Source: http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo3_4.htm
Timestamp: 2018-06-24 12:25:25+00:00

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LA IMAGEN. SISTEMAS ÓPTICOS.
3.1.-La imagen. Consideraciones
3.2.-Sistemas ópticos
3.3.-Fundamento de la microscopía
3.3.1.-Trans-iluminación
3.3.2.-Epi-iluminación
3.4.-Aumento y resolución
Los términos aumento y resolución deben ser bien conocidos por todo usuario del microscopio. El mecanismo mediante el cual se produce este fenómeno ha sido estudiado por siglos y se explica mediante leyes de la física. Considerar únicamente el aumento no es suficiente para sacar el mejor partido del microscopio, pues otro factor, la resolución, determina lo que se verá.
3.4.1.-Aumento
El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y mayor será el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces.
Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la siguiente fórmula:
AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular
Aunque esta fórmula básica permite obtener el aumento total de una imagen, con las técnicas de fotografía clásica o fotografía digital y el uso de software de procesamiento de imágenes es posible lograr un aumento suplementario. Para obtener el aumento definitivo habría que considerar los factores de ampliación que se realizan en la pantalla del computador (para luego imprimirla) o al copiar la foto a papel mediante la técnica de fotografía clásica.
El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el aumentar las imágenes acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado. Esto puede ser resuelto mediante otro principio: La resolución.
Con el microscopio compuesto clásico es posible alcanzar un aumento máximo de 1000x. Esta limitación ha sido resuelta empleando un haz de electrones en lugar de un rayo de luz visible, y se abrió así una nueva era con la microscopía electrónica aplicada al estudio morfológico.
3.4.2.-Resolución
Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como Límite de Resolución, el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos aspectos de la informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el tamaño, mayor será la cantidad de detalles de la imagen digital.
Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos:
• Ojo humano: 0,2 mm.
• Microscopio Fotónico: 0,2 µm.
• Microscopio electrónico: 0,2 nm.
3.4.3.-Factores que determinan el poder de resolución
Al observar pequeños objetos al microscopio, la luz incidente proveniente de ellos es desviada de su trayectoria inicial y mientras más pequeños sean, mayor será la desviación. Las lentes del objetivo deben recolectar como sea posible la mayor cantidad de rayos desviados para formar una imagen nítida; a más rayos capturados, mayor resolución (fig.3-3).
Figura 3-3.-Esquema que muestra un objeto (1) que es atravesado por un haz de rayos luminosos (2) los cuales son captados por el objetivo (3). Al formarse el cono de luz proveniente del objeto se determina un ángulo, también llamado de apertura, donde a representa la mitad del mismo. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).
A partir de las observaciones precedentes, nace la definición de apertura numérica (AN), cifra a considerar para determinar el rendimiento de una lente objetivo (13):
AN = n x sen a
Donde a = la mitad del ángulo de apertura del objetivo.
n = el índice de refracción del medio que se encuentra entre el objeto y el objetivo.
(Para el aire n = 1 y para el vidrio o aceite n = 1.51)
Otra manera de incrementar la resolución es creando, del lado de la fuente luminosa, un cono amplio con un ángulo mayor. Para ello se emplea otro juego de lentes denominado condensador el cual posee la misma apertura numérica que el objetivo (fig. 3-4).
Figura 3-4.-El objeto (1) es iluminado con un rayo de luz (2) que formará un cono luminoso frente al objetivo. Se colocó otra lente (4) que recoge y condensa la luz antes que ilumine al objeto. Tomado de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13)
Para aumentar aún más la resolución, además de agregar un condensador, otra posibilidad es colocar algún líquido entre la lámina cubreobjeto y el objetivo. Se ha obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo índice de refracción es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexión de los rayos luminosos (fig. 3-5).
Figura 3-5.-A la izquierda el espacio entre el cubreobjeto (5) y el objetivo (3) es ocupado por el aire; a la derecha el espacio es ocupado por un líquido de inmersión (6). Apréciese que el cono de luz y el ángulo a son mayores con inmersión. Modificado de de Kapitza H G. Microscopy from the very begining (13).
El poder de resolución de un microscopio compuesto de campo claro puede ser calculado de manera razonable mediante la fórmula (13):
Donde delta= resolución expresada en micrómetros.
lambda = longitud de onda de la luz empleada.
Como la ANobj y la ANcond son iguales, se resume 2AN.
De los anteriores planteamientos se deduce que el poder de resolución de un sistema óptico, en términos generales depende principalmente de:
• Apertura numérica del objetivo y condensador: La relación apertura/resolución es directamente proporcional; a mayor apertura, mayor resolución.
• Longitud de onda de la radiación electromagnética utilizada: La relación longitud de onda/resolución es inversamente proporcional; a menor longitud de onda, mayor resolución.
3.5.-Factores que limitan la resolución en un sistema de formación de imágenes
3.5.1.-Difracción
3.5.2.-Aberraciones
3.5.3.-Corrección de las aberraciones de los objetivos

References: resolución

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 Resolución 
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