Source: https://www.scribd.com/doc/157143449/Soluciones-Electroforesis-protocolos
Timestamp: 2017-04-24 05:53:37+00:00

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Fig. 7. Principales aminoácidos responsables de la carga neta de una proteína, dependiendo del pH. En los soportes no restrictivos (en los que el entramado no interfiere en la migración, ya que el tamaño de las proteínas es muy pequeño en comparación con el tamaño de poro del soporte), la separación depende de la densidad de carga de las moléculas y, así, cuanto mayor sea la densidad, mayor será la velocidad de migración en un campo eléctrico hacia el polo que determine su carga neta. La primera etapa del proceso es la aplicación de la muestra. En papel o acetato de celulosa, esto se puede efectuar de forma puntual (permite el análisis de varias muestras simultáneamente en pequeñas cantidades) o longitudinalmente (permite el estudio de una sola muestra pero en mayor cantidad). La muestra se aplica disuelta en el tampón de electroforesis, del que está impregnado el soporte y que se encuentra en los reservorios de la cubeta, y se deposita en una pequeña zona, lo más estrecha posible, en el centro o en un extremo del soporte (si se conoce cuál va a ser la dirección de desplazamiento de la misma) y de forma perpendicular a la dirección del campo eléctrico. Conviene evitar la proximidad de los bordes del papel, ya que allí el campo eléctrico no es homogéneo y se distorsionan las bandas según avanzan. El volumen que se aplica suele ser inferior a 10 µL y si se necesitan mayores volúmenes porque la muestra se encuentre muy diluida, pueden hacerse aplicaciones sucesivas sobre la misma zona, dejando secar entre aplicación y aplicación. Es necesario humedecer el soporte (papel o acetato de celulosa) para que sea conductor; para ello, se impregna el soporte de tampón de electroforesis por ambos extremos y de forma simultánea para que por capilaridad se desplace hacia la zona de aplicación de la muestra. En los geles de agarosa, se perfora el gel con ayuda de un troquel o una pipeta de diámetro adecuado y se elimina esa porción por succión. La perforación puede ser cilíndrica o rectangular, dependiendo del número y cantidad de muestra a analizar y la muestra se deposita en el orificio practicado sin que llegue a rebosar. En este caso, el tampón está embebido en el soporte (agarosa). En todos los casos, la zona de aplicación debe ser lo más estrecha posible, para aumentar la resolución y evitar solapamientos entre bandas que migren en posiciones cercanas. La electroforesis termina cuando se haya producido la máxima separación de los componentes de la muestra, pero sin sobrepasar los límites del soporte. Para evitar que se sobrepasen estos límites, se utilizan los marcadores electroforéticos que son moléculas coloreadas con una movilidad electroforética superior a cualquier componente de la muestra (poseen elevada carga respecto a su tamaño). Entre los marcadores más utilizados se encuentran la dinitrofenil-lisina (DNP-Lys) y el azul de bromofenol. Una vez acabada la electroforesis, se procede a la etapa de tinción. El soporte se retira de la cubeta y se sumerge en un recipiente que contiene una disolución de un colorante que se une de manera específica a los componentes de la muestra y que precipita a los componentes separados en la posición en la que se encuentren. Las disoluciones más utilizadas en el caso de proteínas son el Negro Amido al 1% (p/v) en ácido acético y el Azul de Coomasie al 0.1% (p/v) en metanol/agua/ácido acético (9:9:2 v/v/v). Si la electroforesis se pretende desarrollar a escala preparativa, ha de utilizarse un papel de mayor grosor (175 gr/cm2), en lugar del utilizado en la electroforesis analítica (85-100 gr/cm2; 0.15mm de espesor), lo que permite la aplicación de una mayor cantidad de muestra (50-100µL). Inmunoelectroforesis. Es una combinación de una electroforesis en geles de agarosa seguida de una inmunodifusión (figura 8). En la primera parte, se realiza una aplicación puntual de la muestra, por lo que al final las distintas proteínas estarán distribuidas a lo largo del gel según el eje de migración. Acabada la electroforesis, y sin efectuar la tinción, se practica en el gel un canal (“trinchera”) paralelo a la dirección de migración con un bisturí de doble hoja (la separación de las hojas determina la anchura de la trinchera) en el que se deposita un antisuero que contenga anticuerpos específicos frente a una o varias de las proteínas separadas en la electroforesis. Los geles se mantienen así a temperatura ambiente (20-22°C) durante 24-48 horas. Los anticuerpos y las proteínas (que actúan como antígenos) difunden, y si se encuentran en la proporción adecuada, producen complejos antígeno-anticuerpo insolubles que precipitan y aparecen en el gel como bandas elipsoidales. Estos complejos solamente se producen cuando ambos compuestos se hallan en lo que se conoce como relación de equivalencia y que no son idénticas para todas las proteínas presentes en la muestra; por eso, deben determinarse en experimentos preliminares las cantidades idóneas de antisuero y de la muestra, así como las distancias entre el pocillo de aplicación de la muestra y la trinchera, ya que si las distancias son muy pequeñas, el antígeno (las proteínas) difunde rápidamente y puede no formarse el precipitado, y si la distancia es mayor de la idónea, hay que emplear mayor cantidad de antisuero y la duración del proceso se alarga. Una vez formadas las bandas de precipitación, el gel puede lavarse para eliminar las proteínas que no hayan inmunoprecipitado y, posteriormente, teñirse como se ha descrito anteriormente. Cada proteína de la muestra produce una banda de precipitación independiente, por lo que es posible identificar el número de constituyentes de la muestra que son reconocidos por los anticuerpos.
Sin embargo. participan directamente en el proceso de separación. Para evitar esto. La IEF es una técnica principalmente cualitativa. Se preparan de modo que sus poros sean de un tamaño comparable al de las proteínas. además de evitar la convección y minimizar la difusión. por lo que dos proteínas con idéntica densidad de carga. Permite identificar substancias en mezclas muy complejas y en concentraciones muy bajas. 8.2006 www. por lo que pueden ser deshidratados y reducidos a una fina película.
Fig. Son químicamente inertes frente a las moléculas biológicas. Electroforesis en Geles de Poliacrilamida (PAGE). Los geles de poliacrilamida son soportes restrictivos del tipo II. etc. requiere que dichas substancias sean inmunogénicas y depende de los anticuerpos utilizados. bisacrilamida y poliacrilamida En función de la concentración de acrilamida se obtienen entramados más o menos densos. 02. grado de reticulación (tamaño de poro). lo que facilita su almacenamiento. transparentes y estables en un amplio intervalo de valores de pH. que se desarrolla en condiciones nativas y es especialmente apropiada para el análisis de líquidos fisiológicos y extractos celulares. la separación electroforética depende entonces de la densidad de carga de las moléculas y de su tamaño. por lo que es difícil de estandarizar. aunque también puede ser útil para ácidos nucleicos. pero de tamaño diferente pueden ser separadas. puede haber más componentes que no sean detectados por el antisuero empleado o que no hayan alcanzado la relación de equivalencia antígeno-anticuerpo adecuada. la N. de manera que produzcan un efecto de tamizado molecular.com Página 2 de 17
.cultek. no presentan efecto EEO y son mecánicamente estables. El número de bandas observado en una IEF debe entenderse como el número mínimo de componentes presentes. temperatura y fuerza iónica. Se utiliza mayoritariamente para la separación de proteínas. • Preparación del soporte.N’-metilen-bisacrilamida que forma parte de dos cadenas que quedan así unidas covalentemente. Fases de una inmunoelectroforesis (IEF). ya que el soporte dificulta más el avance de la de mayor tamaño. se utiliza otro monómero. mientras que la cantidad de bisacrilamida condiciona el grado de entrecruzamiento de las cadenas. las características físicas del gel resultante: su resistencia mecánica.Soluciones Electroforesis
La gran especificidad y sensibilidad de las reacciones de precipitación. Estructura de la acrilamida.
Fig. formarían un gel sin consistencia mecánica y totalmente inmanejable. Ambos componentes determinan. permite diferenciar substancias con movilidades electroforéticas idénticas y detectar componentes que se encuentren en concentraciones mínimas (µg). 9. son también resistentes a agentes desnaturalizantes (urea. El soporte se prepara a partir del monómero de acrilamida (figura 9) que forma largas cadenas lineales. en conjunto. detergentes). por lo que. fragilidad. elasticidad. con abundantes grupos polares que las hace solubles en medios acuosos. es decir. Al no estar las cadenas unidas entre sí.
deben manejarse en una campana extractora con guantes y mascarilla. Es la forma más habitual en la que se desarrolla la PAGE. en función de los distintos tamaños Proteína Albúmina Transferrina B1 lipoproteína
M (kDa) 69 90 1300 160 400
Longitud (Å) 150 190 185 235 700 kDa >100 20-150 10-80 <15
Diámetro (Å) 38 37 185 44 38
Inmunoglobulina Fibrinógeno
Concentración de acrilamida (%T) 3-5 5-12 10-15 >15
Al polimerizar la acrilamida. Consiste en un tubo de vidrio de dimensiones variables. el proceso se inicia con la adición de persulfato amónico a una disolución acuosa (tampón) de ambos monómeros (acrilamida + bisacrilamida).2006
www. PAGE preparativa y algunos casos muy específicos de análisis de proteínas radioactivas. Adición de la solución de monómeros.N. aunque conviene dejarlo transcurrir más tiempo para que no queden restos de monómeros o de pequeñas cadenas libres. la formación de burbujas durante la polimerización que distorsionan el gel y alteran el campo eléctrico). la toxicidad se reduce al mínimo. 7.5 y 30%T respectivamente. Así. 8 Placa. Incrementando %T el tamaño de poro decrece (los geles con %T inferiores a 2. aunque lo más habitual (sobre todo para la separación de proteínas) es el modo vertical (figura 10). la utilización de PAGE en tubo ha quedado restringida a la primera dimensión en electroforesis bidimensionales. Preparación del gel para una electroforesis en placa. abierto por los extremos. La temperatura óptima de polimerización es de 25-30°C y el proceso ocurre en pocos minutos. los hay de dos tipos: 8 Tubo.Soluciones Electroforesis
La polimerización de la acrilamida se obtiene por la adición de catalizadores de la polimerización que inician y aceleran el proceso de formación de un gel tridimensional. Se tapa el orificio inferior y se rellena con la disolución de polimerización sobre la que se deposita una pequeña cantidad de butanol (con esto se evita que al polimerizar el gel forme menisco y se excluye el oxígeno que interfiere en la polimerización). por ello. aunque normalmente es de 15-20 cm de largo × 0.
Fig. Una vez realizada la polimerización. Tamaño aproximado de algunas proteínas y concentraciones de acrilamida (%T) utilizada en PAGE. El gel formado presenta los pocillos donde aplicar las muestras. Puede llevarse a cabo en posición horizontal o vertical (dependiendo del tipo de cubeta empleada). pero es recomendable continuar manipulando el gel con guantes. por lo que es necesario un molde para preparar el gel. seguido de la adición de TEMED (N. Por ello.5-0.5-3. Siempre debe evitarse la presencia de oxígeno. la mezcla de polimerización debe desgasificarse a vacío (lo que impide. Las dimensiones habituales de los geles son: 10-20 cm (L) × 10-15 cm (A) × 0. debido a la posible presencia de radicales libres.8 cm de diámetro interno. Normalmente.cultek. pues inhibe la polimerización.0% son casi líquidos y los geles con un %T del 30% presentan un reticulado tan denso que moléculas tan pequeñas como 2000-3000 Da difícilmente pueden atravesarlos). inferior al 1%).5.5 mm (E). un gel de poliacrilamida se define por el reticulado (%T) que es la concentración total de monómeros (acrilamida + bisacrilamida. El tamaño de poro de los geles de poliacrilamida viene determinado por la concentración total de monómeros. En la actualidad. El tamaño medio de poro es 800Å. ajustando las concentraciones de persulfato y TEMED puede controlarse la velocidad de polimerización.
02. Los monómeros (ya sea en polvo o en disolución) son neurotóxicos por absorción a través de la piel o por inhalación. % p/v) y la dureza (%C) que viene dada por la relación de la cantidad de bisacrilamida al total de monómeros (es un valor bastante constante y.51. Elementos para ensamblar el molde. Tabla I. Por lo tanto.N’.N’-tetrametilendiamina) que actúa como propagador de la reacción de polimerización a pH básico (el pH ácido retarda la polimerización). Una vez formado el gel. 10. 50Å y 20Å para valores de 2. se elimina el butanol y se retira la tapa inferior del tubo. además. Los espaciadores (sujetados con pinzas de presión) colocados sobre los cristales forman el molde. normalmente. adquiere la forma del recipiente. Colocación del peine en la parte superior.com
. En la tabla I se muestran los tamaños aproximados de un conjunto de proteínas y los geles que se suelen utilizar para su análisis.
etc. Otros poseen carga negativa y un fuerte carácter desnaturalizante. así. En el tampón de la muestra. Este hecho es debido a que la zona de concentración tiene un tamaño de poro muy grande (2. sin la organización tridimensional característica de su funcionalidad biológica. como el 3-(cloroamido propil)dimetilamonio-1-propanosulfato (CHAPS) solubilizan muy bien las proteínas de membrana. Este gradiente de concentración de acrilamida puede ser lineal o no (cóncavo. pues los complejos SDSproteína se separan estrictamente según su tamaño molecular. El volumen de muestra que puede aplicarse a cada pocillo depende del tamaño de la propia muestra y del pocillo. son la urea y determinados detergentes. aumenta la resolución de la electroforesis. por lo tanto. la concentración del gel es uniforme y hay un único tampón. Los detergentes afectan a la estructura nativa de las proteínas y a las interacciones con otras moléculas (proteínas. tales compuestos. 11. capacidad de unión de anticuerpos. Con el fin de que ésta. por lo que no es restrictiva frente al de la zona de resolución cuyo tamaño de poro sí es restrictivo. En presencia de algunos compuestos químicos. Existen tres tipos principales de detergentes: 8 Detergentes no iónicos. también se añade el marcador electroforético (el más utilizado es el azul de bromofenol) para poder determinar el final del proceso.). llamados agentes desnaturalizantes.0% (p/v) y deben incluirse en el tampón de la muestra y en el del gel. lípidos. así como de proteínas nucleares y ribosomales (ya que tienen mucha tendencia a agregar y son insolubles) y para el análisis conformacional de proteínas (mediante geles con gradientes transversales de urea). con lo que las bandas se estrechan. Son débilmente desnaturalizantes y no alteran la carga de las proteínas a las que se unen. por lo que finalizada la electroforesis. algunos. aunque los primeros son los más utilizados. En la cubeta. es decir. La modalidad más sencilla es la descrita en apartados anteriores en las que la muestra se carga directamente en el gel en el cual se va a producir la separación. que se polimeriza sobre la anterior (quedan fundidas). Son débilmente desnaturalizantes y no afectan a la carga de las proteínas. que contiene los pocillos de aplicación de la muestra y cuya finalidad es concentrar la muestra en la zona de contacto con la zona de resolución (figura 11). El SDS interacciona con las proteínas formando complejos de características 02. La urea interfiere con las reacciones hidrofóbicas de las proteínas y debe incluirse en el tampón de la muestra y en todos los que se empleen para la preparación de los geles. aunque también se incrementa su duración. cuanto mayor sea la anchura del gel. disuelta en el mismo tampón. Otros agentes desnaturalizantes de proteínas. producen el desplegamiento de la proteína que queda.Soluciones Electroforesis
Si se aumenta la longitud del gel. Se utilizan a concentraciones de 0. etc. se pueden utilizar en geles con urea y en electroenfoque. produciendo bandas muy finas y con una gran resolución. hay dos geles diferentes en uno solo: una zona de resolución (donde tiene lugar la separación de las proteínas) que se polimeriza sin colocar el peine (por lo que la parte superior presenta un frente plano) y otra pequeña zona de concentración de 1-3 cm. La PAGE se desarrolla en condiciones en las que no se altera la conformación nativa de las proteínas separadas. • PAGE en condiciones desnaturalizantes.2006 www. el ß-mercaptoetanol (ß-ME) o el ditiotreitol (DTT). Son compatibles con la utilización de urea y su uso es frecuente como alternativa a los detergentes no iónicos. etc.cultek. el más empleado es el dodecilsulfato sódico o lauril sulfato sódico (SDS) 8 Detergentes anfóteros. El espesor del gel y las dimensiones de los pocillos viene determinado por el grosor de los espaciadores y el tamaño del peine determina la cantidad de muestra que puede aplicarse. en pasos. PAGE en condiciones no desnaturalizantes en sistemas de tampón discontinuo. Permite el cálculo de parámetros moleculares (al contrario que el resto de los tipos de electroforesis).0%T). Estos puentes se pueden romper mediante tratamiento con determinados agentes reductores. Los más empleados son el Triton X-100 y el Octilglucósido. las proteínas pierden su estructura nativa.). Además.) Otra modalidad de electroforesis no desnaturalizante es aquella en la que el tampón presente en los reservorios es diferente al que impregna el gel.
Fig.5-3. el tamaño de poro decrece de forma inversa. ya que las interacciones hidrofóbicas de las proteínas son sustituidas por interacciones detergentes-proteína. en realidad. pero oscila entre 10100µL con un máximo de 200µL. Pueden tener carga positiva (catiónicos) que se usan para la separación de proteínas muy ácidas o muy básicas.1-3. Asimismo. glicerol o sacarosa). mayor será el número de pocillos y. pueden realizarse estudios de funcionalidad de dichas proteínas separadas (actividad enzimática. el cual tampoco es homogéneo. por lo tanto. Con estos geles el intervalo de tamaños de proteínas que pueden separarse se incrementa considerablemente frente a los geles homogéneos y presentan una mayor resolución. el tampón del reservorio superior cubre el gel y los pocillos en los que se ha de cargar la muestra. concentrándose sobre su parte delantera. 8 Detergentes iónicos. En algunas proteínas hay puentes disulfuro entre los residuos de Cys (para formar cistinas) de una misma cadena polipeptídica (puentes intracatenarios) o de diferentes cadenas (puentes intercatenarios) de algunas proteínas con estructura cuaternaria. • PAGE en condiciones no desnaturalizantes. las moléculas de la parte delantera de la banda se frenan más (encuentran antes los poros más pequeños) que las moléculas de la parte trasera. unión a receptores. no difunda al depositarla en los pocillos. ya que. el más utilizado es el cetiltrimetilamonio (CTAB). como por ejemplo. Una modalidad de la electroforesis vertical es la realizada con geles en gradiente en los que la concentración de acrilamida (%T) aumenta progresivamente desde la parte superior del gel hasta la inferior. el de muestras que se pueden analizar simultáneamente y en idénticas condiciones. • PAGE-SDS.com Página 4 de 17
. las principales aplicaciones de la urea es en la separación de las histonas. se le puede añadir un compuesto que aumente su densidad (normalmente. particularmente para solubilizar proteínas de membrana.
pero como regla general y para geles de 20×20 cm de 1. En una proteína nativa de 25 kDa.001% (p/v). se añade glicerol o sacarosa al 10% (p/v) y como marcador azul de bromofenol al 0. se suele añadir entre 1-10µg de muestra (más de 100µg de proteína supone una sobrecarga del gel). el SDS sólo producirá una desorganización parcial de la estructura (figura 12). por lo tanto. La proteína con un puente disulfuro intracatenario.com Página 5 de 17
. en presencia de SDS se desnaturaliza parcialmente. Como ya se ha comentado. se añade ß-ME (5% v/v) ó DTT (20 mM) si se requieren condiciones reductoras. en los de los geles (de concentración y de resolución) y en el de la muestra para mantener las condiciones desnaturalizantes. la muestra se calienta a 100°C durante al menos 3-5 minutos y.cultek. es decir. En resumen. 8 Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente.05M. en presencia de SDS. como es la masa molecular.8) se añade un exceso de SDS (2% p/v). manteniendo sin desplegar la zona que abarca el disulfuro. 12. pH = 6. por lo que los complejos SDS-proteína están cargados negativamente de forma uniforme (la carga por unidad de masa es prácticamente constante para todos los complejos). lo que implica que las cargas propias de las proteínas quedan enmascaradas o anuladas. además. la molécula de SDS proporciona una carga negativa. El tratamiento con SDS+DTT rompe el puente disulfuro y permite el despliegue total de la proteína.5mm de espesor y tinción con azul de Coomasie. la SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas debido a: 8 La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.Soluciones Electroforesis
comunes independientemente de las de cada proteína. 0. El SDS debe incluirse en el tampón de los reservorios. tienen la misma forma elipsoide). La cantidad de muestra que se añade depende de la sensibilidad de la tinción posterior que se vaya a utilizar. Al tampón en el que va disuelta la muestra (Tris HCl. Para incrementar la densidad de la disolución de la muestra. como ésta es constante para todos los complejos SDS-proteína (que. 8 La separación depende de un parámetro físico-químico. opcionalmente. la movilidad electroforética en una PAGE es función del tamaño y de la carga por unidad de masa. Si son dos o más las cadenas unidas por puentes disulfuro intercatenarios. la ausencia de reductores se traduce en que si las proteínas poseen puentes disulfuro. el tratamiento con SDS ( ) ó SDS+DTT ( ) producen idéntico resultado.
Fig. 02. para facilitar la unión del SDS a las proteínas.2006 www. asimismo. cuanto menor sea la masa molecular de la proteína. quedarán más o menos desplegados en función de la posición de los puentes disulfuros (figura 13). mayor será la movilidad de la misma y viceversa. 8 Su densidad de carga es muy elevada. Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforética de proteínas monoméricas.
Las proteínas unen una molécula de SDS por cada dos aminoácidos. 8 Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran. esta movilidad es solamente función de la masa molecular. en el mismo sentido. carente de puentes disulfuro. que se puede calcular. por lo que su velocidad de migración también lo es y las electroforesis son muy rápidas. La preparación de la muestra es de la máxima importancia para asegurar que todo lo comentado anteriormente se cumple. La PAGE-SDS puede realizarse en condiciones reductoras o no reductoras.
permite saber si una muestra no es homogénea (porque aparecen varias bandas en un gel) pero no permite establecer que sea homogénea (puede haber varias proteínas que tengan la misma movilidad electroforética y aparecerían como una sola banda). presenta elevado background. detecta hasta 1ng de proteína por banda). Otro método de tinción es con sales de plata. Su análisis permite identificar el número mínimo de componentes (bandas) de cada muestra. que tiene como principal ventaja su elevada sensibilidad (hasta 0.4-difenil-3(2H) furanona. Cada banda se caracteriza por su movilidad electroforética relativa (“Ur”)
L muestra L marcador
⎧L muestra ≡ Longitud recorrida por la muestra ⎨ ⎩L marcador ≡ Longitud recorrida por el marcador
La PAGE es un criterio de pureza negativo. baja reproducibilidad. es decir. sobre todo.1-0. ácidos nucleicos y polisacáridos también se tiñen. 13.2006
www. emplea compuestos fluorescentes que se unen específicamente a las proteínas (la unión puede realizarse antes o después de la electroforesis). Un método de sensibilidad comparable a la tinción con sales de plata. la imagen que se obtiene es un conjunto de bandas coloreadas sobre un soporte transparente. no es totalmente específico de proteínas.
02. Una vez teñido el gel de poliacrilamida. Una vez finalizada la PAGE. la fluorescamina (detecta hasta 3-5ng de proteína por banda) y el MDPF (2-metoxi-2. el más utilizado es el azul de Coomasie con el que se pueden visualizar 0. como el cloruro de dansilo (detecta hasta 10ng de proteína por banda). se separa el gel de las placas de vidrio haciendo palanca con una espátula y se visualiza con un colorante.1ng de proteína por banda). ya que algunos lipopolisacáridos.cultek. aunque tiene como desventajas que es muy laboriosa y cara. Efecto del SDS y del DTT en la movilidad electroforética de proteínas oligoméricas.5 µg de proteína por banda.com
. algunas proteínas no se tiñen y.Soluciones Electroforesis
y en la segunda (segunda dimensión) según un parámetro distinto del anterior. Obsérvese que algunas bandas producen más de una mancha en la segunda dimensión. Hay proteínas con un comportamiento anómalo en SDS-PAGE. si se representan los valores de logaritmo del peso molecular (logM) frente a la movilidad electroforética (Ur) de un conjunto de proteínas. se combinan dos modos de separación diferentes y se consigue el máximo de resolución posible mediante técnicas electroforéticas. las proteínas ribosomales se separan en un gel discontinuo en la primera dimensión. por lo tanto. en las glicoproteínas y las lipoproteínas. Electroforesis bidimensional. en condiciones no desnaturalizantes y la segunda en condiciones desnaturalizantes. se obtiene una relación lineal (figura 14). y en los del 5%T.
Fig. 02.com Página 7 de 17
. aceptándose que la aparición de una sola mancha indica una muestra homogénea. y ambos en presencia de urea. entre 25 y 200 kDa. por ejemplo. la idea de electroforesis bidimensional suele referirse a la combinación de los dos tipos de electroforesis más resolutivos: electroenfoque (primera dimensión) y SDS-PAGE (segunda dimensión) (figura 15). se utiliza un conjunto de proteínas de peso molecular conocido (marcadores de peso molecular) que se someten a SDS-PAGE en el mismo gel que se analizan las proteínas cuyos peso molecular se desea conocer. esto hace que la relación carga/tamaño sea menor y.cultek. 15. Cálculo de pesos moleculares de proteínas por SDS-PAGE. seguido por otro continuo en la segunda. normalmente. donde se desarrolla la segunda dimensión (EEF) perpendicularmente a la primera. el intervalo lineal va entre 15 y 70 kDa.2006 www. El carril III se coloca sobre un nuevo gel que se ha polimerizado sin pocillos. la parte no proteica no une SDS y puede impedir el acceso del mismo a la proteína. Es una sucesión de dos electroforesis distintas (o en distintas condiciones) realizadas sobre una misma muestra. El carril del pocillo III (sombreado) se corta y el resto del gel se tiñe. 14. en geles del 10%T. Sin embargo. En el pocillo I se aplica el marcador de pesos moleculares y en los pocillos II y III la muestra.
Fig. tamaño o pI). Electroforesis bidimensional. Por ello. La electroforesis bidimensional puede considerarse como un criterio de pureza positivo debido a su gran poder de resolución. Primera dimensión (SDS-PAGE). las glicoproteínas y lipoproteínas unen menos SDS que la mayoría de las proteínas. tengan menor movilidad electroforética y se comporten como si tuvieran mayor tamaño. En la primera de ellas (primera dimensión) se separan los componentes de la muestra según un criterio (carga. Normalmente. las histonas se separan en geles con urea y ácido en la primera dimensión y utilizando tritón/ácido/urea en la segunda. Es importante señalar que la relación lineal entre logM y Ur se mantiene para una concentración dada de poliacrilamida (%T) y sólo en un corto intervalo de peso molecular. De esta manera.Soluciones Electroforesis
En las condiciones de la SDS-PAGE. que llevan unidos azúcares o lípidos. De forma general. La primera dimensión puede llevarse a cabo. en geles del 15%T la relación lineal es válida para proteínas comprendidas entre 12 y 45 kDa.
Además. para proporcionar intensidades constantes del orden de 50-150mA. la difusión es un fenómeno con efectos negativos. esto se llama efecto focalizante del EEF y es el responsable de su enorme resolución. se emplean compuestos anfóteros de bajo peso molecular llamados anfolitos portadores. El gel se prepara a partir de una disolución de acrilamida (3-5%T para facilitar la movilidad) y bisacrilamida en agua. La distancia migrada por la muestra (X) se interpola en la recta obtenida. Si esta disolución se emplea para la preparación de un gel de poliacrilamida. se trocea el carril III y cada segmento (de 1-2 mm) se introduce en 1mL de agua. en cuyo caso los geles son de muy poco grosor (<0. debido a la difusión. 16. adquirirían carga y experimentarían el efecto focalizante mencionado anteriormente. como los geles de poliacrilamida. urea (8M) o detergentes ni iónicos o anfóteros (pero nunca detergentes iónicos como el SDS). Una disolución de una mezcla de estos anfolitos tendrán un pH próximo al promedio de los pI.5 mm) y se polimerizan sobre láminas de plástico tratadas especialmente para que se adhieran al gel.com
⎧pH > pI ⇒ Carga nula negativa ⎪ La carga neta de una proteína es función del pH: ⎨pH = pI ⇒ Carga neta nula (figura 16) ⎪pH < pI ⇒ Carga nula positiva ⎩
Fig. Es un tipo particular de electroforesis en la que los compuestos anfóteros se separan según su punto isoeléctrico (pI. como la 3-dimetilaminopropil metacrilamida) o utilizando gradientes de pH inmovilizados (que se consigue copolimerizando con la acrilamida los compuestos químicos que establecerán el gradiente. frente a su posición en gel.2006
www. Por todo esto. a la que se añaden los anfolitos. y en el II la muestra (X) cuyo pI se desea conocer. junto con las proteínas. para ello.001 unidades de pI. Cuando se alcanza el equilibrio queda formado un gradiente de pH a lo largo del gel. pudiendo llegar a separar proteínas que difieran en 0. por lo que el soporte debe estar refrigerado a 4°C o alrededor de 10°C si se utilizan geles con urea (ya que la urea precipita a 4°C). Si. Estos voltajes tan elevados lleva asociado un importante incremento de temperatura. en el EEF se necesitan fuentes de alimentación capaces de generar 3. Los gradientes de pH generados en algunos soportes.cultek. pH al cual la carga neta de la proteína es nula) en un gradiente continuo de pH. que son pequeñas poliaminas (alrededor de 750 kDa) con abundantes grupos ácidos y básicos. que tiende a ensanchar las bandas. Una vez corrido el gel. La variedad más utilizada de EEF es la analítica. adquiriría carga (positiva o negativa según hacia el polo que difundiera) y por efecto del campo eléctrico volvería a la zona de su pI. aunque también puede llevarse a cabo en cubetas horizontales. se representa el pH de cada fracción. se utiliza un formador de gradiente (sistema de vasos comunicantes) y dos disoluciones con distinta densidad (una más densa de carácter ácido. Una de las aplicaciones más importantes del EEF es el cálculo de pI (figura 17). En el EEF el efecto de la difusión es mínimo y por ello posee una enorme resolución. los anfolitos van perdiendo carga hasta llegar a su pI. Si el EEF se va a desarrollar en un gel con un gradiente de pH inmovilizado. al aplicar una diferencia de potencial cada molécula de anfolito migrará hacia uno u otro polo en función de su carga. con lo que se reduce la conductividad del medio). En todos los métodos electroforéticos descritos anteriormente. que consiste en que el gradiente se hace inestable con el tiempo y se desplaza. determinándose así su pH. en el pocillo I se aplican los marcadores de pI. esto se debe. el disponer de un gradiente estable de pH es lo esencial del EEF. disminuyendo la resolución. además de los anfolitos. El carril III (sombreado) se emplea para determinar el gradiente de pH. Esto se debe a que si una proteína focalizada en su pI se desplazase por difusión. los anfolitos abandonasen la zona de su pI. La deriva catódica puede evitarse variando la naturaleza química del gel (se usan derivados de acrilamida.
02. al flujo electroendosmótico. La preparación del gel es totalmente análoga a la de PAGE.000V. incorporando. determinándose su pH. Representación de la carga neta (Q) de una proteína en función del pH. por lo que las moléculas que forman el gradiente están fijas sobre las propias fibras de poliacrilamida). con gran capacidad de tamponación cerca de su pI y con una gran solubilidad y conductividad. muestran el fenómeno denominado deriva catódica.0.5 hasta 11. hacia el cátodo. El desarrollo del EEF es más complejo que el de la PAGE. hasta alcanzar la zona de su pI.Soluciones Electroforesis
Electroenfoque. ya que se utilizan voltajes variables (ya que según se va formando el gradiente. el EEF aumenta su resolución al disminuir el intervalo de gradiente de pH. por lo que quedará en la parte inferior del gel y otra más básica de menor densidad que quedará en la parte superior del gel). Finalmente. Curva de titulación de una proteína. fundamentalmente. con un pI que abarca desde 2. El EEF puede llevarse a cabo en condiciones que mantengan la estructura nativa de las proteínas o en condiciones desnaturalizantes.
se describió para el caso de RNA y proteínas (Northern y Western Blot respectivamente). mecánicamente son más estables y presentan una gran resistencia química a los reactivos utilizados para la caracterización estructural de las proteínas. mantenidas por un marco o armazón de plástico. que posee una buena capacidad de unión de proteínas (250µg/cm2) y hay variedades con diferentes grados de porosidad según el tamaño de las proteínas a transferir.
02. siendo uno de ellos la propia base de la cubeta. Las proteínas quedan unidas a la membrana de forma no covalente. Southern para el caso de DNA (Southern Blot). pero también pueden ser lecitinas. mediante interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. es decir. que el EEF es un criterio de pureza negativo. mayor será la probabilidad de que al aparecer una banda. se puede obtener información acerca de las proteínas si éstas se transfieren desde el gel a una membrana. El proceso consta de cuatro fases (figura 18): • Transferencia.2006
www. el gel. no obstante. estas moléculas son anticuerpos (el proceso se conoce como inmunoblotting). aplicando vacío. Determinación del punto isoeléctrico de una muestra. cuanto menor sea el gradiente de pH utilizado. ya que retienen mayor cantidad de proteínas. la muestra sea homogénea. por capilaridad). • Bloqueo de la membrana. Una vez en la membrana.cultek. varias bandas indican que la muestra es heterogénea. posteriormente y continuando con la misma terminología. El proceso de transferencia se denomina blotting y fue originariamente descrita por E. pero la aparición de una única banda no permite afirmar que la muestra sea homogénea. Hay que volver a destacar. las proteínas están accesibles (cosa que no ocurre en el gel) para interaccionar con otras moléculas que permitan su identificación. 8 El primer sistema de realizar la transferencia emplea una cubeta similar a las de electroforesis de tipo vertical en la que los electrodos son un conjunto de hilos de platino.Soluciones Electroforesis
Fig. • Detección. Puede llevarse a cabo por diferentes métodos (difusión. La primera membrana utilizada para la transferencia fue de nitrocelulosa. • Unión del ligando. ácidos nucleicos. ya que pueden coexistir proteínas diferentes con igual pI.com
. 8 El segundo sistema emplea una cubeta horizontal y los electrodos son placas de grafito o metálicas. Las membranas de naturaleza hidrofóbica (PVDF [difluoruro de polivinildeno]) presentan ventajas frente a las de nitrocelulosa. Transferencia a membranas (Western Blot). receptores o cualquier otro ligando. una vez más. M. pero para proteínas separadas en geles de poliacrilamida se suele recurrir a un campo eléctrico que se aplica perpendicularmente al plano del gel. 17. son compatibles con la mayoría de los sistemas de detección. Finalizada la PAGE. en la mayoría de los casos. El gel y la membrana están emparedados entre un conjunto de hojas de papel de filtro y láminas de esponja. la membrana y el conjunto de hojas de papel de filtro a cada lado quedan emparedados por los electrodos.
p Unión del ligando específico (anticuerpo primario) a la-s proteína-s transferidas. p/v) o Tween 20 (0. q Detección mediante un anticuerpo secundario conjugado con HRP o FA. leche en polvo desnatada (3%. n Transferencia de las proteínas a la membrana.cultek. p/v).2006
02.Soluciones Electroforesis
Fig. Fases de un Western Blot.1%) para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos. o Bloqueo de la membrana no ocupada por las proteínas con BSA (3-5%.com
migran en función de su tamaño y/o conformación (tabla II).0 0. ya que finalizada la electroforesis. Finalmente. La flecha horizontal indica la dirección de migración de la muestra. que representa el peso que puede soportar 1 cm2 de un gel de agarosa al 1%. La electroforesis de DNA se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida. En los tampones habitualmente utilizados. habitualmente. Cada molécula aporta una carga negativa (procedente del grupo fosfato). Tabla II.0-4. de modo que los diferentes fragmentos (al tener la misma relación carga/tamaño). El molde empleado se muestra en la parte superior. que gelifican a menos de 30°C y funden a 65°C. para separar fragmentos de tamaño superiores a 50kb se utiliza la electroforesis de campo pulsante en la que la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente. Agarosa (%) 0. Se trata del método más común para el análisis.8-10.1-2. contaminantes en algunas agarosas.com
. los ácidos nucleicos están cargados negativamente y migran hacia el ánodo. el gel se puede licuar a temperatura superior a la de fusión y así separar el DNA en disolución. Su resistencia mecánica se expresa en gr/cm2.5 2.0 15.5% (y mantenidas a 4°C) separan eficazmente fragmentos de DNA de 700-3000pb. • Los geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para fragmentos pequeños de DNA (5-500pb). lo que perjudica la resolución. el flujo electroendosmótico (EEO) va en contra de la dirección de migración del DNA (hacia el ánodo). Hay agarosas de gran reticulado para fragmentos de pequeño tamaño molecular. ligasas.7 0.cultek. La presencia de polisacáridos sulfatados. Estos datos son importantes.6 0. endonucleasas de restricción. Concentraciones de agarosa o acrilamida utilizadas para la separación electroforética de fragmentos lineales de DNA de diferentes tamaños. Además. Electroforesis submarina en geles de agarosa. por lo que es muy aconsejable utilizar agarosas con valores muy bajos de EEO.5 5. etc. puede ser perjudicial. 19.).0 0.0 8. La agarosa estándar tiene una resistencia de 1000-2000gr/cm2. algunas son transparentes lo que facilita enormemente el proceso de detección.4-6. El modelo más habitual de cubeta horizontal.Soluciones Electroforesis
La electroforesis de ácidos nucleicos es el método habitual para separar.2006
www.0 20. independientemente de su tamaño (un nucleótido tendrá la misma movilidad que un fragmento de doble cadena de 800pb o uno de 5kb).0 Intervalo de tamaños separables (kb) 5-60 1-20 0.0 Intervalo de tamaños separables (kb) 1000-2000 80-500 60-400 40-200 25-150 6-100
También es importante tener en cuenta la fragilidad del gel. Ambos soportes son restrictivos para los ácidos nucleicos. es bastante similar al descrito en la
Fig. Electroforesis en geles de agarosa. La cubeta se aloja en su parte central al soporte (gel).2 1.0 12.0 0. purificación y obtención de DNA. así como para la mayoría de los RNA. como una unidad.0 Acrilamida (%) 3. molde y gel. en la que se realiza la electroforesis en geles de agarosa.3 0. La agarosa estándar gelifica a 35°C y funde a 80-90°C. indicar que en la agarosa. • Los geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb).9 1. identificar y purificar moléculas o fragmentos de DNA y RNA. aunque las hay modificadas por adición de grupos hidroxietilo.0 0.2-3. ya que son inhibidores de las enzimas con las que va a tratarse el DNA purificado en la electroforesis (polimerasas. en la cubeta se colocan ambos.
02.5-7. Un aspecto importante de las agarosas es su estado físico. Las agarosas disponibles comercialmente presentan una amplia gama de grados de pureza y especificaciones. las de bajo punto de fusión alrededor de 200gr/cm2 y las de alta resistencia llegan hasta 6000gr/cm2. utilizando agarosas de distintas concentraciones (distinto grado de reticulación) pueden separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico constante. por lo que la relación carga/tamaño es prácticamente constante e idéntica para todas las moléculas. utilizadas a concentraciones de 2.
Relación entre el tamaño de los fragmentos de dsDNA lineal y su movilidad electroforética. Para estimar el tamaño de los fragmentos de DNA analizados. es decir. Cuando se trata de estructuras circulares. por la cual estructuras de tamaño intermedio migran más lentamente que otras mayores. y se le añade uno o varios marcadores. con bromuro de etidio (BrEt) cantidades menores de 5ng/pocillo son escasamente visibles. Por encima de 50kb. elevados voltajes producen bandas estrechas y bastante bien resueltas cuando se trata de fragmentos pequeños. la cantidad puede incrementarse hasta 30-50µg. Para conseguir el máximo de resolución. por ejemplo. para diferentes concentraciones (%T) de agarosa. sin embargo. menor diámetro de poro y menor movilidad. los fragmentos se van ordenando hacia el ánodo en relación a su tamaño. Esta modalidad es habitual en estudios de mapeo genético. Un dsDNA lineal se mueve en un gel de agarosa a una velocidad que es dependiente del tamaño del poro del gel. cuanto más “retorcido” este el DNA circular. como pBR322. A mayor concentración de agarosa. xylene cianol FF (0. para geles alcalinos).com
. atraviesa mejor el gel y tiene mayor movilidad. La movilidad electroforética de los fragmentos de DNA es inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño. El voltaje que se aplica en los geles de agarosa depende de la resolución requerida y del tamaño de los fragmentos a separar. Este fenómeno es más acusado a elevadas concentraciones de agarosa y bajos voltajes. En general. La muestra de DNA se carga en los pocillos en una disolución (idealmente en el mismo tampón de la electroforesis) a la que se le incrementa la densidad con sacarosa (40% p/v). adoptando forma de horquilla. los fragmentos grandes cambian su movilidad electroforética. dificultando su migración. como. Los extremos del fragmento de DNA tienen más facilidad para moverse y cambiar de dirección que la parte central. Entre 1-10V/cm (los cm se refieren a la distancia entre los electrodos). las estructuras pueden perder flexibilidad. La separación de fragmentos lineales de DNA de doble cadena (dsDNA) se realiza a un pH cercano a la neutralidad.5×0.25%) o verde de bromocresol (0. si se incrementa el voltaje. por lo que no se apreciarían diferencias de tamaño y no habría separación. la movilidad electroforética de los fragmentos lineales de dsDNA es proporcional al voltaje aplicado. más se retarda a lo largo del recorrido por el gel. Para pocillos de tamaño medio (0. azul de bromofenol (0. los fragmentos se tratan con una segunda endonucleasa de restricción sobre el propio gel o sobre una membrana de DEAE-celulosa (es lo más habitual) y los subfragmentos obtenidos se separan en la segunda dimensión. cuanto mayor sea el tamaño del DNA. la muestra se digiere con una endonucleasa de restricción y los fragmentos se separan en una primera dimensión. por lo que avanza más.cultek. suelen emplearse geles de 15-20 cm de largo y 3-4 mm de grosor. menos cantidad puede cargarse por pocillo. fago λ). deformarse y estirarse en la dirección del campo eléctrico adoptando forma de varilla rígida. cuando existen tamaños diferentes. Si se incrementa el voltaje para intentar acelerar la separación.2006
www. tiene una movilidad electroforética semejante a un dsDNA de 300pb). del tamaño de los fragmentos de DNA y de su diversidad.Soluciones Electroforesis
La electroforesis submarina se lleva a cabo de modo que el tampón cubra totalmente el gel. glicerol (30% p/v) o ficoll (15% p/v). sin que ésta guarde relación con su tamaño. expresado en pares de bases (figura 20).15cm) pueden cargarse 500ng-1µg de DNA de tamaño único. se incluye en el gel (habitualmente en los pocillos de los extremos del gel) un conjunto de patrones. por lo que puede “engancharse” en las fibras del gel. Cuanto mayor es el fragmento de DNA. También pueden realizarse electroforesis bidimensionales en geles de agarosa. La cantidad mínima de DNA que puede cargarse depende del límite del método de detección utilizado y así.25%. de modo que la estructura lineal puede combarse.25%. son tan largos que avanzan prácticamente con la misma velocidad y no se separan. Este fenómeno es muy acusado en fragmentos de tamaño intermedio. y es la causa del fenómeno conocido como inversión de banda. 20. El volumen de muestra que se puede cargar depende de las dimensiones de los pocillos practicados. pero no suele sobrepasar los 50µL. Las estructuras circulares superenrrolladas
02. pAT153. Así. Posteriormente. la separación de fragmentos grandes de DNA es mejor a bajos voltajes (aunque esto incrementa el tiempo de electroforesis). la movilidad electroforética aumenta con el grado de enrollamiento. fragmentos de DNA de tamaños conocidos (fragmentos de restricción de DNA virales o plasmídicos. Factores que afectan a la movilidad electroforética del DNA.5×0. con esta disposición se disipa mejor el calor generado por el paso de la corriente y se consigue un campo eléctrico muy eficaz. pero para el DNA monocatenario (ssDNA) se utiliza NaOH (50mM). de modo similar descrito anteriormente para proteínas. Sin embargo.
Fig. más compacto es.
las bandas pueden incluso observarse según van migrando por el gel. este compuesto tiene un rendimiento cuántico bastante bajo en medios acuosos (polares). pueden ser separadas por electroforesis en geles de agarosa (figura 21). (III): dsDNA lineal. con lo que aumenta su longitud y se hace menos flexible. lo que sucede cuando se intercala en el DNA. (A): punto de aplicación de la muestra. la doble hélice de DNA se abre y queda menos girada. lo que se puede realizar antes (añadiendo el BrEt al propio gel durante su formación) o después (sumergiendo el gel en una disolución con BrEt) de la electroforesis. puede utilizarse radiación de λ=254nm. Si el DNA esta radiactivamente marcado (32P. representación esquemática de estructuras circulares de dsDNA con distintos grados de superenrrollamiento.cultek. el BrEt se utiliza para la tinción del DNA. 21. La detección con BrEt es el método más habitual para detectar DNA en los geles de agarosa. para tener los resultados de forma permanente. Este aumento de tamaño del DNA tratado con BrEt debe tenerse en cuenta si la electroforesis se hace en presencia de este compuesto. aumentando la longitud de éste. Posiciones relativas de diferentes formas de DNA de la misma longitud en un gel de agarosa. Para los geles habituales (10×6×0. en cuyo caso conviene realizar la electroforesis a 4°C. Detección del DNA.2006
www. TOTO-1 y YOYO-1) son capaces de detectar 50-60pg/banda de DNA ó RNA. lo que reduce la movilidad electroforética del fragmento considerado en un 15%. en un sentido o en otro). la cual es absorbida por la sonda y emitida a λ=590nm. y estructuras superenrrolladas con distinto grado de superenrrollamiento e idéntico tamaño. que es absorbida por el DNA y transferida al BrEt ó λ=302nm ó 366nm que es absorbida directamente por la sonda fluorescente. pero se incrementa notablemente cuando pasa a un entorno hidrofóbico.
Fig. por ello la electroforesis se lleva a cabo a temperatura ambiente. ya que se intercala entre pares de bases contiguas del DNA.com
. Formas (0): ssDNA circular cerrado. es necesario fotografiar el gel bajo iluminación (figura 23). 20-30 minutos son suficientes para que el BrEt los impregne. las estructuras con mayor Lk presentan una mayor movilidad electroforética. 35S) se detecta por autorradiografía y si lo esta con nucleótidos fluorescentes.5% y teñido con BrEt.
02. Esto se debe a que al introducirse entre las bases. 22. además. salvo que se utilice agarosa de bajo punto de fusión. A los voltajes habituales a los que se realizan las electroforesis (1-10V/cm) los pequeños aumentos de temperatura debidos a la resistencia del gel no afectan al DNA ni al gel. Aquellas moléculas con grado de superenrrollamiento nulo se mueven más lentamente que las de valores mayores de grado de superenrrollamiento (positivo o negativo.
La temperatura no afecta a la movilidad electroforética entre 4°C y 30°C. (IV): dsDNA circular cerrado. la intensidad de fluorescencia es mayor que si se utiliza 366nm. aunque si la concentración de agarosa es superior al 4%. Es un agente intercalante.Soluciones Electroforesis
de DNA se mueven con una velocidad que depende del grado de superenrrollamiento (Lk). un DNA circular con diferentes valores de Lk analizado en un gel de agarosa al 1. En la parte derecha. Hay dos maneras fundamentales para visualizar DNA una vez finalizada la electroforesis: mediante compuestos fluorescentes que se unen específicamente a los ácidos nucleicos y con tinción de plata (normalmente para geles de poliacrilamida). En la parte izquierda. Como ya se ha comentado anteriormente. la de 254nm produce más roturas en el DNA que la de 302nm. Con BrEt pueden detectarse bandas conteniendo 1-10ng de DNA. (II): dsDNA circular mellado (abierto en una hebra). Relación entre la movilidad electroforética y el grado de superenrrollamiento de estructuras circulares de DNA.5-1. (I): dsDNA circular superenrrollado.
Fig. las bandas de DNA pueden detectarse sumergiendo el gel en una disolución acuosa de BrEt (0.0µg/mL) e iluminando con luz UV. En la figura 22 se muestra la movilidad electroforética de distintas formas de DNA circular en relación a al de un fragmento lineal del mismo tamaño. el tiempo debe aumentarse. es decir. Si se emplea radiación de 254nm ó 302nm. por lo que es ésta última la λ empleada preferentemente. Puesto que las bandas sólo son visibles mientras se están iluminando. Así. aunque otros compuestos fluorescentes (SYBR-Green.5cm).
formamida) ya que afectan también a la agarosa (sus fibras se mantienen mediante puentes de hidrógeno). Para lograr una buena separación y para calcular con fiabilidad los tamaños es necesario que las moléculas estén completamente desnaturalizadas. Transferencia a membranas (Southern y Northern Blot). producen poca fluorescencia de fondo (fluorescencia inespecífica) al ser iluminadas con radiación UV. 23. el pH básico y diversos agentes químicos dependiendo del soporte y del ácido nucleico. por ejemplo. una secuencia única de 1. De esta manera puede identificarse un fragmento específico de DNA o RNA entre toda la población de estructuras separadas por electroforesis y transferidas a la membrana. Las moléculas de DNA o RNA separadas en los geles de agarosa pueden ser transferidas a membranas de nitrocelulosa o de nylon. revelando su posición por autorradiografía de la membrana. pero teniendo en cuenta que el mRNA es monocatenario. Esto permite localizar e identificar secuencias específicas en los fragmentos transferidos. Iluminación incidente.cultek. La sensibilidad del método es muy elevada y pueden detectarse <0. lo que es muy útil para la detección de bandas de DNA. Las membranas de nitrocelulosa dan mejor resolución que las de nylon. No pueden utilizarse agentes desnaturalizantes que rompan los puentes de hidrógeno (urea. Las flechas amarillas representan la radiación emitida (fluorescencia) por los complejos DNA-BrEt.1pg de DNA o RNA usando una sonda marcada con P (figura 24). Iluminación y fotografía de geles de agarosa.000pb presente en el genoma humano (1 parte en 3 millones) puede ser detectada por este método a partir de 10µg de DNA genómico. Se utiliza para la separación de fragmentos de DNA monocatenario grandes (1000-2000 nucleótidos) y especialmente para el análisis de mRNA. además. pudiendo ser utilizadas para hibridaciones sucesivas. que hibridan con la secuencia complementaria. Electroforesis en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes.com
. Iluminación por transmisión (transiluminación). La unión a la membrana ocurre a través del esqueleto azúcar-fosfato de la molécula de DNA o RNA. para asegurar esta desnaturalización se utilizan agentes desnaturalizantes como la temperatura. La transferencia e hibridación son similares a las descritas para el DNA.2006
www. La transferencia se realiza tras la desnaturalización del DNA o RNA.Soluciones Electroforesis
Fig. ya que la estructura secundaria y terciaria de los ácidos nucleicos está mantenida esencialmente por el apareamiento (tanto inter. Se lleva a cabo en modo submarino como ya se ha descrito. quedando libres y expuestas las bases nitrogenadas. que se transfiere posteriormente a membranas para su detección (Northern Blot).como intracatenario) de bases complementarias.
02. Videocámara con la imagen del gel sobre el transiluminador. pero éstas últimas presentan varias ventajas por lo que su uso es más extendido: tienen una mejor consistencia (las de nitrocelulosa son bastante frágiles y pueden desmenuzarse con la manipulación) y poseen mayor capacidad de unión de DNA. incubando la membrana con sondas específicas radiactivas o de otra naturaleza.
se mueven muy lentamente. Normalmente se utilizan ángulos >100°. por electroforesis (electrotransferencia). Normalmente. controlándose la temperatura por inmersión en un baño termostatizado. tardando más los mayores. como ficoll (400kDa). el segundo. sin resolverse en bandas distintas y aparecen como una zona más o menos ancha en la parte superior del gel. Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 un sistema denominado electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) con el que consiguieron separar cromosomas de levadura de varios cientos de kpb. La formación de las estructuras híbridas (heterodúplex) entre la sonda y la secuencia complementaria buscada es muy dependiente de las condiciones experimentales (particularmente de la temperatura). se pueden separar fragmentos de hasta 20kpb. mayor ha de ser la duración de los campos aplicados. El ángulo α que forman las direcciones de los campos eléctricos E1 y E2 se denomina ángulo de reorientación. del porcentaje de agarosa y del tamaño de los fragmentos de DNA. Esto hace que la transferencia a membranas no pueda hacerse directamente. Para una duración de pulso dada. En una PFGE los fragmentos se someten a dos campos eléctricos de distinta orientación. se obliga a los fragmentos de DNA a relajarse y elongarse y alinearse de acuerdo con este segundo campo eléctrico.cultek. por lo que su uso es más restringido. perpendicular al anterior. pero juntos. La transferencia puede realizarse por capilaridad. cuando se opera a un ángulo fijo. los fragmentos se estiran y se orientan según la dirección de dicho campo. Aplicando sucesivos cambios de campo eléctrico (E1/E2/E1/E2/E1/E2 etc. timo de ternera. aunque si el dispositivo permite seleccionar diferentes ángulos. aquellos fragmentos de gran tamaño que no hayan tenido tiempo a reorientarse en la nueva dirección del campo no se separan. antes migra en la dirección de E2. la membrana se sumerge en una disolución que contenga substancias de elevado peso molecular. utiliza hornos de hibridación. Al igual que en el Western Blot. Es importante destacar que la utilidad de la PFGE es análoga a la de la electroforesis convencional. esto permite el mapeo genético de grandes regiones de DNA o de cromosomas enteros pequeños. además de DNA heterólogo de diversos orígenes (bacteriano. Esquema de desarrollo de un Southern Blot (izquierda) y un Northern Blot (derecha). dicha zona se denomina zona de compresión. e incluso hasta 50kpb con geles de agarosa de muy baja concentración. La duración de los campos eléctricos que se alternan se denomina duración del pulso y determina el intervalo de los tamaños de DNA que se pueden separar. fragmentos mayores de 15-20kb deben ser fragmentados previamente con radiación UV o tratamiento ácido. pero no permanecen inmóviles en el gel. la membrana se introduce en una bolsa de plástico hermética que contiene la disolución con la sonda. por centrifugación o por succión (mediante una bomba de vacío). Cuanto menos tarde una molécula en reorientarse.2006
www. Una vez en la membrana. ésta se una inespecíficamente a la membrana y produzca un fondo en el revelado. También puede ser utilizada para electroforesis bidimensionales. Para realizar este bloqueo. salvo que los fragmentos de DNA separados son de mayor tamaño. para evitar que al añadir la sonda. cambiando las condiciones en cada dimensión. desde fracciones de segundo para fragmentos muy pequeños hasta 1-2 horas para fragmentos muy grandes (>5Mb) (Tabla III).com
. esperma de salmón.
Fig. El tiempo de transferencia depende del grosor del gel. Las cadenas de DNA desnaturalizadas no deben ser muy largas para que la transferencia sea efectiva y. y determina lo que deben “girar” los fragmentos de DNA cada vez que cambia la orientación del campo. la electrotransferencia se utiliza cuando la separación del DNA se ha realizado en geles de poliacrilamida (dado que el reticulado es más denso que el de la agarosa). cuya duración determina el intervalo de tamaños que se pueden separar (cuanto mayor sea el tamaño de los fragmentos a separar.Soluciones Electroforesis
La desnaturalización de los fragmentos de DNA.
02. polivinilpirrolidona (360kDa) o seroalbúmina bovina (66kDa). ya que para tamaños superiores a las 20kb los fragmentos se han de dividir en otros menores mediante radiación UV o tratamiento con ácido (HCl). para realizarla se utilizan dos sistemas: en el primero.) se consigue la separación de los fragmentos en función de su tamaño. esto es particularmente útil para la separación de fragmentos muy grandes de DNA (>2Mb). el DNA se fija a ella mediante calentamiento a 80°C o iluminación con radiación UV. las regiones de la membrana no ocupadas por el DNA transferido deben bloquearse. aunque los dos últimos sistemas necesitan dispositivos específicos. se trabaja entre 100° y 120°. así. La PFGE consigue la separación de grandes fragmentos de DNA induciendo su reorientación mediante cambios periódicos en el campo eléctrico. Electroforesis en campos pulsantes (PFGE). previa a la transferencia. el tiempo que se consume en esta reorientación depende del tamaño de los fragmentos. Si ahora se aplica un segundo campo (E2). estos intervalos son muy variables. se realiza introduciendo el gel en una disolución de NaOH que se neutraliza posteriormente. introduciendo las membranas en botellas que contienen la disolución de la sonda.). etc. Al aplicarse el primero (E1) durante cierto tiempo. éste es de 120°. Con las electroforesis descritas hasta ahora. 24.
los electrodos de platino son de mayor grosor que en el resto de las electroforesis.5-3Mb 2. Tabla III.5Mb 1. cuya disposición y diseño posibilitan las distintas orientaciones del campo eléctrico.200kb 1. por lo que retirando la tapa se fundida se vierte sobre la bandeja que lleva adosada el molde.0% (20×20 ó 15×15 cm). Plataforma con el gel incorporado.com Página 16 de 17
. La cubeta tiene un conjunto de electrodos en lugar de un par. ya que los cambios periódicos de polaridad producen una marcada corrosión de los mismos. tanto en la cubeta como en la fuente de alimentación. además. 26. Tapa Fig. un sistema de recircularización del tampón a temperatura estrictamente controlada. Dispositivo hexagonal con los electrodos colocación del peine.6-6Mb 2-9Mb 1-10Mb 3-13Mb 3-13Mb Resolución máxima 1-10kb 10-25kb 35-50kb 60-90kb 200-300kb 400-550kb 700-900kb 800-1. Cubeta con el una vez gelificada la agarosa se retira el molde quedando el gel sistema refrigerante (serpentín) en su base. que se coloca en la cubeta.3seg 0. Duración del pulso 0. La preparación de los geles de agarosa no difiere de los ya descrito para otras electroforesis de DNA.cultek. A la agarosa con cable de conexión incorporado. sobre y sobre los anteriores).5Mb 2. según esta dispuesto en la figura (sobre. de bajo flujo electroendosmótico y elevada resistencia (Figura 26). La cubeta tiene. Preparación de un gel de agarosa para PFGE.000kb 100-1.600kb 1-2.8seg 5seg 25seg 45seg 100seg 125seg 20min 30min 40min 75min 90min 100min 180min Intervalo de separación 1-10kb 5-30kb 30-50kb 20-100kb 40-400kb 40-600kb 40-1. C embutidos. Cubeta utilizada en una PFGE con simetría hexagonal. 02. se utilizan geles de agarosa al 0.Soluciones Electroforesis
El equipo necesario para realizar una PFGE se diferencia notablemente del de otras electroforesis. soportado en los extremos sobre el molde. B desconecta la corriente. El conjunto se ensambla sobre la bandeja.5-6Mb 3-6Mb 6-9Mb 7-10Mb 10-13Mb Duración del proceso (h) 1 2 3 4 6 10-24 17-40 17-40 100-140 100-140 140 140-170 185 190-200 190-200 Voltaje (V) 450 450 450 300 300 300 165-200 165-200 165-200 165-200 30 30 30 30 27
Fig.5-1. de modo que no se produzcan variaciones de temperatura en el gel (Figura 25).5seg 0.6-2. 25.2006 www. Relación entre la duración del pulso y la resolución en una PFGE.6-3Mb 1.
A partir de un bloque grande.2006
www.cultek. junto con agarosa fundida o embebido en pequeños bloques o tacos de agarosa sólida (Figura 27). Todos los procesos de lisis celular y digestiones enzimáticas se realizan sobre el taco de agarosa. lo que las hace fácilmente fragmentables. se cortan pequeños tacos (parte superior) del tamaño de los pocillos practicados en el gel (parte inferior). pero para fragmentos mayores de 500kb no se suele emplear el DNA aislado como tal y sí las propias células que lo contiene. que contiene las células cuyo DNA se desea analizar.
Fig. Preparación de la muestra para PFGE en bloques de agarosa.Soluciones Electroforesis
La preparación y aplicación de la muestra es la fase más delicada de la PFGE por el gran tamaño de las estructuras que se manejan. Los fragmentos de 200-300kb pueden cargarse como disoluciones directamente en el gel.com
. El DNA suele cargarse en el gel como una disolución concentrada (de mucha viscosidad). La utilización de una u otra forma depende del tamaño del DNA a analizar y de la naturaleza de la muestra. 27.

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