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Orden de 19 de septiembre de 2001, por la que se modifica el anexo F del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces.
Publicado en BOE núm. 232 de 27 de Septiembre de 2001
Vigencia desde 28 de Septiembre de 2001
Modificación del anexo F del Real Decreto 1488/1994
El Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces, incorpora al ordenamiento jurídico interno la Directiva 93/53/CEE, del Consejo, de 24 de junio, por la que se establecen medidas comunitarias sobre la materia e incluye en su anexo F la Decisión 92/532/CEE, de la Comisión, de 19 de noviembre, por la que se establecen los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces.
Desde que se adoptó la Decisión 92/532/CEE, se han producido novedades prácticas y científicas, y se ha modificado la Directiva 91/67/CEE, del Consejo, de 28 de enero, relativa a las condiciones de policía sanitaria aplicables a la puesta en el mercado de animales y productos de la acuicultura. Ello ha motivado la reciente aprobación de la Decisión 2001/183/CE, de la Comisión, de 22 de febrero, por la que se establecen los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces y se deroga la Decisión 92/532/CEE.
Mediante la citada Decisión 2001/183/CE se actualiza la normativa comunitaria en relación con el examen y la identificación de los virus que originan la septicemia hemorrágica viral (SHV) y la necrosis hematopoyética infecciosa (NHI), y se introducen los cambios necesarios de conformidad con las últimas modificaciones de la Directiva 91/67/CEE.
Procede, por tanto, modificar el anexo F del Real Decreto 1488/1994, de acuerdo con la facultad expresamente recogida en su disposición final primera, en la redacción dada por el Real Decreto 138/1997, de 31 de enero, por el que se modifica parte de los anexos del Real Decreto 1488/1994.
Modificación del anexo F del Real Decreto 1488/1994 El anexo F del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen las medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces, se sustituye por el que figura en la presente Orden.
Título competencial La presente Orden se dicta al amparo de lo dispuesto en el artículo 149.1.16.ª de la Constitución, por el que se atribuye al Estado la competencia exclusiva en materia de bases y coordinación general de la sanidad.
a) Establece directrices y requisitos mínimos aplicables a los planes de muestreo y métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de la presencia de septicemia hemorrágica viral (SHV) y necrosis hematopoyética infecciosa (NHI).
b) Integra las disposiciones de los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE para la obtención y el mantenimiento de la autorización de zonas y de explotaciones situadas en zonas no autorizadas.
c) Establece disposiciones para el correcto diagnóstico de la septicemia hemorrágica viral y la necrosis hematopoyética infecciosa y el reconocimiento oficial de la autorización de zonas y de explotaciones situadas en zonas no autorizadas de conformidad con los artículos 5 y 6 de la Directiva 91/67/CEE.
d) Está destinado a las autoridades responsables de la lucha contra la septicemia hemorrágica viral y la necrosis hematopoyética infecciosa y al personal de laboratorio que lleve a cabo las pruebas de estas enfermedades. En consecuencia, se presta especial atención a los procedimientos de muestreo, los principios y aplicaciones de las pruebas de laboratorio y la evaluación de sus resultados, así como a las técnicas de laboratorio detalladas. No obstante, cuando proceda, los laboratorios podrán modificar las pruebas recogidas en el presente anexo o utilizar pruebas diferentes, siempre que se pueda demostrar que tienen una sensibilidad y especificidad equivalentes.
En la parte II se describen los procedimientos de diagnóstico para confirmar la existencia de la septicemia hemorrágica viral y la necrosis hematopoyética infecciosa en caso de que se sospeche de su presencia.
En la parte III se establecen criterios y directrices de un programa oficial de inspección sanitaria que documente la ausencia histórica de septicemia hemorrágica viral y la necrosis hematopoyética infecciosa.
En la parte V se recogen los acrónimos y las abreviaturas.
Planes de muestreo y métodos de diagnóstico para la vigilancia de la septicemia hemorrágica viral y la necrosis hematopoyética infecciosa, con objeto de obtener y mantener la autorización de una zona o de una explotación situada en una zona no autorizada I.
Inspecciones y muestreo
1. Disposiciones generales sobre las inspecciones sanitarias clínicas, la recogida y la selección de muestras para vigilancia de zonas o explotaciones situadas en zonas no autorizadas con objeto de lograr o mantener la autorización con respecto a la SHV o la NHI.-En los cuadros 1A, 1B y 1C se resumen las inspecciones sanitarias clínicas y el muestreo de tejidos de los peces, del fluido ovárico o de ambos, que deberá realizarse en las zonas o las explotaciones situadas en zonas no autorizadas para lograr o mantener la autorización con respecto a la SHV o la NHI de conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE. En las partes I.I.2 a I.I.4 se recogen detalles más precisos. Los cuadros 1A y 1B no serán aplicables a las nuevas explotaciones ni a las explotaciones que vuelvan a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes una zona autorizada o de una explotación autorizada situada en una zona no autorizada, siempre que cumplan lo dispuesto en las letras a) o b) de la parte I.A6 o en las letras a) o b) de la parte II.A3 del anexo C de la Directiva 91/67/CEE.
Las inspecciones clínicas deberán efectuarse durante el período comprendido entre octubre y junio o siempre que la temperatura del agua esté por debajo de los 14º C. Cuando las explotaciones deban ser inspeccionadas clínicamente dos veces al año, los intervalos entre ambas visitas deberán ser de un mínimo de cuatro meses. Todas las unidades de producción (estanques, tanques, jaulas de red, etc.) deberán inspeccionarse para comprobar si hay peces muertos, débiles o que actúen de manera anormal. Deberá prestarse especial atención a la zona de desagüe, donde los peces débiles tienen tendencia a acumularse debido a la corriente de agua.
- Si hay truchas arco iris, toda la muestra estará compuesta de peces de esa especie. En caso contrario, la muestra deberá incluir peces de todas las especies presentes siempre que sean sensibles al virus de la SHV o de la NHI (de conformidad con la lista recogida en el anexo A de la Directiva 91/67/CE).Las especies deberán estar representadas de manera proporcional en la muestra.
2. Disposiciones específicas, incluida la recogida de muestras, para la vigilancia de zonas o explotaciones situadas en zonas no autorizadas con objeto de lograr o mantener la autorización con respecto a la SHV y la NHI.
a) Una zona o una explotación situada en una zona no autorizada sometida a supervisión por los servicios oficiales puede obtener la autorización con respecto a la SHV o la NHI siempre que se someta a uno de los dos modelos siguientes:
1. Modelo A: Un programa de vigilancia de dos años.Tras un plazo mínimo de dos años de ausencia de signos clínicos o de otro tipo de SHV o NHI, todas las explotaciones de la zona o toda explotación situada en una zona no autorizada que deseen ser autorizadas, deberán someterse a una inspección sanitaria dos veces al año durante dos años. A lo largo de este período de control de dos años que precede a la consecución de la autorización, se deberá mantener la ausencia de signos clínicos o de otro tipo de SHV o de NHI y se deberán recoger muestras para su examen de conformidad con lo establecido en el cuadro 1A. Además, las muestras deberán seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los resultados de los exámenes de laboratorio para detectar la SHV o la NHI deberán ser negativos.
2. Modelo B: Un programa de vigilancia de dos años con una muestra de tamaño reducido.Tras un programa oficial de inspección sanitaria que documente la ausencia histórica de SHV o NHI durante, al menos, cuatro años, todas las explotaciones de la zona o toda explotación que esté situada en una zona no autorizada, que deseen ser autorizadas, deberán someterse a inspección sanitaria dos veces al año durante dos años. A lo largo de este período de control de dos años que precede a la consecución de la autorización, se deberá mantener la ausencia de signos clínicos o de otro tipo de SHV o de NHI y se deberán recoger muestras para su examen de conformidad con lo establecido en el cuadro 1B. Además, las muestras deberán seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los resultados de los exámenes de laboratorio para detectar la septicemia hemorrágica viral o la necrosis hematopoyética infecciosa deberán ser negativos. Para que los servicios oficiales reconozcan un programa de inspección sanitaria a efectos de documentación de la ausencia de septicemia hemorrágica viral o necrosis hematopoyética infecciosa, éste deberá cumplir los criterios y directrices recogidos en la parte III.
b) Disposiciones especiales para la autorización de nuevas explotaciones y de explotaciones que vuelven a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes de una zona autorizada, o de una explotación autorizada situada en una zona no autorizada.Las nuevas explotaciones y las explotaciones que vuelvan a dar comienzo a sus actividades con peces, huevos o gametos procedentes de una zona autorizada o de una explotación autorizada situada en una zona no autorizada podrán obtener la autorización de conformidad con lo dispuesto en las letras a) y b) de la parte I.A.6 o en las letras a) y b) de la parte II.A.3 del anexo C de la Directiva 91/67/CEE. Por tanto, las disposiciones de muestreo establecidas en los ya citados modelos A y B [letras a) y b) de la parte I.I.2.1] no serán aplicables a dichas explotaciones.
c) Programa de vigilancia para el mantenimiento de la autorización con respecto a la septicemia hemorrágica viral o la necrosis hematopoyética infecciosa.Con objeto de mantener la autorización de una zona o de una explotación situada en una zona no autorizada con respecto a la septicemia hemorrágica viral o la necrosis hematopoyética infecciosa, las inspecciones y el muestreo para realizar los exámenes deberán llevarse a cabo de conformidad con lo establecido en el cuadro 1C. Las muestras deberán seleccionarse, prepararse y examinarse de conformidad con lo dispuesto en las partes II a I.IV y los exámenes de laboratorio deberán ser negativos con respecto a los agentes causantes de la septicemia hemorrágica viral o la necrosis hematopoyética infecciosa.
Preparación y envío de muestras procedentes de los peces.-
Antes de su envío o traslado al laboratorio, se extraerán de los peces partes de los órganos que deban examinarse con instrumental estéril de disección y se introducirán en tubos de plástico estériles que contengan medio de transporte, es decir, medio de cultivo celular con un 10 por 100 de suero de ternera y antibióticos. Se recomienda la combinación de 200 UI de penicilina, 200 microgramos de estreptomicina y 200 microgramos de kanamicina por ml, aunque podrán utilizarse asimismo otros antibióticos de eficacia probada. Los tejidos que se deberán examinar son el bazo, la parte anterior del riñón y, además, bien el corazón o bien el encéfalo. En algunas ocasiones, deberá examinarse el fluido ovárico (cuadros 1A-1C).
El fluido ovárico o las partes de órganos de un máximo de 10 peces (cuadros 1A-1C) podrán recogerse en un solo tubo estéril que contenga al menos 4 ml de medio de transporte, para constituir una muestra conjunta. El peso del tejido de cada muestra deberá ser de 0,5 gramos como mínimo.
Los tubos se colocarán en recipientes aislados (por ejemplo, cajas de poliestireno de paredes gruesas) con una cantidad suficiente de hielo o de bloques de enfriamiento para garantizar la refrigeración de las muestras durante su traslado al laboratorio. Se evitará la congelación. La temperatura de las muestras durante el transporte nunca deberá exceder de 10º C y en el momento de la recepción todavía deberá haber hielo en el recipiente de transporte o alternativamente, uno o más bloques de enfriamiento deberán estar aún helados parcial o totalmente.
El examen virológico deberá iniciarse lo antes posible y nunca después de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la recogida de las muestras. En casos excepcionales (1) , el examen virológico podrá empezar a más tardar en un plazo de setenta y dos horas desde la recogida del material, siempre que éste quede protegido con medio de transporte y se cumplan los requisitos de temperatura durante el transporte (véase el punto 3 de la parte I.I.3).
Recogida de material de diagnóstico suplementario.-
Preparación de las muestras para el examen virológico
Congelación en casos excepcionales.-
En caso de que surjan dificultades prácticas (por ejemplo, condiciones meteorológicas adversas, días festivos, problemas de laboratorio, etc.), que impidan inocular las células en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podrán congelar estas muestras en medio de cultivo celular a una temperatura igual o inferior a -20º C y realizar el examen virológico en un plazo de catorce días. En cualquier caso, el tejido sólo podrá congelarse y descongelarse una única vez antes de su examen. Se deberá llevar un registro de los motivos por los que se han congelado las muestras de tejido en cada ocasión en que se haya hecho (como, por ejemplo, tormenta, muerte de las líneas celulares, etc.).
Homogeneización de los órganos.-
Centrifugado del homogeneizado.-
El homogeneizado se centrifugará a una aceleración de entre 2000 y 4000 x g durante quince minutos, en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5º C, y el sobrenadante se recogerá y se tratará durante cuatro horas a 15º C o durante toda la noche a 4º C con antibióticos; por ejemplo, 1 mg/ml de gentamicina puede ser útil en esta fase.
Si el sobrenadante recogido se almacena a -80º C en el plazo de cuarenta y ocho horas siguientes a la toma de muestras, podrá ser reutilizado una sola vez para el examen virológico.
En caso de que surjan dificultades prácticas (por ejemplo, avería de la incubadora, problemas con los cultivos celulares, etc.) que impidan inocular las células en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podrá congelar el sobrenadante a -80º C y realizar el examen virológico en un plazo de catorce días.
Antes de la inoculación de las células, el sobrenadante se mezclará a partes iguales con un conjunto de antisueros de los serotipos autóctonos de virus de la necrosis pancreática infecciosa (NPI), diluidos en la proporción adecuada, y la mezcla se incubará durante una hora como mínimo a una temperatura de 15 oC o durante dieciocho horas como máximo a una temperatura de 4 oC. El título del antisuero deberá ser como mínimo de 1:2000 en una prueba de neutralización en placa del 50 por 100.
El tratamiento de todos los inóculos con antisuero del virus de la NPI (virus que en algunas partes de Europa está presente en el 50 por 100 de las muestras de peces) tiene por objeto evitar el desarrollo de efectos citopatogénicos (ECP) debidos a este virus en los cultivos celulares inoculados. Con ello se logra reducir la duración de los exámenes virológicos, así como el número de casos en que la presencia de ECP debería considerarse como indicador potencial de la presencia del virus de la septicemia hemorrágica viral o del de la necrosis hematopoyética infecciosa.
Examen virológico
Medios y cultivos celulares.-
Se cultivarán células BF-2 o RTG-2 y bien EPC o bien FHM a una temperatura comprendida entre 20 y 30 oC en un medio adecuado como, por ejemplo, MEM de Eagle (o sus modificaciones) con adición de un 10 por 100 de suero vacuno fetal y antibióticos en concentraciones normales.
Si las células se cultivan en frascos cerrados, es recomendable amortiguar el medio con bicarbonato. El medio utilizado para el cultivo de células en unidades abiertas podrá amortiguarse con Tris-HC1 (23 mM) y bicarbonato sódico (6 mM). El pH deberá ser de 7,6 ±0,2.
Para la inoculación con tejidos se emplearán cultivos celulares jóvenes (de entre cuatro y cuarenta y ocho horas) y en crecimiento activo (no confluente) en el momento de la inoculación.
Inoculación de los cultivos celulares.-
La suspensión de órganos tratada con antibióticos se inoculará en cultivos celulares en dos diluciones, es decir, la dilución original y, además, una dilución 1:10 de la misma, que darán lugar a diluciones finales del material tisular en el medio de cultivo celular de 1:100 y 1:1000, respectivamente (a fin de evitar interferencias homólogas). Deberán inocularse, como mínimo, dos líneas celulares (véase la parte I.III.1). La proporción entre el tamaño del inóculo y el volumen del medio de cultivo celular será aproximadamente de 1:10.
Incubación de los cultivos celulares.-
Los cultivos celulares inoculados se incubarán entre siete y diez días a una temperatura de 15 ºC. Si el color del medio de cultivo celular pasa de rojo a amarillo, lo que indica la acidificación del medio, se llevará a cabo el ajuste del pH con una solución estéril de bicarbonato, o con una sustancia equivalente, para garantizar la sensibilidad celular a la infección vírica.
Al menos una vez cada seis meses, o si se sospecha que la sensibilidad celular ha descendido, se efectuará la titulación de material congelado de virus de septicemia hemorrágica viral y necrosis hematopoyética infecciosa para comprobar la sensibilidad de los cultivos celulares a la infección. En la parte IV se describe el procedimiento recomendado.
Microscopia.-
Subcultivos.-
Se reunirán alícuotas del medio (sobrenadante) de todos los cultivos/pocillos pertenecientes al cultivo primario, por líneas celulares, siete o diez días después de la inoculación. El resultado se inoculará en cultivos celulares homólogos sin diluir y en una dilución de 1:10 (que darán lugar a diluciones finales de 1:10 y 1:100, respectivamente, del sobrenadante) como se describe en la parte I.III.2. De manera alternativa, se pueden inocular directamente en un pocillo que contenga cultivo celular fresco alícuotas de un 10 por 100 del medio que constituía el cultivo primario (subcultivo de pocillo a pocillo). La inoculación podrá ir precedida de la preincubación de las diluciones con el antisuero del virus de la necrosis pancreática infecciosa a una dilución adecuada, tal y como se describe en la parte I.II.3.
Los cultivos inoculados se inocularán entonces durante siete a diez días a una temperatura de 15º C y se mantendrán bajo observación, según se indica en la parte I.III.4.
Si, pese al tratamiento con antibióticos, se produce una contaminación bacteriana, antes de proceder al subcultivo se deberá centrifugar el sobrenadante a 2000-4000 x g durante un período de quince a treinta minutos y a una temperatura de 2 a 5 oC, o filtrarlo a través de un filtro de 0,45 xm (por una membrana con baja afinidad por las proteínas), o someterlo a ambos procedimientos. Por lo demás, los procedimientos de subcultivo son los mismos que los aplicados a los ECP tóxicos.
Pruebas de identificación del virus.-
Si se observa la existencia de ECP en un cultivo celular, se recogerá medio (sobrenadante) y se examinará sometiéndolo a una o varias de las pruebas siguientes: Neutralización, IF o ELISA. Si estas pruebas no permiten identificar el virus con seguridad en una semana, el sobrenadante deberá enviarse para su identificación inmediata al laboratorio nacional de referencia o al laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces.
Neutralización.-
Se eliminarán las células del sobrenadante recogido mediante centrifugación (2000-4000 x g) o filtración por membrana (0,45 xm) por una membrana con baja afinidad por las proteínas y éste se diluirá a 1:100 y 1:10000 en un medio de cultivo celular.
Se mezclarán alícuotas de las dos diluciones de sobrenadante con partes iguales de los siguientes reactivos por separado, y se incubarán durante sesenta minutos a una temperatura de 15 ºC:
- Suero que contenga un anticuerpo con especificidad de grupo frente al virus de la septicemia hemorrágica viral a una dilución de 1:50 (vol:vol) (2) .
- Suero que contenga un anticuerpo con especificidad de grupo frente al virus de la necrosis hematopoyética infecciosa a una dilución de 1:50 (vol:vol) (2) .
- Conjunto de antisueros frente a los serotipos autóctonos del virus de la necrosis pancreática infecciosa a una dilución de 1:50 (vol:vol) (2) .
De cada mezcla de sobrenadante y virus, se inocularán al menos dos cultivos celulares con 50 xl cada uno y se incubarán a 15 oC. Se controlará si aparecen ECP de la forma descrita en la parte I.III.4.
Para cada cepa vírica que se desee identificar, se sembrarán con células al menos ocho cubres o sus equivalentes, a una densidad que permita alcanzar una confluencia del 60 al 90 por 100 aproximadamente después de veinticuatro horas de cultivo. Se recomienda utilizar células EPC por su fuerte adherencia a las superficies de cristal, pero también se pueden utilizar otras líneas celulares, como BF-2, RTG-2 o FHM.
Cuando las células hayan sedimentado en la superficie del cristal (aproximadamente una hora después de la siembra) o cuando los cultivos se hayan incubado durante un período de hasta veinticuatro horas, se inoculará el virus que se desee identificar. Se inocularán cuatro cultivos en la proporción de 1:10 en volumen y otros cuatro en la proporción de 1:1000, que, posteriormente, se incubarán a 15º C durante un período de veinte a treinta horas.
Tras la incubación, los cultivos se aclararán dos veces en MEM de Eagle sin suero, se fijarán con acetona helada al 80 por 100 y se teñirán con ayuda de una IFAT de doble capa. La primera capa de reactivo consistirá en anticuerpos policlonales o monoclonales de calidad de referencia. La segunda capa de reactivo estará formada por un antisuero conjugado con fluorocromo con afinidad por la inmunoglobina utilizada en la primera capa. Por cada uno de los antisueros sometidos a la prueba, deberá teñirse al menos un cultivo inoculado con una dosis alta y otro inoculado con una dosis baja. La prueba incluirá controles negativos y positivos adecuados. Se recomiendan para esta prueba fluorocromos como el FITC o el TRITC.
Los cultivos teñidos se prepararán utilizando solución salina de glicerol y se examinarán con luz ultravioleta incidente, utilizando oculares de 10 ó 12 aumentos y objetivos de 25 ó 40 aumentos con aperturas numéricas > 0,7 y > 1,3, respectivamente.
Tras aclarar los pocillos con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se incorporará a los pocillos el virus que se desee identificar en fases de dilución doble o cuádruple y se dejará reaccionar con el anticuerpo de recubrimiento durante sesenta minutos a 37 oC. Tras el aclarado con la solución amortiguadora PBS-Tween-20, se añadirán anticuerpos con biotina de la especificidad correspondiente a la de los anticuerpos de recubrimiento y se dejará reaccionar durante sesenta minutos a 20º C.
Después de efectuar otro aclarado como el anterior, se añadirá estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y se dejará reaccionar durante una hora a 20º C. Tras efectuar un último aclarado, se visualizará la enzima ligada utilizando sustratos ELISA adecuados (OPD u otros).
CUADRO 1A Plan de inspección y muestreo para las zonas y explotaciones situadas en zonas no autorizadas para el período de control de dos años que precede a la autorización con respecto a la septicemia hemorrágica viral y la necrosis hematopoyética infecciosa
(De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en la parte I del presente anexo) Exámenes de laboratorio para detectar la presencia de virus (3) Número de inspecciones clínicas anuales (dos años)
Número de exámenes de laboratorio anuales (dos años)
Número de peces en crecimiento (material de los órganos)
Número de reproductores (fluido ovárico)
120 (primera inspección) (4) 150 (segunda inspección)
30 (primera inspección) (5) 0 (segunda inspección)
b) Explotaciones únicamente con reproductores
150 (primera o segunda inspección). (5) c) Explotaciones sin reproductores
120 (primera inspección) 150 (segunda inspección)
30 (primera inspección). (5) 0 (segunda inspección).
b) Explotaciones de salmónidos sin reproductores
30 (primera y segunda inspecciones). (6) 0
c) Explotaciones sin salmónidos y sin reproductores
Exámenes de laboratorio para detectar la presencia de virus Número de inspecciones clínicas anuales (dos años)
0 (primera inspección) (7) 30 (segunda inspección)
30 (primera inspección) (8) 0 (segunda inspección)
30 (primera o segunda inspección). (8) c) Explotaciones sin reproductores
0 (primera inspección) 30 (segunda inspección)
30 (primera inspección). (8) 0 (segunda inspección).
30 (primera y segunda inspecciones). (9) 0
(De conformidad con los anexos B y C de la Directiva 91/67/CEE y las disposiciones establecidas en la parte I del presente anexo) Número de peces de una muestra conjunta sometida a examen de laboratorio (10) Número de inspecciones clínicas anuales
20 (primera o segunda inspección)
10 (primera o segunda inspección)
30 (primera o segunda inspección). (11) c) Explotaciones sin reproductores
10 (primera o segunda inspección). (11) b) Explotaciones sin reproductores
30 (12) 0
A) Aislamiento convencional de los virus y posterior identificación serológica de los mismos.
B) Aislamiento e identificación serológica simultánea de los virus.
C) Otras técnicas de diagnóstico (IFAT, ELISA).
Aislamiento convencional de los virus y posterior identificación serológica de los mismos
Selección de muestras.-
Preparación y envío de muestra de peces.-
Recogida de material suplementario para diagnóstico.-
Preparación de las muestras para el examen virológico.-
Examen virológico.-
Identificación del virus.-
Procédase del modo indicado en la parte I.IV.
Aislamiento e identificación serológica simultánea de los virus
Preparación y envío de muestras de peces. -
El homogeneizado se centrifugará a una aceleración de entre 2000 y 4000xg durante quince minutos, en una centrifugadora refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5º C, y el sobrenadante se recogerá y se tratará durante cuatro horas a 15º C con antibióticos, por ejemplo, 1 mg/ml de gentamicina, o se filtrará (0,45 xg) por una membrana con baja afinidad por las proteínas.
Tratamiento del sobrenadante con antisueros para diagnóstico.-
La suspensión de órganos tratada con antibióticos o filtrada por membrana se diluirá a 1:10 y 1:1000 en medio de cultivo celular; se mezclarán alícuotas suyas a partes iguales con los reactivos enumerados en la parte I.IV.2 y se incubarán durante 60 minutos a 15º C.
De cada mezcla de suero y virus (preparada del modo indicado en la parte II.B.II.3), se inocularán al menos dos cultivos celulares por línea celular con 50 xl cada uno.
Si no se han obervado ECP después de siete a diez días, se realizarán subcultivos a partir de los cultivos inoculados con sobrenadante y medio (parte II.B.II.3) con arreglo a la parte I.III.5.
Las técnicas IFAT o ELISA descritas en las partes I.IV.3 y I.IV.4, respectivamente, se podrán aplicar al sobrenadante, que se habrá preparado del modo indicado en la parte I.II.2. Estas técnicas rápidas se completarán con un examen virológico con arreglo a los puntos A o B antes de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la toma de la muestra, si:
El material tisular podrá someterse a otras técnicas de diagnóstico como la RCPTI, la IF realizada con cortes congelados o la inmunohistoquímica realizada con material fijado con formol. Estas técnicas deberán completarse siempre con la inoculación en cultivos celulares de material tisular no fijado.
Directrices y criterios aplicables a un programa oficial de inspección sanitaria.
Tras haber aplicado un programa de erradicación del virus de la septicemia hemorrágica viral o del virus de necrosis hematopoyética infecciosa reconocido oficialmente, en virtud del cual se hayan retirado todos los peces de las instalaciones y éstas se hayan limpiado, desinfectado y dejado en reposo antes de volver a abastecerlas con peces procedentes de explotaciones autorizadas, o
En explotaciones piscícolas en las que no haya precedentes de infección con los virus de estas enfermedades.
En tubos de cultivo celular con células BF-2 o RTG-2, en el caso del virus de la septicemia hemorrágica viral, y con células EPC o FHM, en el del virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, se propagarán lotes de virus de un número bajo de pases en cultivos celulares. Se deberá emplear un medio de cultivo celular con, al menos, un 10 por 100 de suero. En la inoculación deberá emplearse una MOI baja (< 1).
Con los ECP totales presentes, se recogerá el virus mediante centrifugado del sobrenadante del cultivo celular a 2000xg durante quince minutos, se esterilizará pasándolo por un filtro de membrana de 0,45 ìm y se distribuirá en criotubos etiquetados. El virus se mantendrá a -80º C.
Una semana después de la congelación, se descongelarán tres tubos de cada virus colocándose en agua fría y se titularán con sus líneas celulares respectivas. Cada cepa de virus se descongelará y titulará, al menos, cada seis meses o si se sospecha que la sensibilidad de una línea celular se ha visto reducida.
La titulación por dilución hasta el límite se efectuará utilizando, al menos, seis tubos en cada fase de dilución.
Los títulos se compararán con los obtenidos previamente. Si el título de uno de las tres cepas de virus es inferior en un factor igual o superior a dos unidades logarítmicas, respecto al título inicial, no deberá volver a utilizarse la línea celular para fines de vigilancia.
Los registros se conservarán, al menos, diez años.
BF-2 Fibroblasto de alevín de Lepomis macrochirus (línea celular).
ECP Efectos citopatogénicos.
LCR Laboratorio comunitario de referencia para las enfermedades de los peces. ELISA Prueba de inmunoabsorción enzimática.
EPC Epithelioma papulosum cyprini (línea celular).
FHM Pimephales promeles (línea celular).
FITC Isotiocianato de fluoresceína.
Hepes Ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'2-etano-sulfónico.
HRP Peroxidasa de rábano.
IFAT Prueba de fluorescencia indirecta para la detección de anticuerpos.
(V) NHI (Virus de la) necrosis hematopoyética infecciosa.
(V) NPI (Virus de la) necrosis pancreática infecciosa.
MEM Medio mínimo fundamental.
MOI Multiplicidad de infección (proporción del número de partículas víricas infecciosas añadido a un número conocido de células de un cultivo).
PBS Solución salina amortiguadora fosfatada.
RTG-2 Gónadas de trucha arco iris (línea celular).
RCP-TI Reacción de polimerización en cadena con transcripción inversa.
(V) SHV (Virus de la) septicemia hemorrágica viral.
(1) En casos excepcionales, como, por ejemplo, cuando los peces se recojan en zonas muy remotas que no dispongan de correo diario. Ver Texto (2) O como indique el laboratorio de referencia en relación con la posible citotoxicidad de los antisueros. Ver Texto (3) Asimismo, se podrá utilizar una muestra reducida de conformidad con lo establecido en el cuadro 1B si se cumplen las condiciones establecidas en las partes I.I.1, letra b) de la parte I.I.2.1 y parte III. Ver Texto (4) Inspecciones clínicas. Ver Texto (5) En circunstancias excepcionales, si fuera imposible obtener fluido ovárico, en su lugar se podrían tomar órganos. Ver Texto (6) Las muestras deberán recogerse como muy pronto tres semanas tras el traslado de los peces de agua dulce a agua salada. Ver Texto (7) Inspecciones clínicas. Ver Texto (8) En circusntancias excepcionales, si fuera imposible obtener fluido ovárico, en su lugar se podrían tomar órganos. Ver Texto (9) Las muestras deberán recogerse como muy pronto tres semanas tras el traslado de los peces de agua dulce a agua salada. Ver Texto (10) En las zonas autorizadas sólo será necesario recoger muestras por rotación en un 50 por 100 de las explotaciones cada año. En las explotaciones autorizadas situadas en zonas no autorizadas se deberá recoger muestras cada año. Ver Texto (11) En circunstancias excepcionales, si fuera imposible obtener fluido ovárico, en su lugar se podría tomar órganos. Ver Texto (12) Las muestras deberán recogerse como muy pronto tres semanas tras el traslado de los peces de agua dulce a agua salada. Ver Texto ');

References: Real Decreto 
 Real Decreto 
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 artículo 149