Source: https://www.jove.com/video/50048/super-resolucin-de-imagen-de-la-maquinaria-de-divisin-bacteriana?language=Spanish
Timestamp: 2018-07-23 04:23:48+00:00

Document:
Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery | Protocol (Translated to Spanish)
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Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.
La división celular bacteriana requiere el montaje coordinada de más de diez proteínas esenciales en midcell 1,2. Fundamental en este proceso es la formación de una supraestructura de tipo anillo (anillo Z) por la proteína FtsZ en el plan de división de 3,4. El anillo Z se compone de varios monocatenarios protofilamentos FtsZ, y la comprensión de la disposición de los protofilamentos dentro del anillo Z proporcionará información sobre el mecanismo de anillo Z ensamblaje y su función como un generador de fuerza 5,6. Esta información ha permanecido esquiva debido a las limitaciones actuales en la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía electrónica. Microscopía de fluorescencia convencional es incapaz de proporcionar una imagen de alta resolución de la Z-ring debido al límite de difracción de la luz (~ 200 nm). Electrónica cryotomographic imágenes ha detectado disperso en pequeñas protofilamentos FtsZ C. células crescentus 7, pero es difícil de aplicar a células más grandes, tales comoE. coli o B. subtilis. Aquí se describe la aplicación de un método de microscopía de super-resolución de fluorescencia, microscopía de localización fotoactivado (palma), para caracterizar cuantitativamente la organización estructural de la E. coli Z-anillo 8.
PALM imagen ofrece una alta resolución espacial (~ 35 nm) y el etiquetado específico para permitir la identificación inequívoca de proteínas diana. Hemos marcado FtsZ con la mEos2 proteína fluorescente fotoactivable, que cambia de verde de fluorescencia (excitación = 488 nm) al rojo de fluorescencia (excitación = 561 nm) tras la activación a 405 nm 9. Durante un experimento PALM, solo FtsZ-mEos2 moléculas se activan y estocásticamente las posiciones correspondientes centroides de las moléculas individuales se determinan con precisión <20 nm. Una imagen de super-resolución de la Z-ring se reconstruye mediante la superposición de las posiciones del centroide de todos los detectados FtsZ-mEos2 moléculas.
<clase p = "jove_content"> Usando este método, se encontró que el anillo Z tiene un ancho fijo de ~ 100 nm y se compone de un paquete suelto de protofilamentos FtsZ que se solapan entre sí en tres dimensiones. Estos datos proporcionan una plataforma para futuras investigaciones de los cambios del ciclo celular dependientes de la 10 Z-anillo y se puede aplicar a otras proteínas de interés.
Inocular medio LB con una sola colonia de la cepa JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Crecer durante la noche en un agitador a 37 ° C.
Se diluye la cultura 1:1,000 a M9 + mínimos medios de comunicación [sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, ácidos aminoácidos y vitaminas MEM] y crecer hasta la fase logarítmica media (OD 600 = 0,2 a 0,3) en presencia de cloranfenicol (150 ug / ml) a temperatura ambiente (RT).
Inducir el cultivo con 20 mM IPTG durante 2 horas (véase Nota # 1).
Pellet cultura en microcentrífuga (8.000 rpm, 1 min) y se resuspenden en un volumen igual de M9 +; repetición. Después de la resuspensión segundo, continuar el crecimiento a temperatura ambiente durante 2 h.
Fijar cultivo inducido con 4% de paraformaldehído en PBS (pH = 7,4) a TA durante 40 min. Pellet cultura y se resuspende en un volumen igual de PBS; repetición. Si las células de imágenes en vivo, vaya fijación, la cultura pellet y resuspender con un volumen igualde M9 - [Las sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, ácidos aminoácidos MEM]; repetición.
Diluir 1:10 cuentas de oro con la cultura resuspendido. Aplique la muestra en la cámara de imagen preparada (ver paso 2.4).
[1] Nota: El protocolo de inducción anterior (pasos 1.1-1.3) se ha optimizado para el sistema de expresión de la cepa JB281. Las condiciones detalladas de inducción puede variar para otros sistemas de expresión o proteínas de interés.
2. Asamblea de la Cámara de imágenes
Hacer un 3% (w / v) de solución de agarosa en M9 -. Derretir de agarosa a 70 ° C en un bloque de calor de sobremesa durante 40 min. Tienda de agarosa fundida a 50 º C durante un máximo de 5 horas.
Colocar un portaobjetos limpio microaqueduct en la mitad superior de la cámara de formación de imágenes con los electrodos orientados hacia abajo. Alinee la junta inferior de la diapositiva microaqueduct el fin de cubrir los canales de perfusión.
Aplicar ~ 50 l de la agarosa fundida al centro del cristaldiapositiva. Inmediatamente encima de la gota de agarosa gel con un cubreobjetos limpio y seco. Permitir que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 30 min.
Para limpiar cubreobjetos: organizar cubreobjetos en un soporte de cerámica y sonicar durante 20 min en la rotación de baños de acetona, etanol y KOH 1 M en frascos de vidrio. Repetir el ciclo tres veces, para un total de 9 sonicaciones, seguido de una sonicación sola en dH 2 O. Guarde los cubreobjetos limpios en dH 2 O. fresco Antes de su uso, soplar cubreobjetos secos con aire filtrado.
Retire con cuidado el cubreobjetos, dejando almohadilla de gel en la diapositiva microaqueduct. Añadir inmediatamente 1 l de muestra de cultivo celular (ver paso 1,6) a la parte superior de la almohadilla de gel. Esperar a ~ 2 min, permitiendo que la solución sea absorbida por la almohadilla de gel. Top almohadilla de gel con un nuevo cubreobjetos limpio y seco. Montar la cámara de formación de imágenes todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Encender el microscopio, cámara y láseres. Abra MetaMorph suaveWare (Molecular Devices).
Lugar apropiado de excitación / emisión de los filtros en la ruta de formación de imágenes (Figura 1).
Establecer potencias de láser y la configuración de adquisición en consecuencia.
488-nm láser = 15 mW (ver nota # 2)
561-nm láser = 75 mW
405-nm láser = 2 mW ± filtro de densidad neutral (Véase la nota n º 3)
Bloqueo de cámara de formación de imágenes en la etapa a través del adaptador etapa complementaria.
Designar una región de una imagen apropiada (100x100 píxeles) que está homogéneamente iluminado por los tres láseres.
Identificar un área de la muestra que contiene tanto células como marcadores de referencia (cuentas de oro) en estrecha proximidad, pero no se solapan.
Centrarse en la superficie de las células más cercanas a la cubreobjetos. Adquirir una imagen de campo claro con 50 ms de tiempo de integración y mover el foco del 0,5 micras en la muestra (Figura 3AI).
Adquirir conjunto verde imagen de fluorescencia con una excitación de la 488-n m láser utilizando un tiempo de integración 50 ms (Figura 3Aii).
Adquirir el streaming de vídeo en el canal rojo con iluminación continua de 405-nm y láser 561-nm. Para las células fijas, una tasa de 50 ms trama se utiliza para un total de 20.000 marcos (~ 17 min totales) con la potencia del láser 405-nm en rampa por ~ 10% cada 1.000 marcos (véase la Nota 4). Para las células vivas, una tasa de 10 ms trama se utiliza para un total de 3.000 tramas (~ 30 s en total) a una potencia de láser constante 405-nm.
Mover el foco de nuevo a la superficie inferior de las células y adquirir otra imagen campo claro como en el paso 3.7.
[2] Nota: La intensidad integrada de la fluorescencia verde de una célula es directamente proporcional al número total de FtsZ-mEos2 moléculas expresadas en la célula. La potencia de excitación de 488-nm y la configuración del conjunto de adquisición de fluorescencia se debe mantener constante para todas las células de modo que la relación FtsZ-mEos2 niveles de expresión en células diferentes se pueden comparar.
ONTENIDO "> [3] Nota:. Las células fijadas se crean imágenes con la densidad neutra (ND) del filtro (Figura 1, los componentes ópticos # 5) en su lugar a fin de lograr una tasa de activación lenta de modo que cada molécula individual puede ser identificado con precisión los ND filtro es retirado cuando la imagen en vivo células para aumentar la tasa de activación, mientras que el mantenimiento de una baja probabilidad de dos moléculas que se activan simultáneamente en una zona de difracción limitada. El ritmo más rápido aplicado a imagen de células vivas se necesita para disminuir el tiempo total de adquisición, así "congelar" el anillo Z en el tiempo y limitar el efecto de fotodaño a la célula.
[4] Nota: Los números de tramas adquiridas fueron optimizados para nuestro sistema y dependen de la estructura celular particular, etiquetado densidad, velocidad de activación y si agotar toda la piscina de fluoróforos es importante para el análisis. En las células vivas, es importante para obtener un número suficiente de localizaciones en un período tan corto de time como sea posible para evitar la borrosidad de la imagen provocada por el movimiento de la estructura celular.
4. PALM construcción de la imagen
Determinar la posición del centroide de cada punto detectado.
Cargue la pila de imágenes en Matlab (MathWorks, Inc).
Recortar la pila en la imagen para una región alrededor de una célula que excluye todas las cuentas fiduciarias.
Seleccione un umbral de intensidad para la detección de punto que está por encima del nivel de fondo, pero por debajo del punto medio de la intensidad. Nos cuenta de la variación en el nivel de fondo a lo largo de un experimento mediante el cálculo de la media móvil de la intensidad máxima utilizando una ventana de marco 150. El umbral de intensidad para cada trama se interpola a partir de los valores medios de funcionamiento.
Restar el valor umbral respectivo de cada trama. Puntos potenciales se identifican como tres píxeles adyacentes con intensidades por encima del umbral.
Ajustar la intensidad de la fluorescencia de cada mancha prospectivo a un Gaussia de dos dimensionesfunción de n [Ecuación # 1] usando un algoritmo de mínimos cuadrados no lineal (Figura 2). La precisión de la localización de cada punto se calcula usando el número total de fotones detectados [Ecuación # 2]. Cualquier mancha mal ajuste con una precisión de localización superior a 20 nm (células fijas) o 45 nm (células vivas) se descarta (véase la Nota 5). Cualquier punto con una intensidad mayor que dos veces de la media de intensidad, posiblemente debido a la superposición de emisores, también se descarta.
Para las células fijas, eliminar observaciones repetidas de la misma molécula haciendo caso omiso de cualquier lugar cuyo centro de gravedad es la posición dentro de los 45 nm de cualquier otro lugar que lo precedió por 6 cuadros o menos. Para las células vivas, todas las manchas se conservan.
Calibrar la deriva de la muestra utilizando el movimiento marcador de referencia.
Cultivos a cabo una región de 10x10 píxeles alrededor de un marcador de referencia.
Restar el valor umbral respectivo determinado en 4.1.3 a partir de cada trama.
Montar el perfil de intensidad en cadabastidor a través de los mínimos cuadrados algoritmo de ajuste asumiendo una forma gaussiana bidimensional.
Calcular el desplazamiento entre las posiciones del centroide con respecto al bastidor 1.
Corregir la posición del centroide de cada molécula único identificado en 4.1, con la deriva de la muestra, calculada en 4,2. Compare las imágenes de campo claro adquiridos en 3,7 y 3,10. Si se observan células para moverse con relación a los marcadores de referencia, los datos se lanza hacia fuera.
Superponer todas las posiciones corregidas centroide sobre una única imagen compuesta de píxeles 15x15 nm. Trace cada molécula única como una unidad de área, de dos dimensiones perfil gausiano centrado en la posición centroide con una desviación estándar igual a la precisión de localización [Ecuación # 2]. Esto da lugar a un mapa de densidad de probabilidad, en donde la intensidad de un píxel es proporcional a la probabilidad de encontrar una molécula de dicho píxel (Figura 3Aiv).
Comparación de imágenes PALM las imágenes del conjunto.
REPLOT el centroposiciones de ID como en 4.4, pero en un plano con 150x150 píxeles nm y una desviación estándar igual a 250 nm. Esto genera una imagen de la palma que imita una imagen de difracción limitada, que puede ser usado para comparar con la imagen de conjunto de difracción limitada, adquirido en 3,8 (Figura 3Aiii).
Para confirmar que las moléculas detectadas son representativos de toda la población, comparar la imagen reconstruida conjunto (Figura 3Aiii, paso 4.5.1) con la imagen de fluorescencia conjunto experimental (Figura 3Aii, paso 3,8) para confirmar que ambas imágenes muestran estructuras de forma similar , la orientación y la intensidad relativa.
[5] Nota: La precisión de localización mínimo requerido se determina empíricamente para cada método de formación de imágenes mediante el trazado de las precisiones de todas las moléculas de una muestra dada y la selección de un punto de corte apropiado.
5. PALM Análisis de Imágenes
Medición Z-Ring width y diámetro.
Girar la imagen de la palma a fin de orientar verticalmente el eje longitudinal de la célula (Figura 4A).
Crop fuera de la región celular que contiene el anillo Z.
Calcular la intensidad acumulativa mediante la proyección de un perfil de intensidad a lo largo del eje largo de la célula.
Montar el perfil de intensidad a una distribución gaussiana. La anchura del anillo se define como la anchura máxima de medio completo (FWHM) de la distribución gaussiana de módulos (Figura 4B).
Proyectar el perfil de intensidad acumulativa de 5.1.2 a lo largo del eje corto de la célula. El diámetro del anillo se define como la longitud total del perfil de intensidad (Figura 4C).
Trazado Densidad FtsZ (ver Nota 6).
REPLOT las posiciones del centroide como en (4,4), pero sin el perfil gaussiano de tal manera que cada molécula única se le da un valor de 1 y se asigna a un único píxel correspondiente a su posición centroide. De esta manera, la intensidad de cada unopíxel representa el número total de moléculas detectadas en ese píxel. La imagen de la palma de densidad también se puede visualizar como un gráfico de contorno (Figura 5E).
Determinación de la resolución espacial.
Teóricamente-alcanzable resolución espacial: crear un PSF representante para toda la muestra utilizando el promedio precisión determinada la localización de todas las moléculas detectadas y calcular la FWHM (Ecuación 3).
Resolución espacial logrado experimentalmente: calcular el desplazamiento medio entre observaciones repetidas de la misma molécula.
[6] Nota: Se utilizó PALM de reflexión interna total (TIR-PALM, Figura 1 y 5) para restringir la activación y la excitación de una capa delgada (~ 200 nm) por encima de la interfaz célula / vidrio. de modo que sólo las moléculas de FtsZ asociados con la membrana más cercana a la cubreobjetos será detectado.
Ilustrado en la Figura 3Aiv es una de dos dimensiones, super-resolución de procesamiento de la Z-ring generado a partir del método de obtención de imágenes PALM descrito anteriormente. A continuación, se resume la información cualitativa y cuantitativa que se puede obtener a partir de ellos.
Cualitativamente, se observó que el anillo Z es una estructura irregular que adopta varias configuraciones (banda única o arco helicoidal) que no son distinguibles en las imágenes convencionales de fluorescencia (comparar Figura 3A-Dii y iv). Observaciones como estos pueden ser utilizados para determinar el porcentaje de la población de células que muestra una configuración estructural particular.
También se puede medir cuantitativamente las dimensiones de la Z-ring. Nuestro enfoque para la determinación de la anchura del anillo y el diámetro se describe en el paso 5,1 y se ilustra en la Figura 4. De la Figura 4B, la anchura de los anillos fue determined ser nm 113 (FWHM). Este valor es más ancha que la anchura espera de una sola protofilament FtsZ (5-10 nm basado en in vitro EM 11). En la Figura 4C, el diámetro del anillo se mide como 1.050 nm. Este diámetro puede ser usado para describir cuantitativamente el grado de constricción durante la división celular.
Otro enfoque es cuantitativo para calcular la densidad molécula contando el número de moléculas localizadas dentro de una región definida. La medición de densidad se proporciona información sobre cómo herméticamente moléculas se empaquetan en la estructura. Densidad molécula puede ser descrito en términos relativos y absolutos. Densidad relativa (por ejemplo, fracción de las moléculas en el anillo Z vs la célula completa) proporciona información sobre la distribución de moléculas en las distintas poblaciones celulares. Medición de la densidad absoluta se complica por el hecho de que la imagen de la palma (Figura 3Aiv) es en realidad una proyección 2Dde un objeto 3D. Para eludir esta complicación, empleamos TIR-PALM, que restringe el plano de detección en un solo lado de la Z-ring. Los datos resultantes se ilustra en la Figura 5E. Puesto que las moléculas trazados representan un subconjunto de la población total de FtsZ, la densidad determinada es un límite inferior de la densidad real. La densidad máxima observada en las imágenes TIR del anillo Z sugieren que algunas secciones contienen superposición protofilamentos 10.
Figura 1. Un esquema simplificado de nuestra configuración microscopio. Todos los tres rayos láser son controlados por un programa de formación de imágenes de ratón desarrollado en MetaMorph que permite el control preciso de la longitud de onda de excitación apropiada. La línea gris oscuro indica la trayectoria de la luz de excitación, mientras que la línea gris claro indica la trayectoria de las emisiones. Para Refle interna totalcción (TIR) ​​de microscopía, la plataforma ajustable se traduce perpendicular a la trayectoria de la luz a fin de cambiar el ángulo de incidencia.
Figura 2. Un resumen del método PALM. Inicialmente, todas las moléculas de FtsZ-mEos2 están en el estado de fluorescencia verde. Tras la exposición a iluminación continua por los láseres de 405 y 561, las moléculas individuales están estocásticamente convierte al estado fluorescencia roja. La velocidad de este proceso está determinada por la potencia del láser 405, mientras que la tasa de fotoblanqueo se determina por la potencia de los 405 y el láser 561. Idealmente, la velocidad de activación y fotoblanqueo están equilibrados de tal modo que sólo una molécula se detecta por trama. Una vez que un número suficiente de tramas son adquiridos, las imágenes se procesan en Matlab mediante el ajuste de cada punto identificado como se describe en el paso 4,1. Cada uniqmolécula ue se representan a continuación (paso 4,4) en un único plano, generando así una imagen de la palma, se muestran en pseudo-color rojo. El marco se indica en rojo se determina que contiene un punto de repetición de la misma molécula como la trama precedente y que no se incluyó en la construcción de la imagen de la palma.
Figura 3. Imágenes representativas de células fijadas (A y B) y en vivo (C y D) que expresan FtsZ-mEos2. Para todas las células, el contorno y la forma general se puede visualizar en la imagen de campo claro (i). Ensemble imágenes de fluorescencia (ii) se adquieren con excitación desde el láser 488 (paso 3,8) y representan la distribución de toda la piscina de FtsZ-mEos2. La imagen de conjunto reconstruido a partir de los datos PALM (iii, paso 5,4) proporciona un control cualitativo para los fieles del métodorepresentación de la estructura de conjunto verdadero. La imagen generada PALM (iv) es la suma de todos los únicos FtsZ-mEos2 localizaciones y representa un mapa de densidad de probabilidad para FtsZ-mEos2. El perfil celular está representada por la línea de puntos amarilla en imágenes iii y iv. Las células A y C muestran FtsZ en una conformación única banda, mientras que las células B y D ilustran FtsZ adopción de una conformación helicoidal arco, que es indetectable en la imagen de difracción limitada conjunto (iii). Barras de escala, 500 nm.
Figura 4. A. Una imagen de la palma que muestra representaciones esquemáticas de anchura anillo Z (rojo) y Z-ring diámetro (verde). Anchura B. anillo se calcula mediante el ajuste del perfil de intensidad proyectada (azul de X) a lo largo del eje largo de la celda con un Gaussian función (gralínea y) y determinando después la FWHM (línea roja punteada). Aquí, la anchura del anillo se determinó que era 113 nm. Diámetro C. anillo está determinada por la proyección de la primera perfil de intensidad a lo largo del eje corto de la celda y luego el cálculo de la longitud completa (línea verde de puntos) del perfil de intensidad por encima de cero. El diámetro del anillo Z se determinó que era 1.050 nm.
Figura 5. TIR-PALM permite el recuento preciso de moléculas. Como en la Figura 3, la imagen de campo claro (A), el conjunto de imágenes de fluorescencia (B), imagen reconstruida conjunto de fluorescencia (C) y PALM imagen (D) se ilustran para una célula dada expresar FtsZ-mEos2. Los mismos datos utilizados para construir D vuelve a representarse como un gráfico de contorno de la guarida moléculadad (moléculas por píxel) en E. A partir de este análisis de la densidad, FtsZ-mEos2 se determinó para ser máximamente presente en 8 moléculas por píxel. Debido a que una sola capa de protofilamentos FtsZ daría lugar a una densidad máxima de 5 moléculas por píxel 10, Este análisis sugiere que el anillo Z está compuesto de múltiples capas de protofilamentos FtsZ.
PALM imágenes contienen información acerca de los recuentos y las posiciones de moléculas dentro de una célula, permitiendo un análisis detallado de la distribución y la disposición de las moléculas de proteína diana que es difícil de lograr por otros medios. A continuación detallamos las precauciones que se deben tomar para extraer información cuantitativa precisa, manteniendo la relevancia biológica de las imágenes de palma. También explorar la información que puede obtenerse mejor utilizando células vivas vs fijo. Por último, se sugiere vías para la obtención adicional de super-resolución información sobre la maquinaria de división celular.
El método descrito anteriormente se ha optimizado para producir imágenes precisas de palma en las siguientes maneras. Primero, se caracteriza y se optimiza la funcionalidad de la proteína de fusión a fin de que sirva como un marcador fiable de anillo Z estructura 10. En segundo lugar, hemos afinado la expresión de la proteína de fusión ya que tanto el exceso de expresión y bajo-resultadosen la formación de estructuras aberrantes 10,12,13. En tercer lugar, hemos elegido los umbrales para la determinación de molécula única (paso 4.1.5) sobre la base de fluoróforo propiedades photoblinking 14. Photoblinking complica la determinación de moléculas únicas y no tenerse en cuenta, conduce a overcounting de moléculas individuales. Aunque overcounting no afecta las mediciones de dimensión, que es amplificar las mediciones absolutas de densidad y puede crear la apariencia de grupos falsos. Todos estos factores deben ser considerados cuidadosamente al aplicar este método a otras proteínas de interés.
La selección de células vivas o fijas para formación de imágenes depende de la información deseada y el rendimiento. En vivo imágenes de células es informes rápidos (30 s), pero sólo en localizables (es decir, de movimiento lento) moléculas. Esto normalmente significa que sólo las moléculas asociado a membrana se observó en las células vivas, mientras que las células fijas proporcionar información sobre todas las moléculas marcadas. En vivo imágenes de células provides de alta resolución de dimensiones estructurales y de la morfología, pero no puede proporcionar mediciones precisas de la densidad de la molécula debido al movimiento de las moléculas individuales. Imágenes fijas de células puede proporcionar toda esta información, pero requieren un nivel bajo de activación UV de manera que las moléculas únicas pueden ser identificados. Esto conduce a tiempos de imágenes ampliadas (> 15 min). Además, la fijación puede causar aberraciones estructurales. Todos estos factores deben sopesarse al elegir qué tipo de muestra a utilizar.
El método PALM hemos descrito proporciona super-resolución de los detalles de la estructura de anillo Z que se pueden comparar entre diferentes cepas, los estados del ciclo celular, y condiciones de crecimiento. La aplicación de los últimos avances tecnológicos, pueden dar una idea añadido en el mecanismo cytokinetic de la Z-ring. Por ejemplo, la introducción de astigmatismo en la vía de detección es la forma más sencilla de añadir capacidad de tres dimensiones (~ 100 nm resolución Z) a la configuración óptica illustclasificar en la Figura 1 15. También, simultáneamente imágenes de dos o más proteínas al mismo tiempo se ha convertido en una opción realista con la rápida aparición de espectralmente distintas proteínas fluorescentes fotoactivables. Finalmente, el desarrollo de una proteína fluorescente que photoactivates de una manera independiente UV-permitiría seguimiento a largo plazo de una sola célula sin generar el daño del ADN inducido por la iluminación 405 nm.

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