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Timestamp: 2018-11-16 20:53:30+00:00

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Cromatogrfia de Liquidos
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ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS
 VALENZUELA YQUISI ARTURO CODIGO: 162125
ABANCAY, JUNIO DEL 2018
............................. 4 1.............................................................................3 Cromatografía de partición ....................1 Tipos de cromatografía en HPLC y aplicaciones ............. 5 1......................................2 Cromatografía de adsorción ........... 6 1 .................. 4 1......................... UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS Contenido 1 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ...
...............................................10 Selectividad ............................................................................................................................................................................8 Volumen y tiempo de retención ............. 11 1......................6..............................................................................................................................2 Cromatografía en capa fina ......6 Cromatografía plana .................................................................. 11 1..... 6 1...................................................................... 10 1... También se la denomina a veces cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de alta resolución (high pressure liquid 2 ....................................12 Resolución cromatográfica .......7 Instrumentación...... 9 1...........5 Cromatografía en gel ........................15 Instrumentación ................... 10 1...... UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS 1............14 Asimetría (AF) ................................................... 11 1..............................................9 Factor de capacidad (K) .....................................................................................................6..13 Número de platos teóricos . 11 1.................................. 7 1................................... 9 1..................... 12 1 INTRODUCCIÓN La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (high performance liquid chromatograph ) y es un tipo de cromatografía en columna utilizada frecuentemente en bioquímica y química analítica...................... 12 1.............................................................4 Cromatografía de intercambio iónico ............ 8 1..... .........1 Cromatografía en papel .............................. 9 1...11 Eficiencia ...................................
a partir de su desarrollo la cromatografía de gases (GC.la aplicación de la HPLC en la industria farmacéutica se convirtió en pilar de los laboratorios farmacéutico en la década 1970 . la cromatografía en capa delgada de forma plana . 2 Objetivos En este informe monográfico se describirán los principios de la técnica de HPLC y los desarrollos responsables del fenómeno .empero.gas chrmatogrphi) se ha Utilizado cada vez más que las diferentes técnicas de cromatografía de líquidos . UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS chromatography) (HPLC). la riqueza acumulada por la teoría de la la cromatografía de gases . en la separaciones se obtiene como un gradiente de campo eléctrico basada en signos y la carga analítico 3 Resumen Debido a su rapidez y sensibilidad . high –perfomnce liquid chromato-grapi) que rivaliza en eficiencia como la cromatografía de gases y permite hacer separaciones y mediciones en cuestión de minutos la causa de la rápida aceptación de la cromatografía de gases en la década de 1950 fue su aplicación inmediata en la industria petroquímica en cambio . también los métodos de le los métodos de la cromatografía de líquidos normal y la fase inversa ( separaciones basadas en polaridad ) la cromatografía por exclusión de tamaños (separaciones basadas en tamaños moleculares ) y la cromatografía de intercambio iónicos (separaciones basadas en cargas eléctricas ) asimismo . aunque esta terminología se considera antigua y está en desuso.han conducido al desarrollo de los métodos de cromatografía de líquidos de alta eficiencia (HPLC . El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica. y hoy en día el mercado de nuevos instrumentos de HPLC es mayor que el más maduro de la cromatografía de gases 3 . además de la electroforesis . la cromatografía de líquidos tiene un potencial de aplicación más amplio debido a que 85% de los compuestos conocidos no son los suficientes volátiles o estables como para para ser separados por cromatografía de gases .así como a su amplio espectro de aplicación .
una estacionaria y otra móvil. o bien un líquido inmiscible con la fase móvil. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido). la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interior de las celdas formadas por las fibras de la celulosa. Para aumentar la eficiencia en las separaciones. Después se coloca la muestra por la parte superior y se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. es una técnica de análisis químico ampliamente utilizada. Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: en columna. 5 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) La cromatografía es un método físico de separación. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS 4 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA Cromatografía líquida. la cual permite separar físicamente y cuantitativamente los distintos componentes de una solución por la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. consta de dos fases. se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesor uniforme. en la cromatografía de alta resolución.1 Tipos de cromatografía en HPLC y aplicaciones La Cromatografía de líquidos. En el primer caso. el tamaño de las partículas de fase fija se disminuye hasta los micrones. la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase estacionaria. y 4 . una fija que suele llamarse fase estacionaria. 5. en la cromatografía en papel. usando altas presiones para lograr que la fase móvil pueda fluir. en el segundo. en capa delgada o en papel. la fase estacionaria se encuentra rellenando un tubo. En cromatografía líquida. depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido). La cromatografía líquida se lleva a cabo en una columna de vidrio. y es por tanto una forma de cromatografía líquido. basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles.
La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano. Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina. muchas drogas de abuso (LSD. Aplicaciones: se utiliza para compuestos no polares con masas <5000. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis. si este presenta una alta fuerza de elución eluirá las especies absorbidas más rápidamente que uno que tenga un valor más bajo. que frecuentemente son isómeros o compuestos muy relacionados. El soluto compite por los sitios sobre la superficie del sólido con el disolvente utilizado como eluyente. la retención es el resultado de la adsorción. Se utiliza en la separación de la vitamina D3 y sus metabolitos las vitaminas A. insolubles en agua y relativamente simples. variando el disolvente. La tabla 1 nos muestra los tipos de cromatografía líquida que existen así como su separación cromatografía. La tendencia a ser adsorbido disminuye en el siguiente 5 . es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000. muestras solubles en disolventes no polares y es capaz de diferenciar entre compuestos isómeros. antidepresivos tricíclicos. La elección de la fase móvil es fundamental para el éxito de una cromatografía líquido-sólido. bloqueadores beta y los PTH aminoácidos.2 Cromatografía de adsorción Es la técnica más usada para la separación de compuestos orgánicos neutros. su fase estacionaria es la superficie de un sólido finamente dividido. D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas). Se basa en la afinidad de adsorción. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fácilmente y los pigmentos menos polares de las plantas. en la forma de un soporte sólido en un plato inerte. siendo la primera la preferida. por ejemplo). Es particularmente adecuada para el análisis de moléculas no ionizantes. 5. y que en este caso es un líquido. tales como los carotenoides y las porfirinas.
Ejemplos típicos son la resolución de los numerosos aminoácidos formados en la hidrólisis de una proteína. como silicagel o celulosa. a medida que el disolvente avance a lo largo del soporte los líquidos suben espontáneamente por capilaridad. el más usado es el ácido silícico o gel de sílice. la separación y análisis de alcoholes alifáticos y la separación de derivados de azucares. aquellos componentes de la muestra que sean más solubles en el líquido que queda adsorbido serán retenidos.4 Cromatografía de intercambio iónico El disolvente por lo general es agua y las especies a separar son iones. de manera que. 5. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS orden: ácido>alcohol>carbonilo>éster>hidrocarburo. la polaridad puede ser notablemente diferente al la del líquido estacionario. 5. A continuación se muestra una cromatografía de absorción. el disolvente se elige de manera tal que uno de ellos se adsorba más al soporte que el otro. y los que tengan mayor afinidad por el que no se adsorbe serán arrastrados por este. La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes. también se usa para la separación de 6 . Aplicaciones: es un poderoso instrumento para la separación de sustancias estrechamente relacionadas. este los vaya impregnando. Esta consiste en aplicar una gota de la solución con la mezcla de substancias a separar en la parte inferior de una tira de papel o en una delgada capa de un material inerte. es muy utilizada en la química inorgánica. el papel o material inerte (los denominaremos soportes) se colocan en un recipiente con un solvente.3 Cromatografía de partición Cromatografía líquido-líquido La separación de las sustancias se logra por migración diferencial de los solutos. La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un sólido inerte.
así como resinas sintéticas. los factores que determinan la separación de las 7 . Dentro de los intercambiadores encontramos: arcillas y las ceolitas. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS aminoácidos y otros ácidos y bases orgánicas. cromatografía de exclusión y cromatografía de tamizado molecular. mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volúmen poroso y son las últimas que se eluyen. La fase estacionaria es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados. azúcares y preparaciones farmacéuticas. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar. Se efectúa en una columna por el método de elusión. Aplicaciones: Encuentra mucho uso en los analizadores para aminoácidos. conservantes de alimentos. teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones). la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. se ha aplicado a una gran variedad de sistemas orgánicos y bioquímicos incluyendo fármacos y sus metabolitos. En el caso de intercambiadores aniónicos. contienen grupos funcionales básicos adheridos a la molécula de polímero generalmente son aminas. en el tamaño y la forma molecular de las especies de la muestra. 5. por lo menos en parte. La fase fija está formada por partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las moléculas de pequeño tamaño. sueros. mezclas de vitaminas. también se le conoce como cromatografía de permeación en gel.5 Cromatografía en gel Es una técnica de caracterización de polímeros que proporciona la distribución completa de pesos moleculares de una muestra y sus distintos promedios. El fraccionamiento se basa. El intercambio iónico es un proceso en el cual ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solución y un sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. Estas últimas pueden ser usadas para intercambio de cationes se usan: resinas ácidas fuertes las cuales contienen grupos de ácidos sulfónico y resinas ácidas débiles con grupos de ácido carboxílico. Está basada en la atracción entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria.
A veces a la se la llama Cromatografía de Lecho Abierto. cromatografía en papel. Aplicaciones: Este técnica se emplea en la separación de proteínas de alimentos. azucares. Cambios de buffers. Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. cromatografía en capa fina. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS moléculas son el tamaño del poro. desalado.6 Cromatografía plana La separación se produce sobre una capa de un sólido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie plana. derivados de agarosa (Sepharosa). existen tres tipos. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex). donde una hoja o tira de papel de filtro sirve como fase estacionaria y medio de separación. La fase móvil se mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad. mecánica y químicamente. Hay diferentes tamaños de partícula para un gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. proteínas. que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte. Aplicaciones: 8 . ácidos grasos. polipéptidos etc. éste puede ser un papel. a veces es ayudado por gravedad o por potencial eléctrico. así como para la separación de compuestos de alto peso molecular. afinidad o de interacción hidrofóbica. el tamaño de la partícula y el flujo de elución. polisacáridos. La cromatografía plana tiene como fase móvil un líquido y como fase estacionaria un líquido o un sólido dispuestos sobre una superficie plana. en la que la separación se produce sobre una capa de sólido finamente dividido que se ha fijado sobre una superficie plana.proteínas y polímeros. tener bajo contenido en grupos iónicos. Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables. determinación de glucosa y fructosa en zumos de fruta. uniformidad de poro y tamaño. pueden ser desalados antes de ser concentrados o liofilizados 5. y la electroforésis. tal como una placa de vidrio. después de cromatografías de intercambio iónico. es un método notablemente simple y de bajo costo.
UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS se utiliza para separar e identificar los componentes de pequeñas muestras de substancias inorgánicas. Es una técnica muy sencilla. El mecanismo predominante es la adsorción. bases. orgánicas y bioquímicas. Un equipo para HPLC puede ser representado por la siguiente figura 9 . 5. La fase móvil se selecciona empíricamente.7 Instrumentación. 5. bajo punto de ebullición para facilitar el secado de las placas. agua y otras especies (ácidos. poliamidas. adecuada viscosidad y tensión superficial. La fase móvil el disolvente a utilizar debe reunir una serie de características: inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase estacionaria. Los materiales más usados han sido: gel de sílice. 5. también para la separación de muestras clínicas y bioquímicas así como en otras aplicaciones analíticas generales por su gran sencillez y bajo costo. El mecanismo que interviene en la separación fundamentalmente de reparto. se utiliza una tira de papel de filtro como soporte para la separación. se emplean mezclas consistentes en compuestos orgánicos. celita.2 Cromatografía en capa fina Se realiza en placas de vidrio o plástico recubiertos con una capa delgada de partículas finamente divididas contenidas en la fase estacionaria. El papel utilizado puede ser papel de filtro estándar o papel. económico y baja inflamabilidad y toxicidad.1 Cromatografía en papel Se utilizan papeles especiales de elevada pureza.6. agentes complejantes) que modifiquen la solubilidad de los compuestos de la muestra.6. se usa en determinadas aplicaciones con una finalidad didáctica. La fase estacionaria está constituida por el agua absorbida sobre las moléculas de celulosa del papel. elevada pureza. alúmina.
la muestra contenida en el loop de volumen calibrado. El cual da una señal eléctrica proporcional a la cantidad de materia. tubería. en el cual. esta señal es enviada al registrador que a su vez da un cromatograma de intensidad en función del tiempo (figura 7). esto implica un 99% o mas de pureza para evitar contaminantes que puedan interferir en la elución de la muestra o bien que contengan algunas pequeñas partículas que puedan tapar la columna. kA se define como: 10 . el factor de retención. por lo que es necesario filtrarlos antes de que entren a la columna. conexión. algo importantes es que deben ser grado HPLC. hasta el detector. incluye las contribuciones efectivas del volumen del inyector. se conoce como factor de retención (k). los componentes de la mezcla pasan al detector. El volumen muerto (V0) representa lo que se conoce como espacio muerto o volumen de retraso de la columna. Para el soluto A. El factor de retención es un parámetro experimental importante que se utiliza para describir las velocidades de migración de los solutos en columnas. 5. La bomba envía el disolvente hacia la válvula inyectora que es una válvula de seis vías que permite introducir al disolvente. lo ideal es obtener picos gaussianos los cuales corresponden cada uno a un componente diferente de la muestra.  Los basados en una propiedad del soluto 5.8 Volumen y tiempo de retención El volumen de fase móvil es necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyección a través de la columna. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS La fase móvil puede ser un disolvente puro o una mezcla de disolventes. Luego de que se produzca la separación en la columna.9 Factor de capacidad (K) Actualmente. En HPLC existen dos tipos básicos de detectores:  Los basados en una propiedad de la disolución. columna y detector. en el punto máximo del pico del soluto se define como volumen de retención (Vr).
se define como la relación de la constante de distribución del soluto retenido con más fuerza. Vs es el volumen del soluto en la fase estacionaria y Vm el volumen del soluto en la fase móvil 5. es decir. La eficiencia de las columnas cromatográficas aumenta a medida que es mayor el número de platos N y la altura H es menor 5. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS donde KA es la constante de distribución del soluto A.11 Eficiencia La eficiencia de una columna cromatográfica depende del ensanchamiento de banda que ocurre cuando un compuesto pasa a través de la columna. lo que incrementa el número de platos. 5. y la constante de distribución del soluto retenido con menos fuerza.13 Número de platos teóricos Expresada como una cantidad adimensional. A: Donde KB es la constante de distribución de la especie retenida con más fuerza. Para las mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatográficas se emplean dos términos: (1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o número de platos teóricos N. y KA es la constante de la especie retenida con menos fuerza. una consecuencia adversa de añadir platos es un incremento en el tiempo necesario para la separación de los componentes 5. especie B.10 Selectividad El factor de selectividad α de una columna para dos solutos. refleja el número de veces que el soluto se reparte entre las dos fases durante su paso a través de la columna 11 . que fluye más rápido. A y B. B.12 Resolución cromatográfica Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B. la especie A. Sin embargo. la resolución de cada columna queda definida como: Se puede mejorar la resolución para una fase estacionaria determinada alargando la columna. Los dos están relacionados por la ecuación: Donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm).
14 Asimetría (AF) El factor de asimetría del pico se define como la razón de las mitades del ancho del pico a una altura dada. Conforme se mida más abajo la asimetría del pico AF es mayor.15 Instrumentación Los componentes básicos de un sistema para HPLC son:  Depósitos para la fase móvil (disolventes)  Sistema de bombeo para proporcionar presión a la fase móvil  Sistema de inyección de muestras  Columna cromatográfica  Termostatos para las columnas  Detectores  Sistema para el tratamiento de datos y registrador 12 . un compromiso aceptable es medir AF en 10% de la altura del pico. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS 5. 5. debido al ruido del detector.
no provocan pulsaciones pero están limitadas a presiones relativamente bajas. el disolvente no deberá extraer especie alguna del material con el que estén construidos. Los recipientes que se utilicen para almacenar la fase móvil tienen que ser inertes. 13 .Construidos con materiales inertes respecto a los disolventes empleados. El bombeo produce un flujo pulsado que después debe amortiguarse.Generar presiones superiores a 6000 psi. Están provistos de unos filtros. Suelen ser botellas de vidrio y tubos de teflón.1 y 10 ml/min con una precisión del 0. es decir. se utiliza una bomba que es la encargada de introducir la fase móvil o disolvente a través de la columna . Están formadas por una pequeña cámara cilíndrica que se llena y luego se vacía por oscilación de un pistón de zafiro. Son sencillas. . pudiéndose adaptar a la técnica de elución con gradiente. debido a su pequeño volumen interno Bombas neumáticas o de presión constante: hacen uso de la presión de un gas aplicado al recipiente conteniendo la fase móvil. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS a. Las bombas empleadas en HPLC son de tres tipos: Bombas recíprocas o de vaivén : son las más utilizadas. indispensables para eliminar los gases disueltos y partículas que pueda contener la fase móvil b. Debido a las elevadas presiones de trabajo y al pequeño tamaño de las partículas de la fase estacionaria.Capaces de cubrir un amplio rango de flujo entre 0. Sus principales ventajas son que se consiguen presiones elevadas y se suministra un caudal constante.5 % y que esté libre de pulsaciones. .
pero las separaciones resultan más reproducibles cuando la temperatura se mantiene constante f. C. tener una sensibilidad elevada. Los detectores basados en una propiedad del soluto que no la suele presentar la fase móvil. y proporcionar indicación cuantitativa y cualitativa de los mismos. c. Suministran un flujo libre de pulsaciones pero con una capacidad limitada a unos 250 ml. El detector utilizado depende de la naturaleza de la muestra y deberá reunir una serie de características como son. No es necesario el control estricto de la temperatura de la columna. Suelen ser muy selectivos y sensibles: 14 . El papel del detector es indicar los momentos de aparición de los componentes. buena estabilidad y reproducibilidad. El material de las columnas cromatográficas suele ser de acero inoxidable cuya longitud varía de 5 a 30 cm y un diámetro de 1 a 5 mm e. 2001). Está limitado a una presión máxima de operación de 1500 psi. D. En las columnas cromatográficas es donde se produce la velocidad diferencial de los solutos que permite su separación (Harris. Los volúmenes que se inyectan de muestra deberán ser pequeños para evitar la sobrecarga de la columna. d. Hay varios tipos: El método más simple es la utilización de una jeringa de alta presión con un diafragma a la entrada de la columna. UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS Bombas de desplazamiento o tipo jeringa: consisten en una cámara equipada con un mecanismo de tornillo.
En el Centro de Investigaciones Químicas se cuenta con un cromatografía de líquidos de alta resolución marca Agilent con un detector DAD con capacidad de análisis espectral. y poder ser identificados. es la que mejores resultados ofrece para el análisis de las especies moleculares en soluciones tan complejas como las descritas en la presente monografía. La separación cromatografía es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra (que es llevada por una fase móvil) y una fase estacionaria empaquetada dentro de una columna. Está técnica es adecuada para el análisis de moléculas no volátiles y térmicamente sensibles. especies iónicas y compuestos de alto peso molecular como proteínas. Mediante esta técnica. 15 . UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC ESCUELA ACADÉMICO DE INGENIERÍA DE MINAS 6 CONCLUSION Actualmente la técnica de HPLC en fase reversa. utilizando fases móviles y estacionaria.
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