Source: https://www.jove.com/video/55779/estudios-estructurales-de-escala-atmica-de-asambleas-macromoleculares?language=Spanish
Timestamp: 2020-06-03 10:31:45+00:00

Document:
Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Protocol (Translated to Spanish)
Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).
Asambleas supramolecular proteínas desempeñan un papel fundamental en procesos biológicos que van desde la interacción huésped-patógeno, infección viral a la propagación de enfermedades neurodegenerativas. Estos conjuntos consisten en múltiples subunidades de la proteína organizados de forma no covalente para formar objetos macromoleculares grandes que puedan ejecutar una variedad de funciones celulares o producir consecuencias perjudiciales. Penetraciones atómicas en los mecanismos de montaje y el funcionamiento de las Asambleas macromoleculares siguen siendo a menudo escasas desde su inherente insolubilidad y cristalinidad no reduce a menudo drásticamente la calidad de los datos obtenidos de la mayoría de las técnicas utilizada en biología estructural, tales como Cristalografía de rayos x y resonancia magnética Nuclear (RMN) de solución. Aquí presentamos RMN Espectroscopia de estado sólida magic-angle spinning (SSNMR) como un potente método para investigar las estructuras de asambleas macromoleculares a resolución atómica. SSNMR puede revelar detalles atómicos del complejo montado sin limitaciones de tamaño y solubilidad. El protocolo que presentamos describe los pasos esenciales de la producción de 13C / asambleas de proteína macromolecular marcado con el isótopo15N a la adquisición de espectros SSNMR estándar y su análisis e interpretación. Como ejemplo, mostramos la tubería de un análisis estructural de SSNMR de un conjunto de proteínas filamentosas.
Avances en magic-angle spinning espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética nuclear (SSNMR) ofrecen una herramienta eficaz para la caracterización estructural de asambleas macromoleculares de proteínas con una resolución atómica. Estas asambleas de proteína son sistemas ubicuos que desempeñan un papel esencial en muchos procesos biológicos. Sus estructuras moleculares, las interacciones y la dinámica es accesible por los estudios SSNMR, como se ha demostrado para viral (cápsida1) y mecanismos de infección bacteriana (secreción sistemas2,3, pili4), membrana proteína complejos5,6,7,8 y amiloides funcionales 9,10,11. Este tipo de montaje molecular también puede provocar patologías como enfermedades neurodegenerativas donde proteínas montan en Estados mal plegados, amiloides y comportamiento celular aberrante o célula muerte 12,13. Asambleas de proteína son construidos a menudo por la Oligomerización simétrico de copias múltiples de subunidades de la proteína en grandes objetos supramoleculares de varias formas incluyendo fibrillas, filamentos, poros, tubos o nanopartículas. La arquitectura cuaternaria está definida por las interacciones débiles entre las subunidades de la proteína para organizar el montaje espacial y temporal y para permitir funciones biológicas sofisticadas. Investigaciones estructurales a escala atómica en estas asambleas son un desafío para las técnicas de alta resolución desde su indisolubilidad intrínseca y muy a menudo su no-cristalinidad restringe el uso de solución NMR o Cristalografía de rayos x convencional se acerca. Magic-angle spinning SSNMR (MAS) es una técnica emergente para obtener datos de resolución atómica de asambleas macromoleculares insolubles y ha demostrado su eficacia para resolver modelos atómicos 3D para un creciente número de sistemas biomoleculares complejos, incluyendo filamentos bacterianos, las asambleas y partículas virales 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Avances técnicos en campos magnéticos altos, desarrollos metodológicos y preparación de la muestra ha establecido MAS SSNMR en un método robusto para investigar proteínas insolubles en varios ambientes, en particular en su biológicamente relevantes macromoleculares armados estatales o en las membranas celulares, haciendo la técnica altamente complementarias a microscopia del cryo-electrón. En muchos casos, un alto grado de simetría caracteriza tales asambleas de proteína. MAS SSNMR explota esta característica, como todas subunidades de la proteína en una Asamblea de homomolecular tendría la misma estructura local y por lo tanto, prácticamente la misma SSNMR firma, reduciendo drásticamente la complejidad del análisis.
Un protocolo eficiente para estudios estructurales de los conjuntos de proteínas macromoleculares por MAS moderadas (< 25 kHz) SSNMR se presenta en este video y se puede subdividir en diferentes pasos (figura 1). Le mostraremos las etapas críticas del flujo de trabajo de un estudio estructural de SSNMR ejemplificado en un conjunto de proteínas filamentosas (pasos ver resaltado en la figura 1), con la excepción de purificación de la subunidad de la proteína, diferentes para cada proteína Asamblea pero de vital importancia para los estudios estructurales y sin entrar en detalles técnicos/metodológicos del cálculo de la espectroscopia y estructura de la SSNMR para qué tutoriales especializados están disponible en línea. Mientras que el presente Protocolo se concentrará principalmente en estado sólidos experimentos NMR realizados en condiciones de MAS, el uso de alineado entornos biológicos 23,24,25,26 , 27, como bicelles alineadas, permiten la investigación de la conformación de la proteína y la interacción dinámica de proteínas en membrana-como medios sin tecnología MAS. Vamos a mostrar la expresión de la proteína y los pasos de ensamblaje así como la grabación de los espectros SSNMR cruciales y su análisis e interpretación. Nuestro objetivo es proporcionar penetraciones en la tubería de análisis estructural que permite al lector a realizar un estudio estructural de resolución atómica de una Asamblea macromolecular mediante técnicas SSNMR.
El protocolo comprende 3 secciones:
1. estado sólido producción NMR de la muestra
Como un requisito previo a un análisis de NMR de estado sólido, los componentes proteicos de la necesidad de ensamblaje macromolecular a expresarse, marcado con el isótopo, purificada y montado en vitro en el estado complejo nativo (para un ejemplo véase figura 2) . Para asegurar la alta sensibilidad de NMR, enriquecimiento del isótopo en 13C y 15N etiquetado es necesario mediante el uso de los medios de expresión bacteriana mínima complementados con 13C y 15N fuentes, tales como uniforme 13 Etiquetado C glucosa/glicerol y 15NH4Cl respectivamente. En la etapa posterior del Protocolo, selectivamente muestras marcada con C 13producción con selectivamente 13fuentes C-etiquetados como (1, 3 -13C)- y (2 -13C)-glicerol (o (1 -13C)- y (2 -13C)- glucosa) se utilizan para facilitar el análisis de NMR. Muestra etiquetada mixta correspondiente a una mezcla equimolar de 50% 13C-etiquetado o 50% y 50% 15N - (1, 3 -13C)- y el 50% (2 -13C)-glucosa se introducen para describir la detección de intermolecular interacciones. Un alto grado de pureza de proteína así como condiciones rigurosas durante el paso de montaje son factores clave para asegurar un orden estructural homogénea de la muestra final.
2. preliminar caracterización estructural basado en unidimensional NMR de estado sólido (1D)
Presentamos los experimentos esenciales para un análisis estructural de SSNMR. Unidimensional (1D) polarización transversal (CP) y INEPT / experimentos de28 RINEPT, detectados en núcleos de 13C se utilizan para detectar segmentos de proteína rígida y flexible en la Asamblea, respectivamente y para estimar el grado de estructural homogeneidad y polimorfismo local (para una ejemplo véase figura 3).
Rong > 3. Determinación de la estructura del análisis conformacional y 3D
Incisos 1 y 2 refieren al análisis conformacional, que se basan en la asignación de la resonancia SSNMR de todos los residuos rígidos de la Asamblea de la proteína, como los cambios químicos son sondas muy sensibles con el medio ambiente local y pueden utilizarse para predecir la phi/psi diedro de los ángulos y así determinar la estructura secundaria. Figura 4 ilustra un ejemplo de una asignación de resonancia secuencial en la base rígida de un conjunto de proteína. La determinación de la estructura 3D se basa en la recopilación de datos estructurales tales como las restricciones de distancia codificación cerca de cercanías (< 7-9 Å), que contiene tanto intra - e intermolecular información. Incisos 3 y 4 describen interpretación y colección de moderación distante a largo plazo. Contactos de largo alcance se definen como intramolecular 13C -13C cercanías derivados residuos de i a j, con | i-j | ≥4, definiendo así el pliegue de terciaria de la proteína de la subunidad monomérica o como intermoleculares 13C -13C cercanías, definiendo las interfaces intermoleculares entre las subunidades de proteína en la Asamblea. Intra - e intermoleculares interfaces se ilustran en la figura 5. Restricciones SSNMR detectaron a través de 13C -13C y 15N -13C Asociación experimentos generalmente codifican para distancias internuclear < 1 nm. Subsección 4 explica la detección de las limitaciones de la distancia intermolecular. En las Asambleas de proteína simétrica, el uso de muestras etiquetados homogéneo (es decir, 100% etiquetada uniformemente o selectivamente) para identificar las interacciones intermoleculares subunidad-subunidad es limitada, como tanto intra - y inter - molecular contactos conducen a señales detectables. La detección inequívoca de cercanías intermoleculares se logra utilizando muestras etiquetadas mixtas, que contiene una mezcla equimolar de dos muestras etiquetadas diferentemente, combinado antes de la agregación. Inciso 5 presenta brevemente modelado de la estructura.
Figura 1 : Flujo de trabajo de un estudio estructural de resolución atómica por NMR de estado sólido. 13 C, isótopo 15N marcada producción de proteínas, purificación de la subunidad, montaje de la subunidad, control de formación de la Asamblea, SSNMR experimentos, análisis de experimento SSNMR y extracción de las restricciones de distancia, y se muestran modelos de estructura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. RMN de estado sólido muestra producción
producción de uniforme 13 C / subunidades de la proteína marcada con N 15
uso recién transformado, pET24-péptido-6his que contienen plásmidos E. coli BL21 (DE3) las células, la cosecha de la placa de agar preparado.
Inocular una pre-cultura 15 mL de precalentado medio LB con una colonia. Incubar a 37 ° C con agitación de 200 rpm durante la noche.
Transferencia de la pre-cultura en 1 L de la principal cultura de precalentado medio M9 (ver composición en cuadro 1), que contiene el necesario marcado con el isótopo nitrógeno fuentes de carbono y.
Nota: Esto puede ser uniformemente 13 glucosa marcado con C, selectivamente (1 - 13 C)- o (2 - 13 C)-etiqueta glucosa 29 , 30 , 31 o () 1, 3 - 13 C)- o (2 - 13 C)-etiquetado glicerol 32 , 33.
Esto incubar a 37 ° C y medir el OD 600 tan pronto como la cultura se convierte en turbia. Cuando el OD 600 ha alcanzado un valor de 0.8, inducen la expresión de la proteína con 0,75 mM IPTG para 4 h.
Nota: Las condiciones de inducción óptima pueden variar de una proteína a otra.
Recuperar las células por centrifugación durante 30 min a 6000 x g y 4 ° C.
Bosquejo de purificación (no se muestra en el protocolo de video)
Lyse las células utilizando técnicas estándar como tratamiento sonicación o lisozima y purificar la subunidad de la proteína mediante técnicas establecidas o adaptado para el investigado el ensamblaje de la proteína.
Nota: La proteína puede expresarse en los cuerpos de inclusión, compruebe para la localización de la proteína de lisis celular y posterior centrifugación. Si la proteína se encuentra en el sedimento de la ruina de la célula, se ha acumulado en los cuerpos de inclusión.
Prueba de expresión y la pureza de la muestra de proteína por ejemplo por un estándar 12-15% Tris-Tricina SDS-PAGE, ver figura 2A. Si la pureza es suficiente, la proteína puede ser montada, de lo contrario realizar un paso de purificación adicional.
In vitro el ensamblaje de los filamentos de proteína
Compruebe la concentración de proteína en la solución purificada. Si la proteína contiene residuos de absorbentes, medir la absorción en un espectrofotómetro UV a 280 nm. Inserte el tampón puro en el espectrofotómetro, calibración y luego medir la absorbancia de proteínas.
Calcular la concentración de proteína usando el coeficiente de absorción de la subunidad de la proteína con la ley de Beer-Lambert adaptada: un λ = ε λ x l x c; aquí es el óptico densidad a una determinada longitud de onda λ; ε es la coeficiente de absorción específica; l es la longitud de la trayectoria óptica en cm; c es la concentración en mol/L.
Concentrado de la proteína a una concentración de 1 mM en una unidad de filtro centrífugo. Introducir la muestra en la unidad de filtración centrífuga y centrifugar a 4000 x g durante 30 minutos, agite suavemente la solución en la unidad de filtro con una pipeta para evitar la deposición de la proteína en el filtro. Repita el procedimiento hasta que se alcance la concentración deseada.
Nota: La concentración óptima de la Asamblea depende del sistema y debe ser optimizado (generalmente entre 0.1 - 1 mM). Si se mezcla un equimolar etiquetados se prepararon muestras de dos lotes diferentes de proteínas marcadas (por ejemplo (50/50) (U - 15 N)-/ (U - 13 C)-etiquetado), de mezcla debe tener lugar antes o después de la etapa de concentración para homogeneización de la solución mezclada.
Transferir la muestra en un tubo e incubar en agitación durante una semana a temperatura ambiente.
Generalmente la polimerización de las subunidades en filamentos es acompañado por la solución turbia. Comprobar la morfología microscópica de la fibrilla y homogeneidad por ejemplo por microscopia electrónica (6300 X - 45000 X de aumentos), ver figura 2B.
Centrifugar la muestra durante 1 h a 20000 x g y 4 ° C. retirar la mayor parte del sobrenadante, deje sólo suficiente líquido para cubrir la superficie para evitar el secado de la muestra. Compruebe el sobrenadante para las subunidades no montado en el espectrofotómetro de UV.
Lavar la muestra mediante la adición de H 2 O y cuidado Resuspender el contenido con una pipeta. No no agitar con vortex. Girar la muestra durante 30 min a 22000 x g y 4 ° C. repetir el lavado 3 veces. Comprobar durante todos los pasos de lavado si el pellet conserva su aspecto después de la centrifugación y el sobrenadante de subunidades no montado en el espectrofotómetro de UV.
Agregar azida de sodio 0,02% (p/v) (NaN 3) para evitar la contaminación bacteriana y almacenar la muestra hasta la medición en 4 ° C.
Rotor de NMR de estado sólido relleno
centrifugar dos veces durante 30 min a 22000 x g y 4 ° C. retirar máximo del sobrenadante, la consistencia resultante de la muestra depende de la Asamblea de la proteína y es generalmente un gel-como depósito.
Utilizar una pipeta capilar para insertar la muestra en el rotor SSNMR.
Nota: Aquí, presentamos el procedimiento en un rotor de 4 mm de diámetro.
Centrífuga del rotor en una mesa de centrifugar suavemente introducir la muestra en el rotor. Repita el procedimiento hasta que el rotor se llena para arriba. Mantener el espacio mínimo para cerrar el rotor con la tapa del rotor. Si la cantidad de muestra no es suficiente, presentar una inserción comercialmente disponible para llenar el espacio restante para asegurar la homogeneidad de distribución de la muestra en el rotor.
Nota: Depende de la consistencia de la muestra montada, sería más adecuado utilizar una espátula delgada, especialmente para muestras muy densas. Rotores con un diámetro de 2.5 a 4 mm se utilizan en frecuencias MAS moderadas.
Añadir trazas de ácido 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic (DSS) para la calibración de temperatura y cambio de química interna.
Cierre la tapa con un dispositivo de cierre.
Ver bajo una lupa, si la tapa está bien insertada y completamente cerrada.
figura 2: resultados de representante para purificación de proteína subunidad y montaje. A) 15% Tris-Tricina SDS-PAGE de la subunidad de la proteína (incluyendo su 6-etiqueta) en diferentes etapas de purificación. Carril 1 - marcador de peso molecular de proteína; carril 2 - e. coli BL21 (DE3) células control uninduced; carril 3 - e. coli BL21 (DE3) células inducidas con 0,75 mM IPTG; carril 4 - solubilizado cuerpos de inclusión lane 5 - fracciones sobrenadante de células lisado; carril 6 - fracción purificada después de níquel inmovilizado cromatografía de afinidad metálica (IMAC) FPLC y desalación. B) negativamente manchadas las fibrillas de la proteína por proyección de imagen de TEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. caracterización estructural preliminar basado en unidimensional (1D) estado sólido NMR
puesta en marcha inicial y 1 D de polarización cruzada (CP)
introducir el rotor en el imán de NMR
empezar a girar el rotor a una frecuencia de 5 kHz y esperar una estabilización de ± 10 Hz, entonces acelerar hasta 7 kHz. Sintonizar y partido 1 H, 13 C y 15 N canales. Ajustar la temperatura a 2-10 ° C (275-283 K); muestra de la calefacción a 7 kHz MAS es baja y ajuste de la temperatura generalmente no es necesario en esta frecuencia MAS.
Registrar un espectro de 1 H de D 1 solo pulsado usando 16 exploraciones.
Nota: Los niveles de potencia deben previamente se han optimizado en un compuesto de referencia (como a 13 C / < sup > 15 N histidina o glicina), para proporcionar valores de partida para la optimización de los niveles de energía en los experimentos en la muestra objetivo; Este procedimiento es una tarea rutinaria y por lo tanto fuera del alcance de este protocolo de.
Mantener la temperatura durante todos los experimentos entre 2-10 ° C, en muestras hidratadas de que la temperatura se refleja en el cambio relativo de la resonancia de 1 H de agua a granel con respecto a la señal DSS del 34. Medir la temperatura después de la relación δ (H 2 O) = 7.83-T/96.9 con una precisión de 1-2 ° C 35.
Set up deseado MAS frecuencia y esperar a que la estabilización de ± 10 Hz.
Nota: Aquí se demuestra para una frecuencia de 11 kHz.
Tune y partido 1 H y 13 C canales otra vez y ajustar la temperatura con la ayuda de un experimento de 1 H 1 D.
Configurar una D 1 1 H - 13 C CP 36.
Nota: CP experimentos demuestran las señales derivadas de los residuos en una conformación rígida. Calibración de pulso y parámetros de la disociación se pueden directamente optimizar en la muestra cuando la sensibilidad es lo suficientemente alta como para observar las señales después de menos de 32 ~ exploraciones. Se asumen los valores de optimización inicial de la optimización estándar de un compuesto de referencia. Tiempo de contacto de CP y los niveles de energía son seleccionados en base a intensidad máxima de la señal. En las muestras de proteína, el tiempo de contacto óptimo de CP está generalmente entre 200 μS y 2 ms. los parámetros desacoplamiento también deben ajustarse nuevamente de la calibración en un compuesto de referencia.
Observar cuidadosamente la localización de bandas laterales a la frecuencia determinada de MAS de giro.
Grabar un 1D 13 CP C espectro de la referencia que sirve como huella espectral 1 D. Parámetros típicos son exploraciones de 128, 1 CP contacto tiempo ms, 100KHz, disociación, fuerza, un retraso de reciclaje de 3 s y 25 ms de la adquisición de.
Calibrar el 1 H y 13 C desplazamientos químicos siguiendo las recomendaciones de IUPAC 37. Determinar la frecuencia de resonancia de la señal de DSS de H 1 (cambio química de 0 ppm); 13 C desplazamientos químicos se hace referencia a los cambios de 1 H (generalmente ~ 0.25144, derivado de la relación de los 13 C a la 1 H resonancia frecuencia 37).
Proceso 1D 1 H - 13 C CP experimentar sin apodización función (véase Figura 3A y B para la detección en un conjunto homogéneo bien ordenado proteína). Elija un pico aislado para estimar el grosor de línea en la muestra, indicativa de la homogeneidad y orden estructural. Linewidths típico 13 C para conjuntos de proteínas biológicas bien ordenado bajo MAS en campos magnéticos altos oscilan entre 20-150 Hz (medido como el ancho a media altura (FWHH)).
Calcular la relación señal a ruido (S/N) en el espectro de la CP.
Nota: La relación señal-ruido depende de muchos factores, incluyendo principalmente la cantidad de muestra en el rotor, el grado de rigidez de la estructura de las proteínas y la presencia de una conformación molecular solo. Como regla general, una muestra debe ser adecuada para la espectroscopia multidimensional de SSNMR si se observa una señal en un optimizado 1D 1 H - 13 C CP espectro grabado con 64 exploraciones.
Zoom en la región espectral de las resonancias de carbonilo de columna vertebral de proteína (principalmente) localizada entre 165-180 ppm. Estimar el contenido de estructura secundaria en la Asamblea por la posición de las resonancias de carbonilo de columna vertebral de proteína con resonancias de residuos de α-helicoidal o el downfield cambiado de puesto la conformación β o upfield, respectivamente (véase figura 3B para una subunidad α-helicoidal en su mayoría) 38.
1D INEPT experimento
establecido a 1 D 1 H - 13 experimento C inepto para sonda piezas altamente móviles (sub-μs) de la Asamblea de la proteína.
Nota: GARP la disociación de algunos kHz durante adquisición 39 utiliza comúnmente, para permitir retrasos interscan corto (típicamente 1 s) sin dañar la punta de prueba.
Registrar un espectro de referencia INEPTOS que sirve como huella digital para los segmentos de proteína móvil, parámetros típicos son 128 exploraciones y un tiempo de la adquisición de 25 ms.
proceso de la 1 H - 13 C inepto. La cantidad y las posiciones de las señales son indicativas de la cantidad de residuos móviles y la composición de aminoácido respectivamente.
Nota: También grabar un 2D 1 H - 13 C inepto experimento si las señales están presentes en el espectro INEPTOS D 1 (ver figura 3 para un ejemplo) para permitir una identificación más específica de aminoácidos. En casos ambiguos de la asignación, se recomienda comprobar las posiciones de señal del componente de buffer solución NMR.
Utilizar la base de datos BMRB 40 y publicado datos 38 para asignar las resonancias a su aminoácido correspondiente en cerca de conformación al azar de la bobina, el espectro contiene solamente componentes de amortiguamiento móvil si no los residuos son un régimen altamente móvil.
figura 3: resultados representativos de Adquisición de espectros SSNMR para un conjunto bien estructurado de la proteína. Un) 13 C detecta FID de un experimento de polarización transversal 13 C 1 H. B) 1 H - 13 C polarización transversal el experimento. C) 1 H - 13 C inepto experimento de un conjunto de proteína rígida; sólo buffer componentes son visibles. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. determinación de la estructura del análisis conformacional y 3D
asignación secuencial de resonancia
configurar un 2D 13 C - 13 C difusión spin protón-conducido (PDSD) 41 el experimento para detectar las correlaciones intra-residuo 13 C - 13 C, incluyendo las cadenas laterales. Asumir los valores para el paso de polarización transversal inicial 1 H - 13 C de D 1 1 H 13 CP C experimento.
Establece el tiempo de batido a 50 ms para uniformemente 13 C marcado con las muestras y a 100 ms para selectivamente 13 muestras etiquetadas C. Establecer el tiempo de adquisición indirecta entre 5-25 ms y la adquisición directa entre 15-25 ms depende de la resolución espectral intrínseca, que puede estimarse por la señal visible de la longitud de decadencia de inducción libre (FID) (ejemplificada en Figura 3A).
Prueba de varios parámetros de procesamiento para encontrar valores óptimos con respecto a la relación señal a ruido y resolución en el espectro, típicamente procesamiento adecuado se puede lograr usando una función de ventana qsine con un cambio de campana del seno (SSB) de 2,5 a 4.
Configuración, registro y proceso de un 2D 13 C - 13 C PDSD con un experimento mezcla intermedia de tiempo para detectar secuenciales 13 C - 13 C correlaciones conectar sobre todo i - i±1, pero también i±2 y i±3 residuos, dependiendo de la rigidez del esqueleto de la proteína y elementos de estructura secundaria. El tiempo de mezclado se debe establecer entre 100-200 ms para muestras uniformemente marcadas. Todos los demás valores pueden ser asumidos el control de corto mezcla tiempo 2D 13 C - 13 C PDSD.
Configurar, registro y proceso de un 2D 15 N - 13 C N CA y N CO experimento con un CP de 1 H - 15 N y una específico CP 15 N - 13 C transferencia 42. optimizar la transferencia de polarización 13 C 15 N - de una manera D 1 directamente en la muestra de interés, con base en la intensidad máxima en la región CA o carbonilo, respectivamente. TypICal los valores para el tiempo de contacto específico de CP son entre 2-6 ms.
configurar, registro y proceso de una serie de 2D 15 N-(13) C - 13 C experimentos con el propósito de la asignación.
Nota: El primer 15 N - 13 C polarización transferencia valor del parámetro puede asumir el control de la N CA / N CO experimenta. Establecen correlaciones intra-residuo de N (CA ) CB y N (CA ) CO , respectivamente sueño 43 y PDSD 13 C - 13 C transferencia de polarización. La conectividad secuencial (i-1) residuo (i) al residuo obtenida N (CO i-1) CA i-1 y N (CO i-1) CX i-1 experimentos, tanto utilizando un PDSD 13 C - 13 C transferencia de la polarización.
Programa de análisis de elija un NMR como CcpNmr análisis 44 o 45 de SPARKY
Cargar los espectros 2D en el software (ejemplificado con el análisis de CcpNmr) y cargar la secuencia de la proteína primaria.
Comienza con la identificación de los tipos de aminoácido visibles en el corto mezcla 13 C - 13 espectro C PDSD. Conecta los átomos de carbono de los sistemas de giro para permitir la " tipo de residuo " asignación específica; Ver Figura 4A para la asignación de un residuo de treonina. Identificar residuos de tantos como sea posible; Esto dependerá del tamaño de subunidad de la proteína, resolución espectral y de dispersión.
Superposición de la corta de mezcla con el espectro del PDSD C mezcla intermedia 13 C - 13.
Nota: Los picos adicionales visibles en la PDSD intermedio mezcla surgen sobre todo secuencial (residuo i - residuos i±1) contactos. Un ejemplo de una asignación secuencial de dos residuos se ilustra en la Figura 4B.
Marca los picos de resonancia de un sistema del centrifugado y encontrar correlaciones en la PDSD intermedio mezcla con frecuencias de resonancia de otros sistemas de centrifugado. En pequeñas proteínas o péptidos, puede ser posible lograr la asignación de toda resonancia secuencial basada en experimentos PDSD 2D 13 C - 13 C.
Nota: En el residuo de motivos de estructura secundaria β-filamento contactos de i - residuos i±2 13 C - 13 C podrían mostrar señales más intensas que contactos secuenciales debido a su proximidad en el espacio; en el residuo de motivos de estructura secundaria α-helicoidal contactos de i - residuos i±3 13 C - 13 C también pueden conducir a señales intensas.
Si se dispone de mezcla intermedia PDSD experimentos sobre muestras de C-labeled selectivamente 13 recubrirás en el espectro mezcla corto (si está disponible en el selectivamente 13 C-labeled muestra) y asignar el suplementario teniendo en cuenta el etiquetado selectivo 13 C patrón de picos, (1, 3 - 13 C y 2 - 13 C glicerol 32 , 33 o 1 - 13 C y glucosa 13 C 2 29 , 30 , 31.
Nota: por ejemplo, en un 2 - 13 C glicerol marcado muestra varios tipos de aminoácidos son etiquetados en la posición de Cα sin los carbonos adyacentes (Cβ y C ') etiquetados, por lo tanto favoreciendo la Cα-Cα transferencia entre residuos adyacentes. En muestras selectivamente marcadas, correlaciones de largo alcance 13 C - 13 C puedan acumular ya en el intermedio mezcla 13 C - 13 C PDSD experimentos. Si un pico no puede ser explicado por una correlación secuencial, podría presentarse de un contacto a largo plazo. Para altamente ordenadas estructuras subunidad homogénea en el conjunto macromolecular, solamente un conjunto de resonancias se espera que sea visible en el espectro. Si duplica (o más multiplicado) resonancias son accesibles por átomos 13 C o proteína tramos de columna vertebral, conformaciones de dos (o más) para el átomo o el tramo de la secuencia primaria de la Asamblea, respectivamente, existan.
Utilizar el espectro NCA 2D que contiene correlaciones de Cα intra-residuo 15 N - 13 para identificar las frecuencias de resonancia de 15 N para cada residuo. Si la resolución en la dimensión de 13 C no es suficiente, utilice la información complementaria sobre la resonancia Cβ en NCACB 2D para identificar la frecuencia de resonancia de 15 N intra-residuo.
Utilizar los espectros NCACO que contiene residuo intra 15 N - 13 C - 13 C correlaciones y 2D NCACB (i) identificar la frecuencia de 15 N intra-residuos y (ii) para resolver ambigüedades en los 13 C - 13 C PDSD con la ayuda de la dimensión adicional 15 N. La inversión de la señal debido a la transferencia de sueño conduce a la observación de las correlaciones de Cα-Cβ típico para que la señal Cα es positiva y la señal Cβ negativo. Otras cadena lateral 13 C, si es visible en el espectro, son positivo otra vez.
figura 4: 2-dimensiones 13 C - 13 C SSNMR PDSD experimentos en un ordenado, uniforme 13 C, 15 proteínas N-labeled Asamblea. A) corto tiempo PDSD de mezcla (mezcla de 50 ms). B) asignación del tramo 2-residuos Ile32 - Thr33 utilizando la superposición del tiempo corto mezcla PDSD con un tiempo largo mezclado PDSD (200 ms de mezcla). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
determinación de la estructura secundaria
uso 13 Cα, valores de cambio química de Cβ 13 calcular el químico secundario cambio 46 ΔδCα-ΔδCβ , indicativo de la estructura secundaria. Calcular 13 Cα(assigned) - 13 Cα (bobina al azar) y 13 Cβ(assigned) - 13 Cβ (bobina al azar).
Nota: Pueden obtener valores de cambio químico para residuos en conformación de bobina al azar de 38. Valores
ΔδCα-ΔδCβ de parcela, positiva o negativa para > 3 residuos consecutivos indican β-filamento o conformación α-helicoidal respectivamente; residuos de glicina y prolina pueden mostrar valores de cambio química inusual, como a menudo actúan como " los interruptores de la estructura secundaria ".
Predecir los ángulos de diedro de la proteína de los desplazamientos químicos asignados con TALOS + 47 , 48 o rapaces 49 , 50. Los ángulos de diedro predichos de Phi/Psi reflejan la estructura secundaria de la proteína subuNit y utilizan como estructurales las restricciones durante todo el proceso de modelado de.
Colección de restricciones estructurales
Set up y grabar un 2D 13 C - 13 experimento del PDSD C con un tiempo largo mezclado para detectar a larga distancia 13 C - 13 C correlaciones. Mezcla típica veces rango de ms de 400 a 1 s. utilizar selectivamente 13 muestras de marcado con C, como la dilución de giro mejora la transferencia de polarización entre carbonos distantes.
Recubrimiento largo mezcla 2D 13 C - 13 C PDSD grabado en selectivamente etiqueta muestra en la mezcla intermedia 13 C - 13 C PDSD, si es posible grabadas en la misma muestra selectivamente marcada. Picos adicionales surgen de las correlaciones entre los átomos más distantes de 13 C. Durante la asignación de la resonancia, tener en cuenta el esquema de etiquetado selectivo.
Evaluar cuidadosamente la resolución del espectro para definir una ventana de la tolerancia de asignación, es decir, depende de las resonancias de resolución espectral en un cierto rango de ppm que esto puede contribuir a la señal. La desviación estándar de la precisión de la asignación se calcula automáticamente en los programas de asignación de NMR análisis CcpNmr como SPARKY.
Si una señal puede ser explicada por un secuencial (residuo i - i±1 de residuos) o un contacto de mediano alcance 13 C - 13 C (residuos-residuo ± 2, 3 o 4), mantener esta asignación desde la polarización base transferencia puede explicar la correlación incluso si la distancia de 13 C - 13 C está por encima del rango visible contacto.
Clasificar las tareas de largo alcance 13 C - 13 C contactos en señales de frecuencia clara y ambigua. En el caso de asignaciones de frecuencia sin ambigüedades, asignación de una única resonancia es posible con respecto a la ventana asignación de tolerancia.
Nota: Las tareas ambiguas contienen todas las asignaciones posibles de la resonancia dentro de la ventana de tolerancia. Las ambigüedades se pueden levantar simultáneamente durante el cálculo de la estructura iterativa rondas de desambiguación basados en las estructuras preliminares calculadas usando sólo las restricciones sin ambigüedades, ya que se realiza en rutinas computacionales como ARIA 51 o 52 de UNIO. Además, datos estructurales de diferentes fuentes biofísicas (e.g. mutado o truncada estructura de subunidad por solución NMR o Cristalografía de rayos x, las mediciones de masa por longitud, mapa de cryo-EM) también pueden utilizarse para reducir el nivel de ambigüedad, ejemplos véase 1 , 3 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58.
la detección de las limitaciones de la distancia intermolecular en un montaje simétrico de la proteína
configurar un 2D 15 N - 13 experimento de 59 C dolor-CP en mixto (50/50) U - 15 N - / U - 13 C-labeled muestra. Las señales detectadas en el espectro de dolor-CP surgiera de entre molecular 15 N - 13 C cercanías. Utilizar las resonancias previamente asignadas para realizar la asignación de los contactos intermoleculares.
Establecer un 2D 13 C - 13 C PDSD con un tiempo largo mezclado (> 600 ms) en un (50/50) mixto (1, 3 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-glicerol o (1 - 13 C)-/ (2 - 13 C)-muestra glucosa.
Nota: Las señales detectadas en este espectro de 13 C - 13 C surgen de la molecular y la molecular 13 C - 13 C cercanías. Sin embargo, la alta complementariedad de los dos regímenes de etiquetado permite pares particular resonancia surgir inequívocamente de contactos inter-moleculares, por ejemplo, una CA de serina en el (2 - 13 C)-glucosa marcada subunidades que correlacionan una CB de serina en el (1 - 13 C)-etiquetado como subunidades de glucosa.
Recubrimiento el espectro de la muestra mezclada a los espectros de 13 C 2D 13 C - grabado en homogéneo etiquetado muestras ((1,3-13C) - y (2 - 13 C)-glicerol o (1 - 13 C)- y (2 - 13 C)-glucosa etiquetado de las muestras). Señales adicionales en el espectro registrado en la muestra mixta deben derivarse de interacciones inter moleculares.
Modelado de estructura de datos SSNMR
preparar las listas de retención SSNMR necesarias para el cálculo de estructura: secuencia de la proteína (1); (2) restricciones de distancia inequívoca intra molecular; (3) restricciones de distancia ambigua intra molecular; (4) ángulo diedro TALOS basados en restricciones; (5) restricciones de distancia inequívoca entre molecular; (6) restricciones de distancia ambigua entre molecular; (7) otros datos de otras técnicas biofísicas (por ejemplo, parámetros de simetría de masa por longitud).
Varios comentarios proporcionan penetraciones en el modelado de la estructura basado en datos SSNMR y en conjunto con datos estructurales complementarios 14 , 60 , 15 , 19 , 61 , 62 nota que las restricciones de distancia ambigua pueden ser elimina la ambigüedad durante el cálculo de la estructura con respecto a la preliminar modelos estructurales basados en las restricciones de distancia sin ambigüedades. Para asegurar la precisión de la estructura, observe cuidadosamente si la estructura converge a un único pliegue.
figura 5 : intra y intermolecular contactos en asambleas de proteína simétrico. Representación esquemática de intra - vs intermoleculares 13 C - 13 C contactos a largo plazo en un conjunto macromolecular helicoidal. Las subunidades se colorean en blanco y rojo para ilustrar el etiquetado mixto de las subunidades, es decir, antes del montaje se realizó una mezcla 1:1 de dos diferentes esquemas de etiquetado (por ejemplo, 1 - 13 C glucosa y 1 - 13 Glucosa C). A) Intramolecular 13 C - 13 C contactos a larga distancia (flecha punteada azul); B) intermoleculares 13 C - 13 C contactos a larga distancia (rojo flechas de guiones). haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El flujo de trabajo típico de SSNMR incluye varios pasos ilustrados en la figura 1. Generalmente las subunidades de la proteína son producidas por en vitro expresión heteróloga en e. coli, purificadas y montadas bajo agitación, pero a veces también en condiciones estáticas. Expresión y purificación de la subunidad de la proteína se siguieron por cromatografía de gel de la SDS (figura 2A). La formación de asambleas macromoleculares puede entonces confirmarse por análisis de microscopia electrónica (EM) (ver figura 2B para un ejemplo de un conjunto de filamentos).
Después de la introducción de la Asamblea de la proteína en el rotor SSNMR, el rotor se inserta en el espectrómetro, la frecuencia del MAS y la temperatura están reguladas y se registran los espectros. Primeras penetraciones pueden obtenerse mediante técnicas SSNMR D 1. La figura 3 muestra un típico FID SSNMR detectado en el canal 13C en una muestra estructuralmente homogénea de proteínas, un 1H -13C CP espectro, revelar las resonancias de13C presentes en el núcleo rígido de la subunidad de la proteína en la Asamblea y un espectro C inepto 2D 1H -13, que representan los residuos móviles. Para penetraciones atómicas en el núcleo rígido de la estructura de la Asamblea, experimentos SSNMR multidimensionales necesitan grabarse en uniformemente y de forma selectiva con la etiqueta muestras para asignar primero las resonancias SSNMR y luego detectar proximidades a largo plazo (ver figura 4 del ).
Todos los espectros son procesados y analizados con el software adecuado para asignar las resonancias SSNMR y extraer intra - y las restricciones de la distancia intermolecular (figura 5). Las restricciones de distancia SSNMR se utilizan ya sea por separado o en conjunto con los datos de técnicas complementarias, que pueden ser integrados en el programa de modelado.
Para estructuras atómicas representativas de asambleas macromoleculares solucionados mediante técnicas SSNMR la figura 6 ilustra varias asambleas filamentosos de apéndices bacterianos y las fibrillas amiloideas.
Figura 6:filamentosas estructuras macromoleculares determinadas por un enfoque de NMR de estado sólido: filamentos bacterianos y las fibrillas de la proteína amiloide. A) pilus de tipo 1 de uropatógenos e.coli, PDB código 2N7H 4; Filamento B) ASC, PDB código 2N1F 63; C) agujas de sistema de secreción tipo III, PDB códigos 2MME, 2LPZ y 2MEX 2,3,64; D) fibrillas de amiloide-beta de Aβ42, PDB código 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 y Osaka mutante PDB código 2MVX 57, Iowa mutante PDB código 2MPZ 58; E) fibrillas de alfa-sinucleína, PDB código 2N0A 68; F) dominio de HET-s del prión, PDB código 2RNM, 2KJ3 69,70. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
NMR de estado sólido (SSNMR) es un método de elección para la caracterización de conjuntos de proteínas macromoleculares en un nivel atómico. Uno de los temas centrales en la determinación de la estructura basada en la SSNMR es la calidad espectral del sistema investigado, que permite crear modelos estructurales 3D de precisión diferentes, generalmente que van desde modelos de baja resolución (contiene el secundario estructura elementos y poca información 3D) a pseudo-atómicas estructuras 3D. La cantidad y calidad de información estructural extraída de experimentos SSNMR multidimensionales es la clave para calcular una estructura de NMR de alta resolución de la Asamblea.
El protocolo descrito se basa en la detección de 13C -13C y 15N -13C estructural las restricciones que requiere la grabación de varios espectros 2D (y a veces 3D) con alta señal a ruido. A frecuencias MAS moderadas (< 25 kHz), se introduce la muestra en rotores con tamaños de 3.2-4 mm de diámetro permitiendo cantidades de proteína de hasta ~ 50 mg, depende de la hidratación de la muestra. La cantidad de muestra dentro del rotor es directamente proporcional a la relación de señal a ruido en espectros SSNMR, un factor decisivo para la detección de las limitaciones de distancia de largo alcance y la asignación inequívoca.
La resolución espectral es un parámetro crucial durante la asignación secuencial de la resonancia y la colección de restricciones. Para obtener resultados óptimos, los parámetros de preparación de la muestra necesitan ser optimizado, particularmente en la purificación de la subunidad y las condiciones de montaje (pH, buffer, agitación, temperatura, etc.). Para la optimización de la muestra, se recomienda para preparar muestras sin etiqueta para varias condiciones distintas para las que se ha observado la Asamblea y para grabar un 1D 1H -13C CP espectro (descrito en el paso 2.1) en cada muestra preparada. Los espectros sirven para comparar la dispersión entre las diferentes preparaciones, basado en que se pueden determinar las condiciones óptimas y resolución espectral.
La calidad de los datos SSNMR depende fuertemente de la elección de los parámetros de adquisición de NMR, especialmente para los pasos de transferencia de polarización. El uso de altas fuerzas del campo magnético (≥600 MHz 1H de frecuencia) es esencial para la alta sensibilidad y resolución espectral, necesaria frente a objetivos complejos tales como asambleas de proteína macromolecular.
Un factor limitante en muchos casos es la disponibilidad de espectrómetro. Por lo tanto, una elección juiciosa de las muestras a ser preparado debe preceder a la sesión del espectrómetro. En cualquier caso, uniformemente 13C, 15muestra marcada con el N es un requisito previo para realizar la asignación secuencial y la residual de resonancia. Asignado por estado sólidas técnicas de RMN de proteínas ver71. Determinación de la estructura de asambleas macromoleculares en frecuencias MAS moderadas requiere selectivamente las muestras marcada con C 13; para la detección de largo alcance 13C -13C y 13C -15N en contacto con las muestras basadas en 1, 3 -13C - y 2 -13C-gylcerol o 1 -13C - y 2 -13C-glucosa etiquetado son de uso general, como se describe anteriormente. La elección entre los dos sistemas de etiquetado se basa en la relación de señal a ruido espectral y resolución. Para distinguir entre el intra - e intermoleculares contactos a largo plazo, mixtas muestras etiquetadas y diluidas han revelado eficientes.
En Resumen, los pasos críticos para un estudio estructural atómico de SSNMR son: (i) la preparación de las subunidades y la necesidad de la Asamblea a ser optimizada para obtener la muestra excelente cantidad y calidad, (ii) Espectrómetro campo fuerza y adquisición de los parámetros deben ser escogido cuidadosamente; III selectivos Etiquetadoras estrategias se requieren para una determinación de la estructura 3D y la cantidad de datos requeridos depende de la calidad de los datos y la disponibilidad de datos complementarios.
A pesar de su aplicabilidad a una amplia gama de sistemas supramoleculares, que van desde proteínas de la membrana homomultimeric nano-objetos, SSNMR es a menudo limitada por la necesidad de cantidades de mg de material isotópicamente etiquetado. Los recientes desarrollos tecnológicos en ultra rápido SSNMR MAS (≥100 kHz) abrir la Avenida 1detectado H NMR y empujar el límite de la cantidad de muestra mínima para sub-mg 72,73,74. Sin embargo, para estudios estructurales detallados 13C-etiquetado muestras son indispensables, que limita la aplicación de SSNMR para las muestras montadas en vitro o sistemas expresados en los organismos que sobreviven en un medio mínimo, donde en las células SSNMR es un método emergente (para comentarios ver 75,76,77,78).
Un factor importante en el uso de SSNMR para obtener estructuras 3D de alta resolución es la resolución espectral: intrínseca heterogeneidad conformacional en una Asamblea puede limitar el análisis de espectros y resolución espectral. Residuo específico 13C etiquetado puede en algunos casos ofrecer una alternativa para obtener información de la distancia específica sobre residuos estratégicos con el fin de obtener modelos estructurales (para una reciente ejemplos véase 79,80).
SSNMR para la determinación de la estructura 3D todavía requiere la colección de varios conjuntos de datos con tiempos de recogida de datos a menudo mucho en instrumentos sofisticados, dependiendo el enfoque y el sistema varios días a semanas en un 600-1000 MHz (frecuencia de1H) Espectrómetro de. Por lo tanto, el acceso a tiempo de espectrómetro puede ser un factor limitante en un profundo estudio de la SSNMR.
En el caso de conjuntos de proteínas homomultimeric, llevando a datos SSNMR de calidad suficiente para identificar un gran número de limitaciones estructurales como en 3,57,64,70, SSNMR no da todavía tienen acceso a las dimensiones microscópicas. Por lo tanto, en una determinación de novo de SSNMR estructura de un conjunto de homomultimeric, EM o datos de masa por longitud (MPL) idealmente complementan datos SSNMR para derivar los parámetros de la simetría. SSNMR datos solo proporcionan la atómica intra - e intermoleculares interfaces
SSNMR es altamente complementario con técnicas estructurales como la EM o MPL medidas pero los datos también perfectamente se pueden combinar con las estructuras atómicas obtenidas por cristalografía de rayos x o solución NMR en subunidades truncados o mutados. Un número creciente de estudios puede encontrarse en la literatura donde la conjunción de diferentes datos estructurales ha permitido determinar modelos atómicos 3D de asambleas macromoleculares (ver figura 6 para ejemplos representativos).
En el campo de la biología estructural, SSNMR surge como una técnica prometedora para el estudio deinsolubles y no-cristalino asambleas en el atómico nivel, es decir, proporcionar datos estructurales a escala atómica. En este sentido, SSNMR es el colgante a solución NMR y Cristalografía de rayos x para conjuntos moleculares, incluyendo proteínas de membrana en sus asambleas de medio ambiente y de la proteína nativas como sobres virales, bacterianas filamentos o amiloides, así como RNA y Complejos RNA-proteína (véase por ejemplo81). Su gran versatilidad de aplicaciones en vitro y en el contexto celular, como el seguimiento de los cambios estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios, identificar superficies de interacción con las moléculas del socio en la escala atómica (por ejemplo 82) y asignación dinámica molecular en el contexto de complejos montados, indican el importante potencial de SSNMR en futuros estudios estructurales sobre conjuntos de complejos biomoleculares.
Componente Medio M9
Vivencias2 10 ΜM
FECLAS3 1 ΜM
MEM vitamina mezcla 100 X 10 mL/L
13 C glucosa 2 g/L
Tabla 1: Composición del medio de la mínima expresión de proteínas recombinantes de producción de E. coli células BL21.
Este trabajo es financiado por la ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. y ANR-14-CE09-0020-01 para A.L.), "Inversiones para el futuro" programa IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 a B.H.) referencia ANR-10-IDEX-03-02 a B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 a A.L.), el programa FP7 (FP7-PEOPLE-2013-CIG a A.L.) y el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (ERC Starting Grant para A.L., acuerdo No 639020) y proyecto " WEAKINTERACT."

References: resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución