Source: https://www.jove.com/video/58470/separacin-de-espinacas-tilacoides-complejos-de-protenas-por?language=Spanish
Timestamp: 2019-09-21 06:57:53+00:00

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Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting | Protocol (Translated to Spanish)
Aquí presentamos un protocolo para separar complejos de tilacoides solubilizado por electroforesis nativa en verde. Bandas de gel verde posteriormente se caracterizan por tiempo correlacionó solo fotón contando (TCSPC) y pasos básicos para el análisis de los datos se proporcionan.
Las reacciones de luz de la fotosíntesis se llevan a cabo por una serie de complejos de proteína pigmentada en las membranas tilacoides. La estequiometría y la organización de estos complejos es altamente dinámica en el largo y corto plazos debido a los procesos que se adaptan la fotosíntesis a las cambiantes condiciones ambientales (es decir, el amortiguamiento no fotoquímica, las transiciones de estado y la respuesta a largo plazo). Históricamente, estos procesos se han descrito espectroscópico en términos de cambios en la fluorescencia de la clorofila y espectroscopia sigue siendo un método esencial para el monitoreo de parámetros de fotosíntesis. Hay un número limitado de formas en que se puede visualizar la compleja dinámica de la proteína subyacente. Aquí describimos un método rápido y simple para la separación de alta resolución y visualización de complejos de tilacoides, electroforesis en gel verde nativo. Este método se combina con tiempo-correlacionada fotón contando para la caracterización detallada de las propiedades de fluorescencia de clorofila de bandas separadas en el gel verde.
Organismos fotosintéticos constantemente deben ajustar su fisiología a las cambiantes condiciones ambientales para maximizar su productividad y competir con éxito con vecinos1. Esto es especialmente cierto de la maquinaria responsable de las reacciones de luz de la fotosíntesis, como luz ambiental condiciones pueden fluctuar por tres órdenes de magnitud entre las sombras y a plena luz del sol. Además, factores ambientales tales como sequía, frío o estrés por calor pueden reducir la disponibilidad de dióxido de carbono para la fijación de carbono, que es el fregadero del electrón natural para los productos de las reacciones de luz. Plantas deben, por lo tanto, cosechar y utilizar radiación solar tan eficientemente como sea posible sin perder la capacidad de disipar el exceso de energía luz según sea necesario. Mientras que photooxidative daño todavía ocurre rutinariamente bajo todas las condiciones de luz2,3, falta lograr excitación absorbe energía con éxito puede conducir al daño catastrófico celular y muerte. Varios mecanismos adaptativos existen que permiten que el aparato fotosintético a ajustarse a los cambios en las condiciones ambientales prevalecientes y a las fluctuaciones transitorias (es decir, en plazos cortos y largos)4. Estos incluyen la respuesta a largo plazo (LTR) y Temple no fotoquímica (NPQ). NPQ es en sí mismo considerado para abarcar por lo menos tres otros fenómenos de componente, incluyendo las transiciones de estado (qT), amortiguamiento de energía rápidamente inducible (qE) y fotoinhibición (qI)5.
Estos procesos fueron originalmente observados y define en gran medida en términos de fenómenos espectroscópicos [e.g., NPQ se refiere a una gota en observada fluorescencia (quenching de fluorescencia de la clorofila) que no es debido a un aumento en la tasa de fotoquímica]6. El término "las transiciones de estado" se refiere igualmente al cambio observado en la cantidad relativa de la fluorescencia de PSI y PSII7. Mientras que las técnicas espectroscópicas que han posibilitado la enumeración de estos fenómenos [en particular, la amplitud de pulso modulada de espectroscopia de fluorescencia (PAM)] y siguen siendo un medio vital para observar y diseccionar los procesos fotosintéticos en vivo, mucho de la bioquímica es necesaria para aclarar los mecanismos subyacentes a estas observaciones espectroscópicas. Transiciones de estado, por ejemplo, implica un ciclo de la fosforilación/desfosforilación de las proteínas LHCII por la STN7 cinasa y la fosfatasa TAP38/PPH1, respectivamente8,9,10. Este ciclo ajusta la distribución física de la antena LHCII entre los dos fotosistemas moviendo una porción de trimers LHCII de PSII a PSI, cambiando así la absorción de la sección transversal de los fotosistemas11,12. El componente FC de NPQ rápidamente convierte la energía de exceso de excitación en calor a través de las acciones del ciclo de epoxidación/de-epoxidación de violaxantina/zeaxantina y la proteína de subsidiarios. El papel exacto de subsidiarios en este proceso es aún no comprendido del todo13. El componente de qI de NPQ, fotoinhibición, generalmente se atribuye al daño a la proteína D1 del PSII. Restauración de competencia fotosintética total requiere un proceso de reparación elaborados para solucionar dañado PSII photocenters. El ciclo de reparación PSII implica la migración de complejos PSII de la pilas granal, desmantelamiento de los complejos, recambio de proteínas dañadas de la D1, rearmado de los complejos PSII y el movimiento de complejos PSII en el granal pilas14. La naturaleza exacta de la fotoinhibición y PSII fotodaño sigue siendo objeto de intenso escrutinio15.
La dificultad en el estudio de fenómenos como el estado de las transiciones o reparación PSII surge en parte del hecho de que hay no una forma simple de visualizar la mecánica de sistemas bioquímicos complejos. El enfoque clásico de la bioquímico para entender un proceso es primero separar sus componentes por lo que puede ser caracterizados en aislamiento. Electroforesis nativa surgieron de los esfuerzos exitosos en la década de 1980 para separar y caracterizar los complejos del fotosistema de los tilacoides con más métodos de preparación (es decir, centrifugación de gradiente de sacarosa y cromatografía)16. Los sistemas detergentes para solubilizar suavemente los conjuntos nativos de las membranas tilacoides pronto fueron adaptados a los métodos de separación electroforética, en particular por Allen y Staehelin17 y y Peter y Thornber18, dando lugar a electroforesis en gel verde nativo. Mientras que representan sólo uno de una variedad de técnicas en el arsenal experimental, página nativa tiene un número de características atractivas que han hecho un método ampliamente empleado en la investigación de la fotosíntesis. Página nativa es relativamente rápida y sencilla, requiriendo equipo poco especializado, ofreciendo al mismo tiempo la separación de alta resolución de un gran número de complejos de tilacoides. Esto hace que página nativa una herramienta conveniente para estudiar la dinámica de los tilacoides y, cuando se combina con la página estándar de la segunda dimensión, así como una variedad de sistemas de tampón y detergente, un versátil sistema para la búsqueda y caracterización de nuevos complejos de tilacoides.
Dicho esto, los geles verdes nativos han tenido una reputación de ser una técnica poco fiable, especialmente en manos inexpertas, ya que es fácil producir resultados pobres consisten en geles borrosos, graso con pocas bandas. Este problema fue solucionado, en parte, con la introducción del azul natural página19. El uso de tinte coommassie en el sistema BN hace separación de las proteínas más robusto. Por lo tanto, BN-página suele ser una técnica más fiable y más fácil para un novato relativa configurar y puede proporcionar separaciones de alta resolución de los complejos de tilacoides. Por estas razones, BN-PAGE se ha convertido en el método de elección para la mayoría de los trabajos de este campo. BN-PAGE es generalmente más lento correr de electroforesis en gel verde, su principal inconveniente es que la coloración de tinte de coommassie interfiere con la identificación de bandas débiles que contiene clorofila, además de hacer aguas abajo espectroscópicas Caracterización problemática.
La información bioquímica proporcionada por geles nativos y 2D SDS-PAGE puede fortalecerse enormemente cuando se combina con los datos de técnicas espectroscópicas. Independientemente del sistema empleado, un problema central con el uso de geles nativos para identificar complejos es que la identificación siempre puede ser impugnada (es decir, las proteínas se encuentran en una banda podría siempre representan complejos comigrating o componentes, sino de un solo complejo fisiológico auténtico). Caracterización espectroscópica proporciona información biofísica sobre los pigmentos en las bandas de gel verde y puede utilizarse para determinar qué tipo de complejos son capaces de contener. Fluorescencia de la clorofila es especialmente útil en este sentido debido a la a menudo dramáticamente diversos espectros y cursos de la vida de la fluorescencia que son característicos de complejos pigmento fotosintéticos diferentes proteínas. Mientras que los espectros de fluorescencia de estado estacionario simple 77K históricamente han sido útiles para confirmar las identidades de los complejos de gel nativo, moderno tiempo-correlacionada fotón contando (TCSPC) puede proporcionar mucha más información. TCSPC permite no sólo la caracterización de los complejos basados en cursos de la vida de la fluorescencia, pero también hace posible la descripción detallada de la transferencia de energía entre componentes espectrales dentro de un complejo. Este tipo de caracterización se está convirtiendo en cada vez más necesaria como el uso de varias extensiones de sistemas de gel nativo y se descubren nuevos supuestos complejos, permitiendo la identificación de complejos de la proteína para ser mejor autenticados y proporcionar nuevos información biofísica sobre el funcionamiento de estos complejos.
En este trabajo ofrecemos un método que permite a los que tienen poca o ninguna experiencia con electroforesis nativa para lograr alta calidad de resolución de los complejos de tilacoides nativo con el fin de investigar los mecanismos de las reacciones de luz de fotosíntesis. Esta técnica básica entonces se puede aumentar a criterio del experimentador para mejorar resultados o ampliar la aplicabilidad a otras especies. Luego Describimos el proceso para sujetar vendas de gel verde nativo TCSPC, así como algunos pasos para el análisis básico y presentación de los datos proporcionados por la técnica. El acoplamiento de electroforesis nativa con análisis TCSPC amplía la utilidad de estos sistemas de gel proporciona autenticación y caracterización biofísica de complejos de proteína dentro de las bandas. El sistema de gel verde descrito aquí se basa en que desarrollado por Allen y Staehelin17 con algunas modificaciones y es el mismo que el utilizado en Schwarz et al. 20. este sistema es uno de los muchos pero tiene características específicas que son útiles para esta metodología. Es lo suficientemente rápida para que aislamiento de tilacoides, electroforesis y análisis TCSPC conveniente se pueden realizar en un día, evitando posibles problemas de almacenamiento de la muestra y degradación. También encontramos que este método es robusto en las manos de usuarios inexpertos, sin dejar de ofrecer resultados que van de bueno a superior, dependiendo del grado de optimización.
Es importante tener en cuenta que los complejos visualizados en un gel nativo en el detergente y el buffer sistemas utilizados, así como sobre la biología del organismo bajo investigación. Diferentes sistemas de tampón y detergente preferentemente separan diferentes tipos de complejos, y un organismo fotosintético determinado tendrá diferentes complejos de otros organismos, no todos los cuales estarán presentes en cualquier circunstancia dada. El sistema descrito aquí es particularmente adecuado para el estudio de megacomplexes PSI, como se describe en Schwarz et al. 20, pero cae en el extremo más desestabilizador del espectro para quienes estudian megacomplexes PSII. Para un estudio exhaustivo de los diversos sistemas de tampón y detergente usados en electroforesis nativa de tilacoides proteínas, se recomienda revisar Järvi et al. 21 y Rantala et al. 22.
1. soluciones preparación para verter el gel verde nativo
Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para resolver geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 8.3.
Preparar 4 x solución amortiguadora concentrada para apilar los geles consisten en glicerol al 40%, glicina de 200 mM y 100 mM Tris amortiguada a pH 6,3.
Almacenar estos búferes a 4 ° C para evitar el crecimiento de moho.
Nota: Los topes son estables durante meses a 4 ° C, por lo que se recomienda la preparación de 100-200 mL de cada amortiguador para uso continuado.
Preparar 1 L de 10 x funcionamiento tampón que contiene 250 mM Tris HCl, pH 8.3, 1,92 M de glicina y 1% SDS. Tienda el 10 x corriente buffer en el Banco.
2. solución preparación para aislamiento y solubilización de tilacoides
Preparar 100 mL de buffer de homogenización de TMK que contiene 50 mM de tampón Tris (pH 7), 10 mM de MgCl2y 10 mM de KCl y almacenar a 4 ° C.
Nota: Este es el principal buffer de homogeneización y la manipulación de las muestras de tilacoides. Alternativamente, soluciones madre concentradas pueden preparadas y diluidas según sea necesario (tampón Tris, MgCl2y KCl pueden todos ser fácilmente almacenada en el Banco 1 M se concentra).
Preparar las soluciones madre de los tilacoides detergentes solubilización, maltoside B-decyl (DM) y n-octilo B-d-glucósido (OG), mediante la disolución de cada detergente en buffer TMK 20% w / v. congelación a-20 ° C en alícuotas de 1 mL.
Preparar el tampón de solubilización de tilacoides (SB), que también es el tampón de carga de la muestra.
En primer lugar, hacer TMK-glicerol búfer mediante la combinación de 7 ml de tampón TMK y 3 ml de glicerol.
A 800 μL de tampón de TMK-glicerol, añadir 100 μL de solución stock de DM y 100 μL de la solución madre de OG. Almacenar esta solución de trabajo de SB, que contiene 2% DM y 2% OG, congelado a-20 ° C en alícuotas de 1 mL.
Nota: Cada alícuota puede ser descongelado y a congelar como sea necesario.
3. verter verdes Mini geles para uso posterior
Preparar separado apilado y resolver soluciones de gel en tubos de ensayo desechables de 15 mL.
Nota: Los volúmenes proporcionados son suficientes para un solo gel mini usando a separadores de placa de 1,5 mm.
Para hacer la solución gel de apilamiento, combinan 1,25 mL de 4 x buffer gel de apilamiento, 0,5 mL de solución stock acrilamida al 40% (39:1 C) y 3,25 mL de agua para darle 5 mL de acrilamida de 4% en el 1 x de tampón de apilamiento. Para hacer el gel de resolución solución combinan 1,875 mL de 4 x resolución de 4,7 mL de agua a 7,5 mL de acrilamida 5% 1 x solución de tampón, buffer y 0,94 mL de solución stock acrilamida al 40% (39:1 C).
Verter el gel de resolución.
Añadir 50 μL de persulfato de amonio 10% (APS) a la solución de gel de resolución, luego añada 10 μL de TEMED, cerrar el tubo e invertir suavemente varias veces para mezclar. Inmediatamente verter la solución de gel entre las placas de gel, dejando aproximadamente 1 cm entre la parte superior del gel de resolución y parte inferior de los dientes de peine para el gel de apilamiento.
Pipetee suavemente 100% de etanol en la parte superior del gel de resolución a nivel del gel.
Nota: Si el gel no establece dentro de 15 min, solución fresca de APS debe hacerse o TEMED nuevo debe utilizarse.
Después de que el gel ha polimerizado (la interfaz entre el gel y el etanol será fácilmente visible y no se mueve cuando se inclina el gel), vierte el etanol y la mancha con un papel absorbente.
Verter el gel de apilamiento.
Añadir 25 μL de 10% APS a la solución de gel de apilamiento, añadir 5 μL de TEMED, luego tapa e invertir para mezclar en la misma forma que el gel de resolución. Vierta la solución en gel en la parte superior del gel de resolución hasta llenar completamente el espacio entre las placas y colocar un peine de 10 pozos.
Nota: Cuando esté listo para ser usado, retire el peine del gel y enjuague los pozos con agua, asegurándose de que los pozos estén rectas y sin obstáculos por el gel. El gel puede guardarse con el peine en su lugar a 4 ° C durante al menos varios días.
4. aislamiento de tilacoides crudo de espinaca hojas
Nota: Todos los pasos deben llevarse a cabo sobre el hielo usando tampones y equipo previamente enfriada. También se recomienda la iluminación tenue. Dependiendo del criterio del experimentador y los procesos biológicos en estudio, los inhibidores de la proteasa y fosfatasa deben añadirse fresco a búferes TMK antes de homogeneización.
Homogeneizar completamente hojas de espinaca en tampón de TMK con un homogeneizador de vidrio Dounce.
Nota: Aproximadamente 1 a 2 mL de tampón es normalmente suficiente para una hoja de espinaca bebé pequeño. Una hoja de espinaca bebé único general puede proporcionar suficiente material para cargar varios pozos en gel mini de 1,5 mm.
Filtrar el homogeneizado crudo de la hoja para eliminar la suciedad insoluble.
Para hacer un simple dispositivo de filtrado, corte una tarea delicada limpie en mitad y doblar en cuartos. Pack el paño tarea delicada en la parte inferior de una jeringa desechable de 5 mL y pre-moje el paño con tampón de TMK.
Utilice el émbolo de la jeringa para Pulsa el exceso de tampón de la limpieza de la delicada tarea y asegúrese de que el filtro Limpie se presiona firmemente a la parte inferior de la jeringa después de retira el émbolo.
Pipeta el homogeneizado de la hoja en el centro del paño filtro y utilizar el émbolo para pasar el homogeneizado a través del filtro. Recoger el filtrado homogeneizado en un tubo de centrífuga de 1.5 mL.
Centrifugar el homogeneizado a 5.000 x g durante 10 min a 4° C para que sedimenten los materiales insolubles, incluyendo membranas tilacoides. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de tampón TMK.
Normalizar la cantidad de clorofila en cada muestra ajustando el volumen de cada muestra de tilacoides resuspendido para que cada muestra contiene la misma cantidad total de clorofila, como se describe a continuación.
Nota: Esto permitirá que cada muestra a ser solubilizado en el mismo volumen de detergente y reduce al mínimo la variabilidad en la solubilización debido a diferencias en el volumen de pellets.
Para extraer la clorofila de cada muestra de tilacoides resuspendidos, tomar 50 μL alícuota en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y añadirle 950 μL de metanol. Tapa el tubo y mezclar invirtiéndolo varias veces.
Centrifugue el extracto de metanol/clorofila a 10.000 x g durante 10 minutos para que sedimenten los precipitados proteínas.
Determinar la concentración de clorofila, el pigmento que contienen sobrenadante según Porra et al. 23. tomar lecturas de absorbancia a 652 y 665 nm usando un espectrofotómetro y una cubeta de 1 cm. Determinar la concentración de clorofila total usando la siguiente ecuación:
Chls un + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)
Utilizando las mediciones de concentración de clorofila como guía, retire y deseche algo de volumen de cada muestra, si es necesario, para que cada tubo contiene la misma cantidad total de clorofila.
Volver a pellets tilacoides por centrifugación a 5.000 x g durante 10 minutos, retire y descarte el sobrenadante. Tenga cuidado de eliminar sobrenadante todos sin aspiración alguna de la pelotilla.
5. solubilización de las membranas de los tilacoides para carga en geles nativos
Descongelar una alícuota de la solución de detergente glicerina (SB) de TMK 30% e invertir varias veces para mezclar. Mantener en hielo.
Disolver el precipitado de tilacoides añadiendo el volumen adecuado de SB para dar una concentración de 1 mg/mL de clorofila.
Nota: Esta concentración es un punto de partida para encontrar las condiciones óptimas de solubilización, que deben determinarse empíricamente. La concentración de clorofila debe mantenerse iguales entre muestras para permitir comparaciones válidas para hacerse.
Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces teniendo cuidado de no espumar de la muestra. Mantenga en hielo para permitir que las muestras de los tilacoides solubilizar.
Nota: Solubilizar por al menos 10 minutos. Tiempo de solubilización debe ser lo suficientemente largos que se minimiza la diferencia en tiempo de solubilización entre muestras.
Ejemplo: Si se requiere 3 minutos para solubilizar todas las muestras, luego aproximadamente 30 minutos deben de solubilización.
De centrífuga tilacoides solubilizado a 10.000 x g a 4 ° C para pellets de material insoluble.
Nota: Solubilizado tilacoides muestras son estables en el hielo durante horas, pero a-70 ° C se debe guardar, como ciclos de congelación y descongelación pueden resultar en una pérdida de megacomplex bandas.
6. separación de proteínas solubilizadas tilacoides por electroforesis nativa
El sobrenadante de tilacoides solubilizado preparado en el paso 5.4 directamente sobre el gel nativo preparado antes de la carga. Para un gel de 1,5 mm, carga 15 μL de tilacoides solubilizado por pozo.
Correr el gel verde nativo en esencialmente la misma manera que los geles de SDS-PAGE con 1 x buffer de corriente. Correr el gel a 100 V y colocar el tanque del gel todo en hielo húmedo para la duración de la carrera para mitigar resistente calefacción del gel.
Nota: El gel debe requerir aproximadamente 2 horas para el pigmento libre en el frente de migración para llegar a la parte inferior del gel (figura 1).
7. supresión de tilacoides complejo bandas de geles verdes nativos
Nota: Suprimir la banda específica de interés del gel es necesario para permitir que la banda para colocarse en la trayectoria de la viga y para impedir que se recogen callejero fluorescencia de complejos cercanos.
Retirar el gel de la célula de electroforesis y enjuague corriente buffer de las placas de gel con agua destilada. Retire la placa superior del gel y el gel con agua destilada de enjuague.
Mantener el gel en la placa inferior de vidrio y coloque el gel y la placa de hielo. Cuando no esté en uso, mantenga el gel en la oscuridad y cubierta con una envoltura de plástico para evitar que se resequen.
Con el gel queda en la placa de vidrio, suprimir cada grupo de interés cuando esté listo para el análisis TCSPC. Impuestos especiales bandas limpiamente con un bisturí afilado o una cuchilla de afeitar y cuidar que la banda suprimida no contiene ningún material contaminante de la banda.
8. colección de espectros de fluorescencia de estado estacionario de temperatura
Para cada complejo que será analizada por TCSPC, se toma un espectro de fluorescencia de la temperatura entre 600 y 800 nm, utilizando un espectrómetro de fluorescencia.
Nota: La longitud de onda de excitación utilizada para recoger este espectro debe coincidir con la longitud de onda utilizada para TCSPC.
9. TCSPC de bandas de Gel verde
Nota: Refiérase a la figura 2 para una descripción de la configuración TCSPC.
Emparedado de la rebanada de gel entre dos portaobjetos de microscopía. Utilice cinta de enmascarar, coloca en cada extremo de uno de los portaobjetos de microscopía y doblada varias veces, para crear a separadores para que las diapositivas pueden llevar a cabo juntos firmemente sin comprimir el trozo de gel.
Nota: Esto crea un camino para que el láser pase entre el microscopio y a través de la rebanada de gel.
Añadir una pequeña cantidad de agua a la rebanada de gel en el borde de las diapositivas de cristal para crear una interfaz suave que reduzca la dispersión de la señal.
Abrazadera de gel o diapositiva de emparedado en la trayectoria de la viga para que el rayo golpea el trozo de gel a través del borde libre de las placas, lo que permite la emisión de fluorescencia que a través del lado de los portaobjetos de vidrio en la que se encuentra el gel, perpendicular a la trayectoria de viga.
Nota: Dependerá de la longitud de onda de excitación utilizado en el experimento. Longitud de onda de 435 nm excitará clorofila a y clorofila b, y 465 nm preferencial excitará clorofila b. En este caso, 435 nm fue utilizada como la longitud de onda de excitación.
Recoge 10.000 puntos del total de datos a intervalos regulares en todo el espectro de emisión de fluorescencia de cada complejo. Por ejemplo, recoger datos cada 10 nm, a partir de 680 nm y terminando en 750 nm.
Nota: Preparar múltiples bandas de gel para cada complejo a estudiar así muestra fresca está disponible en caso de que el fotoblanqueo previene la colección de señal adecuada.
10. TCSPC (análisis de datos)
Para un determinado complejo, primero normalizar la altura máxima de cada curva de decaimiento para longitudes de onda todos recogidos.
Nota: Este paso no es necesario para la construcción del DAS pero permite curvas de decaimiento se sobrepuso y comparar visualmente como una primera inspección de los datos.
Partido de cola cada curva de decaimiento para el espectro de fluorescencia de estado estacionario del complejo como se describe a continuación.
Elija un punto después de que la señal de decaimiento ha aplanado hacia fuera, generalmente después de unos pocos nanosegundos.
Para cada longitud de onda, normalizar la curva de decaimiento por lo que la intensidad de señal en el punto seleccionado es igual al valor del espectro de fluorescencia de estado estacionario en esa longitud de onda (es decir, los valores de todas las longitudes de onda en el punto seleccionado volverá a crear el espectro de fluorescencia de estado estacionario).
Construir espectros de caries asociado (DAS) de las curvas de decaimiento comparable de cola, como se describe a continuación.
Utilizando datos de puntos de las curvas de decaimiento comparable cola construcción una serie de diagramas gráficos de intensidad de fluorescencia frente a longitud de onda en intervalos regulares de tiempo (por ejemplo, cada 10 ps). Por ejemplo, el DAS al 50 ps se construye trazando el valor de cada curva de decaimiento en 50 ps vs longitud de onda.
Superposición de los espectros de caries asociado para crear una trama de estilo de cascada que muestra la decadencia del espectro de fluorescencia con el tiempo.
Resultados representativos para la electroforesis del gel verde se presentan en la figura 1. Carril 1 proporciona un ejemplo de resultados ideales para electroforesis en gel verde de espinaca tilacoides, en el que un número máximo de bandas verdes claro, agudos es accesibles. Estos resultados son un tanto atípicos, en parte porque no todas las bandas en el carril 1 normalmente están presentes en una muestra determinada. Limpieza adicional de la muestra, en forma de aislamiento del cloroplasto antes de solubilización de tilacoides y electroforesis del gel del gradiente (4-7% acrilamida) también son normalmente necesarias para lograr resultados óptimos. Carriles 2 y 3 presente más típicos resultados usando el protocolo detallado aquí junto con un gel no gradiente de 5%. Carriles 4, 5 y 6 proporcionan un ejemplo de resultados pobres debido a la creciente grados de bajo de solubilización de la muestra de tilacoides. Carril 7 proporciona un ejemplo de resultados típicos con Arabidopsis tilacoides en vez de espinacas. Tenga en cuenta que para Arabidopsis las bandas megacomplex en la parte superior del gel tienden a resolverse mal comparado con los de espinaca.
Una representación gráfica de la configuración TCSPC utilizada para recoger datos de bandas de gel verde nativa se muestra en la figura 2. La figura 3 muestra un típico flujo de trabajo para el análisis del principio después de que se ha recogido datos TCSPC como se describe en el paso 10. Cuando se recaben datos TCSPC, cada curva en una determinada longitud de onda representa un número arbitrario de puntos de datos, o "cuenta". Cuando estas curvas se superponen uno con el otro, como se muestra en la Figura 3A, las curvas no se puede comparar uno con el otro directamente porque no están representados en la misma escala y no todos pueden registrarse en el mismo punto de tiempo inicial. El primer paso en el análisis de los datos es por lo tanto comparar cada curva a su correspondiente función de respuesta de instrumento (IRF). El pico de la Fig para una curva dada se establece en tiempo t = 0, y el borde de la curva de decaimiento de la fluorescencia correspondiente se superponen a la vanguardia de la Fig, como se muestra en la figura 3B. Esto establecerá todas las curvas en el mismo registro de tiempo para su posterior análisis.
Aunque no es necesario para la construcción del DAS, en este momento la normalización de todas las curvas a la misma altura de pico permite una útil comparación entre las curvas para hacer como un primer análisis de los datos. En la figura 3, las misma curvas de decaimiento de LHCII presentado en la Figura 3A se muestran después del registro de tiempo, como en la figura 3By normalización de altura de pico. Como se ve en la figura 3D, curvas de decaimiento pico normalizado de los diferentes complejos pueden entonces superponerse uno con el otro en una determinada longitud de onda, permitiendo que las diferencias de comportamiento entre los complejos para visualizar. Por ejemplo, LHCII tiene una fluorescencia característico de larga duración que se descompone lentamente, mientras que la fluorescencia PSI fuertemente se apaga, que se decae muy rápidamente. La curva de decaimiento de la fluorescencia de banda 5 proporciona un interesante ejemplo de datos muy sugerentes, en parte porque claramente es bifásica. La curva de decaimiento de fluorescencia inicial para la banda 5 complejo sigue al mismo ritmo que PSI para aproximadamente 500 ps pero decae más rápidamente después de eso. Interesantes resultados de este tipo pueden ser analizadas con mayor detalle por construir espectros asociados a caries (DAS).
En la figura 4, representante DAS parcelas de cascada se muestran LHCII y la banda de 5 complejos. Construcción de DAS requiere primero que las curvas de decaimiento de un complejo dado cola-coincidir con el espectro de fluorescencia de temperatura para el complejo, como se describe en el paso 11.2. Los resultados de coincidencia de cola curvas de decaimiento de LHCII se muestran en la Figura 4A. DAS entonces se construyen de estas curvas como se describe en el paso 11.3. DAS de LHCII fueron construidos de las curvas de decaimiento que se muestra en la Figura 4A y figura4B se presentan los resultados. DAS entre 0 y 100 ps fueron omitidos para mayor claridad y sólo presenta cada 100 ps después de eso debido al decaimiento lento característico de LHCII aislado. DAS de LHCII es notable por la falta de características dinámicas y la forma del espectro de fluorescencia de LHCII se mantiene igual que la caries de la señal en el tiempo. El decaimiento del espectro de fluorescencia también se retrasa, que requieren 100 ps para alcanzar máxima fluorescencia. Esto sugiere, como podría esperarse de luz aislada cosecha complejos de la proteína, que la energía no se transfiere entre energéticamente distintos pigmentos dentro del complejo como se decae de la fluorescencia. La excepción a esto es el cambio en el espectro que ocurre durante los primeros 100 ps, presumiblemente debido a la redistribución inicial de energía de la excitación en todo el complejo.
DAS para la banda 5 complejos se muestran en la figura 4, construido en una manera similar a la que muestra de LHCII. Banda 5 proporciona un contraste aleccionador a LHCII de varias maneras. Comparado con el LHCII, fluorescencia de banda 5 se descompone mucho más rápidamente, alcanzando la máxima intensidad en solo 30 ps y que decae a menos del 20% de la intensidad inicial después de 500 ps. El espectro de fluorescencia de la banda 5 complejo también exhibe un número de la interesante dinámica como se decae de la emisión. Comparando los espectros en 0 y 60 ps muestra claramente un aumento en fluorescencia en 720 nm a expensas de fluorescencia en 680 y 710 nm. Después de eso, el pico a 680 cambios nm a 690 nm y amplía, mientras que el pico a 720 nm cambios hacia 710 nm (e.g., comparar 60 ps PS 500). Datos de este tipo ayuda a descartar la presencia de proteínas de antena LHCII ajenas mientras que proporciona evidencia de la transferencia de energía de LHCII a la antena PSI y eventualmente a la base de la PSI.
Esta dinámica también sugiere que hay probablemente picos sin resolver alrededor de 680 nm, 690 nm, 710 nm y 720 nm. Estos datos por lo tanto proporcionan un ejemplo donde espectrales características podrían resolverse mejor recogiendo datos TCSPC intervalos más cercano (por ejemplo cada 5 nm en lugar de cada 10 nm). Incluso en ausencia de mayor resolución espectral, sin embargo, el DAS para la banda 5 complejos son un ejemplo de evidencia de transferencia de energía entre múltiples especies fluorescentes dentro de un complejo. También parece haber un pico que se decae rápidamente por encima de los 740 nm, lo que sugiere que también deben recoger datos sobre un espectro más amplio para incluir más de las características espectrales.
Figura 1: resultados de gel representante verde. Bandas de gel verde sometidas a análisis TCSPC están etiquetados LHCII PSI (fotosistema I LHCII megacomplexes), PSI (fotosistema I LHCI), banda 5 (complejo PSI-LHCII), PSII-LHCII (fotosistema II y asociados II complejo de recolección de luz), PSII (fotosistema II de la base complejo) y LHCII (luz-cosechar complejo II). Carril 1 muestra un patrón de bandas ideal resultante del aislamiento del cloroplasto antes de solubilización y verde gel electroforesis en gel de acrilamida gradiente de 4-7%. Carriles 2 y 3 muestran resultados promedio de aislamiento de tilacoides simples y electroforesis en gel de gradiente no 5% acrilamida. Carriles 4-6 Mostrar severidad creciente de bajo de solubilización. Carril 7 muestra resultados representativos para Arabidopsis usando el Protocolo simple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema de tiempo-correlacionada fotón cuenta instrumento. Fuente de luz es un láser de4 NdYVO pasivamente bloqueado de modo que un laser de tinte dumping de cavidad de bombas. los pulsos 5-ps en las tasas de repetición variables y longitudes de onda se caracterizan mediante un autocorrelador. Los pulsos se dividen, con una porción a un fotodiodo de referencia y el resto de excitar la muestra. Emisión de la muestra se recoge usando un objetivo de microscopio y componentes polarizados se detectan utilizando dos canales de detección. Emisión de la muestra es tiempo resuelta mediante la electrónica de detección indicada, donde CFD = discriminador constante de la fracción, TAC = convertidor de amplitud de tiempo y MCA = analizador de varios canales. Resolución de tiempo depende de la función de la respuesta del instrumento (ca. 40 ps). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: datos representativos de TCSPC crudos y normalizado de la fluorescencia del decaimiento curvas. (A) superposición de datos TCSPC de LHCII. Se recopilaron datos TCSPC cada 10 nm entre 670 nm y que de muestra representativas de la curva A de 740 nm (B) registro de tiempo de los datos de fluorescencia a la función de la respuesta del instrumento (IRF). (C) los datos LHCII de (A) normalizan a una altura máxima de 1 después de que todas las curvas se registraron a sus respectivos IRFs. (D) recubrimiento del decaimiento de la fluorescencia curvas a 680 nm para PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII y banda 5. Todas las curvas de decaimiento fueron normalizadas a una altura máxima de 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: construcción de cascada-estilo DAS. (A) cola de coincidencia de las curvas de decaimiento de LHCII en preparación para la construcción de parcelas DAS. (B) DAS parcelas LHCII para tiempo t = 0, para cada 100 ps de 100 a 500 ps y PS. 1000 (C) DAS parcelas 5 banda cada 30 ps de t = 0 a 210 ps y cada 100 ps después de eso a 500 ps. Para ambos (B) y (C), tiempo = 0 se define por la IRF, que es 40 PS. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Un éxito tilacoides solubilización y gel nativo ejecutar resultará en la resolución de múltiples bandas verdes visibles distintas sobre el gel sin la distorsión significativa o mancharse de las bandas. Sobrecargar el gel, una alta concentración de detergente, un pH de muestra incorrecta, disuelta material, correr el gel a temperatura demasiado elevada o demasiado rápidamente y un gel incorrectamente vertido son factores que pueden contribuir a complejos de tilacoides mal resuelto. Y optimizar las condiciones del gel sí mismo (por ej., concentración gradiente de acrilamida), puede ayudar a maximizar la resolución de las bandas de interés. Es nuestra experiencia que las condiciones de solubilización y la biología de la muestra sí mismo son los factores más importantes que contribuyen a la calidad y cantidad de complejos de tilacoides resueltas en geles nativos de verdes. Es importante recordar que no todos los complejos estará presentes en todas las condiciones biológicas.
Los geles verdes nativos se vierten en esencialmente la misma manera como normales geles mini de SDS-PAGE. Los geles se pueden verter en la mañana y están listos para usar más adelante el mismo día, o pueden almacenarse a 4 ° C por varios días con el peine del gel y sin cambios significativos en el rendimiento. Estándar, disponible 39:1 C soluciones de acrilamida se pueden utilizar para verter el gel de apilamiento y resolver. Geles llamados "poro grande" pueden ser hechos usando acrylamide:bis mayor-relaciones de acrilamida (e.g., 100: 1 C) para aumentar la separación de megacomplexes en la parte superior de los geles, pero podemos encontrar que también tiende a causar menos agudamente resuelto bandas. En nuestra experiencia, la resolución más alta de la banda (con el mayor número de bandas separadas) se logra con la menor proporción de C y un gradiente de concentración de acrilamida lineal de 5-7%. Sin embargo, si un gradiente anterior no está disponible, resolución y separación de la banda muy satisfactoria se logra con una concentración de gel de resolución de alrededor del 5% acrilamida. Es importante que realizar eso electrophoresis a relativamente bajo voltaje para reducir el calentamiento del gel, que podría desnaturalizar los complejos, y para permitir complejos nativos separar uno del otro con alta resolución.
El método para el aislamiento de tilacoides aquí es rápida pero relativamente "sucio" (es decir, no intenta separar los cloroplastos otros organelos o membranas de tilacoides de otras membranas de la célula). Esto es suficiente para los fines de visualizar complejos de tilacoides y medidas posteriores basados en la fluorescencia, puesto que se visualizan sólo clorofila que contienen proteínas. Cabe señalar que para otros usos de aguas abajo (e.g., segunda dimensión detección de SDS-PAGE y proteína), proteínas de tilacoides no estará presentes. Cabe señalar que la mejor resolución se logra cuando cloroplastos están aislados antes de solubilización, presumiblemente debido a la eliminación de materiales insolubles antes de solubilización. Cuando siguiendo el método descrito aquí, otros métodos de homogeneización como puede utilizarse una licuadora y un homogeneizador de vidrio Dounce es rápido y eficaz y permite que todo el material de hoja homogeneizada a conservarse cuantitativamente. La relación de la memoria intermedia a hoja parece no ser importante, a nuestro conocimiento. Aproximadamente 2 mL de buffer para una mitad de una hoja de espinaca baby es un conveniente punto de partida pero puede ajustarse en base a necesidades experimentales.
La proporción adecuada de tampón de solubilización a clorofila es crucial para la optimización del rendimiento de gel verde y debe ser determinada por el experimentador para una especie vegetal determinada o disposición experimental. Solubilización adecuado resultará en un sobrenadante de color verde esmeralda claro, profundo por encima de un gránulo de almidón blanco. Una capa de material verde en la parte superior la pelotilla blanca indica que los tilacoides se han solubilizado bajo. Bajo de solubilización debe evitarse, ya que se traducirá en pobre migración en el gel, incluyendo manchas de las bandas y no proporcionará un preciso patrón de bandas. Los pellets de tilacoides producidos por este método deben ser fáciles de suspender y solubilizar. En el caso de pellets compactas que no se resuspendió rápidamente y homogéneamente se recomienda un método alternativo. Muestras pueden ser suspendidas primero la mitad del volumen de buffer de TMK-glicerol, al que luego se agrega un volumen medio adicional de tampón TMK-glicerol que contiene una concentración de X 2 de detergentes.
Exceso de solubilización debe también evitarse, ya que puede causar la pérdida de densidad de algunas bandas megacomplex. Además, no es posible compensar exceso solubilización por la carga de un volumen mayor de muestra en el gel - hemos encontrado que cargar más de 15 μL de la muestra por pocillo en un gel de 1,5 mm reduce la calidad de la separación; Aunque ello puede ser conveniente para visualizar complejos con baja abundancia. Por el contrario, carga menos de 15 μL puede mejorar resolución de banda y reducir borrosidad pero reducirá la visibilidad de algunas bandas de baja densidad. En general, la concentración creciente de la proteína y mayor concentración de detergente contribuyen a la distorsión de la banda y gel manchas.
Para el tiempo-correlacionada fotón cuenta análisis (TCSPC) de los complejos de gel verde, las longitudes de onda de excitación y de emisión deben ser elegidos por el experimentador a su discreción. Para nuestros propósitos, la longitud de onda de excitación solicitadas fue 435 nm, que se excita la clorofila a y clorofila b. diferentes longitudes de onda puede, sin embargo, utilizarse para excitar clorofilas específicos u otros pigmentos más selectivamente (por ejemplo, una excitación longitud de onda de alrededor de 465 nm preferencial excitará clorofila b). Del mismo modo, un espectro de emisión de la fluorescencia que cubre una región de 680 a 740 nm fue seleccionada basada en los espectros de emisión reportados de LHCII, PSI y PSII. Por lo tanto, esta región cubre todas las características espectrales relevantes de interés para nuestros propósitos. Los intervalos de longitud de onda en la que se recogen datos están también hasta la discreción del experimentador. Intervalos más cortos, como cada 5 nm en lugar de cada 10 nm, hará posible construir un espectro más detallado asociada a caries, pero esto requiere más tiempo y puede no ser necesario. Por el contrario, intervalos más largos pueden no resolver detalles espectrales relevantes.
Simplemente superponiendo fluorescencia normalizada curvas de decaimiento de los diferentes complejos permiten revelar información sobre los complejos. Fluorescencia de LHCII, por ejemplo, es característico duradera, mientras que la fluorescencia de PSI se descompone mucho más rápidamente. Debe tener cuidado en este punto examinar datos contra la función de la respuesta del instrumento (IRF) para asegurar que la cinética de deterioro observado se resuelven temporalmente desde el tiempo de respuesta del instrumento.
Construcción de espectros asociados a caries (DAS) de los datos TCSPC crea una imagen mucho más detallada de la transferencia de energía entre cromóforos dentro de un complejo que lo que es posible simplemente mirar las curvas de decaimiento aislado. Al construir DAS, cola coincidencia de las curvas de decaimiento TCSPC el espectro de fluorescencia de estado estacionario es necesario porque la intensidad de la señal recogida por TCSPC es arbitraria. En puntos de tiempo como 5.000 ps, sin embargo, la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda determinada (la "cola" del decaimiento) es igual a la intensidad de fluorescencia de estado estacionario para esa longitud de onda. El espectro de fluorescencia de estado estacionario puede por tanto utilizarse para normalizar todos los TCSPC decae para que su cola es equivalente al espectro de estado estacionario. Esto le da la verdadera intensidad relativa de la señal de fluorescencia para cada curva de decaimiento. La serie completa de DAS, cuando juntos el overlaid en el estilo de trama de la cascada, proporciona una representación gráfica de la decadencia del espectro de fluorescencia con el tiempo. Si las parcelas se llevan a cabo a tiempo suficiente puntos de tiempo (para las colas de las curvas de decaimiento) la trama de la cascada decaerá hasta el espectro de fluorescencia de estado estacionario. El momento más temprano, por el contrario, está determinada por la función de respuesta del instrumento TCSPC.
Financiación y apoyo fueron proporcionados por el Departamento de química de la Universidad Estatal de Michigan.

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