-INCUBACIÓN 1. Retirar las etiquetas de las latas (en caso de tenerlas). 2. Lavar bien las latas con agua tibia jabonosa y escobillones en caso de ser necesario. 3. Enjuagar con agua tibia. 4. Secar las latas con toallas de papel desechables. 5. Envolverlas en papel filtro o en toallas desechables con el fin de descubrir microfugas durante el período de preincubación. 6. Marcar las latas con el No de identificación, fecha y temperatura de preincubación. 7. Incubar una lata a 35ªC y la otra a 55ªC durante 10 días. 8. Agitar en invertir la posición de las latas diariamente. 9. Observar todos los días con el fin de descubrir microfugas y abombamiento, si una lata presentase microfugas o abombamientos, se debe examinar inmediatamente. 4.2. PREPARACIÓN DE LAS LATAS PARA SU ANALISIS 1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo y las latas a analizar. 2. Flamear rápidamente la parte a ser abierta, en el caso de estar las latas abombadas tomar precauciones para evitar un peligro. 3. Abrir las latas con ayuda de un abrelatas, preferiblemente en un cubículo o campana aséptica; no se debe abrir la lata por la tapa del fondo, donde lleva impresa su fecha de vencimiento. 4. Cubrir inmediatamente con la base de una placa de petri la superficie expuesta al aire. 4.3. ANALISIS DEL CONTENIDO DE LA LATA 1. Pesar 2 gramos de cada lata, tomando de todas las partes del contenido a fin de que la muestra sea representativa. 2. Disponer de 6 tubos con caldo Cerebro Corazón adicionado de almidón al 0.1% para las latas incubadas a 35ªC y 6 tubos para la lata incubada a 55ªC. 3. Adicionar los 2 gramos de cada lata en cada uno de los tubos con caldo cerebro corazón adicionado de 0.1% de almidón. 4. Verter una capa de 1cm de parafina estéril en seis tubos (tres de las latas a 35ªC y tres de las latas a 55ªC), con el fin de crear condiciones de anaerobiosis. 5. Incubar los seis tubos de la lata a 35ªC y los seis tubos de la lata a 55ªC (tres en aerobiosis y tres en anaerobiosis) durante 72 horas. 6. Observar si hay desarrollo microbiano que se evidencia por turbidez en el tubo. 7. Considerar que el producto es estéril comercialmente o satisfactorio, cuando máximo un tubo en aerobiosis muestra desarrollo. (sinembargo 57
si esto ocurre mejorar la asepsia durante las manipulaciones. 8. Hacer un frotis directo del producto, desengrasar si es necesario con xilol. 9. Efectuar coloración de gram en el producto para determinar el tipo de gérmenes presentes. 10. Contar el número de células bacterianas por campo; un número elevado, indicará malas condiciones de higiene durante su proceso o la utilización de materias primas muy contaminadas. 4.4. PRUEBAS ADICIONALES 1. 2. 3. 4.
Evaluar el color, olor, aspecto y pH del producto. Vaciar el contenido del producto. Lavar la lata en la estufa a 37ªC para secarla. Observar si tiene o no la capa protectora.
5. INVESTIGACIÓN 1. Criterios de clasificación de las conservas. 2. ¿Cuáles son las causas de alteraciones biológicas en las conservas? 3. Clases de alteraciones físicas y químicas en las conservas. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Programa de Microbiología e higiene de los alimentos. Medellín, Universidad de Antioquia, Facultad Nacional de salud pública “Hector Abad Gómez”, 1990. ca. 150h. QW85 E8-90. 2. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador.
Grupo 1: 2 conservas de atún Grupo 2: 2 conservas de salchicha Grupo 3: 2 conservas de frutas Grupo 4: 2 conservas de verduras Grupo 5: 2 conservas mixtas (animal y vegetal) NOTA: las dos conservas deben de la misma marca y de la misma presentación y contenido.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 15: RECOLECCIÓN DE MUESTRAS DE AGUA PARA ANÁLISIS BACTERIOLÓGICO 1. INTRODUCCIÓN El agua es un elemento fundamental para la vida, tanto del hombre como de los animales y las plantas. Basta decir que sin ella, no habría vida en este planeta. El agua químicamente pura es un líquido muy escaso y difícil de obtener debido a que es un solvente casi universal y en el cual son soluble la mayoría de las sustancias. Por esta propiedad, el agua se contamina frecuentemente con las sustancias con las que entra en contacto. Son muy pocas las operaciones industriales o de ingeniería que se pueden realizar con buenos resultados si no se cuenta con adecuados equipos para obtener aguas a condiciones dadas de calidad. Es de importancia tener conocimiento a cerca de las condiciones microbiológicas de las aguas que sirven como abastecimiento para las diferentes necesidades de una población, para evitar así contaminaciones ambientales y problemas de salud publica. Según el Ministerio de Salud al agua potable se le realizan las siguientes determinaciones microbiológicas: Coliformes Totales y Fecales por el método de sustrato definido o de filtración por membrana (Decreto 475 de marzo 10 de 1998). 2. OBJETIVOS 1. Realizar la toma de muestras de agua del grifo, pozo, piscina y envasada. 2. Conocer el fundamento de las técnicas de filtración por membrana y del sustrato definido. 3. Determinar la presencia de coliformes totales o fecales por el método de filtración por membrana o del sustrato definido. 4. Realizar el conteo teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la calidad del control. 3. MATERIALES Medios de cultivo
Reactivos Tiosulfato sodio 0.01N
* Algodón y alcohol al 70% 59
Materiales* Frasco o bolsas estériles Refrigerador portatil
Las muestras para análisis bacteriológico se deben tomar en frascos que se hayan lavado con extremo cuidado, enjuagados con agua limpia y esterilizados por lo menos 60 minutos a una temperatura de 170ªC. Es necesarios evitar que la parte baja de la tapa y la boca del frasco no toquen cosa alguna que pueda contaminarla muestra. 4.2.
Los frascos que se destinen para la recolección de muestras de agua con cloro residual deben llevar un agentes declorador (0.5 ml de tiosulfato de sodio 0.01 N por cada 100 ml de agua); su presencia en una muestra de agua clorada en el instante de la recolección, neutraliza cualquier cloro residual y evita que con esto prosiga la acción bactericida del cloro durante el tiempo que la muestra se encuentre en tránsito al laboratorio, en tales condiciones es probable que el examen bacteriológico indique el verdadero contenido bacteriano de la muestra en el momento del muestreo. 4.3.
El examen bacteriológico de las muestras de agua se deben iniciar inmediatamente después de su recolección, sin embargo, muy raras veces se puede proceder así y se deben establecer normas mas prácticas. El tiempo permisible entre la captación de la muestra y el examen bacteriológico no debe ser mayor de 6 horas para aguas muy contaminadas y de 12 para aguas relativamente puras. En ningún caso ese lapso debe exceder las 36 horas. En el período que transcurre entre la recolección y el examen, se debe mantener la temperatura de la muestra entre 6 y 10ªC (refrigeración, no congelación). Para lograr estas condiciones, en el transporte se introducen los frascos con las muestras en un termo o nevera de icopor con bolsas de hielo. Es importante que al refrigerar las muestras se tomen precauciones y medidas para prevenir cualquier contaminación proveniente del hielo derretido. 4.4.
Captación de las muestras
4.4.1. Muestras de grifo o llaves 1. Observar que el grifo no presente escapes de agua. 2. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación: tipo de muestra, fecha hora 3. Abrir el grifo y dejar correr agua durante 2 o 3 minutos para eliminar impurezas y agua acumulada en el interior de la cañería. 60
4. Restringir el flujo de la llave para recoger el agua sin salpicaduras. 5. Destapar el frasco e iniciar la recolección de la muestra hasta las ¾ partes del frasco. 6. Tapar el frasco, refrigerar y enviar al laboratorio lo más pronto posible. 7. Nota: si se diera el caso que muestras sucesivas del mismo grifo tengan coliformes, entonces este deberá ser desinfectado con una solución de hipoclorito para eliminar cualquier foco de contaminación externa; en este caso el laboratorio suministrará la información pertinente. 4.4.2. Muestras de Ríos, Arroyos, Lagos 1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación: tipo de muestra, fecha hora. 2. Sumergir rápidamente el frasco tapado debajo de la superficie del agua (15-20 cm) para evitar recolectar materia flotante. 3. Destapar e invertir el frasco para que la boca quede ligeramente hacia arriba y en sentido opuesto a la corriente (sostener con una mano por su parte posterior, formando con la horizontal un ángulo de 45ª). 4. Mover el frasco lentamente en contra de la corriente mientras entra el líquido para evitar que el agua que toca la mano entre en el frasco. 4.4.3. Muestra de agua de pozo con bomba 1. Dejar funcionando la bomba por lo menos una hora antes de captar la muestra. 2. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación: tipo de muestra, fecha hora. 3. Tomar las muestras en la descarga libre de la bomba o en algún grifo colocado para este fin siguiendo las instrucciones (4.4.1) 4.4.4. Muestra de agua de pozo sin bomba Es una muestra muy difícil de recolectar, debe hacerse con muchas precauciones para que el examen bacteriológico tenga significado alguno, pero por lo peligros de contaminación externa, los exámenes bacteriológicos de las aguas de esta clase de pozo, no tienen mucho significado. 1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación: tipo de muestra, fecha hora. 2. Atar un cordel al cuello del frasco. 3. Destaparlo en la superficie e inmediatamente sumergirlo con cuidado, evitando que toque las paredes del pozo. 4. Llenar el frasco, sacarlo y taparlo inmediatamente. 5. Refrigerar y enviar al laboratorio lo más pronto posible. 4.4.5. Muestra de agua de estanque 1. Rotular el frasco recolector de la muestra con la siguiente identificación: tipo de muestra, fecha hora 61
Tomar el frasco por su parte inferior con una mano. Invertir el frasco boca abajo. Sumergir a una profundidad de 30 cm. Destapar el frasco. Invertir el frasco boca arriba, hasta que quede inclinado formando un ángulo de 45ª. 7. Desplazar el frasco para crear una corriente que permita llenarlo hasta las ¾ partes. 8. Sacar el frasco y taparlo. 9. Refrigerar y enviar al laboratorio. 4.5.
El volumen de la muestra debe ser el suficiente para verificar todas las pruebas que se requieran, de preferencia alrededor de 300ml. 5. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, Espeña, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Aálisi Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 6. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: 200 mL de agua de grifo. Grupo 2: 200 ml de agua envasada. Grupo 3: 200 mL de agua de pozo. Grupo 4: 200 mL de río. Grupo 5: 200 g de agua de pozo con bomba.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 16: CUATIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE FILTRACIÓN POR MEMBRANA 1. INTRODUCCIÓN La técnica de filtro de membrana (FM) es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numéricos más rápidos que los métodos de los tubos múltiples. Esta es extraordinariamente útil para controlar posibles situaciones de emergencia en elación con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales. Sin embargo esta técnica tiene limitaciones sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contenga bacterias no coliformes. Para esta agua, y también en caso de que no se haya utilizado anteriormente la técnica de filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la técnica de fermentación en tubos múltiples para demostrar la aplicabilidad y comparación de aquella. (Estándar Methods, 17 ed). 2. OBJETIVOS 1. Conocer el fundamento de la técnica de filtración por membrana. 2. Sembrar muestras líquidas por medio de la técnica de filtración por membrana. 3. Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, después de evaluar la calidad del control. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Agar Chromocult Coloración de gram Reactivo de Kovacs Agua esteril Tiosulfato sodio 0.01N
Materiales* Equipo de filtración por membrana estéril Membranas de acetato de celulosa (0,45µ) Pinzas de punta lisa Incubadora tijeras Toallas desechables Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Frasco o bolsas estériles Probeta esteril
4. PROCEDIMIENTO 1. Abra el paquete que contiene el filtro de membrana estéril, tome el filtro de membrana con la pinza y colóquelo con la trama hacia arriba sobre la placa porosa del aparato. 2. Coloque cuidadosamente el embudo sobre el receptáculo y ajuste herméticamente el embudo a la base o receptáculo. Asegúrese de que la llave esté cerrada. 3. Tome la muestra y agítela fuertemente por unos segundos. 4. Mida el volumen de la muestra apropiado (100ml) usando una probeta estéril. 5. Vierta la muestra de agua dentro del embudo del portafiltro y filtre aplicando vacío parcialmente. 6. Luego de filtrar la muestra cierre la llave y asegúrese que la membrana no quede muy seca para evitar que se rasgue. 7. Adicione 30 ml de agua estéril por tres veces y filtre aplicando vacío a través de la membrana. 8. Tras el enjuagado y la desconexión del vacío en el proceso de filtrado, desbloquee y retire el embudo. 9. Inmediatamente retire el filtro de membrana con unas pinzas estériles. 10. Adhiera la membrana sobre una placa con agar Chromocult, haciendo un movimiento de rotación para evitar que quede aire atrapado. 11. Introduzca una muestra de agua estéril pare el lavado, comprobando posibles contaminaciones. 12. Incube las muestras de agua y la membrana de control a una temperatura de 35ªC durante 22 a 24 horas. 13. Realizar la lectura de los resultados. 5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Lectura: Las colonias de E.coli presentarán una coloración azul violeta oscura, los coliformes totales presentarán colonias rojas y colonias azul violeta oscuro, mientras que otras enterobacterias que pueden crecer en este medio de cultivo presentarán colonias incoloras. Repórtese las colonias contadas como UFC de coliformes totales o fecales. Tenga en cuenta para el recuento membranas que contengan entre 20 y 80 UFC de coliformes totales y no más de 200 UFC por membrana de todos los tipos de microorganismos que puedan crecer. Comprobación o confirmación de coliformes fecales: Cubrir las colonias coloreadas de azul violeta oscuro con una gota del reactivo de Kovacs, una coloración roja del reactivo al cabo de aproximadamente un minuto indica la formación positiva del indol. 64
Cuando se filtran volúmenes mayores de muestra (100ml) corrija el resultado de la siguiente forma: UFC de Coliformes /100ml = UFC de Coliformes contadosx100 ml de muestra de agua Repórtese como de Recuento de Coliformes Totales/100ml para el recuento de coliformes comprobados, tenga en cuenta el recuento inicial y el % de comprobación positivo, para ello aplique la siguiente fórmula: % coliformes verificados= Número de UFC comprobados ___x100 Número total de UFC presuntivas En las aguas potables o de buena calidad el recuento de estos microorganismos es mínimo, por lo tanto se deberán contar todas las UFC de coliformes, sin tener en cuenta el límite inferior de 20. Si aparece un crecimiento difuso o congruente que cubre toda la membrana o una buena parte de ella y las UFC no están separadas entre sí, se reporta como crecimiento congruente o difuso, con o sin coliformes. Se pedirá otra muestra que debe ser tomada del mismo lugar, al hacer el análisis nuevamente de la muestra de 100ml se deberá dividir en dos alícuotas de 50 ml para evitar el sobrecrecimiento. Si el número total de UFC supera los 200 o si las colonias no están separadas para permitir su conteo, se deberá comunicar este resultado como muy numeroso para el recuento. La dudosa presencia de coliformes se puede confirmar colocando la membrana en caldo lactosa bilis verde brillante, otra alternativa es raspar la membrana bien sea con un asa o un escobillón e inocular en el tubo con caldo lactosado verde brillante. Si este cultivo produce gas en 48 horas a temperatura de 35ºC mas o menos0.5ªC se comunicará la presencia de coliformes. Para aguas de calidad diferente a la potable al igual que sucede si ninguna membrana tiene recuentos dentro de los parámetros ideales, realice un recuento total de coliformes en todas las membranas y reporte como recuento en 100 ml por ejemplo si se han analizado porciones en dos membranas y se encuentran cinco y tres colonias respectivamente, se reportará un recuento de 8 colonias/100ml, es decir: = (5+3) x 100 (50 + 50) De la misma forma si se han estudiado porciones de 50, 25 y 10 ml y el recuento ha sido 15, 6 y menos de una colonia de coliformes, repórtese un recuento de 25/100ml. 65
6. BIBLIOGRAFIA 1. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual Técnico y Procedimientos. Programa latinoamericano de Microbiología e Higiene de los Alimentos. Facultad Nacional de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Universidad de Antioquia. Medellín, 1994. 2. MERK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania, 1994.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 17: NUMERO MÁS PROBABLE DE PSEUDOMONA AERUGINOSA 1. INTRODUCCIÓN El género Pseudomona y los otros gram negativos no fermentativos (Alcalígenes, Alteromonas, Flavobacterium, Acrhromobacter Moraxella) son bacilos o diplobacilos, gérmenes ubicuitarios, carga norma del suelo, aguas dulces y marinas y vegetales (frutas y legumbres), etc. Son aerobios facultativos, móviles por un flagelo polar (monotricos) o inmóviles, con raras excepciones son oxidasa positiva, tienen un metabolismo estrictamente respiratorio (oxidativo) y no fermentativo; ciertas especies pueden atacar la glucosa y otros glúcidos por vía oxidativa. Crecen en medios simples a temperaturas de 30ªC, produciendo pigmentos en la mayoría de los casos (Escobar, 1994, p 251). En el medio hospitalario se comporta como oportunista, produciendo infecciones y hasta septicemias, son carga norma del muchos alimentos produciendo alteración en los mismos, su presencia en aguas recreacionales puede causar problemas de infecciones como conjuntivitis, otitis, etc. (Escobar, 1994, p 251). 2. OBJETIVOS 1. Determinar el NMP de Pseudomona aeruginosa en muestras de agua envasada o de piscina. 3. MATERIALES Medios de cultivo Caldo casoy doble concentración Caldo casoy concentración simple Agar cetrimide
Reactivos Oxidasa
Materiales* Incubadora
Solución amortiguadora Pipetas 1 y 10mL fosfato pH 7.2 Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Lámpara luz UV
4. PROCEDIMIENTO 1. Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene la muestra de agua a analizar. 2. Mezclar muy bien la muestra. 3. Adicionar la muestra de agua así:  10ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy a doble concentración.  1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy a concentración simple.  1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno de caldo casoy a concentración simple, a partir de una dilución 1:10 de solución buffer fosfato pH 7,0. 4. Mezclar e incubar por 24 horas a 37ªC. 5. Anotar los tubos que presentan crecimiento positivo (turbidez). 6. Confirmar la presencia de Pseudomona aeruginosa mediante un repique de todos los tubos positivos al agar cetrimide. 7. Incubar a 37ªC por 24 horas. 8. Confirmar la presencia de Pseudomona aeruginosa realizando la prueba de la oxidasa: colocar una colonia en la tirilla, adicionar una gota de agua destilada estéril y leer en los 60 segundos siguientes. La aparición de un color morado o azul indica prueba de oxidasa positiva. 9. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento en el agar cetrimide por formación de un pigmento verde azulado, además el olor a frutas característico y la prueba de la oxidasa positiva. 10. Buscar en la tabla correspondiente y expresar el resultado como NMP de Pseudomona aeruginosa/ 100 ml de agua. 5. INVESTIGACIÓN 1. Importancia de la determinación de Pseudomona aeruginosa en aguas envasadas. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ESCOBAR DUQUE, María Beatriz. Manual Técnico y Procedimientos. Programa latinoamericano de Microbiología e Higiene de los Alimentos. Facultad Nacional de Salud Pública Héctor Abad Gómez. Universidad de Antioquia. Medellín, 1994. 3. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 4. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 68
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 18: PRESENCIA-AUSENCIA DE COLIFORMES EN MUESTRAS DE AGUA (METODO DEL SUSTRATO DEFINIDO) 1. INTRODUCCIÓN La prueba de presencia-ausencia de coliformes es una sencilla modificación del procedimiento de fermentación en tubos múltiples. La simplificación que se deriva de utilizar una sola porción grande (100ml) en un solo frasco de cultivo para obtener una información cualitativa sobre la presencia-ausencia de coliformes, se justifica por la teoría de la falta de esos microorganismos en una muestra de agua potable de 100ml (Escobar, 1994, p 331). La prueba de presencia-ausencia proporciona además una oportunidad opcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otros indicadores (coliformes fecales, Pseudomonas, Streptococcus fecales y Clostridium), también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un mayor número de muestras por unidad de tiempo y de hacer estudios comparativos con el procedimiento de filtro de membrana, que indica que la prueba de presencia-ausencia puede aumentar al máximo la detección de coliformes en muestras que contienen microorganismos que podrían sobre pasar en su crecimiento al de loas colonias de coliformes, provocando problemas para su detección (Escobar, 1994, p 331). La prueba de presencia-ausencia se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los sistemas de distribución o en las plantas de tratamiento de aguas. En principio, se estudian alrededor de 100 muestras por el método de filtro de membrana, además de la prueba de presencia-ausencia. Una vez establecido que los métodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para coliformes, se puede utilizar únicamente la prueba de presencia-ausencia. Cuando una muestra produce un resultado positivo en esta prueba, se estudiarán las posteriores muestras repetidas mediante un método cuantitativo, hasta que se vuelvan a obtener resultados negativos en dos muestras consecutivas (Escobar, 1994, p 331). 2. OBJETIVOS 1. Determinar coliformes totales y fecales en una muestra de agua a través de la prueba de presencia-ausencia( sustrato definido) 69
3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Caldo LMX / Fluorocult / Reactivo de Kovacs Readicult / Collilert
Materiales* Bolsas de polipropileno Incubadora Lámpara luz UV Asa bacteriológica Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Pipetas 1 y 10mL
* Algodón y alcohol al 70% 4. PROCEDIMIENTO 1. Inocular 100ml de la muestra de agua en el frasco o bolsa estéril. 2. Adicionar el medio de cultivo deshidratado si se trata de materiales listos para usar (Readicult, Collilert); 3. Mezclar vigorosamente para obtener una buena homogenización de la muestra con el medio. 4. Incubar a 37ªC durante 18-24 horas. 5. Realizar la lectura del crecimiento comparando con los siguientes resultados:  Coloración verde (amarillenta) del medio con precipitado o material flotante: presencia de coliformes totales.  Fluorescencia a la luz UV: presencia de coliformes fecales (E.coli). 6. Reportar como presencia o Ausencia de coliformes totales o E.coli / 100mlde agua. 5. INVESTIGACIÓN 1. Fundamento de la prueba de presencia-Ausencia. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, Espeña, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 70
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 19: PRUEBA DEL TIEMPO DE REDUCCIÓN DEL AZUL DE METILENO (T.R.A.M.) 1. INTRODUCCIÓN Cuando se agrega una pequeña cantidad de azul de metileno a la leche , se le mezcla e incuba a 37ªC, sobreviene una decoloración debida al metabolismo bacteriano, es rapidez de decoloración es directamente proporcional al número de gérmenes presentes (Escobar, 1994, p 289). La mayoría de microorganismos son capaces un su multiplicación de modificar el potencial de oxido-reducción de la leche, razón suficiente para transformar el azul metileno en un compuesto incoloro (Escobar, 1994, p 289). 2. OBJETIVOS 1. Realizar la prueba de tiempo de reducción del azul de metileno a muestras de leche cruda, pasteurizada o hervida de diferente procedencia. 3. MATERIALES Medios de cultivo
Reactivos Azul de metileno (0.5%)
Materiales* Homogenizador Baño serológico Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Gradilla Tubos de ensayo
4. PROCEDIMIENTO 1. 2. 3. 4. 5.
Agitar muy bien la muestra de leche Depositar en un tubo tapa rosca 10 ml de la muestra de leche. Adicionar 1ml de la solución de azul de metileno 0.5%. Tapar el tubo y mezclar. Incubar en el baño serológico a 37ªC y observar la muestra cada 30 minutos, agitando el contenido en cada lectura. 6. Anotar el tiempo de decoloración del azul de metileno. 71
5. INVESTIGACIÓN 1. La relación existente entre el tiempo de reducción del azul de metileno, la calidad de la leche y la carga bacteriana. 2. Factores que influyen en la reducción del azul de metileno. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, Espeña, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 20: MICROBIOLOGÍA DE LECHE Y DERIVADOS 1. INTRODUCCIÓN La leche es el producto de secreción de origen animal y sus cualidades sanitarias están influenciadas por muchos factores que intervienen en su curso de producción, elaboración y entrega al consumidor. Las características nutritivas de ésta y de sus productos los convierte en alimentos deseables al consumidor, además de que estos mismos valores nutritivos facilitan la proliferación de muchos microorganismos, los cuales pueden ocasionar cambios indeseables en el producto. Los microorganismos y los subproductos son indeseables en la leche y derivados si son capaces de alterar las características organolépticas, produciendo enfermedades o si indican manejo descuidado o antihigiénico del producto. Las decoloraciones, la viscosidad, la putrefacción, la rancidez, la gaseosidad y muchos otros defectos están causados por diversos microorganismos que crecen en productos lácteos. Los análisis microbiológicos que se le deben practicar a la leche y derivados se encuentran consignados en el Decreto 2437 de agosto 30 de 1983 emanado del Ministerio de Salud, los cuales abarcan los siguientes: LECHE HiGIENIZADAS O PASTEURIZADA: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales y Fecales. LECHE EN POLVO: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras, Bacillus cereus, Salmonella y determinación de Esporas de Clostridium sulfito reductor. LECHE ULTRAPASTEURIZADA: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y anaerobios, Coliformes Totales y Fecales. (Decreto 476/98). YOGURT O KUMIS: Coliformes Totales, Fecales, recuento de mohos y levaduras. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). HELADOS: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). CREMA DE LECHE PASTEURIZADA: Coliformes Totales, Fecales, recuento de mohos y levaduras, Staphylococcus aureus coagulasa positiva y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). 73
AREQUIPE: Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Coliformes Totales, Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). QUESO FRESCO: Coliformes Fecales, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras y Salmonella. (Resoluciones: 2310/86, 1804/89, 11961/89). A las leches crudas o pasteurizadas se les puede realizar la prueba de tiempo de reducción del azul de metileno con el fin de determinar de una forma rápida su calidad y conocer de una manera aproximada su carga bacteriana. 2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, colifomes totales y fecales a partir de leche hervida. 2. Determinar coniformes fecales, Recuento de mohos y levaduras y Recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de queso fresco. 3. Realizar recuento de mesófilos aerobios y facultativos viables, coniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de arequipe. 4. Realizar pruebas microbiológicas al yogurt y suero costeño elaborados en la granja de Berástegui. 5. Realizar la prueba del tiempo de reducción del azul de metileno a leches de diferente calidad y procedencia. 3. MATERIALES Medios de cultivo Bilis verde brillante lactosa con durham A. EMB Agua peptona 0.1% Agua triptona Agar Baird –Parker Agar Hecktoen Agar BPLS Caldo tetrationato de sodio Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusión cerebro corazón Agar plate count Agar Ogy * Algodón y alcohol al 70%
Reactivos Coloración de gram
Reactivo de Kovacs Plasma fresco Griess Alfa naftol KOH 40% Rojo de metilo Peroxido hidrogeno 3% Azul de metileno (0.5%)
Balanza Cuchillos-cucharas Incubadora Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIÓN 1. Consecuencias fermentados
6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD DE COLOMBIA. Decreto 3075. Norma sobre manipuladores, 1997. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: 200 mL de leche hervida. Grupo 2: 200 g de queso fresco. Grupo 3: 200 mL de suero costeño. Grupo 4: 200 mL de arequipe. Grupo 5: 200 g de yogurt.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 21: MICROBIOLOGÍA DE CARNICOS 1. INTRODUCCIÓN La carne es, tanto por su valor nutritivo como su valor sensorial, uno de los alimentos más importantes para el hombre. Es el alimento básico para cubrir las necesidades de proteínas de alta calidad. La carne como material biológico, es una materia prima muy delicada. La calidad de los productos obtenidos de ella depende tanto de los animales de abasto como del proceso de la materia prima a partir de éstos, así como de su procesado, y distribución hasta el consumidor. Además, la tecnología tiene que tener en cuenta las características biológicas y los cambios que acontecen en ésta durante su obtención y procesado así como las exigencias higiénicas para un aprovechamiento óptimo de la carne. Tras la producción de carne, la obtención de ésta y su procesado tienen también una gran importancia económica. Además de una óptima obtención y procesado de la carne exigen un alto estándar higiénico, para poder ofrecer al consumidor carne y productos cárnicos que se pongan en riesgo sanitario mínimo, por ello la higiene, tiene que estar completamente integrada en la moderna tecnología de los alimentos. Los análisis microbiológicos practicados a los productos cárnicos procesados según el Decreto 2162 /83 y el 2131/97 son los siguientes: 
Cárnicos cocidos: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigación de Salmonella e investigación de Listeria monocytogenes. Cárnicos crudos madurados o ahumados: NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigación de Salmonella e investigación de Listeria monocytogenes. Cárnicos crudos: NMP de coliformes fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de esporas Clostridium sulfito reductor, investigación de Salmonella.
2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, coniformes totales y fecales a partir de productos cárnicos. 76
2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de productos cárnicos. 3. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de productos cárnicos. 3. MATERIALES Medios de cultivo Bilis verde brillante lactosa con durham A. EMB A. leche Agua peptona 0.1% Agua triptona Agar Baird –Parker Agar Hecktoen Agar BPLS Caldo tetrationato de sodio Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusión cerebro corazón Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina * Algodón y alcohol al 70%
Reactivo de Kovacs Plasma fresco Griess Alfa naftol KOH 40% Rojo de metilo Peroxido hidrogeno 3% Oxidasa
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIÓN 1. Importancia de la investigación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis 77
Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: Cárnicos crudos: 200 g de Chorizo o carne fresca Grupo 2: Cárnicos crudos: 200 g de Hamburguesa. Grupo 3: Cárnicos Escaldados: 200 g de Salchicha. Grupo 4: Cárnicos Ahumados: 200 g de Salchichón Grupo 5: Cárnicos Cocidos: 200 g de Morcilla ó butifarra
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 22: MICROBIOLOGÍA DE OVOPRODUCTOS 1. INTRODUCCIÓN Los huevos tienen una vida muy corta, puesto que tienden a descomponerse rápidamente o a ser alimento de numerosos microorganismos, entre ellos la Salmonella. Con el fin de prolongar la conservación de los huevos evitando a la vez su cont6aminación microbiana, se someten a diversos procesos industriales, con lo que se convierten en ovoproductos. Los ovoproductos se pueden obtener a partir de huevos sin cáscara; Estos ovoproductos tienen que ser pasteurizados a una temperatura menor de 65ªC durante un tiempo menor de 4 minutos. Los análisis microbiológicos que se le realizan a lo derivados del huevo son los siguientes: 
Mayonesa: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de Bacillus cereus, recuento de mohos y levaduras e investigación de Salmonella. (Resolución 17882/85). Pastas alimenticias al huevo: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, Recuento de Bacillus cereus, recuento de mohos y levaduras, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor e investigación de Salmonella. (Resolución 4393/91) Sabajón: Mesófilos aerobios facultativos viables, NMP de coliformes totales y fecales, recuento de estafiloccos coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras e investigación de Salmonella. (Invima)
2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, mohos y levaduras, coliformes totales y fecales a partir de ovoproductos. 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de ovoproductos. 3. Realizar recuento de Bacillus cereus a partir de ovoproductos. 79
3. MATERIALES Medios de cultivo Bilis verde brillante lactosa con durham A. EMB A. leche Agua peptona 0.1% Agua triptona Agar Baird –Parker Agar Hecktoen Agar BPLS Caldo tetrationato de sodio Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusión cerebro corazón Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina Agar Cereus según Mossel Agar almidón Caldo MR-Glucosa (5%) Caldo MR-Xilosa (5%) Caldo MR-Arabinosa (5%) Agar SIM * Algodón y alcohol al 70%
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIÓN 1. Cuáles son los riesgos microbiológicos por el consumo de las aves y los derivados del huevo. 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis 80
Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1y 2: Mayonesa Grupo 3 y 4: Pastas alimenticias al huevo Grupo 5: Sabajón
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 23: MICROBIOLOGÍA DE PESCADOS Y MARISCOS 1. INTRODUCCIÓN Los productos como pescados y mariscos contienen gran cantidad de sustancias nutritivas, en las cuales priman las proteínas y son muy escasos los carbohidratos razón por la cual es muy fácil que las bacterias procedan a descomponer las sustancias nitrogenadas de este produciendo colores, sabores y olores desagradables, haciendo al producto inconsumible. Según las normas nacionales (Invima) a los pescados y mariscos se le realizan las siguientes determinaciones microbiológicas: Pescado fresco y congelado, incluido el congelado en el mar, bloques de pescado picado o no y moluscos antes del consumo (peligrosidad reducida): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. Pescado de agua dulce (peligrosidad reducida): Recuento de mesófilos (para determinar vida útil), coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. Productos empanados, precocidos incluyendo porciones “dedos” y pasteles de pescado, normalmentese cocinan antes del consumo (peligrosidad escasa): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. Gambas, langostinos, mariscos congelados crudos, normalmente se consumen tras la descongelación, pero pueden consumirse tras una demora impredecible (peligrosidad escasa): Coliformes fecales, Staphylococcus aureus, Salmonella y Vibrium. 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, coliformes fecales a partir de pescados y mariscos. 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella y Vibrium a partir de pescados y mariscos. 3. Conocer las normas del comercio internacional que existen para productos marinos. 82
3. MATERIALES Medios de cultivo Bilis verde brillante lactosa con durham A. EMB Agua peptona 0.1% Agua triptona Agar Baird –Parker Agar Hecktoen Agar BPLS Caldo tetrationato de sodio Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusión cerebro corazón Agar Plate count Agar TCBS Caldo soya tripticasa * Algodón y alcohol al 70%
Reactivo de Kovacs Plasma fresco Griess Alfa naftol KOH 40% Rojo de metilo Oxidasa
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar 5. INVESTIGACIÓN 1. ¿Cuales son las principales enfermedades transmitidas por alimentos que se pueden contraer por el consumo de productos marinos crudos contaminados? 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 83
7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador.
Grupo 1: Pescados de agua dulce = 200 g Grupo 2: Pescado de agua salada = 200 g Grupo 3: productos empanados, precocidos (dedos, pasteles) = 200 g Grupo 4: Mariscos (camarón, langostas) = 200 g Grupo 5: Moluscos (ostras, mejillones, caracol): 200 g
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 24: MICROBIOLOGÍA DE FRUTAS Y HORTALIZAS 1. INTRODUCCIÓN Las frutas son alimentos muy saludables ya que poseen generalmente muy poca grasa y muchas vitaminas y fibra, lo cual las hace indispensable en la dieta, supliendo estas, los requerimientos que otros alimentos no pueden proporcionar, haciendo parte de una dieta integral y equilibrada. Contrario de lo que sucede en la mayoría de los alimentos, las frutas continúan con su proceso de respiración después de la recolección, generando esto una serie de "alteraciones", que en muchos casos vienen precedidas de una mala recolección, clasificación y/o almacenamiento, reflejándose esto en el desarrollo de podredumbres, hecho que no favorece la comercialización, la economía y la calidad del producto. Por otra parte los cultivos frutales están a la intemperie, lo cual los pone en contacto con una gran cantidad de factores (agua de riego, polvo, insectos, pájaros, etc.) que son de vital importancia al momento de determinar la carga microbiana de las frutas. Según el Invima a las frutas y derivados se les realizan las siguientes determinaciones microbiológicas: Pulpas de frutas congeladas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas pasteurizadas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas ultrapasteurizadas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas concentradas con dos o más frutas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Pulpas de frutas azucaradas (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, coliformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. 85
Frutas en almíbar (Resolución 7992 de junio 21-91): Recuento de mesófilos aerobios, oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Mermelada de frutas (Resolución 15789/84): Recuento de mesófilos aerobios, oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. Jalea de frutas (Resolución 15789/84): Recuento de mesófilos aerobios, oniformes totales y fecales, recuento de mohos y levaduras y esporas de Clostridium sulfito reductor. 2. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, oniformes totales y fecales a partir de frutas. 2. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de frutas. 3. Realizar recuento de mohos y levaduras a partir de pulpas de frutas. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Bilis verde brillante lactosa Coloración de gram con durham A. EMB Reactivo de Kovacs A. leche Peroxido hidrogeno 3% Agua peptona 0.1% Agua triptona Agar ogy Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina Caldo nitrato Agar kligler  Algodón y alcohol al 70%
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIÓN 1. ¿Por qué en las frutas y derivados no se investigan estafilococos salmoneras? 86
¿Cuáles son los patógenos de importancia en las frutas y derivados?
6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, Espeña, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Aálisi Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: Pulpa de fruta congelada: 200 g. Grupo 2: Pulpa de fruta azucarada: 200 g. Grupo 3: Néctar de frutas: 200. Grupo 4: Mermelada: 200 g. Grupo 5: Frutas en almíbar: 200 g.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 25: MICROBIOLOGÍA DE CEREALES Y PANIFICACIÓN 1. INTRODUCCIÓN Los cereales son las semillas de ciertas gramíneas y en conjunto constituyen el producto alimenticio más importante del mundo. Cocinados o molidos y transformados en harinas, aceites y otras sustancias, son excelente fuente de energía para el hombre y el ganado. La cerveza y otras bebidas alcohólicas se elaboran con cereales fermentados. Denominación que engloba varias especies de la familia de las Gramíneas cultivadas por sus semillas, que son importantes productos alimenticios. El nombre deriva de Ceres, diosa romana de la agricultura. Aunque los cereales no pertenecen a ninguna familia específica de las gramíneas en sentido estricto, la elección de algunas especies como fuente de alimento parece haber estado determinada por el mayor tamaño de la semilla o por la facilidad de obtenerla en cantidad suficiente y de liberarla de la cáscara no comestible. Los granos más cultivados son maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo, mijo, avena y centeno. Todas estas plantas se cultivan desde la antigüedad y tanto su cultivo como su utilización han constituido un indicador de crecimiento económico, en especial en los países más pobres. Proceden de Europa, Asia y África, salvo el maíz, que es de origen americano. Según el Invima, a los cereales y productos de panificación se le realizan las siguientes determinaciones microbiológicas, dependiendo de la clase Galletas y Colaciones: Resolución No. 11488 de agosto 27-84 Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras. Harina de trigo para panificación: Norma No. 267 del INVIMA Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras, Salmonella y Bacillus cereus. Avena en hojuelas para consumo humano: Norma No. 2159 del INVIMA Recuento de mesófilos, oniformes fecales, recuento de mohos y levaduras, Salmonella. Harina de avena para consumo humano: Norma No. 2160 del INVIMA Recuento de mesófilos, oniformes fecales, recuento de mohos y levaduras, Salmonella. 88
2. OBJETIVOS 1. Realizar recuento de microorganismos Mesófilos aerobios, oniformes totales y fecales a partir de cereales y productos de panificación. 2. Determinar e identificar la presencia de Salmonella a partir de productos de cereales y productos de panificación. 3. Realizar recuento de hongos y levaduras a partir de cereales y productos de panificación. 3. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Bilis verde brillante lactosa Coloración de gram con durham A. EMB Reactivo de Kovacs Agar plate count Plasma fresco Agua peptona 0.1% Griess Agua triptona Alfa naftol Agar Baird –Parker KOH 40% Agar Hecktoen Rojo de metilo Agar BPLS Caldo tetrationato de sodio Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusión cerebro corazón Agar ogy Agar B.cereus-Mossel Agar leche Agar almidón  Algodón y alcohol al 70%
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar. 5. INVESTIGACIÓN 
¿Cuáles son los factores que permiten la invasión y el crecimiento de los microorganismos en los granos de cereales?
6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998. 7. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: Galleta: 200 g. Grupo 2: Colación: 200 g. Grupo 3: Harina: 200 g. Grupo 4: Pan: 200 g. Grupo 5: Bizcocho: 200 g.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 26: MICROBIOLOGÍA DE BEBIDAS 2. INTRODUCCIÓN Las bebidas refrescantes constituyen un conjunto muy heterogéneo en el que se distinguen dos tipos de productos cuyas características microbiológicas son muy diferentes, las cuales son: las bebidas a base de extractos naturales de frutas o de otros vegetales y los zumos de frutas o bebidas a base de zumos de frutas. Otro tipo de bebidas son las alcohólicas, las cuales se producen a partir de diversas materias primas, pero especialmente a partir de cereales, frutas y productos azucarados; Entre ellas se encuentran bebidas no destiladas como la cerveza y el vino, y destiladas como el whisky y el ron. Un último tipo de bebidas consumidas por sus características refrescantes y estimulantes son las aromáticas entre las cabe mencionar el café, el té y las obtenidas a partir del cacao. Según el Invima los análisis microbiológicos que se le realizan a las bebidas son los siguientes:     
Cerveza: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos y levaduras. Gaseosas: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos y levaduras. Refresco líquido en bolsa: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, recuento de esporas de Clostridium sulfito reductor y recuento de mohos y levaduras. Café: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva, recuento de mohos y levaduras. Aromática: Recuento de mesófilos, oniformes totales y fecales, Staphyfilococcus coagulasa positiva y recuento de mohos y levaduras.
3. OBJETIVOS 1. Realizar Recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, Staphylococcus coagulasa positiva, oniformes totales y fecales a partir de bebidas. 2. Determinar e identificar la presencia de esporas de Clostridium sulfito reductor a partir de bebidas.
91 4. MATERIALES Medios de cultivo Reactivos Bilis verde brillante lactosa Coloración de gram con durham A. EMB Reactivo de Kovacs A. leche Plasma fresco Agua peptona 0.1% Griess Agua triptona Alfa naftol Agar Baird –Parker KOH 40% Agar Hecktoen Rojo de metilo Agar BPLS Peroxido hidrogeno 3% Caldo tetrationato de sodio Oxidasa Caldo selenite- cistina Caldo nitrato Caldo MR-VP Agar citrato Agar urea Agar kligler Agar Lia Infusión cerebro corazón Agar plate count Agar SPS Caldo tioglicolato Agar gelatina  Algodón y alcohol al 70%
5. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar 6. INVESTIGACIÓN 
¿Cuáles son las barreras naturales al microorganismos que presentan las bebidas?
7. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998.
92 8. NECESIDADES PARA EL LABORATORIO Todos los grupos deben traer: Fósforo para encender el mechero, toallas absorbentes, enmascarar, Marcador. Grupo 1: Cerveza Grupo 2: Aromática Grupo 3: Café Grupo 4: Refresco líquido en bolsa Grupo 5: Jugo
93 UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS GUÍA Nº 27: MICROBIOLOGÍA DE AGUAS 1. INTRODUCCIÓN Según el Invima los análisis microbiológicos que se le realizan a las bebidas son los siguientes:  
Agua potable: oniformes totales y fecales. (Decreto 475/98). Agua potable envasada: Recuento de mesófilos aerobios y facultativos viables, oniformes totales y fecales y Pseudomona aeruginosa. (Resolución 12186/91).
2. OBJETIVOS 1. Realizar NMP de oniformes totales y fecales a partir de agua potable. 2. Realizar recuento de microorganismos mesófilos aerobios y facultativos viables, oniformes totales y fecales a partir de agua envasada. 3. MATERIALES Medios de cultivo Caldo LMX / Fluorocult / Readicult / Collilert Caldo casoy doble concentración Caldo casoy concentración simple Agar cetrimide
Materiales* Bolsas de polipropileno
Lámpara luz UV
Solución amortiguadora Asa bacteriológica fosfato pH 7.2 Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Pipetas 1 y 10mL Algodón y alcohol al 70%
4. PROCEDIMIENTO De acuerdo al producto a analizar 5. INVESTIGACIÓN
1. ¿Cuáles son los principales riesgos por el consumo de agua que no cumple con los criterios de potabilidad? 6. BIBLIOGRAFÍA 1. ACOSTA de GUEVARA Emma y GONZALEZ ORTIZ Lucy. Fundamentos para el análisis microbiológico de los alimentos. Barranquilla, 1995. 2. ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Técnicas de análisis Microbiológico. Vol. 1, 2da edición, Editorial Acribia. Zaragoza, España, 1984. 3. MINISTERIO DE SALUD. Instituto Nacional de Salud. Análisis Microbiológico de Alimentos. Serie de Publicaciones científicas No. 10 Santa fe de Bogotá, 1998.
ANEXO A: División laboratorio de alimentos y bebidas alcohólicas-Laboratorio de Microbiología de Alimentos INVIMA.
ANEXO B: Normatividad relacionada con Alimentos A continuación encontrará una recopilación de normas relacionadas con productos alimenticios. CLASE DE NORMA
Se establecen las normas de identidad y pureza de los endulcolorantes utilizados en los productos alimenticios.
2162 Ver »
Regula la producción, procesamiento, transporte y expendio de los productos cárnicos procesados.
2437 Ver »
Regula la producción, procesamiento, transporte y comercialización de la leche.
561 Ver »
1601 Ver »
Reglamenta la sanidad Minsalud y portuaria y vigilancia Mintransporte epidemiológica en naves y vehículos terrestres.
1036 Ver »
Subrogase el Capítulo 1 del Título 1 del Decreto No 2278 de agosto 2 de 1982
Regula las condiciones sanitarias de producción, empaque y comercialización, al control de la sal para consumo humano.
2278 Ver »
2106 Ver »
1397 Ver »
2229 Ver »
547 Ver »
1944 Ver »
2131 Ver »
Regula las actividades de fabricación, procesamiento, preparación, envase, almacenamiento, transporte, distribución y comercialización de alimentos en el territorio nacional.
Modifica algunos artículos del Minsalud y Decreto 2437/83 y deroga el Minagricultura Decreto 2473/86 sobre leches.
3075 Ver »
476 Ver »
698 Ver »
Modifica los artículos 23 y 24 Minsalud y del decreto 547 de 1998 Minagricultura sobre la sal para consumo humano.
977 Ver »
Minsalud y Mindesarrollo
Crea el Comité Nacional del CODEX alimentarios y se fijan sus funciones.
612 Ver »
60 Ver »
1270 Ver »
1175 Ver »
Por el cual se modifica parcialmente el Decreto 3075 de 1997, especialmente lo relativo al artículo 65 - expedición del certificado de inspección sanitaria para exportación
Resolución 126 Ver »
Resolución 1287 Ver »
Norma sobre grasas y aceites comestibles.
Resolución 4135 Ver »
6328 Ver »
11488 Ver »
15789 Ver »
15790 Ver »
Se reglamenta las características organolépticas físico químicas y microbiológicas de las mermeladas y jaleas de frutas.
Se reglamenta las características organolépticas físico químicas y microbiológicas de los derivados del tomate.
Resolución 17855 Ver »
Resolución 10593 Ver »
Resolución 13402 Ver »
Resolución 16078 Ver »
Resolución 17882 Ver »
Resolución 19021 Ver »
2310 Ver »
Resolución 9553 Ver »
Resolución 1804 Ver »
Por la cual se modifica la resolucion la Resolución 2310 de 1986.
Resolución 11961 Ver »
Modifica parcialmente la resolución número 2310 del 24 de febrero de 1986.
Resolución 222 Ver »
Por la cual se declaran aptos los equinos como animales de abasto público en el territorio nacional.
Resolución 1618 Ver »
Resolución 4124 Ver »
Resolución 4125 Ver »
Resolución 4126 Ver »
Resolución 4241 Ver »
Por la cual se definen las característiscas de las especies o condimentos vegetales y se dictan normas sanitarias y de calidad de estos productos y de sus mezclas.
Resolución 4393 Ver »
Resolución 7992 Ver »
Resolución 12186 Ver »
5213 Ver »
Minsalud Mincomex
Por la cual se fijan las condiciones para los procesos de obtención, envasado y comercialización de agua potable tratada, con destino al consumo humano. Por la cual se establece una delegación de los vistos buenos en los registros de importación a los productos alimenticios elaborados o procesados en el exterior.
Resolución 604 Ver »
Resolución 2284 Ver »
Resolucion 19304 Ver »
Elaboracion y control de grasas y aceites comestibles para el consumo humano
Resolución 580 Ver »
Resolución 599 Ver »
Resolución 730 Ver »
Resolución 4547 Ver »
Resolución 2387 Ver »
Por la cual se oficializa la norma técnica colombiana NTC 512-1 relacionada con el rotulado de alimentos.
Resolución 260576 Ver »
Mediante la cual se derogan las Resoluciones 238148/99 y 248903/99. Registros Sanitario de Panela
Resolución 1893 Ver »
Resolución 402 Ver »
1528 Ver »
1987 Ver »
Por la cual se modifica la Resolución 1746 del 23 de julio de 2002
Resolución 2012 Ver »
Por la cual se prorroga la suspensión de la expedición de Documentos Zoosanitarios para la Importación de bovinos, porcinos, demás especies susceptibles y sus productos de riesgo desde Ecuador
Resolución 16563 Ver »
2002001697 Resolución 2002 Ver »
2002007893 Resolución 2002 Ver » Resolución 2002011308 2002 Ver »
DG-0100196 Ver »
NTC 512-1 Ver »
Acciones conjuntas para controlar la fabricación ilegal de la panela INVIMA
Aplicación y cumplimiento de la Resolución 0402 de 2002. Pollo Marinado Industrias Alimentarias Rotulado
Report "Guias Microbiologia de Alimentos Unicordoba"

References: Resolución 
 artículo 65

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 
 Resolución 

Resolución 
 resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 

Resolución 
 Resolución 

Resolución 

Resolución 
 Resolución 
 Resolución 
 Resolución 
 Resolución