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Timestamp: 2019-05-24 05:46:28+00:00

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Proteómicos análisis de ácidos acompañantes, y de las proteínas de estrés en la extrema halophile Halobacterium NRC-1: un enfoque comparativo proteómicos para estudiar la respuesta de choque térmico
Proteome Science, 2006; 4: 6-6 (más artículos en esta revista)
Hem D Shukla (shukla@umbi.umd.edu) [1]
[1] Center of Marine Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute, Baltimore, MD 21202, USA
Copyright © 2006 Shukla; licenciatario BioMed Central Ltd
Halobacterium sp. NRC-1 es extremadamente halófilas archaeon y se ha adaptado a un crecimiento óptimo en condiciones de muy alta salinidad. Su proteoma es altamente ácida pI con una mediana de 4,9, una característica singular que ayuda al organismo a adaptarse alta salina medio ambiente. En el medio ambiente natural de crecimiento, Halobacterium NRC-1 se encuentra con una serie de condiciones estresantes incluida la alta temperatura y la intensa radiación solar, el estrés oxidativo y el frío. Proteínas de choque térmico y chaperones indispensable desempeñar funciones en un organismo en virtud de la supervivencia de muchas condiciones de estrés. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método mejorado de 2-D electroforesis en gel con una mejora de la resolución de los ácidos proteoma, y para identificar proteínas con diversas funciones celulares usando gel-en la digestión y LC-MS/MS y MALDI-TOF.
Un modificados 2-D gel de electroforesis procedimiento, utilizando tiras de IPG en el rango de pH de 3-6, permitió que la mejora de la separación de las proteínas ácidas relativo a las técnicas anteriores. La combinación de los datos experimentales de 2-D electroforesis en gel de los que se dispone de información genómica, permite la identificación de al menos 30 proteínas celulares que participan en muchas funciones celulares: la respuesta de estrés y plegado de proteínas (CctB, PpiA, DpsA, y MsrA), la reparación y la replicación del ADN ( Una ADN polimerasa subunidad α, Orc4/CDC6, y UvrC), regulación transcripcional (Trh5 y ElfA), la traducción (ribosomal Rps27ae y Rphs6 proteínas de la subunidad 30 S ribosomal; Rpl31eand Rpl18e de la subunidad 50 S ribosomal), el transporte (YufN) , Quimiotaxis (CheC2), y limpieza (ThiC, ThiD, FumC, ImD2, GapB, TpiA, y PurE). Además, cuatro productos de genes con función indeterminado también fueron identificados: Vng1807H, Vng0683C, Vng1300H, y Vng6254. Para estudiar la respuesta de choque térmico Halobacterium NRC-1, el crecimiento de las condiciones de choque térmico y se determinaron los perfiles proteómicos, bajo condiciones normales (42 ° C), y por calor (49 ° C) condiciones, se compararon. Utilizando un enfoque diferencial proteómicos en combinación con la información disponible genómica, la bioinformática análisis reveló cinco putativo de las proteínas de choque térmico que se upregulated en las células sometidas a estrés térmico a 49 ° C, es decir, DnaJ, GrpE, sHsp-1, Hsp-5 y sHsp-2 .
El modificados 2-D electroforesis en gel de mejorar notablemente la resolución de la extremadamente ácida proteoma de Halobacterium NRC-1. Constitutiva expresión de proteínas de estrés y ayudar a los chaperones organismo para adaptarse y sobrevivir en la extrema salinidad y otras condiciones de estrés. El patrón de expresión upregulated putativo chaperones DnaJ, GrpE, sHsp-1, Hsp-5 y sHsp-2 en temperatura elevada claramente sugiere que Halobacterium NRC-1 dispone de un sofisticado mecanismo de defensa para sobrevivir en ambientes extremos.
Halobacterium sp. NRC-1 habita en un extremo y entorno dinámico que presenta un desafío importante para su supervivencia. El organismo tiene la capacidad de adaptarse a 4,5 M, de la sal y la exposición de crecimiento hasta cerca de 50 ° C, aunque a ritmo más lento. Responde a una gran variedad de las perturbaciones ambientales incluida la intensa radiación solar, altas temperaturas, frío, la alta salinidad y el estrés oxidativo [1 - 3]. Las células pueden crecer con ambas aeróbicas y anaeróbicas respiración y fermentación anaeróbica han fotótrofas y capacidades [4]. El organismo es fácil genéticamente con una amplia variedad de herramientas genéticas, incluida la clonación con fines de vectores, marcadores seleccionables, y un sistema de fácil génica [5]. Estos hechos, junto con la disponibilidad de la secuencia completa del genoma [4], hacer Halobacterium sp. NRC-1 un sistema ideal para el estudio de las respuestas a las perturbaciones ambientales.
Las secuencias del genoma de Halobacterium sp. NRC-1 han demostrado la presencia de tres replicons: a Mbp cromosoma 2, y dos minichromosomes de 365 kbp (pNRC200), y 191 kbp (pNRC100), la codificación de las proteínas predijo 2630 [4]. Análisis bioinformáticas de la NRC-1 genoma han demostrado predecir el proteoma a ser muy ácido, con una media de sólo el 4,9 pI [2]. Experimental proteómicos análisis preliminar de Halobacterium NRC-1 y las formas conexas de halophiles ha expuesto la viabilidad de ambos bidimensional en gel de electroforesis (2-DE) análisis [6, 7], cromatografía líquida acoplada espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS), y MALDI-TOF análisis [7, 8]. Además, el análisis de espectrometría de masas de los preparativos de la membrana púrpura Halobacterium ha informado también de [9]. Sin embargo, estos estudios no han analizado extensamente los cambios en la abundancia de los distintos patrones de proteínas o en virtud de las condiciones de crecimiento diferencial.
A pesar de los recientes avances en la investigación proteómica, y la mejora de los sistemas de 2-DE, el análisis de la Halobacterium NRC-1 proteoma es un reto importante [7]. Debido a su extrema acidez, y relativamente alta hidrofobicidad, tienden a precipitar las proteínas en su punto isoeléctrico durante IEF análisis [10, 11]. Además, la presencia de la sal en la muestra y el exceso de TDT en pH ácido conduce a rayas y sesgado los resultados. Estos problemas han sido abordados previamente utilizando de bajo peso molecular de corte de las columnas, ultrazoom inmovilizados tiras de gradiente de pH, y las combinaciones de IPGphor / Multiphor sistemas [7, 12]. Sin embargo, rayas en el alto peso molecular de la región 2-D geles aún plantea desafío considerable en la obtención de resultados reproducibles, que son esenciales para el estudio comparativo a nivel mundial y el análisis de proteínas en la extrema halophiles.
Heat shock respuesta homeostática es un importante mecanismo que permite a las células sobreviven a una variedad de problemas ambientales [13]. Algunas proteínas de choque térmico son constitutivamente expresada en extremófilos bajo condiciones normales de crecimiento, lo que sugiere que han evolucionado espontánea adaptación a condiciones ambientales extremas [14]. Estas proteínas de choque térmico en función multi-proteína como chaperones moleculares y ayudar en el correcto plegamiento de proteínas de estrés proteínas dañadas, y la estabilización de otras proteínas celulares [15 - 18].
Halobacterium NRC-1 es impugnado por las condiciones hostiles en su entorno natural incluida la intensa radiación solar, las altas temperaturas, la alta salinidad y el estrés oxidativo. La secuencia completa del genoma de Halobacterium NRC-1 ha puesto de manifiesto la presencia de 13 de choque térmico genes que pertenecen a cinco grandes familias de Hsps incluyendo alfa y beta thermosomes, DnaK, DnaJ, GrpE, DpsA, MsrA y sHsps [4]. Entre ellos, Halobacterium NRC-1 genoma contiene 3 copias de las pequeñas proteínas de choque térmico (sHsps), mientras que, otros genomas archaeal sólo contienen uno o dos ejemplares de cada uno. Pequeñas proteínas de choque térmico son menos de 25 kDa en tamaño y ubicuo en todos los tipos de organismos, incluidas las arqueas, bacterias y eukarya [19].
En el presente estudio, una modificación de 2-DE procedimiento es empleado para mejorar la resolución de las proteínas ácidas. Usando el procedimiento modificado, el 30 de abundancia proteínas expresadas se identificaron siguientes LC-MS/MS y análisis MALDI-TOF. Además, por emplear una expresión diferencial de proteínas enfoque de los análisis, en combinación con la bioinformática análisis, se ha tratado de identificar las proteínas de choque térmico putativo y acompañantes hasta temperatura regulada durante el estrés en este modelo de extremófilos.
Optimización de 2-D electroforesis en gel de ácido para la resolución de las proteínas
Halobacterial proteínas son muy ácidos y tienen superficies muy cargado negativamente, que se cree que aumentar la solubilidad y, en función de mantener los altos niveles de salinidad [20]. Con el fin de mejorar la resolución y minimizar rayas de las proteínas en el rango ácido, tres modificaciones se introdujeron a un procedimiento publicado recientemente [7]: (1), la muestra fue ampliamente dializados con 3 kDa de corte con bolsa de diálisis por lo menos 4 de amortiguación de los cambios; (2), el 2,0% de Tween-20, un detergente no iónico, se utilizó en la rehidratación de amortiguación en lugar de la NP-40, y (3), la rehidratación paso se llevó a cabo a 50 voltios durante 16 horas a 22 ° C . Aparentemente, dirigió la rehidratación de IPGready tiras en baja tensión impedido la habitual precipitación observada en el pH ácido. Estas modificaciones eficazmente eliminado la sal y el ácido concomitantemente permitido centrar las proteínas de manera más eficiente en el ácido gama de la tira IPG. Como se muestra en la Fig. 1, proteínas fueron bien resueltas en el ácido gama muy limitada y rayas se observó en el rango superior MW, a diferencia de informes anteriores [6, 7, 21, 22]. Sin embargo, las proteínas ácidas que se resolvieron sin modificaciones a través de 2-D gel procedimiento dio lugar a rayas horizontales y verticales en el rango superior MW. (Fig. 1B].
Al emplear el protocolo modificado para analítica 2-DE ácida de las proteínas, treinta abundantemente proteínas expresadas se identificaron bajo condiciones estándar de laboratorio el crecimiento a los 42 ° C [5]. Los datos presentados en la Fig. 1 representan el mapa de referencia, que se generó utilizando tiras de IPG listo el rango de pH 3-6. En el presente enfoque, un alto grado de reproducibilidad se observó entre los geles, y reproducir imágenes de gel de promedio y se analizaron. Los análisis de geles resultantes se realizaron mediante el software ImageMaster y unos 411 se detectaron manchas de proteínas en el rango de 10-150 kDa con pI's en el rango de 3 a 6. El promedio de la pI expresó proteoma resultó ser 4,42, que está en estrecho acuerdo con la predicción del proteoma derivados de la secuencia del genoma [4]. Múltiples experimentos revelaron que la utilización de la imagen 2-D Master Software, altamente reproducible, se obtuvieron los datos que fue corroborada por los informes anteriores [23]. En el presente estudio, experimental y pI pesos moleculares se corresponde estrechamente con la predicción obtenida de secuencia del genoma. En experimentos adicionales, si los hay pocas proteínas en el rango neutro y básico podría ser identificados (datos no presentados), aunque se predice 390 polipéptidos en el Halobacterium NRC-1 secuencia del genoma en la serie de pI 7-11, problemas similares también fueron encontrados En informes anteriores [24 - 26].
Identificación y análisis de los celulares chaperones, y abundantemente expresado productos genéticos en virtud de 4,5 M de la sal
Sobre la base de la proteína ácida de 411 perfiles de proteínas de referencia en 2-D mapas, 30 abundantemente proteínas expresadas en representación de una amplia gama de pI MW y se seleccionaron para su identificación. Spots fueron extirpados, digeridos con tripsina, y los péptidos resultantes se analizaron por MALDI-TOF y LC-MS/MS análisis. Los resultados presentados en la Fig. 1 y el cuadro 1 muestran que la abundancia expresaron proteínas que podrían ser identificados están involucrados en una gran variedad de procesos celulares. En este nuevo enfoque el péptido obtenido de las masas de MALDI-TOF Se hicieron búsquedas en la base de datos MASCOT contra la parte superior y se golpea con una correspondencia precisa con el pI y pesos moleculares de las proteínas de predecir secuencia del genoma, y los datos obtenidos de 2-D gel de electroforesis análisis. Por lo tanto, sólo acompañado de cerca los valores se tuvieron en cuenta para la identificación de proteínas. Curiosamente, este planteamiento podría identificar fácilmente falsos positivos a pesar de que los resultados de MASCOT algunos falsos positivos resultaron ser superiores a los reales de proteínas identificadas. Sin embargo, que la antedicha enfoque descontado la probabilidad de identificación de falsos positivos y nos permitió identificar los reales candidatos. Del mismo modo, la MS / MS espectros contra NCBInr Se hicieron búsquedas en la base de datos utilizando SEQUEST como se describe en materiales y métodos. Las proteínas identificadas por LC-MS/MS y análisis MALDI-TOF, con teóricas y experimentales (M r y pI) los valores se presentan en la Tabla 1 con la ORF número, el nombre de la proteína, MS Resultado por ciento y la cobertura. El análisis de la bioinformática identificado proteínas ha demostrado que su pI y pesos moleculares coinciden con los valores previstos de la secuencia del genoma [4].
Plegamiento de proteínas y respuestas de estrés
CctB es una subunidad beta de la thermosome, que pertenece al grupo dos chaperonins en arqueas y participa en diversas funciones celulares durante el estrés [27]. Se ha informado a suprimir la agregación de las proteínas normales en virtud de la sal [28]. Se ha observado que la temperatura bajo estrés, la thermosome reúne espontáneamente en filamentos, lo que sugiere que pueden desempeñar un papel estructural en vivo [29]. Además, otras funciones que se han sugerido para el grupo II chaperonins que ayuda a adaptar las condiciones de estrés, incluyendo la estabilización de membrana [29]. El otro acompañante identificado bajo condiciones normales de crecimiento fue peptidil-prolyl isomerasa o rotamase (PpiA), que facilita el plegado de proteínas adecuado por el aumento de la tasa de transición de los residuos de prolina entre la cis y trans estados [30]. El presente enfoque también ayudó a identificar MsrA, una proteína implicada en el estrés celular protección contra el estrés oxidativo daños [31]. MsrA ha informado de actuar contra el daño oxidativo por inactivación de radicales de oxígeno que tienen la tendencia a los daños del ADN [32]. DpsA, otra proteína implicada en la protección del daño en el DNA de estrés oxidativo, [33], también puede ser identificado. Sin embargo, informes recientes sugieren que DpsA protege a las células contra las múltiples tensiones durante la fase estacionaria [34]. Los datos obtenidos por la combinación de 2-D gel, y LC-MS/MS MALDI-TOF que indican claramente que algunos de los acompañantes y de las proteínas de estrés son constitutivamente expresadas en la célula. Esto puede deberse al hecho de que el Halobacterium NRC-1 habita en un medio ambiente extremo de la alta salinidad y otras tensiones [19] y, por tanto, ha evolucionado de una única y nueva estrategia para la adaptación al improvisado extrema salinidad y otros tipos de presiones.
La replicación del ADN, transcripción, traducción y reparación
La supervivencia de Halobacterium NRC-1 bajo condiciones ambientales extremas siempre depende del éxito de la reparación y la replicación del material genético. El análisis proteómicos ha demostrado la presencia de una polimerasa (subunidad α) que participan en la replicación del ADN, y Orc4/CDC6 que desempeña un papel indispensable en el inicio de la reproducción por medio de la unión de origen de la replicación. Los hallazgos sugieren también que CDC6, que tiene estructura de dominio AAA, participa en la replegado de la desnaturalización de proteínas, el volumen de negocios de proteínas, y en virtud de la modificación postraduccional salinidad extrema [35]. La identificación de la escisión nucleasa cadena C (UvrC), que es miembro de ambos UvrABC sistema y ortólogos COG0322 familia, indican que cada vez más están expuestos a células solares de alta y de la radiación ultravioleta, y su expresión con éxito la reparación del ADN celular daños [36]. La presencia de la regulación de la transcripción (Trh5, ElfA), la traducción [dos 30S (Rps27ae, Rphs6), dos 50 S (Rpl31e, Rpl18e) ribosomal proteínas] productos genéticos indican que a pesar de las condiciones extremas de estrés celular con éxito mantener y regular la información genética para su éxito Supervivencia.
Identificación del transporte, quimiotaxis, de limpieza y productos de genes
El análisis proteómicos también ha demostrado la presencia de proteína YufN que es un miembro de la familia de transportadores ABC halobacterial incrustados en las membranas que contiene el dominio pfam 02608. YufN involucrada en la importación de nutrientes a las células o la liberación de productos tóxicos en el medio circundante y las funciones a expensas de la hidrólisis de ATP [37]. Esta clase de proteínas es la más importante de la familia de transportadores de membrana de Halobacterium NRC-1 genoma.
CheC2 quimiotaxis es una proteína que es un miembro de COG1776 familia, y parte de dos componentes quimiotaxis y phototaxis módulo de red en Halobacterium NRC-1. Se prevé que durante phototaxis, esta proteína recibe señales de los transductores foto HtrI y HtrII y controlar un conmutador flagelar [38] que permite la célula ideal para avanzar hacia condiciones de iluminación donde la luz impulsada por la bomba de protones de bacteriorhodopsin convierte la energía luminosa en energía química [39 ]. El otro gen identificado por los productos proteómicos análisis se ThiC, ThiD, FumC, ImD2, GapB, TpiA, y PurE, que pertenecen a una categoría de proteínas implicadas en la función metabólica general [40]. Además, cuatro productos genéticos sido objeto de la función indeterminado también fueron identificados: Vng1807H, Vng0683C, Vng1300H, y Vng6254.
Supervivencia de Halobacterium NRC-1 bajo estrés térmico
Con el fin de examinar la respuesta de choque térmico en Halobacterium NRC-1, diferencial proteómicos estrategia fue empleada: en primer lugar las condiciones de choque térmico respuesta fueron optimizados y el crecimiento de Halobacterium NRC-1 se puso a prueba en una amplia gama de temperaturas de óptima (42 ° C) A la letal (56 ° C). Los datos presentados en la Fig. 2A, muestran que las células normales de crecimiento exhibido hasta 49 ° C, aunque con tasas de crecimiento más lento en comparación con el control (42 ° C). A temperaturas más elevadas (> 50 º C) el crecimiento fue inhibido, y las células blancas de photobleaching apareció. Sin embargo, la viabilidad de estas altas temperaturas se mantienen en gran medida por varias horas y después se reanudó el crecimiento pasando de nuevo a 42 ° C. Para seguir evaluando la importancia fisiológica de la subletal inhibitorio del crecimiento, pero la temperatura, se mide la supervivencia de Halobacterium NRC-1, después de pretratamiento de las células subletales en la temperatura en 49 ° C durante 1 h seguida de cambiar a un letal 56 ° C durante 6 Horas y enchapado en CM + placas. Un aumento de 2.5 veces en la supervivencia de las células se observó premeditados, en los 49 ° C en comparación con las células que se han desplazado directamente a 56 ° C (Figura 2B]. Por primera vez se demuestra que cuando crece Halobacterium NRC-1 células son brevemente expuestas a la temperatura subletal que pueden sobrevivir a una temperatura mucho más grave por termotolerancia en desarrollo, que es probable que se ecofisiológicas de importancia para el organismo [41]. Parece probable que el aumento de calor en termotolerancia conmocionado es ubicua en las células arqueas y representa un posible mecanismo para la supervivencia bajo el estrés térmico inducido por la síntesis de las proteínas de choque térmico [42]. Como tal, un clásico choque de calor es la respuesta observada en Halobacterium NRC-1, no resulta sorprendente puesto que se trata de un mecanismo de respuesta de estrés adaptado y desarrollado por halophiles que habitan en ambientes hipersalinos.
Alta resolución PÁGINA 2-D en combinación con la ayuda avanzada ImageMaster análisis es una herramienta poderosa para estudiar la fisiología microbiana en general. Para el estudio de la inducción y la expresión de proteínas de choque térmico en Halobacterium NRC-1, mediante el empleo de un diferencial enfoque de la proteómica, las células creciendo exponencialmente fueron sometidos a condiciones de choque térmico de 49 ° C durante 8 horas (tiempo de generación de ~ 6 hrs). Las muestras que contengan total de las proteínas celulares se prepararon de control de calor y conmocionado células (cantidades iguales), y resueltas a través de geles 2-D por triplicado. Los geles fueron digitalmente imágenes después de la tinción de plata. El análisis de los datos mostró que, al menos, 123 proteínas muestran cambios en la expresión cuando las células se trasladó a temperatura elevada. Consequentely, la adaptación a las altas temperaturas requiere un importante cambio en la composición de proteínas celulares [43]. A través de una comparación de la ayuda ImageMaster representante conjuntos de geles, se observó que 63 tenían más de las proteínas expresadas bajo condiciones de choque térmico. Por lo menos 37 proteínas mostraron una mayor de 2 veces mayor a los 49 ° C. Por el calor conmocionado en las células, la síntesis de las 46 proteínas se redujo abruptamente, en comparación con el control de las células de crecimiento a 42 ° C. Sobre la base de comparación precisa de representante geles de control, el calor y las muestras tratadas, se observó que predijo, y experimental pesos moleculares, y pIs valores de Hsps fueron acompañadas de cerca. En la presente investigación fue la identificación precisa sobre la base de la información disponible genómica, el análisis bioinformático, en combinación con los datos experimentales.
Los resultados indican claramente que el aumento de las células cuando se desplazan a temperatura elevada, hay una mayor síntesis de cinco proteínas de choque térmico. Entre ellos, tres pertenecen a la categoría de pequeñas proteínas de choque térmico (sHsp) y dos a la familia DnaJ, respectivamente. Así, basado en el análisis bioinformático y diferenciado proteómicos enfoques que se pueden identificar como chaperones moleculares putativo DnaJ, GrpE, y tres pequeñas proteínas de choque térmico sHsp-1, Hsp-5, y sHsp-2 en células conmocionado calor (Fig. 3A & B; Cuadro 2]. En cada caso, la experimentación y M r pI valores de estos putativo identificado las proteínas de choque térmico se aproximaron a los valores teóricos de la información genómica. Estos resultados corroboran los informes anteriores de que las pequeñas proteínas de choque térmico (sHsps) upregulated son significativamente bajo condiciones de estrés celular, como golpes de calor [44, 45]. La mayoría de los genomas archaeal contienen uno o dos genes pequeños golpes de calor, sin embargo, en Halobacterium NRC-1 genoma, hay tres copias de sHsp [19], que son funcionales, y su síntesis está regulada a estrés térmico. Sin embargo, estas proteínas han chaperonin propiedades y también se expresan en los niveles basales en virtud de las temperaturas óptimas de crecimiento como el sHsps de otros organismos. Por lo tanto, parece probable que sHsps indispensable desempeñar funciones en el sistema chaperón molecular de Halobacterium NRC-1, el organismo y ayudar a sobrevivir bajo condiciones de estrés extremo. Los resultados indican que sHsp, DnaJ y GrpE acompañante forman parte de la red que ayudan en replegado de desnaturalizarse las proteínas normales de las proteínas y ayudar a mantener su estado plegado bajo estrés grave [46]. Curiosamente, aunque más del 40% de todas las proteínas de choque térmico presente en el genoma se identificaron, otras proteínas de choque térmico espera, DnaK, Lon, HtrA, y HtpX no pudieron ser identificados, posiblemente debido a la limitación de este enfoque.
Análisis cuantitativo de los cinco putativo identificado las proteínas de choque de calor que se dejaba claro que las tres pequeñas proteínas de choque térmico sHsp-1, Hsp-5 y sHsp-2 son más de 2 veces inducida bajo condiciones de choque térmico, en comparación con el control (Fig. 4] . Estas tres pequeñas proteínas de choque térmico previsto en el genoma de Halobacterium compartir ~ 35% similitud de secuencia y pertenecen a la familia Hsp20/alpha crystallin (PF00011), que participa en el desarrollo de termotolerancia en otros sistemas [47]. Informes anteriores han sugerido que el 16,5 kDa pequeñas proteínas de choque térmico M. Jannaschii reprimir la agregación de las proteínas normales en el E. Coli a 100 ° C [48]. Estos sHsps se cree que son independientes ATP-chaperones que impiden la agregación, y son importantes en replegado de desnaturalizarse las proteínas en combinación con otros Hsps en la célula. También se cree que sHsps se unen a las proteínas desnaturalizado acumulado bajo condiciones de estrés, y mantener en un estado plegado-competente [49].
También hubo más de un 2 veces la inducción de la DnaJ y GrpE en calor conmocionado células de Halobacterium NRC-1 en comparación con el control (Fig. 4]. Curiosamente, en Halobacterium NRC-1, DnaJ y GrpE chaperones tipo de bacterias que forman la maquinaria celular acompañante capaz de reparar los daños de proteína inducidos por el calor en el cultivo de células [50, 51].
En el presente informe se ha tratado de optimizar las condiciones para resolver el ácido proteoma de Halobacterium NRC-1. Proteínas ácidas tienden a precipitar en ácido gama de este fenómeno y los resultados se centra en los pobres. Usando el protocolo modificado sugerido, es posible reducir al mínimo las dos rayas verticales y horizontales, lo que permite a las proteínas se centran en el ácido gama. La combinación de 2-D gel análisis, y LC-MS/MS MALDI-TOF ha permitido la identificación de varias proteínas de estrés, proteínas importantes para la replicación del ADN y la reparación, el reglamento de traducción, transporte, quimiotaxis, y la administración del hogar. Por primera vez se ha establecido claramente que Halobacterium NRC-1 desarrollar termotolerancia a temperaturas elevadas a través de la expresión de varias proteínas de estrés. Por otra parte, que la expresión de proteínas de estrés en virtud de las condiciones subletales ofrece protección frente a la mucho más graves destaca. Al emplear proteómicos enfoque diferencial, cinco proteínas de choque térmico se identificaron hasta que fueron regulados en la temperatura de estrés en Halobacterium NRC-1, y permiten a las células sobrevivir bajo estrés grave.
Preparación de la célula lisado
Para la extracción de células y proteínas de lisado preparación, Halobacterium NRC-1 (ATCC 700922) fue cultivada en lotes culturas en CM + mediano con sacudir a la luz. Cuando llegó a 0,9 culturas OD 600 de la creciente culturas se dividieron y crecido en cualquiera de los dos pares de condiciones estándar (42 ° C), o con golpes de calor (49 ° C, 8 horas). Triplicado culturas fueron cosechadas y se prepararon lisados de células. En pocas palabras, las células de 25 ml de la cultura fueron recolectados por centrifugación a los 10, 000 × g durante 10 minutos. El pellet de células se resuspendió en 2,5 ml de buffer de resuspensión (5 mM Tris-HCl, pH 8,0, el 2% de Tween-20, y 1 mM PMSF, (recién preparada). Homogeneizada La suspensión celular fue interrumpido utilizando un francés con tres pasajes de Prensa En 16000 psi. Unbroken células y escombros fueron retirados por centrifugación a 8000 × g durante 10 minutos a 4 ° C, y el sobrenadante que contiene la fracción soluble de las proteínas fue trasladado en un tubo. Posteriormente, el lisado fue digerida con 100 μ g / ADNasa ml, y 40 μ g / ml RNasa, durante 60 min a 37 ° C para eliminar los ácidos nucleicos. Después de enfriamiento rápido a 4 ° C, la fracción soluble se dializados 3000 utilizando una bolsa de diálisis Da corte contra 5 mM Tris-HCl pH 8,0 Durante 24 horas a 4 ° C con al menos cuatro cambios. Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante la utilización de un colorante Bradford basada en la proteína de ensayo reactivo de Bio-Rad.
2-D electroforesis en gel
2-DE para el análisis, 80 μ g de proteína dializados extracto se mezclan con 250 μ l de rehidratación de amortiguación (8,5 M de urea, 2% TWEEN 20, 2% CHAPS, 0,5% IPG buffer, pH 3-10, 20 mM TDT y 0,002% Bromofenol azul). Después de fondo (10 min, intervalo de 2 min) vortexing, proteína de la muestra se centrifuga a 10, 000 × g durante 5 min. La muestra fue despejado proteína pipeta en IPG franja titulares (IPGphor, Pharmacia Biotech) y se incubaron con 11 cm listo tiras de IPG, el rango de pH de 3-6. El IPG tiras se permitió a rehidratar durante 16 horas a 50 V a 22 ° C, que mejora la resolución de las proteínas en el gel. IEF se realizó a 500 V durante 1 h, 1000 V durante 1 h y 8000 V de 2 h, para un total de 24000 Vh. Después de la FEI, IPG tiras fueron equilibrado (15 min) en 10 ml de buffer de Equilibrio (50 mM Tris-Cl, pH 8,8, 6 M urea, el 30% de glicerol, 2% SDS, 20 mM TDT y azul de bromofenol 0,002%), seguido de re El equilibrio (15 min) en el mismo buffer, pero que contiene 20 mM iodoacetamide para reducir al mínimo las rayas durante la segunda dimensión electroforesis. Después de equilibrio, la tira IPG fueron colocados en un 12,5% en gel SDS-PAGE (18 × 24 cm). Las tiras fueron selladas con la ayuda de agarosa al 0,5% en buffer de electroforesis. Las proteínas fueron electrophoresed a 120 V para 12 h utilizando un Hoefer SE 600 electroforesis unidad. Después de la electroforesis, geles fueron teñidos de plata de acuerdo a Blum et al [52] y se almacena en 10% de ácido acético a 4 ° C.
Análisis de imágenes de geles 2-D
La plata manchada geles fueron digitalizadas utilizando un Kodak 290 EDAS sistema de procesamiento de imágenes. Análisis de la imagen se ha realizado mediante el software ImageMaster 2D Elite (Pharmacia Biotech), como se describe por Krapfenbauer et al 2001 [23]. Después de la detección in situ de antecedentes y resta (no in situ el modo), la edición rigurosa (automático y manual), y se han filtrado. Posteriormente, el gel de imágenes se superpone, y acompañado, y la determinación cuantitativa de un volumen spots se realizó (modo: el volumen total de terreno normalización). Para cada análisis, los datos estadísticos (por triplicado geles de dos extracciones independientes de la proteína), mostró un alto grado de reproducibilidad entre normalizado terreno volúmenes. Normalizados volúmenes de puntos de control y experimental geles fueron exportados a Excel (Microsoft) para el cálculo de los niveles de expresión diferencial.
Tripsina digestión y extracción de gel de péptidos
Las muestras fueron resueltas a través de 2-D mediante electroforesis en gel de IPG listo franja de pH 3-6. Proteínas spots fueron extirpados de plata manchada geles y lavados con agua mili-Q, y dos veces con el 50% de acetonitrilo 15 min. Gel piezas fueron lavados con una solución de 1:1 de 0,1 M de NH 4 HCO 3 y acetonitrilo durante 15 min. Por destaining, gel piezas fueron incubadas en 10 mM DTT/0.1 M NH 4 HCO 3 de 45 min a 56 º C para reducir la proteína, seguido de incubación en 55 mM iodoacetamide/0.1 M NH 4 HCO 3 durante 30 minutos a temperatura ambiente En la oscuridad de alquilación. Sobrenadantes fueron descartados y gel de las piezas se lavaron con 100 μ l NH 4 HCO 3, seguido de dos lavados (5 min cada uno con vortexing y breve centrifugación) con 100 μ l (o lo suficiente para cubrir), de 25 mM NH 4 HCO 3 en el 50% acetonitrilo . Las partículas de gel se deshidrataron en una Speed Vac (Thermo Savant) para completar la sequedad y rehidratada con tripsina digestión buffer (50 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2). Para la digestión de tripsina 12,5 ng / μ l de tripsina porcina (Promega, Madison, EE.UU.) se añadió en un volumen final de 25 μ l. Tubos se incubaron en hielo durante 45 min, después de que 25 mM NH 4 HCO 3 se añadió y tubos fueron incubados durante la noche a 37 ° C. El sobrenadante fue retirado en un tubo limpio siliconized y extrajeron dos veces en el 50% y el 5% de acetonitrilo ácido fórmico y acetonitrilo. La mezcla fue vortex 20-30 min y se centrifuga. Sobrenadante se agruparon en un tubo y el volumen se redujo a 10 μ L utilizando una velocidad Vac. Posteriormente, la mezcla digerida fue aprobada a través de un C18 ZipTip (Millipore). Péptidos se eluyen siliconized en un tubo con 3 μ l de ácido fórmico al 5% antes de su análisis por MALDI.
Identificación de proteínas por LC-MS/MS y MALDI-TOF
LC-MS/MS análisis se realizó mediante la inyección de 10 μ l de muestra en el sistema de HPLC Surveyor equipado con BioBasic C-18 embalados nanospray punta (Nuevo Objetivo, Woburn, MA) directamente unido a un LCQ Deca XP además de trampa de iones-espectrómetro de masas equipados con Nano-LC fuente de ionización por electrospray (Thermo Finnigan, San Jose, CA). El aerosol es 1,70 kV de tensión, la temperatura capilar fue de 150 ° C, y la colisión de iones-trampa Se obtuvieron los espectros de fragmentación por colisión de energía de 35 unidades. Cada completo espectro de masa era seguido de tres MS / MS espectros de los tres picos más intensos. La dinámica de exclusión fue habilitado. Después de cada muestra, una inyección de 10 μ l de 0,1% acuoso ácido fórmico fue analizada para garantizar el adecuado equilibrio del sistema.
Los 15 archivos en bruto se NCBInr búsquedas en contra de la base de datos utilizando SEQUEST (ThermoFinnigan, San Jose, CA), que correlaciona la experimentación de masas en tándem espectros teóricos contra los espectros de masas en tándem de secuencias de aminoácidos obtenidos de la National Center for Biotechnology Information (NCBI), la secuencia de bases de datos . Tríptico fisuras en sólo Lys o Arg y hasta dos perdidas división interna de los sitios en un péptido se permitió. El nivel máximo permitido incertidumbre en la masa fue precursor de iones m / z 1,4. Misa espectros fueron adquiridos por los datos que dependen de iones de selección entre una amplia gama, así como discretos y estrechos encuesta escanear m / z rangos para aumentar el número de identificaciones
Los archivos de salida fueron filtradas por Xcorr filtro (Xcorr + DeltaCn). El valor de XCorr y DeltaCn se Xcorr> 2,0 por +2 cargado péptidos, y en parte con fines plenamente tríptico y DeltaCn> 0,1.
MALDI-TOF Análisis realizado por la reconstitución de los péptidos secos en 10 μ l de 0,1% TFA y desalado utilizando el C18 ZipTip columna de Millipore (Bedford, MA). Un concentrado μ l de la muestra fue avistada en la placa de MALDI meta con 1 μ l de 5 mg / ml de α-cyano-4-hydroxycinnamic ácido en un 1:1 v: v mezcla de 50% acetonitrile/0.05% TFA. La muestra se deja secar durante aproximadamente 15-20 min antes de colocar la muestra a la placa espectrómetro de masa MALDI-MS para el análisis. Los datos fueron obtenidos mediante la Kratos AXIMA CFR MALDI-TOF (Shimadzu Biotech, EE.UU.) en el modo lineal. Los espectros se conoce internamente calibrado utilizando tripsina autolisis picos.
El péptido monoisotopic masa de datos de huellas dactilares obtenidas de MALDI-TOF se utiliza para buscar bases de datos no redundante [53], utilizando el motor de búsqueda MASCOT con distintos valores de los parámetros [54] (péptido masa tolerancia de 0,5 a 1 Da, perdido divisiones de 2 ). Exteriores de calibración se realizó a través de Calibración Mezcla 2 de la Sequazyme y Péptido Misa Normas Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).
2D - bidimensional en gel de electroforesis.
IEF - centrándose isoeléctrico.
PÁGINA - electroforesis en gel de poliacrilamida.
LC-MS/MS - cromatografía líquida acoplada espectrometría de masas en tándem.
MALDI-TOF - Matrix desorción de ionización por láser asistida en tiempo de vuelo.
HSP - proteínas de choque de calor.
SHsp - pequeñas proteínas de choque de calor.
Este trabajo recibió el apoyo de la subvención por la Fundación Nacional de Ciencia. Autor gracias Dr Peter L. Gutiérrez y Shabina-Ali Khan, Proteómica Core instalación de la Universidad de Maryland, Centro Médico, y John Hopkins University School of Medicine, por su amable ayuda. También doy las gracias al Dr B. Joshi de la lectura crítica del manuscrito.

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