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Timestamp: 2018-03-24 19:26:42+00:00

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Tema 8 Espectrometría de masas [69406] | Proteómica (UdL) | Unybook
Tema 8 Espectrometría de masas (2015)
Tema 8 Espectrometría de masas
2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 8 Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas PRINCIPIOS DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS La espectroscopía de masas se trata de una técnica espectroscópica que analiza la relación masa/carga (m/z) de los compuestos, en función de la cual son separados.
En la siguiente imagen podemos ver un esquema de un espectrómetro de masas.
En primer lugar, los analitos atraviesan una zona en la que son ionizados, el ionizador (señalada en la imagen con el número 2). Después de ser ionizados, los analitos atraviesan una región en la que se genera un campo eléctrico (3). Los compuestos (ionizados) se aceleran hacia una estructura que los separa en función de su relación masa/carga, el analizador (4). Al final del analizador, hay un detector que va registrando los distintos analitos que van llegando.
La mayoría de analizadores se basan, como el explicado en el ejemplo, en generar campos eléctricos.
Para que el analito acabe llegando al detector, debe llevar una trayectoria correcta. Es decir, una vez acelerado (en el campo eléctrico) no debe ir ni muy rápido ni demasiado lento. Según como manipulemos los electrones al ionizar el compuesto, conseguimos que solo lleguen al detector los analitos con una relación masa/carga concreta.
Un compuesto sin carga no llegará nunca al analizador, ya que la forma de llegar es siendo acelerado por un campo eléctrico.
1 Espectrometría de masas El detector envía los datos a un ordenador que elabora una gráfica en la que se representan las diferentes relaciones masa/carga (m/z) detectadas y la intensidad de la señal. El hecho de que los compuestos deban ser ionizados para poder ser analizados es lo que nos permite obtener los datos de la relación masa/carga.
Un mismo analito puede tomar diferentes cantidades de cargas al ser ionizado. Por este motivo, podemos encontrar las distintas moléculas que tenemos del mismo péptido cargadas de distinta manera (con diversas cantidades de carga). Este fenómeno se traduce en una gráfica en la que, a partir de una única proteína pura estaríamos obteniendo diversos picos, que se corresponden con los distintos estados de carga. Esto dificulta el cálculo de la masa exacta del compuesto, para lo que hay que aplicar la fórmula que se muestra en la imagen anterior. La masa dependerá de la relación masa/carga del compuesto y del número de cargas que éste haya adoptado. Además, a este cálculo hay que restar n protones, ya que, al ionizar dando carga positiva se añade un protón de más al analito.
Al proceso de obtener una sola señal por cada analito (a partir del gráfico inicial con diversas señales por péptido) se le llama deconvolución. La deconvolución consiste por tanto en agrupar las diferentes señales en una sola de manera acorde a la relación masa/carga del péptido y a la anchura de los picos.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV LA ENVOLTURA ISOTÓPICA En la gráfica de la espectrometría de masas podemos observar los distintos compuestos separados en función de su relación masa/carga. Al hacer ampliar la zona donde aparece cada pico, podemos ver que en realidad están formados por varios picos muy seguidos, separados por aproximadamente 1 Dalton.
Podemos atribuir este fenómeno a la abundancia natural del isótopo de carbono, C13. Como sabemos, el isótopo de carbono más abundante es el C12, pero un 1% del carbono que encontramos en la naturaleza es C13. Para la mayoría de técnicas analíticas, la presencia de C12 o C13 no es importante, pero en la espectrometría, este hecho afecta al resultado ya que el C13 pesa 1Da más.
El primer pico que nos aparece dentro del espectro de un péptido se corresponde al péptido formado solamente por C12. Conforme la relación masa/carga del pico va aumentando, nos encontramos ante un péptido con mayor contenido en C13.
Cuando analizamos un péptido, estamos analizando a la vez millones de moléculas, por lo que podemos encontrar diferencias en cuanto a la proporción de C12 y C13 entre ellas.
La presencia de C13 también debe tenerse en cuenta a la hora de calcular la masa del péptido.
Encontramos dos tipos de masa diferentes: la masa monoisotópica, en la cual consideramos que todos los C que forman el péptido son C12; y la masa media (average), en la que, a la hora de calcular la masa del péptido, consideramos la abundancia natural del C13. La masa isotópica es la que viene presentada por el primer pico, conocido como pico monoisotópico.
Al emplear los valores de espectrometría de masa para identificar proteínas, se intentan usar los valores de la masa isotópica siempre que sea posible.
Nos siempre el pico monoisotópico es el más abundante. El pico más abudante se debe a una cuestión estadística. En función de la masa molecular del péptidocambia la probabilidad de que todos los C sean C12, es decir, cuanto mayor sea la masa molecular disminuye la probabilidad de encontrar una molécula compuesta únicamente por C12 y, por tanto, disminuye la altura del pico monoisotópico.
3 Espectrometría de masas Por otro lado, la envoltura isotópica permite conocer la carga de un determinado péptido. La carga del péptido es inversa de las diferencias que encontramos entre los distintos picos. En el ejmplo de la imagen, tenemos 4 picos distintos, con una diferencia de relación masa/carga entre ellos de 0,25, por lo que la carga es 4.
La resolución es la que determina que se vea o no la envoltura isotópica de los péptidos. Si la resolución es muy alta, los distintos picos se diferenciarán mejor. Para conocer la diferencia de masa/carga que el espectrofotómetro permite distinguir hay que dividir la relación masa/carga del péptido entre la resolución. Por ejemplo, si nuestro péptido tiene una relación masa/carga de 1000 y tenemos una resolución de 10000, el aparato identificará como distintos dos relaciones masa/carga separadas por 0,1; es decir, podrá diferenciar entre 1000 y 1000,1.
COMPONENTES DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS En primer lugar, es necesaria una fuente de ionización o ionizador. La separación de iones se lleva a cabo por el analizador y, por último, el espectrómetro incorpora un detector.
Podemos encontrar distintos tipos de cada uno de estos componentes.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV SISTEMAS DE IONIZACIÓN MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Los analitos se sitúan sobre un soporte físico, la placa de MALDI, sobre el cual dejamos secar los analitos en presencia de una matriz, normalmente orgánica, que debe ser fácilmente ionizable. La muestra debe quedar envuelta por la matriz.
Se dispara un láser que incide sobre la matriz, que se ioniza, transfiriéndose parte de esta ionización a los analitos. Es decir, la matriz es capaz de transferir la ionización a los analitos, que adquieren carga.
Posteriormente, tenemos las placas de extracción, que son unos electrodos. Cuando estos electrodos se acitvan, se establece un campo eléctrico que hace que los analitos salgan disparados hacia el analizador.
Podemos encontrar diversos tipos de matriz pero, en general suelen ser compuestos aromáticos fácilmente ionizables.
Por lo general, el ácido α-cyano-4-hidroxycinamico funciona muy bien para péptidos y, para trabajar con proteínas suele usarse el ácido sinapínico.
En la siguiente imagen podemos ver una ampliación de un pozo de una matriz de MALDI. Cuando la dejamos secar, la matriz cristaliza, quedando la muestra entre los cristales.
5 Espectrometría de masas Ionización electrospray - ESI Tenemos la muestra en estado líquido y la disparamos en forma de spray a través de un pequeños capilar en presencia de un campo eléctrico. Así, las pequeñas gotas de muestra cogen carga. La muestra debe estar en formato soluble y debe estar disuelta en forma de un solvente que se pueda evaporar.
Como se hace en presencia de una fuente de nitrógeno o de vacío, el solvente de las gotas se va evaporando y quedan solo los analitos, en los que se concentra la carga de las gotas.
Esta ionización va muy bien acoplada a la cromatografía de fase líquida, ya que los analitos se van disparando en spray a medida que salen de la cromatografía.
Los analitos se cargan tan eficazmente que habitualmente cada péptidos o proteína acostumbra a presentar múltiples cargas. En cambio, con el método MALDI, es más común que por cada péptido, se obtengan solo una o dos cargas. El hecho de que con la ionización electrospray las proteínas adquieran varias cargas hace que el análisis de los resultados sea más complejo.
SLD o Soft Laser Desorption fue el sistema precursor del electrospray.
Los científicos que descubrieron estas técnicas ganaron el premio Nobel de química en el año 2002.
ANALIZADORES DE MASAS Time of Flight (TOF) - Tiempo de vuelo Este analizador se basa en el tiempo que tardan los analitos en llegar desde el ionizador hasta el detector. Como ya se ha dicho, los analitos son acelerador en las placas de aceleración, y la velocidad que adquieran dependerá de su relación masa/carga. Cuanto mayor sea la relación masa/carga del analito, más tiempo tardará en llegar hasta el detector. EN función del tiempo que tarda el analito en llegar al detector, deducimos su relación masa/carga.
El analizador consiste en un tubo en cuyo interior se ha generado vacío. En el extremo de este tubo es donde se localiza el detector.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En principio, cuanto más largo es el tubo, mayor es la resolución del aparato. Actualmente, la mayoría de los aparatos son de unos 3 metros de longitud y, debido a su longitud, acostumbran a estar curvados.
Quadrupole mass spectrometry Se basa en la presencia de cuatro electrodos dispuestos de forma cilíndrica en los cuales se juega a alternar los potenciales eléctricos. Es decir, se hace variar la diferencia de potencial entre los cuatro polos.
Para llegar al detector, los analitos ionizados deberán atravesar el quadrupol. En función de los potenciales eléctricos de los cuatro polos, los electrones de los analitos entrarán o no en resonancia.
Solo aquellos que entren en resonancia llegan al detector. Por tanto, el quadrupol funciona como un filtro de relación masa/carga  lo podemos preparar para que deje pasar un determinado valor de relación masa/carga (que será la que entre en resonancia) o bien para que deje pasar diferentes relaciones masa/carga en caso de querer hacer un rastreo de una muestra completa (variando la relación que puede pasar). Al quadrupol a veces se le llama filtro de masas.
El tiempo que tarda el quadrupol en hacer el rastreo es de milisegundos.
No tiene alta resolución pero se usan mucho cuando se quere hacer la labor de filtro de masa.
Ion traps (trampas iónicas) Las trampas iónicas consisten en unas cámaras o cavidades compuestas por una serie de electroimanes. Los analitos quedan confinados en el interior de la cámara y se hacen variar los potenciales eléctricos de los electroimanes para que vayan saliendo los distintos analitos. Las diferentes relaciones masa/carga van saliendo hacia el detector a distintos tiempos (cada m/z sale cuando los electroimanes tienen unos potenciales eléctricos concretos). Por tanto, variando los potenciales eléctricos podemos ir decidiendo que analito saldrá en cada momento, hasta dejar un solo analito confinado en el interior.
7 Espectrometría de masas Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (ICR) Se trata de una técnica similar a la trampa iónica. Los analitos se envían a una cavidad que tiene los electroimanes dispuestos de forma circular. Los electrodos hacen que los analitos, que están ionizados, giren. En algún momento, los iones (analitos) entrarán en resonancia y podrán ser detectados.
El momento en que los analitos entran en resonancia depende de su relación masa/carga.
En la siguiente tabla podemos obsrvar las características de los distintos analizadores de masas: Como ya sabemos, la resolución hace referencia a la capacidad del analizador de diferenciar entre dos masas próximas.
La precisión se refiere a la capacidad de dar un valor exacto de la masa del analito.
El rango dinámico es la capacidad de distinguir entre analitos que se encuentren muy concentrados y los analitos que se encuentran a muy baja concentración. Es decir, es la diferencia entre la señal más fuerte que obtenemos, a la cual el detector se encuentra saturado, y la seál mínima, concentración bajo la cual el detector no es capaz de detectar el analito.
Como podemos observar, el ICR o ion cyclotron resonance es un analizador muy lento aunque los mejores espectrómetros de masas del marcado actual derivan de estos- Se ha logrado mejorar el rango dinámico y la velocidad de los ICR para dar lugar a los Orbitraps.
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE LA HUELLA PEPTÍDICA Para la identificación de proteínas de una muestra podemos emplear dos estrategias: la huella peptídica y el análisis de fragmentos.
La huella de masas peptídicas o PEPTIDE MASS FINGERPRINT (PMF) se basa en el uso de una serie de proteasas y compuestos químicos que cortan proteínas en secuencias o aminoácidos concretos.
La proteasa que más se emplea para esta técnica es la tripsina, que corta siempre después de las argininas y las lisinas.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La idea es que, si conocemos la secuencia de la proteína podemos prever los puntos de corte de la enzima y deducir los péptidos que se generarán tras el corte, que tendrán unas masas concretas. Las masas de los péptidos generados se analizan con espectrometría de masas.
El patrón de masas generado tras digerir con una proteína concreta es lo que conocemos como huella peptídica.
Cada proteína tendrá una huella distinta ya que esta depende de su secuencia. Por tanto, es muy poco probable que dos proteínas tengan la misma huella.
Podemos usar la huella peptídica para comparar un análisis experimental con análisis in silico si nos encontramos por ejemplo ante una proteína purificada que queremos identificar. Tratamos la protéina con tripsina geneando una serie de péptidos que analizamos con el espectrómetro de masas. Así, obtenemos un listado de masas de los péptidos generados. A continuación se lanza una búsqueda contra una base de datos de forma que nos busque alguna secuencia que teóricamente dé las mismas masas al cortar con la misma proteasa.
Empleando MALDI ToF (espectrometría de masas con MALDI como método de ioización y Time of Flight como analizador) conseguimos ordenar los péptidos generados en función de su tamaño: los de menor masa se aceleran más y van más rápido por elt ubo de vuelo - se obtiene la relación masa/carga de cada uno de los péptidos.
A la hora de buscar en las bases de datos y comparar se toma sobre todo el pico isotópico (en el que se asume que todos los C de la proteína son C12) ya que las bases de datos consideran que todos los carbonos son C12.
La identificación de la proteína es de tipo probabilístico: el programa se basa en unos algoritmos y analiza cuál es la probabilidad de que la coincidencia entre el espectro de la muestra y el de la muestra encontrada en la base de datos se deba al azar.
Normalmente, el motor de búsqueda deja elegir la base de datos en la que se va a buscar. Las más empleadas son UniProt y NCBi. Solo se pueden identificar aquellas proteínas que se encuentren en las bases de datos por lo que, en función de si el organismo en cuestión es muy conocido o no, será mejor lanzar la búsqueda contra SwissProt o contra TrEMBL (si estamos hablando de UniProt).
El motor de búsqueda que suele emplearse es el MASCOT.
9 Espectrometría de masas En algunas ocasiones, la huella peptídica no permite identificar proteínas. Esto puede deberse a distintas razones: por ejemplo, puede deberse a que contamos con poca cantidad de proteína, o bien a que tras la digestión se ha generado un número insuficiente de péptidos. Si los péptidos tienen modificaciones post-traduccionales tampoco obtendremos un buen resultado ya que no se puede conocer bien su masa (no será igual a la masa prevista en función de la secuencia). Si la proteína no está completamente pura, no podremos llevar a cabo la identificación, por lo que este método no sirve para mezclas de proteínas (obtendremos una mezcla de los péptidos de todas las proteínas que no podremos discriminar). Además, como es lógico, no podremos identificar una proteína que no conste en las bases de datos.
Ante estas circunstancias, la alternativa a la huella peptídica es identificar la proteína a partir de fragmenteos de péptidos mediante el espectro de masas en tándem.
ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (MS/MS): identificación a partir del análisis de fragmentos de péptidos Con la evolución de la espectrometría de masas, se han construido aparatos que cuentan con dos analizadores de masas. Entre ellos, el aparato contiene una cámara de colisión que permite fragmentar los péptidos.
Al comienzo del aparato tenemos una fuente de ionización que ioniza los péptidos de la muestra. Los iones van hasta el primer analizador de masas en el que se selecciona una relación de masa/carga concreta que pasará a la cámara de colisión. Este péptido aislado es conocido como precursor o ión parental. En la cámara de colisión, el ión parental se divide en diversos fragmentos que serán analizados en el segundo analizador de masas. Finalmente, llegan al detector, en el cual se obtienen los picos correspondientes a los distintos fragmentos (son fragmentos de un único péptido).
Es decir, del espectro de una proteína nos quedamos con un único péptido (que aislamos en el primer analizador) y lo fragmentamos generando un espectro de fragmentación que permite identificarlo.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El análisis de fragmentos nos da información sobre la secuencia de los péptidos. Si la secuencia de la proteína es conocida, bastará con analizar un único péptido para identificarla, ya que dentro de un mismo proteoma (misma especie) no se acostumbran a repetir las secuencias.
Los péptidos están compuestos por aminoácidos que tienen masas diferentes y , por lo general, la fragmentación de estos se produce normalmente por el enlace peptídico.
No todas las moléculas que tenemos del mismo péptido se fragmentan por el mismo punto, por lo que tras la fragmentación obtenemos distintos fragmentos. Llamamos fragmento B a la parte del péptido que queda en N-terminal y fragmento Y a la parte del péptido que queda en C-terminal.
Como estadísticamente es más probable que un péptido se fragmente por un solo sitio, es decir, que tenga un solo punto de corte, podemos prever a partir de una secuencia determinada que frgamentos se podrán formar (teniendo en cuenta que se frgamentan por los enlaces peptídicos). También podría ocurrir que el péptido se frgamente por dos puntos, auqnue es menos probable.
Por tanto, para identificar una proteína podemos trabajar de forma análoga a como se trabaja con la huella peptídica: tenemos el espectro de fragmentación con un listado de relaciones masa/carga de los distintos frgamentos y podemos buscar en bases de datos los péptidos que, al fragmentarse, pueden producir el mismo espectro de fragmentación.
11 Espectrometría de masas Además, si el espectro es de muy buena calidad la información obtenida nos puede permitir secuenciar de novo con la ayuda de programas informáticos y de intuición. Esto nos puede resultar útil a la hora de identificar proteínas de proteomas no conocidos.
Como ya se ha dihco, en principio los péptidos acostumbran a fragmentarse por el enlace peptídico, pero tamibén pueden generarse otro tipo de fragmentos: por ejemplo, si el corte se produce entre el Cα y el carbonilo o entre el Cα y el grupo amino. Estos fragmentos reciben otros nombres distinos de B e Y.
También pueden producirse los llamados iones immonium, que son aquellos en los que queda un aminoácido solo. Puede ocurrir cuando el péptido se fragmenta por dos puntos.
TIPOS DE FRAGMENTACIÓN Existen cuatro tipos: - La más común es CID o Collision Induced dissociation: la cámara de colisión está llena de algún tipo de gas relativamente poco reactivo. Cuando el péptido entra en la cámara, choca con las moléculas de gas generando energía cinética que acabará fragmentando el péptido. Se utilizan gases neutros que no reaccionen químicamente con el péptido como argón, helio e incluso aire.
Este sistema genera principalmente fragmentos B e Y.
- ECD o ETD - Electron Capture or Electron Transfer Dissociation : la cámara de colisión tiene un gas con capacidad para reducir u oxidar el péptido. Al igual que ocurre en CID, el péptido colisiona con el gas y, aparte de generar energía cinética se producen reacciones de trnasferencia de electrones.
Así, mediante la oxidación o reducción del péptido se desestabiliza (y, por tanto, fragmenta) de forma más eficiente. Acostumbra a generar iones c y z. Además, las modificaciones post-traduccionales son más estables.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV - PSD (Postsource Decay) y LIFT: se trata de técnicas que se utilizan para equipos MALDI-TOF.
Los instrumentos más antiguos usan la forma de fragmentación PSD que se basa en que la propia energía generada por la ionización conduce a la fragmentación del péptido . Si se ioniza con una potencia de láser más fuerte de lo habitual, se genera una energía en el péptido que después de ser acelerado, provocará su fragmentación. Como se ionizan los péptidos con un láser, también se llama Laser Induced Dissociation.
En la aceleración inicial aún no se ha producido la fragmentación del péptido, por lo que todas las moléculas del péptido sufrirán la misma aceleración. Como consecuencia de esta aceleración inicial, los iones se van fragmentando. Como la velocidad depende de la aceleración inicial, todos los fragmentos procedentes del mismo "padre" o péptido precursor viajarán juntos y pasarán a la vez a través de una puerta de tiempo (Timed Ion Selection), una puerta electromagnética que puede dejar pasar o no a los iones. Por tanto, mediante la puerta de tiempo se separan los iones de manera que podemos dejar pasar una sola relación masa/carga concreta.
Es necesario contar con un elemento que nos permita separar los distintos "iones hijos". El PSD clásico jugaba con potenciales del reflector para separar, aunque no funcionaba bien.
En la actualidad, el PSD no se usa sino que ha sido sustituido por LIFT. Se trata de una variante del PSD que reagrupa y reacelera todos los fragmentos generados. La velocidad que estos adquieran dependerá de su relación masa/carga. Por tanto, mediante LIFT si es posible separar los distintos fragmentos que se producen a partir de un mismo precursor.
En la siguiente tabla podemos ver la comparación de los tipos de espectrómetros de masas masas más comunes que se utilizan actualmente.
En los últimos años, los tipos de espectrómetros no han cambiado mucho, pero sí son distintos en cuanto a especifidad, sensibilidad, … Q-Q-ToF: este espectrómetro de masas combina el quadrupol como primer analizador y el Tiempo de Vuelo (ToF) como segundo analizador. Además, como cámara de fragmentación, este aparato también emplea un quadrupol. Este tipo de aparato llega a precisiones de masas y resoluciones bastante buenas. Es bastante fácil de acoplar con electrosprays.
Q-Q-Q o triple quadrupol es bastanta similar al Q-Q-ToF. Como su propio nombre indica, el Q-QQ tiene tres quadrupoles. No es excesivamente bueno en precisión de masas y resolución pero sí en sensibilidad ya que, normalmente los quadrupoles son más sensibles que el sistema de Tiempo de Vuelo.
Además, tiene un rango dinámico bastante amplio. También se acopla bien a la ionización en electrospray.
13 Espectrometría de masas ToF-ToF (tiempo de vuelo-tiempo de vuelo). Normalmente se encuentra acoplado a la ionización de tipo MALDI. Estos aparatos tienen en un punto intermedio de la trayectoria de vuelo una puerta de tiempo (Time Ion Selector) que, en un momento determinado, deja pasar iones de una relación masa/carga concreta.
Trampas iónicas (IT-LIT): tienen una elevada sensibilidad pero, en general, no suelen tener mucha resolución ni un gran rango dinámico.
Orbitrap Como ya se ha comentado anteriormente, el Orbitrap es la evolución del cyclotron y (Fourier Transformation) se trata del espectrómetro de masas más potente que podemos encontrar actualmente.
Incorpora muchos elementos: el corazón del instrumento es un Orbitrap, una variante más elíptica de la transformación de Fourier o Cyclotron que permite que los fragmentos sean más pequeños y más rápidos. Además del Orbitrap, este espectrómetro de la casa comercial Thermo incorpora otros elementos adicionales como un quadrupol, trampas que permiten guardar o aislar determinados iones para que salgan cuando se quiera, … 14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Las casas comerciales que no tienen la patente han intentado mejorar sus QToFs para acercarse a los niveles de resolución y sensibilidad de estos instrumentos, pero no se llegan a ser aparatos tan buenos como este.
Los laboratorios y centros de proteómica que se pueden permitir comprar los aparatos más punteros pueden hacer cosas que no están al alcance del resto de laboratorios con peores aparatos. Los laboratorios más potentes en proteómica pueden incluso permitirse comprar más de uno a pesar de que están valorados en 600.000€ aproximadamente.

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