Source: https://www.jove.com/video/2040/imagen-de-una-sola-molcula-de-transporte-nuclear?language=Spanish
Timestamp: 2019-05-23 09:06:45+00:00

Document:
Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport | Protocol (Translated to Spanish)
Imagen de una sola molécula de transporte nuclear
Microscopía de una sola molécula approch proporcionan nuevos conocimientos sobre el transporte nuclear.
La utilidad de los enfoques de una sola molécula de microscopía de fluorescencia se ha demostrado ser de una gran disponibilidad en la comprensión de las reacciones biológicas en la última década. La investigación de las interacciones moleculares con alta resolución temporal y espacial profunda dentro de las células se ha mantenido un reto debido a las señales de por sí débil que surgen a partir de moléculas individuales. Obras recientes de Yang et al. demostrado que estrecha el campo de microscopía de epifluorescencia permite la visualización de transporte nucleocytoplasmic en el nivel de una sola molécula. Por el enfoque de una sola molécula, la cinética importantes, como el tiempo de transporte nuclear y la eficiencia, para las moléculas de carga depende de la señal e independientes se han obtenido. Aquí se describe un protocolo para el abordaje metodológico, con una mejor resolución espacio-temporal de 0,4 nm y 12 ms. La resolución mejorada que nos permitió la captura de transporte activo y eventos transitorios pasiva difusión a través de los complejos de poro nuclear (NPC) en semi-células intactas. Esperamos que este método es utilizado en el esclarecimiento de otros eventos de unión y el tráfico dentro de las células.
1. Preparación del sistema celular para el experimento de una sola molécula
Por lo menos una semana de antelación, iniciar un cultivo fresco de la línea celular HeLa de un stock de descongelación a 37 º C y poner en un frasco de cultivo de 25 cm 2 con 5 ml de medio, incuban las células a 37 º C en 5% de CO 2 incubadora durante 24 horas y se dividió al menos 3 veces a fin de ofrecer condiciones óptimas para las células. Sin embargo, las células no se debe dividir más de 20 veces debido a la tendencia de su tasa de crecimiento para disminuir de manera significativa. Células HeLa fueron previamente manipuladas genéticamente para tener GFP (proteína verde fluorescente) fusionado a la proteína de membrana de poro nuclear sobre POM 121. Es necesario que una localización precisa de la envoltura nuclear.
Un día antes del experimento, las células destinadas a un experimento de una sola molécula debe ser extendido en un cubreobjetos colocado en un autoclave placa de Petri estéril. El cubreobjetos deben ser suspendidos en DMEM (Dulbecco modificado de Eagle, Grand Island, NY) suplementado con 4,5 g / l de glucosa, 862 mg / L Glutamax-I, 15 mg / ml de rojo fenol, 100 U / ml de penicilina, 100μg/mL estreptomicina y 10% de suero de ternero recién nacido. El volumen de una cultura debe ser 1 ml por cada hoja de la cubierta, distribuida uniformemente sobre toda la superficie. Estas placas de Petri con la cubierta se desliza entonces se colocan en la incubadora de CO 2 y se mantiene durante 24 horas antes del experimento. Para que un cultivo de células para ser adecuado para un experimento de una sola molécula de la célula en la confluencia de la hoja de la cubierta no debe superar el 70% para proporcionar una buena libertad de los tampones de lavado y proteínas de interés de someterse al transporte nuclear.
En el día del experimento, el flujo de las cámaras fueron construidas mediante la adición de una cubierta superior de deslizamiento, junto con dos líneas de grasa de silicona como separadores. Es esencial asegurar que las células no se sequen durante la preparación. Por lo general, prefieren tener dos cámaras hechas en una hoja de cubierta para permitir dos condiciones diferentes para el experimento. La cubierta superior se desliza pequeñas astillas de vidrio antideslizante cubrir cortar con un cuchillo de diamante es de aproximadamente 6mm2 fueron colocados boca abajo en una Kimwipe. Dos líneas de grasa de silicona fueron colocados a lo largo fino que los bordes de la cubierta se desliza con una jeringa de 10 ml de plástico que tenía una punta de la pipeta firmemente adherido con Parafilm para controlar el tamaño de la grasa de cuentas.
La diapositiva recubierto de células HeLa fue entonces goteo secos y montados con grasa como el pegamento en un marco de aluminio mecanizado en casa - temperamento, que sirvió para mantener la diapositiva en el soporte de muestras del microscopio.
La cubierta superior se desliza con las dos líneas de grasa fueron recogidos con unas pinzas puntiagudas y entonces se invierte sobre el portaobjetos recubiertos de células, formando una cámara de flujo. Un mensaje que se hizo relativamente firme al presionar ligeramente sobre los bordes del cubreobjetos engrasada.
Como nos hizo dos cámaras separadas por un celular con cubierta de diapositivas es esencial para proporcionar un buen sellado para evitar la contaminación cruzada. Para este propósito varias líneas de la grasa de silicona se aplicaron entre las cámaras de la parte superior de la parte inferior de la diapositiva para sellar la diferencia. Varias líneas de grasa también fueron puestos en los lados exteriores de las cámaras.
DMEM los medios de comunicación, se añadió a la cámara de flujo para evitar que las células se sequen. Flujo de la solución fue promovida por una pieza de papel filtro pequeño para absorber el líquido del lado de la salida de las cámaras de flujo. Con manos firmes, la solución podría ser añadido al mismo tiempo por la micropipeta a un lado de la cámara de flujo con una mano, y se absorbe en el otro lado de papel de filtro.
Después de la construcción, la parte inferior de la diapositiva se lava con una esponja humedecida con punta de algodón, dos veces con agua, y luego dos veces con etanol al 100%.
Una vez que la tapa está montada en el microscopio, las células se lava con 2 x 25 l de amortiguación de importación (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, EGTA 1 mM, pH 7,3). Las células se permeabilized durante ~ 2 minutos con 2 x 25 l 40 mg / ml en tampón de digitonina de importación y se lavan de nuevo con 2 x 25 l de amortiguación de importación (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) suplementado con 1,5% de polivinilpirrolidona (PVP; kDa 360). Puede que sea necesario para controlar la permeabilización en tiempo real utilizando el campo claro. PVP fue incluida en todas las soluciones tampón de importación después de digitonina para prevenir la hinchazón osmótica de los núcleos. El núcleo intacto, junto con un ambiente controlado citoplasmática, ofrece un sistema de transporte muy simplificado que nos permite dilucidar el complicado paso a paso el transporte nuclear. Conjunto anterior y una sola molécula de experimentos que llevó a cabo en el sistema han aportado grandes ideas en el transporte nuclear.
2. Preparación de las proteínas esenciales para el experimento de transporte nuclear
Por medio de una transformación bacteriana convencional de las cepas especiales de E. coli (JM109) fueron diseñadas con el fin de sobreexpresar los genes responsables deproducción de las proteínas antes mencionadas de interés y se mantienen en stock a -80 ° C. (Para NLS 2xGFP usamos pTrcHisB vector Invitrogen). Un asa o ~ 50 l de material congelado de la proteína fluorescente o de la carga que expresan las células de E. coli se transfieren a 5 ml de medio LB con la adición de 5μL de ampicilina (U 1000) y ha crecido aeróbicamente con agitación durante la noche a 37 ° C a 225 rpm.
Después de 24 horas 500 l de cultura saturada se transfiere en 500 ml de medio LB y se agita en la incubadora a 37 ° C durante 5-6 horas después de la adición de 250 l de IPTG (isopropil _-D-1-thiogalactopyranoside) y se incubó durante otra 06.05 horas. Es necesario porque IPTG es un metabolito de la lactosa que activa la transcripción del operón lac, donde se sustituye el gen lacZ con el gen de interés y IPTG se utiliza para inducir la expresión génica.
La cultura es entonces un trompo en la refrigeración de alta velocidad centrífuga a 12000 rpm durante 15 minutos y se descarta el sobrenadante. Células se resuspendió en 40 ml de CelLytic B (B CelLytic resultados en la extracción rápida y eficaz de las proteínas que son adecuados para la purificación de la afinidad y el análisis.) Debe ser el volumen sobre la base de 10 ml por 1 gramo de una bolita. 28 l de mercaptoetanol se agrega para romper los enlaces disulfuro y 400 l de flúor phenylmethanesulphonyl para desactivar las proteasas de digerir las proteínas de interés después de la lisis celular. Un "cóctel de la proteasa", también se agrega (400 l de 0,2 mg / ml pepstatina A. 400 l de 0,2 mg / ml leupeptina, 400 l de 2 mg / ml de tripsina inhibidor) para asegurarse de que los extractos de proteínas no se degradan antes de su análisis de los objetivos de interés. A continuación, añadir 400 l imidazol 1M, se utiliza para la elución de proteínas etiquetadas obligado a los iones Ni adheridos a la superficie de los granos en la columna de cromatografía y 1 mM de DNasa I, que se utiliza para degradar el ADN no deseados de una y doble cadena en 5 phosphodinucleotide y oligonucleótidos fragmentos.
Revuelva la mezcla en la oscuridad en hielo durante 30 minutos para permitir un tiempo adecuado para la reacción, giran a 10.000 rpm durante 60 minutos en la centrífuga de refrigeración. Cosecha el sobrenadante y en la preparación para la cromatografía de realizar la infusión con Ni-NTA (níquel-ácido nitrilotriacético SuperFlow por Qiagen) al girar en tubos de centrifugación de microcentrífuga a máxima velocidad durante 3 minutos y lavar con solución amortiguadora de lisis, repitiendo el hilado y lavado hasta que la mezcla es libre de cualquier tinte azul. Revuelva la mezcla resultante poco a poco en un recipiente oscuro en hielo durante 60 minutos.
Realizar la cromatografía en columna fluye a través de 12 fracciones de la siguiente manera. La primera fracción es un flujo a través de sobrenadante de 10 ml se mezcla con Ni-NTA en el paso anterior. El segundo es de 10 ml de tampón de lisis (50 mM Na-fosfato, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0), tercero 10 ml de solución tampón (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0), el cuarto y el resto son 0,5 ml de tampón de elución (250 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8,0)
Preparar el gel de poliacrilamida SDS-PAGE y preparar nuestras muestras mediante la mezcla de 4 l de una fracción y 1 l de SB 5 veces (300 mm Tris 6,8, 25% de BME, un 10% SDS, 50% de glicerol). Para el estándar que utiliza 100 kb escalera del ADN de Invitrogen. Antes de cargar hervimos nuestras muestras durante 5 minutos. Después de la carga nos encontramos con el gel a 120V durante 60 minutos. Luego manchado, desteñido y finalmente se seca en un secador de gel especial de 2 horas a 80C.
A continuación, vistos los resultados en el gel y encuentra las fracciones que dio el mejor resultado. En función de la proteína de nuestro interés, las bandas deben estar ubicados, respectivamente, con el tamaño de una proteína. Esta fracción debe ser seleccionado para la purificación de proteínas más con MonoQ y Superdex 200 (Amersham Pharmacia).
La concentración se lleva a cabo haciendo girar las fracciones más concentradas en Nanosep filtro con un tamaño de poro de 10 km a 14 rpm durante 5 minutos, lavar con tampón de elución en todo momento. Es necesario determinar la concentración final de proteína utilizando el ensayo de BSA para el procedimiento de etiquetado más proteínas.
La intrínseca fluorescencia verde de NLS-2xGFP no puede ser utilizado para obtener imágenes de una sola molécula de transporte nuclear debido a su pobre foto-estabilidad y el espectro se superponían con autofluorescencia celular. Por lo tanto, la etiqueta de las moléculas de carga con un exceso de un medio de contraste en cisteína reactivos orgánicos (Alexa555 o maleimida Alexa 647 de Molecular Probes) durante 2 horas a temperatura ambiente en fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM después de reducir con TCEP tris (2 - carboxietil) durante 20 minutos. Las reacciones se paró con 2-mercaptoetanol, y las soluciones de proteínas fueron dializados para eliminar el colorante libre.
3. Microscopía de una sola molécula
Nuestro conjunto de microscopio hasta incluye una Olympus IX81 equipado con un 1.4 NA 100x de inmersión en aceite objetivo (UPLSAPO 100XO, Olympus), de 35 mW 633 nm láser He-Ne (Melles Griot), una lámpara de mercurio con las buenas prácticas agrarias filtro establecido, en un -chip de multiplicar la ganancia dispositivo de carga acoplada la cámara (en cascada 128 +, Roper Scientific) y the Slidebook paquete de software (inteligentes innovaciones de imagen) para la adquisición y procesamiento de datos. Un helicóptero óptica (Newport) se utilizó para generar un modo de encendido y apagado de la excitación láser. Las buenas prácticas agrarias y de fluorescencia Alexa647 estaba emocionado por una lámpara de mercurio y 633 nm láser, respectivamente. La emisión de fluorescencia verde y rojo fue recogido por el mismo objetivo, filtrado por un filtro dicroico (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) y un filtro de emisión (NF01-405/488/561/635-25X5. 0, Semrock) y fotografiado por un idéntico cámara CCD.
En los experimentos de una sola molécula, que permiten el tiempo de fluorescencia photobleaching de la molécula de carga única de ser más larga que el tiempo de transporte. Para determinar el tiempo photobleaching, 0,1 moléculas de carga nM se colocan sobre una cubierta de vidrio antideslizante y se inmovilizan después de 30 minutos debido a la no-específica de absorción. Luego, el curso temporal de la fluorescencia se mide. En función de la proteína de veces photobleach interés será diferente en función del número de cisteínas capaces de reaccionar con maleimidas, por lo tanto la intensidad de la iluminación y el área de iluminación se debe ajustar a fin de no inducir a un photobleaching preliminares y asegurar que las moléculas de carga marcado con Alexa 647 pantalla fluorescencia por más de los cargos interactuar con los NPCs.
Para los experimentos de importación en células permeabilizadas, la carga y cofactores esenciales de transporte se suman. Reacciones típicas de carga de importación que figuran GTP 1 mM, 0,5 mM importina, 0,5 M importina-1, 2 y 1 mM Ran M NTF2 para el transporte facilitado y 0,1 nM de 10KDa Dextran para el transporte pasivo .. Concentraciones de carga fluorescentes fueron> 100 nM en experimentos a granel, y ~ 100 pM para los ensayos de una sola molécula. En estas concentraciones,> 99% de la carga que se esperaba para formar complejos con importina y importina. Velocidad de transporte fue supervisado por epifluorescencia (aunque sólo eran importantes las tasas relativas) o microscopía confocal de fluorescencia (si las tasas absolutas se desea).
En primer lugar la posición de la membrana nuclear se determinó por el amplio campo de la microscopía de epifluorescencia con la participación de una lámpara de mercurio HBO con una serie de filtros de las buenas prácticas agrarias para tomar una imagen de la NE. El intensidades de los píxeles dentro de una fila o columna son aproximadamente perpendicular a la NE se ajustan a Gauss. La posiciones de los picos de la Gaussiana para un determinado conjunto de intensidades de los píxeles se consideró la posición NE de esa fila y columna. La posiciones de los picos de una serie de gaussianas como eran entonces se ajustan a un polinomio de segundo grado, produciendo el camino de la NE en toda la imagen.
Una vez que el NE es localizada, es esencial para deshacerse de todos los autofluorescencia la utilización de un 633 nm láser He-Ne hasta que esté completamente photobleached, por lo general más de 60 segundos es suficiente.
Moléculas de la muestra se mantendrá entonces en una solución al 1,5% del PVP y la mezcla añadida a la cámara de flujo en un volumen de 25 L y luego arrastrado por la cámara de aplicar una mecha de papel de filtro. Una atención total debe ser tomado con la adición de las proteínas de carga de importación a las células permeabilizadas justo después de la localización de la envoltura nuclear ya que el enfoque puede ser fácilmente afectada por un movimiento vigoroso.
Tan pronto como las moléculas de carga se suman, 633 nm láser He-Ne se utiliza para iluminar la trayectoria de transporte de las moléculas de tránsito. Un helicóptero óptica (Newport) deben participar en unos 5 Hz para evitar la photobleaching debido a una alta densidad de potencia del láser, así como para permitir una nueva porción de la no-photobleached moléculas individuales para acercarse al NE. Una serie de videos de las translocaciones sola molécula debe ser tomado con una cámara CCD de alta velocidad que pueden llegar hasta los 2500 Hz.
Se realiza correctamente, el protocolo nos ha permitido recoger una serie de vídeos que presentan la translocación de moléculas de carga única interacción con el complejo de poros nucleares en permeabilized HeLa POM 121 células. (Fig. 1). Nos propusimos obtener imágenes y rastrear los pasos de transporte transitoria de las moléculas de dextrano a través de la APN en digitonina permeabilized células HeLa que expresan establemente GFP-POM121. Las células fueron incubadas con concentraciones bajas de la etiqueta moléculas de dextrano. El plano ecuatorial del núcleo se pusieron sobre la mesa con una imagen clara del anillo verde de la fluorescencia de GFP excitado por una lámpara de luz de 488 nm de mercurio. Una exposición de largo plazo de las buenas prácticas agrarias-NE que nos permite obtener una excelente relación señal-ruido (SNR) para localizar el plano medio de la NE. Anteriormente, las moléculas de dextrano 10 kDa se encontró que se difunden a través de la NE en un plazo aproximado de 2 ms con una resolución espacial de unos 20-40 nm de una velocidad de detección de 500 o 1000 Hz. Dicha resolución espacio-temporal permite la captura de sólo uno o dos pasos difusión de moléculas de dextrano a través de la APN que no es suficiente para aclarar una información más espacio para la difusión pasiva. Para la captura de los pasos más finos de las moléculas de dextrano en el NPC con una mejor spatiresolución otemporal, hemos realizado dos mejoras importantes: (i) para adaptar una tasa de detección de fotogramas superiores de 2500 Hz para capturar los pasos de difusión más fino, y (ii) a contratar a una densidad de iluminación óptico más alto para excitar más fotones de moléculas individuales para obtener una mayor resolución espacial. Estas mejoras nos permiten la captura de varios pasos de la difusión transitoria de alexa647 marcado con moléculas de dextrano a través de la NE por una luz láser de 633 nm a una irradiación de 100 kW / cm 2 con una resolución espacio-temporal de 12 nm y 400 ms.
Como se muestra en la Figura 1, una serie de imágenes fijas de los eventos de transporte típico de las moléculas de dextrano se registraron. Mediante el seguimiento de las trayectorias espaciales de las distintas moléculas de dextrano en tránsito, los pasos bien de la difusión a través de la NE se distinguían. Hemos encontrado que hay aproximadamente 30% de los eventos de interacción con los NE han reconocido de origen y destino de los compartimentos. Entre ellas, las moléculas de dextrano en movimiento desde el citoplasma hacia el NE tienen dos destinos: final en el núcleo después de difundirse a través de la NE o retroceder en el citoplasma después de interactuar con la NE La situación similar ocurrió para los eventos de exportación: las moléculas de dextrano a partir del núcleo entrar en el citoplasma o difusa de nuevo al núcleo después de interactuar con la NE. Serie de imágenes tales contienen información sobre la posición espacial de las moléculas individuales en lo que respecta a la APN, así como la información temporal en el tiempo de permanencia de las moléculas a través de la APN. Mediante el análisis de las trayectorias de las moléculas de dextrano en el área de la NE, la frecuencia el tiempo de transporte, la eficiencia y la entrada se puede determinar. El tiempo de transporte en nuestro trabajo puede ser identificada como la importación o el tiempo de exportación. Se les define como el tiempo medio de permanencia de las moléculas de dextrano en el NPC que se someten a la importación o exportación. La importación o exportación de la eficiencia se define como el porcentaje del total de las importaciones o las exportaciones de los acontecimientos sobre la suma de los hechos completos y abortivos. La frecuencia de entrada de importación o exportación se refiere al número de moléculas que interactúan con el NE durante un segundo.
Figura 1. Selección de cuadros de video de los eventos de transporte típico de las moléculas de dextrano a través de la NE. (A) Un evento de citoplasma a núcleo. Una sola molécula de dextrano (punto rojo) se inició en el citoplasma, interactuó con el NE (línea verde píxeles), y terminó en el núcleo. Las trayectorias del evento (líneas azules y los puntos abiertos) se determinaron y se superponen con la NE (línea de color negro). Las líneas verdes y rojas representan 100 nm de distancia de la NE en el citoplasma y la parte nuclear. C, el citoplasma. N, el núcleo. Barra de escala: 2 mm. (B) Un evento de citoplasma a citoplasma. (C) Un evento de núcleo a núcleo. (D) Un evento de núcleo a citoplasma.
Se debe tener cuidado para asegurar un adecuado colocalización de moléculas de NE y solo durante el experimento. También es importante proporcionar una relación señal ruido, sobre todo cuando la señal es baja debido a un etiquetado deficiente o photobleaching. Precisión de localización está limitada por el ruido de fondo (que surge de la fluorescencia fuera de foco, el ruido CCD de lectura, los factores de la corriente oscura y otros).
Este proyecto fue financiado por la Beca de Investigación de la capacidad de mejora (Bowling Green State University).

References: resolución 
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