Source: http://docplayer.pl/2528249-Redakcja-redaktor-naczelna-monika-dziachan-pz-cormay-sa-redakcja-i-korekta-agape.html
Timestamp: 2016-12-08 12:38:14+00:00

Document:
⭐Redakcja: Redaktor naczelna Monika Dziachan PZ Cormay SA Redakcja i korekta Agape
Redakcja: Redaktor naczelna Monika Dziachan PZ Cormay SA Redakcja i korekta Agape
Download "Redakcja: Redaktor naczelna Monika Dziachan PZ Cormay SA Redakcja i korekta Agape"
1 2 SPIS TREŚCI AKTUALNOŚCI Ach, co to był za bal, czyli Srebrna Noc Cormaya 4 5 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Metabolity proleki: Implikacje dla terapeutycznego monitorowania leków 6 7 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Glukuronidacja centrum aktywnego proleku: Izolacja i charakterystyka oksymetyloglukuronidu powstającego z fosfenytoiny 8 12 DO SPECJALIZACJI Terapeutyczne Monitorowanie Leków wprowadzenie Terapeutyczne Monitorowanie Leków aspekty praktyczne DBAJ O ZDROWIE Ostrożnie z lekami 18 PRZYPADKI KLINICZNE Od przypadku do przypadku 19 Wydawca: PZ Cormay SA ul. Wiosenna Łomianki tel.: faks: Redakcja: Redaktor naczelna Monika Dziachan PZ Cormay SA Redakcja i korekta Agape Współpraca: Dr hab. n. med. Bogdan Solnica Prof. dr hab. n. med. Grażyna Odrowąż-Sypniewska Przygotowanie i produkcja: Agape. Agencja doradcza i wydawnicza ul. Rękodzielnicza 11, Warszawa tel./faks: Redakcja zastrzega sobie prawo do skracania i redagowania publikowanych tekstów Numer zamknięto Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY3 NA WSTĘPIE Æwieræ wieku za nami F irma Cormay dzia³a na rynku medycznym od 25 lat. W tym roku obchodzi³a srebrny jubileusz. Tym, którzy mieli okazjê z nami œwiêtowaæ, dziêkujemy za przybycie i uœwietnienie naszej uroczystoœci. Rocznica sk³ania do wspomnieñ i podsumowañ. Na przestrzeni lat firma Cormay przekszta³ci³a siê z firmy lokalnej w miêdzynarodow¹. Swoj¹ dzia³alnoœæ rozpoczê³a od produkcji kilku odczynników. Podpisana w 1989 roku umowa licencyjna z najwiêksz¹ szwajcarsk¹ firm¹ Hoffmann-LaRoche pozwoli³a na uruchomienie produkcji pe³nej linii reagentów do chemii klinicznej. By³y to jednak odczynniki w formie sta³ej, wymagaj¹ce procesu rekonstytucji. Dziêki podjêciu wspó³pracy z firm¹ Hoffmann-La- Roche uzyskaliœmy dostêp do najlepszych technologii produkcji odczynników biochemicznych. Od 1996 roku rozpoczêliœmy opracowywanie i wdra anie do produkcji nowej linii odczynników ciek³ych Liquick-Cor. Odczynniki te opracowywa³ nasz w³asny zespó³ R&D, w oparciu o wspó³pracê z firmami japoñskimi. Filozofią naszej firmy jest osiągnięcie satysfakcji przez klienta i zachowanie najwyższej jakości. Nasz sukces potwierdza wysoka sprzedaż nie tylko na rynku krajowym, ale i w 60 krajach świata W ramach umowy z firm¹ Hoffmann-LaRoche Cormay prowadzi³ wy³¹czn¹ dystrybucjê aparatury diagnostycznej: Cobas Integra, Cobas Mira, a tak e Cobas Micros, Cobas Vega, Cobas Core. G³ówn¹ specjalnoœci¹ firmy Cormay by³y odczynniki biochemiczne, jednak rynek wymaga³ poszerzenia asortymentu. I tak w roku 1998 rozpoczêliœmy produkcjê odczynników hematologicznych. Pocz¹tkowo by³y to odczynniki do aparatów CellDyn, a nastêpnie do aparatów Micros, Medonic, Sysmex i innych. Obecnie koncentrujemy siê na produkcji odczynników hematologicznych do aparatów Mythic 18 i Mythic 22. Filozofi¹ naszej firmy jest osi¹gniêcie satysfakcji przez klienta i zachowanie najwy szej jakoœci. Nasz sukces potwierdza wysoka sprzeda nie tylko na rynku krajowym, ale i w 60 krajach œwiata, w tym w Austrii, Niemczech, Wielkiej Brytanii, W³oszech, Francji, Hiszpanii, Turcji, ZEA (równie w laboratorium medycznym linii lotniczych Emirates ). Ostatnio nasze odczynniki zosta³y wys³ane do Autonomii Palestyñskiej. W styczniu 2010 roku dokonaliœmy przejêcia szwajcarskiej firmy Orphée producenta analizatorów hematologicznych. To znacz¹ce wydarzenie pozwoli nam na zdobycie nowych doœwiadczeñ i poszerzenie sieci dystrybucji. Razem z firm¹ Orphée posiadamy 221 dystrybutorów w ponad 100 krajach. Cormay sprzedaje swoje odczynniki i aparaturê diagnostyczn¹ pomiêdzy Atlantykiem i Pacyfikiem. Cormay i Orphée ju teraz razem rozwijaæ bêd¹ sieæ dystrybucyjn¹ i portfolio produktów. Zachêcam do lektury bie ¹cego numeru, który w ca³oœci poœwiêcony jest tematyce terapeutycznego monitorowania leków. Ewa Stawicka Dyrektor Sprzeda y Krajowej Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 34 Wspaniali goście, wykwintne menu, zabawa do białego rana. A to wszystko w warszawskim Hotelu Marriott podczas jubileuszowej uroczystości 25-lecia firmy Cormay. Ach, co to był za bal, czyli Srebrna Noc Cormaya Takiej imprezy w œwiecie polskiej diagnostyki jeszcze nie by³o us³yszeliœmy podczas nocy z 25 na 26 czerwca i wielokrotnie po niej. Zachwytom nie by³o koñca. Zarz¹d firmy rozpocz¹³ wieczór powitaniem wszystkich goœci. Wœród 280 zaproszonych byli miêdzy innymi przedstawiciele Zarz¹du Polskiego Towarzystwa Diagnostyki Laboratoryjnej: przewodnicz¹cy prof. Dariusz Sitkiewicz, prof. Gra yna Odrow¹ - -Sypniewska, prof. Marek Paradowski. Nie zabrak³o tak e ludzi nauki, którzy w latach wczeœniejszych przyczynili siê do rozwoju firmy Cormay: prof. Dagny Bobilewicz, prof. Andrzeja Brzeziñskiego oraz dr Hanny Zborowskiej recenzentów pierwszych testów diagnostycznych. Izbê Producentów i Dystrybutorów Diagnostyki Laboratoryjnej reprezentowa³ jej Dyrektor Generalny Józef Jakubiec oraz cz³onkowie Zarz¹du IPDDL: prezes Andrzej Banaszkiewicz, szef Roche Diagnostic Polska oraz El bieta Wójcik, Dyrektor Generalny Biomerieux Polska. Oboje byli we wczeœniejszych latach zwi¹zani zawodowo z firm¹ Cormay. Nagrodę Srebrnego Klienta w kategorii nabywca odczynników hematologicznych dla Zakładu Opieki Zdrowotnej w Oleśnie odebrała z rąk Ewy Stawickiej (Dyrektora Sprzedaży Krajowej) Pani Teresa Rosak Nasi honorowi goście. Od lewej: prof. dr hab. Marek Paradowski, prof. dr hab. n. med. Grażyna Odrowąż- Sypniewska, prof. dr hab. Dariusz Sitkiewicz, prof. dr. hab. Dagna Bobilewicz, prof. dr hab. Andrzej Brzeziński, dr n. farm. Hanna Zborowska, dr Elżbieta Wójcik Dyrektor Generalny Biomerieux Polska, Andrzej Banaszkiewicz Prezes Roche Diagnostics Polska. Józef Jakubiec Dyrektor Generalny Izby Producentów i Dystrybutorów Diagnostyki Laboratoryjnej. Na zdjęciu z Tadeuszem Tuora 4 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY5 Swoj¹ obecnoœci¹ zaszczycili nas równie nasi dystrybutorzy z ca³ego œwiata: Szwajcarii, Austrii, W³och, Francji, Chin, Turcji, Grecji, Ukrainy, Bu³garii, Rumunii, Serbii, Macedonii, Czech, Jordanii, Algierii, Sudanu, Egiptu i innych krajów. Zaproszeni zostali tak e pracownicy pozosta³ych firm nale ¹cych do Grupy Kapita- ³owej PZ Cormay: szwajcarskiej firmy Orphée, rosyjskiej Cormay Rusland i Cormay Diana z Bia³orusi. Tak jak zachwytom, przemówieniom równie nie by³o koñca. Krasomówstwem zachwycili przewodnicz¹cy Rady Nadzorczej prof. Stefan Jackowski i Domingo Dominguez, Chief Sales Officer Orphée & Cormay SA. Nastêpnie przysz³a kolej na nagrody. Odznaki i dyplomy zosta³y wrêczone nie tylko pracownikom firmy Cormay, ale tak e najlepszym Klientom oraz dystrybutorom firm Cormay i Orphée. Wielk¹ niespodziank¹ dla cz³onków Zarz¹du by³y statuetki ufundowane przez pracowników firmy Cormay, wyra- aj¹ce podziêkowanie za ich codzienn¹ pracê, wrêczone przy dÿwiêkach piosenki We are the champions. Potem by³a niespodzianka dla naszych goœci wystêp orkiestry Filharmonia Dowcipu, która swym brawurowym wystêpem wprawi³a wszystkich w os³upienie, a z minuty na minutê zaskakiwa³a jeszcze bardziej, wzbudzaj¹c podziw i radosny œmiech. A wszystko to mimo braku szefa orkiestry, zagubionego gdzieœ na lotniskach Europy Po tak emocjonuj¹cym wystêpie zaproszeni mieli czas odpocz¹æ przy kolacji, ale tylko na chwilê, bo zaraz po niej ruszyli do tañca. Gdy schodzili z parkietu, by³o ju dawno po wschodzie s³oñca. Pani Dorota Lenczewska reprezentująca Szpital Psychiatryczny im. Dr St. Deresza odebrała Nagrodę Srebrnego Klienta w kategorii nabywca odczynników biochemicznych AKTUALNOŚCI Naszym Złotym Klientem w kategorii nabywca odczynników biochemicznych został EMC Instytut Medyczny S.A. Nagrodę odebrał Pan Zbigniew Nyczka Filharmonia Dowcipu Prezent dla Tadeusza Tuora od Pani Violetty Bartczak z Kalisza (NZOZ Centrolab) Gala Dinner Szalona wiolonczelistka Filharmonia Dowcipu Filharmonia Dowcipu Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 56 DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE Metabolity proleki: Implikacje dla terapeutycznego monitorowania leków Proleki są analogami aktywnych form leków, opracowanymi specjalnie w celu poprawienia przyswajalności i/lub tolerancji właściwej, aktywnej postaci leku. i mykofenolan mofetylu Fosfenytoina1 (MMF) 2 to dwa przyk³ady proleków, w przypadku których leczenie jest prowadzone na podstawie monitorowania stê enia aktywnej formy leku, czyli odpowiednio leku przeciwpadaczkowego fenytoiny oraz leku immunosupresyjnego kwasu mykofenolowego (MPA). Warunkiem udanego zastosowania metodologii terapeutycznego monitorowania leków w przypadku proleków jest pewna i sprawdzona metodyka analityczna, która w ogólnoœci powinna byæ swoista w stosunku do aktywnej formy leku oraz dawaæ wyniki odpowiednio szybko, dziêki czemu klinicysta mo e w razie koniecznoœci odpowiednio zmieniæ dawkê podawanego preparatu. Chocia metodologie wykorzystuj¹ce HPLC s¹ najbardziej swoistymi procedurami umo liwiaj¹cymi oznaczanie stê enia leków, testy immunochemiczne s¹ z kolei szybsze; mog¹ one jednak ulegaæ zak³óceniom spowodowanym zachodzeniem reakcji krzy owych z udzia³em zwi¹zków chemicznych o podobnej strukturze (np. proleków i metabolitów leków). Problem ten czêsto nasila siê w przypadku pacjentów z dysfunkcj¹ w¹troby lub niewydolnoœci¹ nerek z racji znacznie nasilonej akumulacji metabolitów leku w organizmie. Wykorzystywanie proleków ma nastêpuj¹ce implikacje dla terapeutycznego monitorowania leków: same proleki mog¹ ulegaæ reakcjom krzy- owym w testach immunochemicznych, a tym samym mog¹ komplikowaæ uzyskiwane dane farmakokinetyczne oraz ich interpretacjê kliniczn¹, proleki mog¹ byæ metabolizowane niezale nie od aktywnej formy leku, a powstaj¹ce metabolity mog¹ podlegaæ reakcjom krzy owym w testach immunochemicznych ukierunkowanych na aktywn¹ postaæ leku, z punktu widzenia farmakodynamiki, konieczna jest znajomoœæ udzia³u w ogólnej aktywnoœci farmakologicznej przez prolek, aktywn¹ formê leku oraz metabolity leku. W niniejszym numerze czasopisma Clinical Chemistry, Annesley i wsp. 3 donosz¹ o izolacji i scharakteryzowaniu nowego, oksymetyloglukuronidowego metabolitu fosfenytoiny, bêd¹cej prolekiem fenytoiny. Obecnoœæ tego metabolitu stwierdzono w osoczu pacjentów z mocznic¹, którym podawano fosfenytoinê. Fenytoina jest podstawowym lekiem przeciwpadaczkowym, stosowanym w profilaktyce uogólnionych napadów kloniczno-tonicznych oraz napadów czêœciowych. Z powodu niskiego wskaÿnika terapeutycznego tego leku, wykazuj¹cego nieliniow¹ kinetykê eliminacji oraz efektów niepo- ¹danych zale nych od stê enia leku, w tym przypadku zaleca siê monitorowanie stê enia fenytoiny w osoczu krwi, stanowi¹cego wskazówkê umo liwiaj¹c¹ podawanie pacjentom indywidualnie dobranych dawek. Innym aspektem, jaki nale y wzi¹æ pod uwagê podczas terapeutycznego monitorowania fenytoiny jest fakt, i substancja ta wystêpuje w organizmie g³ównie w postaci zwi¹zanej z bia³kami (> 90 proc.). Stany hipoalbuminemii, zmienione wi¹zanie siê leków z bia³kami (np. mocznica) lub obecnoœæ innych substancji egzogennych mog¹cych wypieraæ fenytoinê z jej miejsc wi¹ ¹cych w cz¹steczkach bia³ek mog¹ powodowaæ wzrost udzia³u frakcji wolnej fenytoiny. Poniewa aktywnoœæ farmakologiczn¹ wykazuje wy³¹cznie niezwi¹zana postaæ leku, w przypadku wystêpowania u pacjenta któregokolwiek spoœród wymienionych powy ej stanów, u yteczn¹ metod¹ jest pomiar stê enia wolnej postaci leku. Fosfenytoina jest estrem fosforanowym i prolekiem fenytoiny, charakteryzuj¹cym siê lepsz¹ od fenytoiny rozpuszczalnoœci¹ oraz lepsz¹ tolerancj¹ w przypadku podania leku drog¹ domiêœniow¹ lub do yln¹. W warunkach in vivo substancja ta szybko ulega hydrolizie do fenytoiny, z okresem pó³trwania równym 5 15 minut. Prolek ten nie jest substancj¹ aktywn¹ farmakologicznie, wykazano jednak, i ulega on reakcjom krzy owym w ró - nych testach immunochemicznych przeznaczonych do oznaczania fenytoiny. Zaleca siê zatem, aby nie monitorowaæ stê enia fenytoiny przy u yciu potencjalnie nieswoistych metod immunochemicznych przez co najmniej dwie godziny od momentu podania fosfenytoiny drog¹ do yln¹ lub przez co najmniej cztery godziny w przypadku domiêœniowego podania fosfenytoiny 4. Fenytoina jest eliminowana z organizmu g³ównie na drodze biotransformacji do kilku nieaktywnych, hydroksylowanych metabolitów. Niektóre spoœród tych metabolitów, w szczególnoœci 5-(p-hydroksyfenylo)-5-fenylohydantoina (HPPH) s¹ dalej metabolizowane na drodze reakcji sprzêgania z kwasem glukuronowym. U pacjentów z niewydolnoœci¹ nerek dochodzi do akumulacji metabolitów, a zw³aszcza produktu reakcji sprzêgania glukuronidu HPPH (HPPH-G). Niektóre spoœród starszych testów immunochemicznych umo liwiaj¹cych wykrywanie fenytoiny dawa³y b³êdne, zbyt wysokie wyniki oznaczenia stê enia jawnej fenytoiny u pacjentów z niewydolnoœci¹ nerek, co by³o spowodowane zachodzeniem reakcji krzy owej z HPPH-G. Owo przesuniêcie wartoœci otrzymywanych wyników by³o jeszcze wyraÿniej widoczne w przypadku oznaczeñ stê enia wolnej fenytoiny, poniewa HPPH-G wi¹- e siê z bia³kami osocza krwi silniej ni fenytoina. Wiêkszoœæ nowszych testów umo liwiaj¹cych oznaczanie fenytoiny nie wykazuje jednak znacz¹cej reaktywnoœci krzy owej z HPPH-G 5, 6. Dysponuj¹c przedstawion¹ powy ej wiedz¹, Roberts i wsp. 6 zbadali dok³adnoœæ ró - nych testów immunochemicznych, przeznaczonych do monitorowania stê eñ fenytoiny u pacjentów z niewydolnoœci¹ nerek, leczonych fosfenytoin¹. Poza jednym wyj¹tkiem, wszystkie zbadane testy immunochemiczne da³y zafa³szowane, zbyt wysokie wyniki oznaczeñ stê enia fenytoiny, przekraczaj¹ce nawet dwudziestokrotnie wyniki uzyskiwane metod¹ HPLC. Czu³a metoda HPLC wykorzystana w tych badaniach nie wykaza³a obecnoœci fosfenytoiny w adnej z badanych próbek, co pozwoli³o na wyeliminowanie proleku z grupy potencjalnych przyczyn obserwowanych niezgodnoœci. Autorzy przedstawili uzasadnienie, zgodnie z którym powodem przesuniêcia war- 6 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY7 toœci wyników musi byæ nieznany dotychczas metabolit lub addukt fenytoiny, mog¹cy gromadziæ siê w organizmie w przypadku niewydolnoœci nerek. Kulminacjê przeprowadzonych póÿniej badañ stanowi aktualne doniesienie 3, przedstawiaj¹ce przekonuj¹cy dowód pozwalaj¹cy okreœliæ strukturê tego nowego, immunoreaktywnego metabolitu, wywodz¹cego siê od fosfenytoiny. Zgodnie ze stanem naszej wiedzy, jest to pierwsza reakcja bezpoœredniej glukuronidacji centrum aktywnego proleku. Bez odpowiedzi pozostaje wci¹ pytanie, czy metabolit ten posiada aktywnoœæ farmakologiczn¹. Robert i wsp. 6 donosili, e w przypadku czterech spoœród siedmiu badanych pacjentów zmniejszono dawki podawanej fosfenytoiny w odpowiedzi na fa³szywe, zbyt wysokie wyniki oznaczeñ stê enia wolnej fenytoiny we krwi. Poniewa aktywnoœæ farmakologiczna oksymetyloglukuronidowego metabolitu pozostaje nieznana, obecnie trudno jest stwierdziæ, czy tego rodzaju zmiana dawki podawanego pacjentom leku jest rzeczywiœcie uzasadniona. Aby mo na by³o udzieliæ jednoznacznej odpowiedzi, konieczne bêdzie zsyntezowanie odpowiedniej iloœci materia³u, umo liwiaj¹cej przeprowadzenie stosownych badañ. Biotransformacje leków prowadz¹ na ogó³ do powstawania metabolitów o zmniejszonej aktywnoœci farmakologicznej lub pozbawionych takiej aktywnoœci. Istniej¹ jednak wyj¹tki od tej regu³y. Morfino-6-glukuronid jest metabolitem morfiny maj¹cym dzia³anie przeciwbólowe, w przeciwieñstwie do 3-glukuronidu morfiny 7. Niedawno wydzielono i scharakteryzowano glukuronidowy produkt sprzêgania MPA, a nastêpnie stwierdzono, i posiada on aktywnoœæ farmakologiczn¹ 8, 9. Jego przeciwieñstwem jest natomiast g³ówny metabolit MPA, fenolowy glukuronid, nie posiadaj¹cy aktywnoœci farmakologicznej. Istniej¹ pewne interesuj¹ce i dostarczaj¹ce wielu informacji zbie noœci pomiêdzy identyfikacj¹ acyloglukuronidu MPA oraz odkryciem oksymetyloglukuronidowego metabolitu fosfofenytoiny, opisanym przez Annesley i wsp. 3. MPA podaje siê pacjentom w postaci proleku MMF, morfolinoetylowego estru MPA. MMF jest szybko hydrolizowany przez esterazy tkanek i osocza krwi do postaci czynnej leku MPA i na ogó³ nie mo - na stwierdziæ jego obecnoœci w osoczu krwi po podaniu leku drog¹ doustn¹. Analogicznie do fosfenytoiny, MMF wykazuje siln¹ reaktywnoœæ krzy ow¹ w teœcie immunochemicznym umo liwiaj¹cym oznaczenie stê enia aktywnej formy leku MPA, a jego obecnoœæ mo na stwierdziæ w osoczu krwi podczas oraz bezpoœrednio po zakoñczeniu infuzji do ylnej preparatu MMF. Podobnie, jak mia³o to miejsce w trakcie badañ przeprowadzonych przez Annesley i wspó³pracowników 3, 4, 6, pierwsza identyfikacja obecnoœci nowego metabolitu by³a wynikiem obserwacji przesuniêcia wartoœci wyników oznaczeñ miêdzy metod¹ wykorzystuj¹c¹ test immunochemiczny oraz procedur¹ HPLC, swoist¹ dla macierzystej postaci leku 7. Jednak e, w przeciwieñstwie do nowego metabolitu fenytoiny, acyloglukuronid MPA jest metabolitem aktywnej postaci leku. W przeprowadzonym nastêpnie badaniu stwierdzono, i metody immunochemiczne oraz HPLC dawa³y porównywalne wyniki w odniesieniu do oceny ryzyka ostrego odrzucenia przeszczepów u pacjentów pediatrycznych 10. W przypadku metody immunochemicznej zastosowano jednak silniejsze kryteria odcinaj¹ce wartoœci dla stê eñ MPA przed podaniem kolejnej dawki oraz dla pola pod krzyw¹ zale noœci stê enia od czasu. W tym przypadku, przesuniêcie wartoœci wyników spowodowane siln¹ sk³onnoœci¹ acyloglukuronidu do ulegania reakcji krzy owej podczas testu immunochemicznego najprawdopodobniej nie wp³ywa³o na zdolnoœæ predykcyjn¹ testu. Postulowano, i procedury umo liwiaj¹ce oznaczanie leku macierzystego oraz jego metabolitów proporcjonalnie do ich aktywnoœci biologicznej powinny byæ lepsze od testów immunochemicznych, w przypadku których odpowiedÿ nie odzwierciedla aktywnoœci biologicznej. Miller i wsp. 11 porównali wyniki uzyskane dla czterech dostêpnych na rynku testów immunochemicznych s³u ¹cych do oznaczania digoksyny z aktywnoœci¹ biologiczn¹ digoksyny oraz jej metabolitów, okreœlon¹ przy pomocy testu wykorzystuj¹cego DIAGNOSTYKA NA ŚWIECIE receptory ludzkiego miêœnia sercowego. Digoksyna ulega procesom metabolicznym, w wyniku których powstaj¹ ró ne, deglikanowane, zredukowane i polarne metabolity, posiadaj¹ce szerokie spektrum aktywnoœci biologicznej. Tylko jeden z testów poddanych badaniu okaza³ siê dawaæ wyniki wykazuj¹ce dobr¹ korelacjê z odpowiedzi¹ uzyskan¹ w teœcie wykorzystuj¹cym receptory. Przedstawione badania podkreœlaj¹ znaczenie œledzenia i analizowania nieoczekiwanych rozbie noœci pomiêdzy ró nymi metodami analitycznymi. Zgodnie z powy sz¹ dyskusj¹, dodatkowa reaktywnoœæ krzy owa metabolitów leku w testach immunochemicznych mo e prowadziæ do uzyskiwania zafa³szowanych, zbyt wysokich wyników oznaczeñ stê- eñ leków lub w niektórych przypadkach mog¹ one znacznie lepiej odzwierciedlaæ ca³kowit¹ aktywnoœæ farmakologiczn¹. Badania przeprowadzone przez Annesley i wsp. 3 powinny zaalarmowaæ i poinformowaæ pracowników maj¹cych do czynienia z tego typu oznaczeniami, e istniej¹ alternatywne szlaki metaboliczne, w których uczestnicz¹ proleki, mog¹ce mieæ potencjalne konsekwencje analityczne i farmakodynamiczne. Michael Oellerich* Victor V. Armstrong Department of Clinical Chemistry Georg-August University Robert-Koch-Strasse 40 D Göttingen *Autor bêd¹cy osob¹ do korespondencji. Faks ; Piśmiennictwo: 1. DeToledo J. C., Ramsay R. E., Fosphenytoin and phenytoin in patients with status epilepticus: improved tolerability versus increased costs. Drug. Saf. 2000; 22: Oellerich M., Shipkova M., Schutz E., Wieland E., Weber L., Tonshoff B., Armstrong V. W.. Pharmacokinetic and metabolic investigations of mycophenolic acid in pediatric patients after renal transplantation: Implications for therapeutic drug monitoring, German Study Group on Mycophenolate Mofetil Therapy in Pediatric Renal Transplant Recipients. Ther. Drug. Monit. 2000; 22: Annesley T. M., Kurzyniec S., Nordblom G. D., Buchanan N., Pool W., Reily M. et al., Glucuronidation of prodrug reactive site: Isolation and characterisation of oxymethylglucuronide metabolite of fosphenytoin. Clin. Chem. 2001; 47: Kugler A. R., Annesley T. M., Nordblom G. D., Koup J. R., Olson G. C., Cross-reactivity of fosphenytoin in two human plasma phenytoin immunoassays, Clin. Chem. 1998; 44: Rainey P. M., Rogers K. E., Roberts W. L. Metabolite and matrix interference in phenytoin immunoassays. Clin. Chem. 1996; 42: Roberts W. L., De B. K., Coleman J. P., Annesley T. M. Falsely increased immunoassay measurements of total and unbound phenytoin in critically ill uremic patients receiving fosphenytoin. Clin. Chem. 1999; 45: Buetler T. M., Wilder-Smith O. H., Wilder-Smith C. H., Aebi S., Cerny T., Brenneisen R., Analgesic action of i. v. morphine-6-glucuronide in healthy volunteers. Br. J. Anaesth. 2000; 84: Shipkova M., Armstrong V. W., Wieland E., Niedmann P. D., Schutz E., Brenner- -Weiss G., et al. Identification of glucose and carboxyl-linked glucuronide conjugates of mycophenolic acid in plasma of transplant recipients treated with mycophenolate mofetil. Br. J. Pharmacol. 1999; 126: Schutz E., Shipkova M., Armstrong V. W., Wieland E., Oellerich M. Identification of a pharmacologially active metabolite of mycophenolic acid in plasma of transplant recipients treated with mycophenolate mofetil. Clin. Chem. 1999; 45: Armstrong V. W., Shipkova M., Schulz E., Weber L., Tönshoff B., Oellerich M. Monitoring of mycophenolic acid in pediatric transplant recipients. Transplant. Proc. 2001: 33, in press. 11. Miller J. J., Straub R. W., Valdes R., Digoxin immunoassay with cross-reactivity of digoxin metabolites proportional to their biological activity. Clin. Chem. 1994; 40: Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 78 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Glukuronidacja centrum aktywnego proleku: Izolacja i charakterystyka oksymetyloglukuronidu powstającego z fosfenytoiny znaczenie w chemii klinicznej Opis badania podjętego w celu określenia struktury nowego, immunoreaktywnego metabolitu fosfenytoiny, odnośnie którego stawiano dawniej hipotezy, iż jest on obecny jako prolek w surowicy krwi pacjentów otrzymujących fosfenytoinę. Clinical Chemistry 47:5; (2001) Thomas M. Annesley*, Stephen Kurzyniec**, Gerald D. Nordblom**, Nathan Buchanan**, William Pool**, Michael Reily**, Rasmy Talaat** i William L. Roberts*** Metody: Metabolit izolowano z surowicy krwi pacjentów z mocznic¹ przy u yciu ekstrakcji do fazy sta³ej oraz HPLC. Analizê strukturaln¹ przeprowadzono przy u yciu metod HPLC i tandemowej spektrometrii masowej, magnetycznego rezonansu j¹drowego (NMR), wymiany deuterowej oraz derywatyzacji chemicznej. Immunoreaktywnoœæ okreœlano przy u yciu metody immunofluorescencyjno-polaryzacyjnej. Wyniki: Metabolit wykaza³ w widmie masowym obecnoœæ jonu macierzystego o wartoœci m/z=457 w trybie jonów ujemnych ulegaj¹cego fragmentacji, daj¹c pik przy wartoœci m/z=251, charakterystyczny dla fenytoiny oraz inne fragmenty fenytoiny. W widmie obecne by³y równie fragmenty zwi¹zane z kwasem glukuronowym. Pik chromatograficzny odpowiadaj¹cy temu metabolitowi wykazywa³ immunoreaktywnoœæ wystarczaj¹c¹ do powodowania fa³szywie podwy szonych wyników immunochemicznych oznaczeñ fenytoiny. Obserwowana w badaniu immunoreaktywnoœæ by³a ponadto proporcjonalna do wzglêdnego stê enia metabolitu w zebranych frakcjach. Analiza przu u yciu NMR wykaza³a obecnoœæ grup fenylowych z przesuniêciami chemicznymi identycznymi z przesuniêciami w fenytoinie, jak równie obecnoœæ w cz¹steczce mostka metylenowego, zgodnego z takim samym mostkiem metylenowym w cz¹steczce estru fosforanowego fenytoiny. Analiza porównawcza próbek surowicy pobranych od pacjentów z upoœledzon¹ czynnoœci¹ nerek otrzymuj¹cych fenytoinê lub fosfenytoinê z wykorzystaniem wielu reakcji monitoruj¹cych kwantyfikacjê wykaza³a, e obecnoœæ tego metabolitu jest zwi¹zana z przyjmowaniem fosfenytoiny. Wnioski: Unikalny metabolit, oksymetyloglukuronid powstaj¹cy z fosfenytoiny wyizolowano z surowicy krwi otrzymuj¹cych ten prolek pacjentów z mocznic¹ American Association for Clinical Chemistry G³ównym problemem zwi¹zanym ze stosowaniem wielu klas leków jest bezpieczne i efektywne dostarczenie œrodka do ¹danego miejsca jego dzia³ania. W niektórych przypadkach aktywne formy leków s³abo wch³aniaj¹ siê po przyjêciu drog¹ doustn¹, co powoduje, i maj¹ one zmienn¹ dostêpnoœæ biologiczn¹. W innych przypadkach, aktywne formy leków s¹ nierozpuszczalne w œrodowiskach wodnych, a tym samym nie mog¹ byæ one stosowane jako efektywnie dzia³aj¹ce œrodki, podawane do ylnie lub domiêœniowo w stanach pilnych. Niektóre leki mog¹ byæ szybko metabolizowane i tym samym nie pozostaj¹ w uk³adzie kr¹ enia na tyle d³ugo, aby gromadziæ siê w ¹danym miejscu dzia³ania. Koncepcja tworzenia proleków powsta- ³a jako rozwi¹zanie wymienionych powy ej problemów. Prolek jest strukturalnym analogiem lub pochodn¹ ¹danej aktywnej formy leku, nadaj¹cym temu zwi¹zkowi w³aœciwoœci u³atwiaj¹ce uwalnianie, poprawiaj¹ce farmakokinetykê leku lub jego dzia³anie. Przyk³ady zwi¹zków wprowadzonych w ostatnim czasie na rynek obejmuj¹ formy prolekowe antagonistów czynników aktywuj¹cych p³ytki krwi 1, przeciwwirusowe leki analogi nukleozydów 2, œrodki cytoprotekcyjne 3, pochodne przeciwnowotworowe 4 6, leki neuroprotekcyjne 7 oraz leki przeciw wirusowi grypy 8. Jedn¹ z metod zwiêkszania rozpuszczalnoœci w wodzie leków zawieraj¹cych w cz¹steczkach grupy hydroksylowe, lub leków, w cz¹steczkach których mo liwe jest przy³¹czenie grupy hydroksylowej do mostka chemicznego, jest przy³¹czenie do cz¹steczki reszty fosforanowej 6, 9, 10. Fosfenytoina (rys. 1) jest estrem fosforanowym i prolekiem fenytoiny, zapewniaj¹cym bardziej efektywne dzia³anie leku oraz wiêksze bezpieczeñstwo w przypadku podawania leku drog¹ do yln¹ lub domiêœniow¹ 11. W przypadku uk³adowego podania leku, reszta fosforanowa cz¹steczki fosfenytoiny zostaje szybko odszczepiona 12, co prowadzi do utworzenia nietrwa³ego produktu poœredniego, który rozpada siê z utworzeniem cz¹steczki formaldehydu oraz aktywnej formy leku fenytoiny. Zachodz¹ce nastêpnie procesy meta- 8 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY9 boliczne oraz klirens nerkowy powinny przebiegaæ zgodnie ze szlakami hydroksylowania i sprzêgania, znanymi dla fenytoiny. W opublikowanym niedawno doniesieniu 13 przedstawiono dane, bêd¹ce poparciem hipotezy o istnieniu wyj¹tkowego metabolitu fosfenytoiny, wykrytego u pacjentów z upoœledzon¹ funkcj¹ nerek, przyjmuj¹cych fosfenytoinê. Ten postulowany metabolit wykazywa³ znacz¹c¹ reaktywnoœæ krzy ow¹ w licznych, dostêpnych na rynku testach immunochemicznych s³u ¹cych do oznaczania fenytoiny, wiod¹c do fa³szywie zwiêkszonych wyników oznaczeñ. W niniejszym badaniu potwierdziliœmy istnienie nowego metabolitu fosfenytoiny. Uda³o nam siê wstêpnie zidentyfikowaæ przy u yciu gradientowej HPLC w odwróconych fazach i tandemowej spektrometrii masowej (HPLC- -MS-MS) **** zwi¹zek wykazuj¹cy w widmie masowym jon fenytoiny o wartoœci m/z=251 oraz jon cz¹steczkowy o wartoœci m/z=457. Metabolit ten nastêpnie izolowano i scharakteryzowano przy pomocy derywatyzacji chemicznej, HPLC, MS-MS, dok³adnej analizy masy cz¹steczkowej, wymiany izotopowej oraz spektroskopii magnetycznego rezonansu j¹drowego (NMR). Metabolit ten jest zwi¹zkiem immunoreaktywnym w najpowszechniej stosowanym teœcie immunochemicznym do monitorowania stê enia fenytoiny, zaœ jego strukturê zidentyfikowano jako N-3 -oksymetyloglukuronid fenytoiny. Zgodnie ze stanem naszej wiedzy, badania te przedstawiaj¹ równie pierwszy przypadek reakcji bezpoœredniej glukuronidacji centrum reaktywnego cz¹steczki proleku. MATERIA Y I METODY PRÓBKI SUROWICY Próbki surowicy wykorzystane do izolacji i scharakteryzowania metabolitów fosfenytoiny, pochodz¹ce od pacjentów z mocznic¹ przyjmuj¹cych fosfenytoinê, by³y tymi samymi próbkami, co próbki stosowane w badaniu zatwierdzonym przez Institutional Review Board 13. Analizy prowadzone metod¹ HPLC 14 potwierdzi³y, i próbki te nie zawiera³y fosfenytoiny, która mog³aby przyczyniaæ siê do reaktywnoœci krzy owej przypisywanej nowemu metabolitowi fosfenytoiny 15. Surowicê pacjentów z mocznic¹ przyjmuj¹cych fosfenytoinê uzyskano z próbek krwi wykorzystywanych w innym, zatwierdzonym badaniu 16. Rys. 1. Struktura fosfenytoiny LEKI I ODCZYNNIKI Fenytoinê, 5-(p-hydroksyfenylo)-5-fenylohydantoinê (HPPH) oraz N-3 -hydroksymetylofenytoinê otrzymano z firmy Pfizer Pharmaceutical. Fenytoino-N-glukuronid oraz HPPH-glukuronid zsyntezowano zgodnie z opisem zamieszczonym we wczeœniejszej publikacji 17. Odczynniki fenytoina TDx oraz wolna fenytoina zakupiono w firmie Abbott Laboratories i stosowano je zgodnie z zaleceniami producenta. Odczynnik metyluj¹cy BF3-metanol zakupiono w firmie Pierce Chemical. Acetonitryl zakupiono w firmie Mallinckbrodt. Rozpuszczalniki deuterowane nabyto od Cambridge Isotope Laboratories Inc. Kolumny ekstrakcyjne 1 ml Oasis HLB zakupiono w firmie Waters Corporation. OCZYSZCZANIE METABOLITU Z SUROWICY Dwie porcje pulowanej surowicy pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fosfenytoinê 14, o objêtoœci 1 ml umieszczono w oddzielnych probówkach z polipropylenu. Do ka dej z probówek dodano acetonitryl (4 ml), ca³oœæ intensywnie wstrz¹saj¹c przez 60 sekund. Probówki odwirowano i acetonitrylowe nads¹cze uzyskane w obydwu probówkach po³¹czono, a rozpuszczalnik odparowano, przenosz¹c nads¹cz niewielkimi porcjami w atmosferze azotu do probówki polipropylenowej o objêtoœci 1,5 ml, przeznaczonej do mikroodwirowywania. Zawartoœæ probówki do mikroodwirowywania rozpuszczono w 100 μl metanolu, ca³oœæ wytrz¹sano, po czym dodano 1 ml wody i ponownie wytrz¹sano. Uzyskan¹ ciecz przeniesiono na kolumnê ekstrakcyjn¹ Oasis 30 mg, któr¹ uprzednio aktywowano przy pomocy 100 μl metanolu i przemyto wod¹. Kolumnê przemywano 300 μl mieszaniny woda-acetonitryl (95:5 czêœci objêtoœciowych). Metabolity fenytoiny eluowano z kolumny czterema porcjami mieszaniny woda- -acetonitryl (80:20 czêœci objêtoœciowych). Poszczególne eluaty poddawano analizie jakoœciowej w kierunku obecnoœci metabolitu o wartoœci stosunku masy do ³adunku m/z=457 przy pomocy autosamplera Perkin- -Elmer Series 200 oraz pompy, pod³¹czonych do tandemowego spektrometru masowego Micromass Quattro Ultima. Frakcje zawieraj¹ce metabolit po³¹czono i odparowano rozpuszczalniki w atmosferze azotu. Zebrane frakcje, poddane ekstrakcji do fazy sta³ej, zawieraj¹ce metabolit, rozpuszczono w mieszaninie metanol-woda (10:90 czêœci objêtoœciowych), po czym izolowano chromatograficznie zwi¹zek o wartoœci m/z=457, stosuj¹c kolumnê 2,1 x 150 mm Zorbax RX-C18 z faz¹ ruchom¹ acetonitryl 1 ml/l roztwór kwasu L-mlekowego w wodzie (22:78 czêœci objêtoœciowych), przy szybkoœci przep³ywu fazy ruchomej równej 0,3 ml/min. Frakcje (1 min; 0,3 ml) zbierano do mikrowirówkowych probówek z polipropylenu o pojemnoœci 1,5 ml i poddawano analizie metod¹ MS- DIAGNOSTYKA POD LUPĄ -MS na obecnoœæ fenytoiny, HPPH, HPPH- -glukuronidu, fenytoino-n-glukuronidu oraz metabolitu fosfenytoiny. Fenytoino-N-glukuronid oraz HPPH-glukuronid analizowano w trybie jonów dodatnich z racji lepszej odpowiedzi analitycznej, zaœ pozosta³e zwi¹zki analizowano w trybie jonów ujemnych, z tego samego powodu. Frakcje zawieraj¹ce metabolit fosfenytoiny zebrano, odparowano i rozpuszczono w niewielkiej iloœci mieszaniny metanol- -woda (10:90 czêœci objêtoœciowych). Dalsze oczyszczanie prowadzono przy u yciu kolumny 2,0 x 100 mm Betamax Acid, stosuj¹c fazê ruchom¹ acetonitryl 1 ml/l roztwór kwasu L-mlekowego w wodzie z dodatkiem wodnego rozwtoru 10 mmol/l octanu amonu (85:15 czêœci objêtoœciowych), dla szybkoœci przep³ywu fazy równej 0,3 ml/min. Podobnie jak opisywano to wczeœniej, zbierano frakcje przez 1 minutê ka da, po³¹czono je i poddano analizie metod¹ MS-MS. Frakcje zawieraj¹ce metabolit po³¹czono i odparowano. W celu usuniêcia resztek octanu amonu przeprowadzono ostateczn¹ ekstrakcjê do fazy sta³ej, podobn¹ do opisanej powy ej w tekœcie. REAKTYWNOŒÆ W TESTACH IMMUNOCHEMICZNYCH Podczas rozdzia³u chromatograficznego i oczyszczania metabolitu fosfenytoiny o wartoœci m/z=457, zbierane przez 1 minutê frakcje poddano analizie przy u yciu immunofluorescencyjno-polaryzacyjnej metody (FPIA, Tdx) oznaczania wolnej fenytoiny. Porcje ka dego z eluatów o objêtoœci 150 μl umieszczono w polipropyenowej probówce do mikroodwirowywania i odparowywano w atmosferze azotu w celu usuniêcia fazy ruchomej zawieraj¹cej acetonitryl. Po odparowaniu fazy ruchomej, do probówek zawieraj¹ce such¹ pozosta³oœæ dodawano 150 μl wodnego roztworu NaCl o stê eniu 9 g/l, wytrz¹sano i analizowano przy u yciu aparatu TDx. DOK ADNA ANALIZA MASOWA Dok³adn¹ analizê masow¹ przeprowadzono przy u yciu spektrometru masowego czasu przelotu Mariner (PE Biosystems). Przyrz¹d wyregulowano i wykalibrowano na HPPH-glukuronid oraz fenytoino-n-glukuronid. Próbki nastrzykiwano bezpoœrednio, przy pomocy strzykawek. Do okreœlenia sk³adu cz¹steczek u yto oprogramowania Masslynx, wersja 3.3. ANALIZA NMR Dane NMR uzyskano przy u yciu spektrometru Varian Inova 600 HPLC-NMR oraz programu VNMR 6.1B, spektrometr ten by³ wyposa ony w komorê przep³ywow¹ 1 H-[ 15 N, 13 C] o aktywnej objêtoœci 60 μl, po- ³¹czon¹ szeregowo z pojedynczym, kwadrupolowym spektrometrem masowym Waters ZMD. Aby z³agodziæ wp³yw zanieczyszczeñ egzogennych, metabolit o wartoœci m/z=457 wydzielono metod¹ HPLC w celu Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 910 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ przeprowadzenia analizy NMR w trybie online, na kolumnie Zorbax XDB-C8 (2,1 mm x 15 cm), po³¹czonej szeregowo z kolumn¹ zabezpieczaj¹c¹ Upchurch Uptight (Upchurch Scientific) z wype³nieniem b³onkowatym C18 (rozmiar cz¹stek 40 μm). Rozdzielenie przeprowadzono przy u yciu fazy ruchomej o sk³adzie: roztwór kwasu deuterooctowego (1 ml/l) w ciê kiej wodzie-deuteroacetonitrylu (80:20 czêœci objêtoœciowych; szybkoœæ przep³ywu: 0,3 ml/minutê). Pik odpowiadaj¹cy metabolitowi monitorowano przy wartoœci m/z=461 (w trybie jonów ujemnych, cztery protony ulegaj¹ce wymianie na 2 H). Dane NMR zbierano dla szczytu piku. Widma 1D NMR wygenerowano przy u yciu szybkiej transformacji Fouriera swobodnego zaniku indukcji, równej sumie przejœæ. Ka - de z przejœæ indukowano przy u yciu nieselektywnego pulsu 90 o 1 H w po³¹czeniu z selektywnym pulsem wstêpnego nasycenia, wysy³anym do rezonansu HDO podczas zaniku relaksacji. Powstaj¹cy, uœredniony po czasie swobodny zanik indukcji mno ono przez wyk³adnicz¹ funkcjê zaniku (poszerzenie linii, czêstotliwoœæ 3 Hz), co mia³o na celu zwiêkszenie wartoœci stosunku sygna³u do szumu. POMIAR STÊ ENIA METABOLITU W SUROWICY KRWI Wzglêdne iloœci metabolitu oznaczano w surowicy krwi 12 pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fosfenytoinê oraz od 12 pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fenytoinê. Surowica pacjentów z mocznic¹ (3 μl), po³¹czone z surowica osoby zdrowej (10 μl) w celu zwiêkszenia mieszanej objêtoœci, umieszczono w polipropylenowej probówce do mikrowirowywania. Nastêpnie, do próbki dodano 300 μl acetonitrylu, ca³oœæ energicznie wstrz¹saj¹c przez 30 sekund. Po zakoñczeniu trwaj¹cego 5 minut wirowywania, nads¹cz acetonitrylowy przeniesiono do kolejnej probówki o pojemnoœci 0,5 ml i odparowano do sucha w atmosferze azotu. Pozosta³oœæ zalano 5 μl metanolu, wytrz¹sano, a nastêpnie dodano 45 μl wody, uzyskuj¹c ³¹czn¹ objêtoœæ próbki równ¹ 50 μl. Po zakoñczeniu wytrz¹sania próbki, jej zawartoœæ przeniesiono do szklanej ampu³ki, a 10 μl próbki analizowano przy pomocy metody HPLC-MS-MS. Analizê chromatograficzn¹ wykonano na kolumnie 2,1 x 150 mm Zorbax RX-C18, zaœ jako fazê ruchom¹ stosowano uk³ad acetonitryl-roztwór kwasu octowego w wodzie o stê eniu 1ml/l (15:85 czêœci objêtoœciowych), przy szybkoœci przep³ywu równej 0,3 ml/minutê. Zintegrowan¹ reakcjê metabolitu okreœlan¹ przez powierzchniê pod chromatogramem, oceniano w trybie jednoczesnego monitorowania kilku reakcji, œledz¹c przejœcie od m/z=457 do 193 przy u yciu tandemowego spektrometru masowego Micromass Quattro Ultima. BADANIA METOD WYMIANY DEUTEROWEJ Poszczególne roztwory (porcje o objêtoœci 50 μl) fenytoiny, HPPH, HPPH-glukuronidu, fenytoino-n-glukuronidu oraz oczyszczonego metabolitu fosfenytoiny inkubowano wraz z 200 μl ciê kiej wody przez godzinê, w temperaturze otoczenia. Po zakoñczeniu inkubacji pobierano próbki o objêtoœci 10 μl, które wstrzykiwano bezpoœrednio do spektrometru masowego Micromass Quattro Ultima przy u yciu autosamplera firmy Perkin-Elmer, stosuj¹c jako fazê ruchom¹ uk³ad acetonitryl-ciê ka woda (50:50 czêœci objêtoœciowych). Nie stosowano kolumny analitycznej, poniewa w tym przypadku nie by³o potrzebne przeprowadzanie rozdzia³u. METYLOWANIE GRUP KARBOKSYLOWYCH Roztwór (10 μl) zawieraj¹cy oczyszczony metabolit fosfenytoiny inkubowano przez ca³¹ noc z nadmiarem BF3 w metanolu. Nastêpnie mieszaninê odparowano, do pozosta³oœci dodawano roztwór metanolu o stê eniu 100 ml/l i nastrzykiwano na kolumnê Betamax Acid, stosuj¹c jako fazê ruchom¹ uk³ad acetonitryl-wodny roztwór kwasu octowego o stê- eniu 1 ml/l z dodatkiem wodnego roztworu octanu amonu o stê eniu 10 mmol/l (85:15 czêœci objêtoœciowych), dla szybkoœci przep³ywu roztworu 0,3 ml/minutê. WYNIKI ANALIZA MASOWA Analiza metabolitu fosfenytoiny przy u yciu metody dok³adnej analizy masowej wykaza³a obecnoœæ zwi¹zku charakteryzuj¹cego siê wartoœci¹ stosunku m/z=457,11 w trybie jonów ujemnych. Stosowano równie oprogramowanie Masslynx, umo liwiaj¹ce przewidywanie wzorów chemicznych i struktur zwi¹zków zgodnych z uzyskan¹ mas¹ cz¹steczkow¹. Fosfenytoina jest prolekiem i pochodn¹ fenytoiny, zak³adaliœmy zatem, i jej metabolit powinien posiadaæ w strukturze rdzeñ zbli ony do fenytoiny. Do oprogramowania okreœlaj¹cego sk³ad pierwiastkowy wprowadzono kryteria, umo liwiaj¹ce wykluczenie wzorów chemicznych, które nie odpowiada³yby strukturze zbli onej do cz¹steczki fenytoiny. Kryteria te by³y nastêpuj¹ce: (a) minimalna liczba atomów azotu, wêgla i wodoru; (b) równowa ników wi¹zañ podwójnych, poniewa cz¹steczka fenytoiny zawiera wiele wi¹zañ podwójnych; oraz (c) tolerancja masy równa 0,04 atomowej jednostki masy. Program okreœli³ na podstawie sk³adu Dokładną analizę masową przeprowadzono przy użyciu spektrometru masowego czasu przelotu Mariner (PE Biosystems) pierwiastkowego 67 wzorów cz¹steczek, spoœród których 7 mieœci³o siê w okreœlonym zakresie tolerancji. Jeden z wzorów, C22H21N2O9, by³ zgodny ze sk³adem pierwiastkowym przewidzianym na podstawie naszych badañ strukturalnych. Kompletne widmo masowe wyizolowanego metabolitu fosfenytoiny, uzyskane przy u yciu systemu Micromass Ultima MS-MS, przedstawiono na rys. 2. Jak widaæ na rys. 2, uzyskane widmo masowe ma kilka cech charakterystycznych: wartoœæ stosunku m/z=457 dla jonu macierzystego jest zgodna z dok³adn¹ mas¹ cz¹steczkow¹ zaobserwowan¹ podczas analizy przeprowadzonej przy u yciu przyrz¹du Mariner, mierz¹cego czas przelotu jonu. Ponadto, kilka mas jonów pochodnych mo na przypisaæ strukturze fenytoiny na podstawie porównania z widmem wzorcowym, otrzymanym dla fenytoiny przy u yciu tego samego, tandemowego spektrometru masowego. Do grupy tych jonów nale ¹ fragmenty o wartoœci m/z 251, 131, 103 i 77. Nie mo na wykazaæ, e fragmenty o wartoœci m/z równej 193, 175 i 113 s¹ produktami fragmentacji fenytoiny, ale mo na je przypisaæ jonowi macierzystemu oraz jonom pochodnym obserwowanym dla kwasu glukuronowego. CHROMATOGRAFIA W³aœciwoœci retencyjne w kilku ró nych warunkach chromatograficznych równie by³y zgodne z proponowan¹ struktur¹ metabolitu fosfenytoiny. W przypadku zastosowania konwencjonalnej chromatografii w uk³adzie faz odwróconych na kolumnie C18, metabolit wykaza³ krótszy czas retencji ni zwyk³e, glukuronidowe metabolity fenytoiny (<7 minut). Przeciwny wynik uzyskano dla fenytoiny, która by³a silniej zatrzymywana na kolumnie i charakteryzowa³a siê czasem retencji równym 14 minut. W³aœciwoœci retencyjne badano równie przy u yciu kolumny Betamax Acid. Kolumna ta wykorzystuje specjaln¹ grupê polarn¹, osadzon¹ w d³ugim ³añcuchu alkilowym, a struktura ta zosta³a zaprojektowana tak, aby uzyskaæ specjalne powinowactwo do karboksylowych grup kwasowych. Zgodnie z oczekiwaniami, fenytoina i HPPH oddzia³ywa³y s³abo z wype³nieniem kolumny. W przeciwieñstwie do nich, metabolit fosfenytoiny, HPPH-glukuronid oraz fenytoino-n-glukuronid wykaza³y siê silniejszym oddzia³ywaniem z wype³nieniem kolumny, mia³y one zatem równie d³u sze czasy retencji. Czasy retencji dla metabolitu fosfenyto- 10 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY11 iny i fenytoino-n-glukuronidu, posiadaj¹cych wolne, kwasowe grupy karboksylowe 18, 19, by³y bardzo zbli one do siebie; zwi¹zki te dawa³y równie piki ostatnich eluatów. IMMUNOREAKTYWNOŒÆ METABOLITU FOSFENYTOINY Na rys. 3 przedstawiono zale noœæ odpowiedzi uzyskanej w teœcie immunochemicznym od chromatograficznego czasu retencji dla próbek surowicy pobranych od jednego z pacjentów z mocznic¹ przyjmuj¹cych fosfenytoinê. Chromatograficzne czasy retencji wyd³u ono w celu zapewnienia maksymalnego mo liwego rozdzielenia sk³adników mieszaniny. Na rys. 3 przedstawiono równie czasy retencji dla ró nych pochodnych hydantoiny, co ilustruje fakt, i w naszych badaniach zaobserwowaliœmy dwa g³ówne piki chromatograficzne o mierzalnej immunoreaktywnoœci. Pierwszy pik (10 14 minut) zidentyfikowano jako fenytoinê, zaœ drugi pik (26 32 minuty) zidentyfikowano jako metabolit fosfenytoiny o wartoœci m/z=457. Obserwacja ta wskazuje, e metabolit fosfenytoiny wykazuje w tym konkretnym teœcie immunochemicznym daj¹c¹ siê ³atwo zaobserwowaæ reaktywnoœæ krzy ow¹. Na ró nych etapach procesu oczyszczania metabolitu z surowicy pacjenta z mocznic¹, jak równie w trakcie analizy acetonitrylowych osadów otrzymywanych z próbek surowicy, frakcje eluatu chromatograficznego zawieraj¹ce metabolit poddawano badaniom, których celem by³o wykazanie istnienia korelacji miêdzy wzglêdnym stê eniem metabolitu a stê eniem fenytoiny oznaczonym metod¹ immunochemiczn¹. Pomiêdzy zale noœciami tymi istnieje bezpoœrednia korelacja, potwierdzaj¹ca fakt, i metabolit rzeczywiœcie ulega reakcji krzy owej w teœcie immunochemicznym s³u- ¹cym do oznaczania stê enia fenytoiny, co ilustruje rys. 4. ANALIZA STRUKTURALNA NMR Dane NMR uzyskane dla metabolitu oraz dla dwóch zwi¹zków wzorcowych zosta³y przedstawione na rys. 5. Fenytoino-N-glukuronid (górne widmo) wykazywa³ w badaniu NMR dwie istotne cechy charakterystyczne. Dwa pierœcienie fenylowe wykazywa³y dwa oddzielne sygna³y rezonansowe obecne przy 7,3 i 7,4 ppm, podczas gdy reszta glukuronidowa dawa³a piêæ sygna³ów rezonansowych (1 5 ), zgodnych z faktem obecnoœci tego typu struktury wêglowodanowej. Analizê chromatograficzn¹ przeprowadzono na kolumnie Zorbax RX-C18 (2,1 x 150 mm), po³¹czonej szeregowo z kolumn¹ Betamax Acid (2,0 x 30 mm). Faza ruchoma: acetonitryl-wodny roztwór kwasu octowego (1ml/l) z dodatkiem wodnego roztworu octanu amonu (6 mmol/l) (82:18 czêœci objêtoœciowych), szybkoœæ przep³ywu: 0,3 ml/minutê; test immunochemiczny, p integracja MS-MS. W przypadku hydroksymetylofenytoiny (rys. 5, œrodkowe widmo), pierœcienie fenylowe równie wykazywa³y ten sam wzorzec sygna³ów rezonansowych, poniewa nie ulega³y one reakcji sprzêgania ani nie by³y modyfikowane w jakikolwiek inny sposób. Poniewa hydroksymetylofenytoina nie zawiera w cz¹steczce reszty glukuronidowej, w widmie nie zaobserwowano adnego z sygna- ³ów rezonansowych przypisywanych reszcie wêglowodanowej. Dodatkowa grupa - CH2 dawa³a jednak dodatkowy, przewidywany, singletowy sygna³ rezonansowy przy wartoœci 5,0 ppm (pik A). Wzór sygna³ów NMR dla metabolitu fosfenytoiny (rys. 5, dolne widmo) wykaza³ obecnoœæ sygna³ów zgodnych z obydwoma zwi¹zkami wzorcowymi. Sygna³y rezonansowe dwóch pierœcieni fenylowych s¹ zgodne z obserwowanymi poprzednio i mo na je zaobserwowaæ przy wartoœciach 7,3 i 7,4 ppm, co pokazuje, e miejsce, w którym zachodzi reakcja sprzêgania w cz¹steczce, nie znajduje siê w adnym z pierœcieni fenylowych. Sygna³y rezonansowe 1 5 obecne w zakresie pomiêdzy 3,0 i 4,5 ppm by- ³y zgodne z sygna³ami, jakich nale a³oby oczekiwaæ dla reszty glukuronidu. W cz¹steczce obecny by³ równie mostek CH2 (pik A), ale jego sygna³ ulega³ rozszczepieniu, poniewa obydwa atomy wodoru tej grupy znajduj¹ siê pod wp³ywem dwóch ró nych elementów: pierœcienia hydantoiny oraz pierœcienia glukuronidowego. DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Rys. 2. Widma masowe fragmentów jonów pochodnych jonu molekularnego o wartości m/z=457 Rys. 3. Odpowiedzi w teście immunochemicznym oraz integracja MS-MS wykreślone w postaci zależności od chromatograficznego czasu retencji dla próbek surowicy pobranych od pacjentów z mocznicą otrzymujących fosfenytoinę WYMIANA IZOTOPOWA (DEUTEROWA) Wyniki badania polegaj¹cego na wymianie izotopowej wodór-deuter (H-D) pomog³y okreœliæ to samoœæ metabolitu fenytoiny. Poniewa atom wodoru (a w tym przypadku atom deuteru) jest zwykle tracony przez cz¹steczkê w trybie jonów ujemnych, jeden z wymienionych atomów deuteru bêdzie tracony przez cz¹steczkê; tym samym obserwowana wartoœæ stosunku m/z dla zwi¹zku bêdzie o jedn¹ jednostkê masow¹ mniejsza ni rzeczywista wartoœæ m/z. Nale y przy tym zauwa yæ, e wi¹zania C-H z trudem ulegaj¹ wymianie izotopowej, a g³ówny efekt wymiany izotopowej H-D bêdzie obserwowany w przypadku wi¹zañ H-N i O-H. Dane wymienione w tabeli 1 pokazuj¹, e przewidywane i obserwowane zmiany sk³adu masowego zwi¹zku spowodowane wymian¹ deuterow¹ s¹ bez wyj¹tku zgodne ze struktur¹ zwi¹zków z grupy pochodnych hydantoiny, w tym równie z proponowan¹ struktur¹ metabolitu fosfenytoiny. DERYWATYZACJA GRUPY KARBOKSYLOWEJ Przeprowadzone przez nas badania chromatograficzne wykaza³y, e metabolit fosfenytoiny by³ zatrzymywany na kolumnie HPLC Betamax Acid, co by³o prawdopodobnie spowodowane obecnoœci¹ grupy karboksylowej w cz¹steczce tego zwi¹zku. Derywatyzacja prowadzona przy pomocy odczynnika BF3- -metanol, selektywnie metyluj¹cego wszelkie obecne w cz¹steczce grupy karboksylowe, prowadzi³a do obserwowanej straty metabolitu o wartoœci m/z=457 przy oczekiwanej wartoœci chromatograficznego czasu retencji oraz do pojawienia siê nowego zwi¹zku chemicznego o wartoœci m/z=471, eluowanego w pobli u tzw. pustej objêtoœci eluentu. Zmiana masy cz¹steczkowej zwi¹zku o 15 jednostek by³a zgodna z przejœciem pojedynczej grupy COOH do postaci COOCH3. Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 1112 DIAGNOSTYKA POD LUPĄ Rys. 4. Korelacja pomiędzy względnym stężeniem metabolitu, którego stężenie wyznaczono przy pomocy metody HPLC-MS-MS oraz stężeniem wolnej fenytoiny, wyznaczonym na podstawie testu immunochemicznego Rys. 5. Widma NMR fenytoino-n-glukuronidu (u góry), hydroksymetylofenytoiny (pośrodku) i metabolitu fenytoiny (u dołu) STÊ ENIA METABOLITU W PRÓBKACH SURO- WICY PACJENTÓW Z MOCZNIC Porównanie próbek surowicy krwi pacjentów z mocznic¹ otrzymuj¹cych fenytoinê i fosfenytoinê przedstawiono w tabeli 2. Próbki surowicy (n=12) w ka dej z grup by- ³y pobrane od ró nych pacjentów. Obecnoœæ metabolitu stwierdzono w osoczu pacjentów otrzymuj¹cych fosfenytoinê, jednak nie uda- ³o siê stwierdziæ reakcji pochodz¹cej od tego metabolitu, przekraczaj¹cej poziom t³a, w osoczu pacjentów leczonych fenytoin¹. Tabela 1. Dane dla wymiany izotopowej H-D (*m/z, tryb jonu ujemnego) Związek Fenytoina Fenytoino-N-glukuronid HPPH-glukuronid HPPH Metabolit fosfenytoiny Związek Oksymetyloglukuronid Średnia ± SD, jednostki powierzchni Mediana Zakres Kreatynina Średnia ± SD, mg/l Mediana Zakres Masa* Pacjenci fenytoinowi 280 ± ± DYSKUSJA Wstêpna identyfikacja metabolitu fenytoiny wymaga³a nieco szczêœcia. Pocz¹tkowo próbowaliœmy izolowaæ metabolity fenytoiny i fosfenytoiny przy u yciu metodologii immunochemicznej. Próbki surowicy pacjentów inkubowano wraz z roztworem (2 ml lub 5 ml objêtoœci) odczynnika firmy Abbott, zawieraj¹cego przeciwcia³a monoklonalne. Po podzia³aniu na mieszaninê bia³kiem A-sefaroz¹ oraz po przeprowadzonym nastêpnie uwolnieniu zwi¹zków chemicznych zwi¹zanych z przeciwcia³ami, otrzymane nads¹cze poddawano analizie przy u yciu metody HPLC-MS-MS. Niestety, wiêksze stê enia fenytoiny w tych próbkach surowicy, w po³¹czeniu z pierwotn¹ swoistoœci¹ metody wobec fenytoiny, doprowadzi³y do uzyskania izolatów, które wyraÿnie wykazywa³y wy³¹cznie obecnoœæ fenytoiny. Fakt ten zmusi³ nas do wykonania badañ przesiewowych próbek ekstraktów surowicy przy u yciu metody HPLC-MS-MS w celu zidentyfikowania metabolitów fosfenytoiny. Zak³adaj¹c, e metabolit posiada³ w cz¹steczce fragment fenytoiny lub HPPH jako centraln¹ czêœæ struktury, wykonaliœmy chromatografiê w uk³adzie odwróconych faz, dla ³agodnego gradientu acetonitrylu, monitoruj¹c wartoœci m/z równe 251 i 268, w trybie jonów ujemnych. Uda³o nam siê uzyskaæ dwa piki o wartoœci m/z=251, które poddano dalszej analizie, polegaj¹cej na identyfikacji jonów macierzystych w piku 251. Jeden z nich zidentyfikowano jako zwi¹zek posiadaj¹cy jon macierzysty o wartoœci m/z=457, zaœ drugi z nich zidentyfikowano jako fenytoinê. Dysponuj¹c tak¹ informacj¹, kontynuowaliœmy izolowanie metabolitu o wartoœci m/z równej 457, zgodnie z danymi przedstawionymi we wczeœniejszej Przewidywana masa H-D* Obserwowana masa H-D* Tabela 2. Porównanie względnych stężeń metabolitu u pacjentów z mocznicą otrzymujących fenytoinę i fosfenytoinę* *Oddzielni pacjenci z każdej z grup (n=12); porównywalny zakres stężeń fenytoiny w osoczu w każdej z grup Pacjenci fosfenytoinowi ± ± czêœci artyku³u. Okaza³o siê, i jako pierwszy etap procedury oczyszczania zwi¹zku nale y przeprowadziæ ekstrakcjê do fazy sta³ej. W pozosta³oœci otrzymanej podczas wytr¹cania osadu z próbek surowicy pacjentów przy pomocy acetonitrylu obecne by³y du e stê enia soli. Sole te powodowa³y t³umienie sygna³ów podczas masowej analizy spektralnej, a tym samym konieczna by³y ich eliminacja (w miarê mo liwoœci). Piœmiennictwo dostêpne na yczenie. 12 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY13 Terapeutyczne Monitorowanie Leków wprowadzenie Terapeutyczne Monitorowanie Leków to licząca obecnie około 40 lat dyscyplina medycyny laboratoryjnej, zajmująca się wykorzystywaniem stężeń leków oznaczanych we krwi do indywidualizacji farmakoterapii. Dr hab. n. med. Bogdan Solnica DO SPECJALIZACJI Badanie kinetyki przemian leku w organizmie ma duże znaczenie praktyczne, ponieważ stanowi postawę tworzenia schematów dawkowania leków Terapeutyczne monitorowanie leków (TML) (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) wyodrêbni³o siê jako dyscyplina medycyny laboratoryjnej w latach 70. XX w., znajduj¹c podstawy teoretyczne g³ownie w farmakokinetyce, st¹d czêsto jest ono nazywane farmakokinetyk¹ kliniczn¹. TML mo na zdefiniowaæ jako wykorzystywanie stê eñ leków oznaczanych we krwi do indywidualizacji farmakoterapii tworzenia i kontroli skutecznych i bezpiecznych schematów dawkowania spe³niaj¹cych przyjête kryteria leków, w okreœlonych sytuacjach klinicznych. Farmakokinetyka jako nauka bada przebieg w czasie (kinetykê) procesów, jakim podlega wprowadzony do organizmu lek. Zgodnie z powszechnie przyjmowanym pogl¹dem, farmakologiczne (lecznicze lub toksyczne) dzia³anie leku zale y od stê enia, jakie osi¹ga on w tkankach organizmu, w tym w miejscu swojego dzia³ania. Z drugiej strony, stê enie leku w p³ynach ustrojowych i tkankach zale y od schematu jego dawkowania oraz przemian, jakim lek podlega po podaniu, po wprowadzeniu do organizmu. Mówi¹c kolokwialnie to, co lek robi z organizmem, zale y w znacznym stopniu od tego, co organizm robi z lekiem. Farmakokinetyka dostarcza narzêdzi s³u- ¹cych do iloœciowego, matematycznego opisu losów leku w organizmie, jego przemian, których ostatecznym efektem jest pojawienie siê leku w miejscu dzia³ania oraz jego usuwanie z organizmu. Badanie kinetyki przemian leku w organizmie ma du e znaczenie praktyczne, poniewa stanowi podstawê tworzenia schematów dawkowania leków. Lek mo e byæ podany na dwa sposoby donaczyniowo, wtedy jego cz¹steczki trafiaja bezpoœrednio do krwi kr¹ ¹cej lub pozanaczyniowo (doustnie, domiêœniowo, wziewnie itd.). Po podaniu pozanaczyniowym substancja lecznicza ulega najpierw uwolnieniu z formulacji farmaceutycznej (tabletka, zawiesina i itd.) i wch³oniêciu z miejsca podania do krwiobiegu. Od tego etapu losy leku podanego donaczyniowo i pozanaczyniowo s¹ takie same. Po dostaniu siê do krwi, cz¹steczki leku odwracalnie wi¹ ¹ siê z bia³kami przenoœnikowymi. Stopieñ wi¹zania leku (wzglêdna wielkoœæ frakcji wolnej i zwi¹zanej) jest cech¹ leku, ale zale y równie od stê enia i w³aœciwoœci bia³ek osocza. Wolna frakcja leku ulega dystrybucji w tkankach organizmu, docieraj¹c te do miejsca swojego dzia³ania (biofaza). W trakcie dystrybucji cz¹steczki leku docieraj¹ równie do narz¹dów odpowiedzialnych za jego eliminacjê drog¹ metabolizmu w¹trobowego i/lub wydalania przez nerki z moczem (Rys. 1). Przemiany leku podanego doustnie lub doodbytniczo zachodz¹ce w w¹trobie przed dotarciem pozosta- ³ych jego cz¹steczek do kr¹ enia systemowego nosz¹ nazwê efektu pierwszego przejœcia. Przebieg procesów wch³aniania, dystrybucji i eliminacji jest opisywany przez parametry farmakokinetyczne, wyznaczane na podstawie analizy zmian stê enia leku we krwi. Nale ¹ do nich: dostêpnoœæ biologiczna czêœæ (odsetek) dawki leku, jaka dociera do kr¹ enia systemowego po podaniu pozanaczyniowym; przydatna w ocenie niezbêdnej wielkoœci podawanej dawki leku, objêtoœæ dystrybucji (Vd) hipotetyczna objêtoœæ p³ynów organizmu, w których lek w stanie stacjonarnym mia³by stê enie takie, jak we krwi, wspó³czynnik proporcjonalnoœci pomiêdzy iloœci¹ leku w organizmie i jego stê eniem we krwi, innymi s³owy okreœla iloœæ leku, jaka musi znajdowaæ siê w organizmie dla uzyskania okreœlonego jego stê enia we krwi, ca³kowity klirens leku (Cl) objêtoœæ krwi (osocza), z jakiej w jednostce czasu lek jest nieodwracalnie usuwany wszystkimi mo liwymi drogami jego eliminacji, biologiczny okres pó³trwania (T1/2) czas, po up³ywie którego stê enie leku we krwi (po zakoñczeniu wch³aniania i dystrybucji) zmniejszy siê o po³owê, sta³a szybkoœci eliminacji (Kel) u³amek ca³kowitej iloœci leku w organizmie usuwany z niego w jednostce czasu (najczêœciej godziny). Parametry charakteryzuj¹ce eliminacjê leku z organizmu (Cl, T1/2, Kel) maj¹ podstawowe znaczenie dla okreœlenia dawek leku i przedzia³u dawkowania (odstêp czasu pomiêdzy dawkami), zapewniaj¹cych uzyskanie po ¹danych stê eñ leku we krwi i w tkankach. Przedmiotem TML jest stosunkowo nieliczna grupa leków. O mo liwoœci monitorowania ich stê enia w ogóle oraz jego klinicznej przydatnoœci decyduje spe³nianie przez te leki okreœlonych kryteriów. Dla ka dego z monitorowanych leków musi istnieæ potwierdzony zwi¹zek pomiêdzy stê eniem we krwi, czyli tam, gdzie mo e byæ ono rutynowo oznaczane, jego stê eniem w tkankach oraz efektem farmakologicznym, terapeu- Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 1314 DO SPECJALIZACJI nia od objawów leczonej choroby. W tym ostatnim przypadku, bez monitorowania stê- enia leku we krwi, jego przedawkowanie i wyst¹pienie dzia³añ toksycznych mog¹ byæ przeoczone na skutek b³êdnej oceny klinicznej, jak np. w przypadku wzrostu czêstoœci akcji serca u chorego z zaostrzeniem astmy oskrzelowej, leczonego teofilin¹ lub nasilenia zaburzeñ rytmu serca w trakcie leczenia lekiem przeciwarytmicznym. TML jest zasadne i przydatne w przypadku leków, dla których brakuje jednoznacznych i ³atwych do oceny kryteriów skutecznego dzia³ania. Np. monitorowanie leczenia cukrzycy jest oparte o pomiary glikemii i hemoglobiny glikowanej, a oznaczenia stê enia leków hipoglikemizuj¹cych nie znajduj¹ tu zastosowania. Z kolei ocena skutecznoœci leczenia immunosupresyjnego u biorcy przeszczepu narz¹du w oparciu o objawy kliniczne i dane laboratoryjne jest du o trudniejsza i w zwi¹zku z tym TML jest tu istotnym elementem monitorowania leczenia. Listê leków, których stê enie we krwi jest oznaczane w ramach TML tworz¹: leki nasercowe (digoksyna, digitoksyna), leki przeciwarytmiczne (amiodaron, meksyletyna, lidokaina, chinidyna, prokainamid / N-acetyloprokainamid), teofilina, leki przeciwpadaczkowe (fenytoina, fenobarbital, prymidon, kwas walproinowy, etosuksimid), antybiotyki (aminoglikozydowe gentamycyna, tobramycyna, amikacyna, netylmycyna; wankomycyna), leki immunosupresyjne (cyklosporyna A, takrolimus, sirolimus, kwas mykofenolowy), metotrksat, leki przeciwdepresyjne (tricykliczne leki przeciwdepresyjne, lit), leki przeciwzapalne (kwas acetylosalicylowy, acetaminofen). Leki i ich metabolity wystêpuj¹ w p³ynach ustrojowych w stê eniach rzêdu mikrogramów do miligramów na litr, wiêc dla potrzeb TML stosowane s¹ metody analityczne o takim progu detekcji, cechuj¹ce siê odpowiedni¹ dok³adnoœci¹ i precyzj¹ oznaczeñ. Metodyka oznaczeñ w TML oraz rozwi¹zania aparaturowe i organizacyjne powinny zapewniaæ krótki czas oczekiwania na wynik (turn- -around time, TAT). Dla potrzeb TML stosuje siê metody chromatograficzne i immunochemiczne. Z metod chromatograficznych stosowana jest chromatografia gazowa z ciek³¹ faz¹ stacjonarn¹ (GLC), wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), szczególnie w odwróconych fazach, z zastosowaniem detektorów spektrofotometrycznych, fluorescencyjnych i elektrochemicznych. Wa n¹ zalet¹ metod chromatograficznych jest mo liwoœæ jednoczesnego oznaczania leku macierzystego i ewentualnych jego metabolitów w tej samej próbce materia- ³u. Ze wzglêdu na wymogi metodyczne, techniki chromatograficzne stosowane s¹ czêœciej dla celów naukowo-badawczych, tym niemniej HPLC, dziêki odpowiedniej automatyzacji procedury, jest stosowana równie w laboratoriach diagnostycznych. Najszersze zastosowanie w TML maj¹ metody immunochemiczne immunoenzymatyczne (EMIT, MEIA), immunofluorescencyjne, w tym immunofluorescencyjno-polaryzacyjna (FPIA), immunoluminometryczne (LIA), immunochemiluminescencyjne, czy nawet immunoturbidymetryczne. Metody te, ka da o w³asnej charakterystyce analitycznej, s¹ stosowane przy u yciu zautomatyzowanych analizatorów, co zapewnia du ¹ wydajnoœæ procesu analitycznego i krótki TAT. W coraz powszechniej obecnie u ywanych zintegrowanych platformach analitycznych leki stanowi¹ czêœæ wykonywanych oznaczeñ immunochemicznych obok hormonów, bia³ek swoistych i innych. tycznym lub toksycznym. Zwi¹zek ten jest podstaw¹ okreœlenia zakresów terapeutycznych i toksycznych stê eñ leku we krwi. Leki, których stê enie jest monitorowane, cechuj¹ siê niskim wskaÿnikiem terapeutycznym. Oznacza to, e ró nica pomiêdzy lecznicz¹ i toksyczn¹ dawk¹ leku jest niewielka, lub, innymi s³owy, ma³¹ ró nicê pomiêdzy terapeutycznymi i toksycznymi stê eniami leku we krwi oraz w pewnych stanach klinicznych, czêœciowe nak³adanie siê na siebie tych zakresów stê eñ. Cech¹ leków poddawanych terapeutycznemu monitorowaniu jest du a osobnicza zmiennoœæ kinetyki ich przemian w organizmie. Jej konsekwencj¹ jest s³aba zale noœæ pomiêdzy dawk¹ leku, a efektem farmakologicznym koniecznoœæ indywidualizacji dawkowania pod kontrol¹ TML. Innym kryterium decyduj¹cym o przydatnoœci TML jest charakterystyka dzia³añ ubocznych i toksycznych leku, które mog¹ byæ trwa³e i/lub zagra aj¹ce yciu, a w przypadku niektórych leków trudne do odró nie- Wa nym analitycznym problemem w TML jest oznaczanie metabolitów leków. Mog¹ one mieæ strukturê mniej lub bardziej zbli on¹ do leku macierzystego oraz wykazywaæ w czêœci jego aktywnoœæ farmakologiczn¹, a szybkoœæ ich powstawania jest osobniczo zmienna. Metabolity leków s¹ problemem metod immunochemicznych. Z jednej strony, poprzez reaktywnoœæ krzy- ow¹ przeciwcia³ mog¹ pogarszaæ swoistoœæ analityczn¹, a z drugiej wymagaj¹ odrêbnych przeciwcia³/zestawów odczynników do ich oznaczania, jak np. w przypadku prokainamidu i N-acetyloprokainamidu czy lidokainy i monoetyloglicynoksylidydu (MEGX). W przypadku leków, które powinny byæ oznaczane ³¹cznie ze swoimi metabolitami, jak np. cyklosporyna A, nale y rozwa yæ u ycie metody chromatograficznej. Innym analitycznym problemem w TML jest oznaczenie stê enia wolnej frakcji leku we 14 Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY15 DO SPECJALIZACJI Rys. 1. Losy leku w organizmie Rys. 2. Zależność pomiędzy stężeniem leku we krwi, a jego działaniem prawdopodobieństwem wystąpienia efektu terapeutycznego i działań toksycznych krwi w przypadku leków o du ym stopniu wi¹zania z bia³kami osocza (np. leków przeciwpadaczkowych). Standardowo oznacza siê ca³kowite stê enie leku we krwi, bêd¹ce sum¹ stê eñ frakcji wolnej i zwi¹zanej z bia³kami. Trzeba pamiêtaæ, e jedynie frakcja wolnych cz¹steczek leku ulega dystrybucji w tkankach organizmu i odpowiada za efekt farmakologiczny. Stopieñ wi¹zania leku z bia³kiem przenoœnikowym mo e siê zmieniaæ, np. z powodu hipoproteinemii/hipoalbuminemii, zmian w³asnoœci wi¹ ¹cych bia³ek (jak w mocznicy) lub na skutek wypierania leku z po³¹czeñ przez inne substancje. Jeœli w przypadku leku wi¹ ¹cego siê z bia³kami osocza w 90 proc. stopieñ wi¹zania zmniejszy siê do 80 proc., to stê enie wolnej frakcji leku podwoi siê, prawdopodobnie osi¹gaj¹c poziom toksyczny. W konsekwencji, przy prawid³owym ca³kowitym stê eniu leku, u chorego mog¹ wst¹piæ objawy zatrucia. Oznaczanie stê enia wolnej frakcji leku jest mo liwe, musi byæ poprzedzone rozdzieleniem wolnych cz¹steczek leku od zwi¹zanych z bia³kami metod¹ dializy równowagowej, ultrafiltracji lub ultrawirowania. Ze wzglêdu na pracoch³onnoœæ i czas trwania procedury oraz problemy metodyczne, oznaczenia te nie znajduj¹ szerokiego zastosowania w TML. Interpretacja wyniku w TML najczêœciej polega na odniesieniu oznaczenego stê enia leku do przyjmowanego zakresu stê eñ terapeutycznych. Jest on definiowany jako zakres stê eñ leku we krwi, w którym prawdopodobieñstwo uzyskania efektu terapeutycznego jest najwiêksze, a ryzyko wyst¹pienia dzia³añ toksycznych najmniejsze u wiêkszoœci leczonych osób (Rys. 2). Taka definicja zakresu stê eñ terapeutycznych jest konsekwencj¹ wp³ywu, jaki na dzia³anie leku przy danym jego stê eniu we krwi i w tkankach wywieraj¹ liczne czynniki (stê- TML jest zasadne i przydatne w przypadku leków, dla których brakuje jednoznacznych i łatwych do oceny kryteriów skutecznego działania enie elektrolitów, hormonów, stan równowagi kwasowo-zasadowej, obecnoœæ innych leków i inne), co jest badane przez farmakodynamikê. Zjawiska te mog¹ byæ przyczyn¹ trudnoœci w interpretacji wyników. Np. u leczonego digoksyn¹ pacjenta z hipokalemi¹ zaburzenia rytmu serca typowe dla zatrucia tym lekiem mog¹ wyst¹piæ przy terapeutycznym jego stê eniu we krwi. Interpretuj¹c wyniki w TML trzeba te pamiêtaæ o mo liwych zmianach stê enia wolnej frakcji leku we krwi przy prawid³owym jego stê- eniu ca³kowitym i zmianie stopnia wi¹zania z bia³kami przenoœnikowymi. Inne podejœcie do interpretacji wyników w TML zak³ada wykorzystanie ich do wyznaczania wartoœci parametrów farmakokinetycznych opisuj¹cych przemiany leku w organizmie indywidualnego chorego. Takie wyliczenia s¹ chlebem powszednim farmakokinetyki i przy wykonywaniu ich w celach eksperymentalnych wykorzystuje siê m.in. modelowanie kompartmentowe. Kompartment (przedzia³) oznacza hipotetyczn¹ przestrzeñ organizmu obejmuj¹c¹ te tkanki i narz¹dy, w których przemiany leku przebiegaj¹ z podobn¹ kinetyk¹. W tym ujêciu organizm mo na traktowaæ jako jeden kompartment (najprostszy model) lub uk³ad z³o ony z dwóch lub wiêkszej iloœci kompartmentów, pomiêdzy którymi przemieszcza siê lek. Analiza zmian stê eñ leku przy zastosowaniu odpowiedniego modelu kompartmentowego wymaga przynajmniej kilku oznaczeñ stê enia leku we krwi w obrêbie jednego przedzia³u dawkowania, w trakcie jego eliminacji, poprzedzonych do ylnym jego podaniem, co ogranicza mo liwoœæ wykorzystania takiego postêpowania w praktyce klinicznej. W praktyce TML wykorzystuje siê do tych celów programy komputerowe dokonuj¹ce wyliczeñ parametrów farmakokinetycznych na podstawie ich wartoœci populacyjnych oraz danych dotycz¹cych stanu pacjenta, historii dawkowania leku i wyników (nawet pojedynczych) oznaczeñ stê enia leku we krwi. Programy takie umo liwiaj¹ tak e dokonywanie opartych na tych kalkulacjach symulacji dawkowania prowadz¹cego do uzyskania za- ³o onych stê eñ leku we krwi. Dziêki takim mo liwoœciom obliczeniowym oferta laboratoriów wykonuj¹cych oznaczenia leków mo e byæ rozbudowana do tzw. serwisu farmakokinetycznego, obejmuj¹cego konsultacje w zakresie fazy przedanalitycznej oraz kalkulacje parametrów farmakokinetycznych. Te ostatnie wymagaj¹ jednak dostêpu do szeregu szczegó³owych informacji o stanie chorego, stosowanej farmakoterapii, historii dawkowania leku oraz wyników oznaczeñ jego stê enia we krwi. Mo liwoœæ uzyskania tych informacji jest najczêstszym ograniczeniem realizacji serwisu farmakokinetycznego. Innym ograniczeniem jest rezygnacja z odrêbnoœci TML w organizacji pracy laboratoriów diagnostycznych w nastêpstwie konsolidacji badañ. Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 1516 DO SPECJALIZACJI Terapeutyczne Monitorowanie Leków aspekty praktyczne W realizacji TML w codziennej praktyce, podobnie jak w przypadku innych badań laboratoryjnych, istotne jest przestrzeganie klinicznych wskazań do jego podejmowania. Wszelkie nadużywanie oznaczeń stężenia leków we krwi wykonywanie ich bez wskazań klinicznych czy też wykonywanie ich zbyt często utrudnia realizację jednego z podstawowych zadań TML, jakim jest obniżanie globalnych kosztów farmakoterapii. Dr hab. n. med. Bogdan Solnica Kliniczne wskazania do TML mog¹ byæ stwierdzone a priori przed rozpoczêciem podawania leku lub wyst¹piæ w trakcie leczenia. Do pierwszej kategorii nale- ¹ rozpoznane u pacjenta schorzenia, mog¹ce zmieniaæ kinetykê przemian leku. Nale y do nich np. niewydolnoœæ nerek, znaczne upoœledzenie czynnoœci w¹troby lub zaburzenia wch³aniania jelitowego. W takich przypadkach dawkowanie leku musi byæ dobrane do stanu pacjenta, a stê enie leku we krwi monitorowane. Drugim tego typu wskazaniem jest mo liwoœæ interakcji w fazie farmakokinetycznej, kiedy w leczeniu skojarzonym jeden lek wp³ywa na wch³anianie, dystrybucjê lub eliminacjê drugiego. Wiadomo np., e amiodaron zwalnia eliminacjê digoksyny, a antybiotyki makrolidowe teofiliny, zatem jednoczesne stosowanie tych leków wymaga modyfikacji dawkowania oraz TML. Brak informacji o ewentualnym wczeœniejszym za ywaniu leku (chory nieprzytomny, utrudniony kontakt, zaburzenia pamiêci) jest wskazaniem do przynajmniej jednorazowego, wstêpnego oznaczenia stê enia leku lub leków, których wczeœniejsze stosowanie mo na podejrzewaæ. Konieczne mo e okazaæ siê te pe³ne terapeutyczne monitorowanie leków, których podawanie bêdzie kontynuowane. Jest to szczególnie wa ne w razie koniecznoœci podania leku w du ej dawce, jak teofiliny w zaostrzeniu astmy oskrzelowej czy fenytoiny w stanie padaczkowym. Tê listê wskazañ do TML zamyka przewlek³e stosowanie leku w trybie leczenia ambulatoryjnego, szczególnie przy podejrzeniu braku wspó³pracy pacjenta, nieprzestrzegania zaleceñ (noncompliance). Oznaczanie stê enia leku w takiej sytuacji, poza dostarczaniem lekarzowi niezbêdnych informacji, jest te sygna³em dla pacjenta o mo liwoœci obiektywnej weryfikacji przestrzegania przez niego zaleceñ. Podstawowym wskazaniem do TML pojawiaj¹cym siê w trakcie leczenia jest brak oczekiwanego efektu terapeutycznego pomimo zastosowania leku zgodnie ze wskazaniami i we w³aœciwej dawce. TML pomo e wtedy wyjaœniæ, czy pacjent w ogóle lek za ywa oraz rozstrzygn¹æ, czy nale y zmodyfikowaæ schemat dawkowania, czy te zastosowaæ inny lek. Drugim wa nym wskazaniem jest wyst¹pienie u chorego objawów sugeruj¹cych toksyczne dzia³anie leku, zw³aszcza, gdy brak jest wiarygodnych informacji o wczeœniejszym jego za ywaniu. Wdro enie TML przy podejrzeniu zatrucia lekiem jest szczególnie potrzebne wtedy, gdy objawy nie s¹ charakterystyczne lub te wystêpuj¹ w chorobie leczonej przy u yciu danego leku. Przy oznaczaniu stê enia leków we krwi, podobnie jak w innych grupach badañ laboratoryjnych, nale y poprawnie wykonywaæ wszystkie czynnoœci sk³adaj¹ce siê na fazê przedanalityczn¹ tych badañ. Oznaczenia stê- enia leków mog¹ byæ wykonywane w surowicy, osoczu heparynowym lub wersenianowym. Dla niektórych metod immunochemicznych wymagany jest tylko jeden materia³ i ta informacja powinna byæ dostarczona u ytkownikom badañ. Stê enie antybiotyków aminoglikozydowych powinno byæ oznaczane wy³¹cznie w surowicy. Stê enie cyklosporyny A, takrolimusu i sirolimusu jest oznaczane w pe³nej krwi pobranej na EDTA. Je eli oznaczenia nie s¹ wykonywane natychmiast, materia³ mo e byæ nawet przez kilka dni przechowywany w temp. od +2 do +8 o C, d³u sze przechowywanie wymaga zamro enia w temperaturze 20 o C. Bardzo wa ne w TML jest œcis³e przestrzeganie w³aœciwego czasu pobierania próbek krwi. Musi on byæ dostosowany do schematu dawkowania leku, a tak e formulacji farmaceutycznej i drogi podania. Szczególnie wa ne s¹ relacje czasowe po- miêdzy pobraniem próbki a rozpoczêciem leczenia i podaniem ostatniej dawki leku tutaj b³êdy pope³niane s¹ najczêœciej. TML powinno siê rozpoczynaæ i pierwsze oznaczenie wykonaæ po osi¹gniêciu stanu stacjonarnego (steady state) wtedy szybkoœæ wprowadzania leku do organizmu staje siê równa szybkoœci jego eliminacji, zawartoœæ/stê enie leku w tkankach osi¹ga wartoœæ sta³¹, a stê- enia leku we krwi oznaczone w tych samych punktach czasowych przedzia³u dawkowania powinny byæ sobie równe (Rys.). Stan stacjonarny jest najbardziej stabilnym etapem przemian leku w organizmie, wtedy zwi¹zek pomiêdzy stê eniem leku we krwi i jego dzia³aniem jest najsilniejszy. Przy przewlek³ym dawkowaniu leku, tzn. bez stosowania dawki nasycaj¹cej, stan stacjonarny ustala siê po up³ywie czasu równego 4 5 biologicznym okresom pó³trwania leku (Rys., Tab.) ten czas jest niezale ny od wielkoœci dawek. Nale y równie pamiêtaæ, e po zmianie dawkowania nowy stan stacjonarny ustala siê po up³ywie tego samego czasu. Pobieranie próbek zbyt wczeœnie, przed ustaleniem siê stanu stacjonarnego, powoduje, e oznaczone w nich stê enia leku s¹ zwykle poni ej zakresu stê eñ terapeutycznych (Rys.). Interpretuj¹cy takie wyniki lekarz mo e zwiêkszyæ dawki leku, doprowadzaj¹c do osi¹gniêcia w stanie stacjonarnym stê eñ toksycznych. Zatem trywialny z pozoru b³¹d przedanalityczny mo e mieæ powa ne konsekwencje dla losów pacjenta. Takie niebezpieczeñstwo mo e wyst¹piæ równie po zmianie dawkowania ponowne oznaczenia stê enia leku we krwi powinny byæ wykonywane po ustaleniu siê nowego stanu stacjonarnego. Zgodnie z drug¹ ogóln¹ zasad¹ próbki powinny byæ pobierane po zakoñczeniu wch³aniania i dystrybucji poprzedniej dawki leku. I tu te czêsto pope³niany jest b³¹d stê- enie leku oznaczone w trakcie jego wch³aniania jest z regu³y podwy szone i mo e mieœciæ siê w zakresie stê eñ toksycznych, czego konsekwencj¹ bêdzie zmniejszenie dawki b¹dÿ odstawienie leku. Stê enie leku oznaczone w czasie jego wch³aniania, przed zakoñczeniem dystrybucji nie odzwierciedla stê enia w tkankach. Z tego powodu nawet przy podejrzeniu zatrucia lekiem powinno siê oznaczaæ jego stê enie po zakoñczeniu wch³aniania i dystrybucji ostatniej dawki, je eli czas jej podania mo na ustaliæ. Przestrzegaj¹c przedstawionych powy ej regu³, w terapeutycznym monitorowaniu wiêkszoœci leków oznacza siê minimalne stê enie w przedziale dawkowania w stanie stacjonarnym (steady state through concentration) pobieraj¹c próbkê krwi bezpoœrednio przed podaniem kolejnej dawki leku tego w³aœnie stê enia najczêœciej dotycz¹ zakresy stê eñ terapeutycznych (Tab.). W przypadku niektórych leków istnieje koniecznoœæ oznaczenia maksymalnego stê enie leku w przedziale dawkowania (peak concentration), pobieraj¹c próbki krwi 30 min. po poda- 16 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY17 DO SPECJALIZACJI niu do ylnym lub min. po podaniu domiêœniowym. Trudniejsze jest oznaczenie stê enia maksymalnego po podaniu preparatu doustnego czas jego osi¹gniêcia zale y od rodzaju leku, formulacji farmaceutycznej oraz innych czynników, jak np. jednoczeœnie spo yty pokarm, niewydolnoœæ serca, interakcje itp. i mo e wahaæ siê w szerokich granicach. Pewnym wyj¹tkiem jest terapeutyczne monitorowanie cyklosporyny A poza próbk¹ pobieran¹ przed podaniem kolejnej dawki (C0), pobiera siê próbki w 2 (C2) i 4 (C4) godzinie po podaniu leku. B³êdy przedanalityczne zwi¹zane z niew³aœciwym czasem pobierania próbek krwi wystêpuj¹ w praktyce TML czêsto i mog¹ mieæ powa ne konsekwencje w postaci nieprawid³owego dawkowania leków. Aby ich unikaæ, nale y rozpowszechniaæ i na ka de yczenie udostêpniaæ u ytkownikom badañ informacje na temat poprawnego pobierania próbek krwi. Dobrze jest te zamieœciæ w formularzu zlecania badañ z zakresu TML pola, w których u ytkownicy badañ powinni wpisywaæ datê rozpoczêcia leczenia oraz datê i godzinê podania ostatniej dawki leku, którego stê enie ma byæ oznaczone. Takie informacje pomagaj¹ w wyselekcjonowaniu w laboratorium próbek materia³u, w których oznaczenie leku bêdzie bezu yteczne i, po porozumieniu z lekarzem, odst¹pieniu od niepotrzebnego badania. TML jest kliniczn¹ odmian¹ farmakokinetyki i ma za zadanie zwiêkszanie skutecznoœci i bezpieczeñstwa farmakoterapii oraz obni enie jej ca³kowitych kosztów. Aby siê z tego zadania wywi¹zaæ, niezale nie od sposobu organizacji TML w laboratorium, oznaczenia stê- enia leków musz¹ byæ wykonywane z okreœlonych wskazañ klinicznych, z przestrzeganiem wymogów przedanalitycznych i odpowiedni¹ jakoœci¹ analityczn¹, a uzyskiwane wyniki musz¹ byæ poprawnie interpretowane i w³aœciwie wykorzystywane w pracy z chorymi (Tab.). Rys. Zmiany stężenia leku we krwi podczas przewlekłego dawkowania. Dla większości leków próbki krwi powinny być pobierane po osiągnięciu stanu stacjonarnego, przed podaniem kolejnej dawki leku Piśmiennictwo: 1. Hallworth M, Capps N. Therapeutic Drug Monitoring & Clinical Biochemistry. London: ACB Venture Publications, Jellife RW, Schumitzky A, Bayard D, Milman M, Van Guider M, Wang X i wsp. Modela-Based, Goal-Oriented Individualised Drug Therapy. Linkage of Population Modelling, New Multiple Model Dosage Design, Bayesian Feedback and Individualised Target Goals. Clin Pharmacokinet 1998; 34: Moyer T. P., Pippenger C. E.: Therapeutic Drug Monitoring. [w:] Burtis C. A., Ashwood A. R. (red.): Tietz Textbook of Clinical Chemistry. W. B. Saunders Company, 1994, Oellerich M. Therapeutic Drug Monitoring, w: Thomas L. (red.): Clinical Laboratory Diagnostics Use and Assessment of Clinical Laboratory Results. TH-Books Verlagsgeselschaft mbh, Frankfurt/Mein1998: Solnica B. Terapeutyczne monitorowanie leków, w: Dembińska-Kieć A, Naskalski JW (red.) Diagnostyka laboratoryjna z elementami biochemii klinicznej. Elsevier Urban & Partner Wrocław 2010: Taylor W. J., Robinson J. D., Spivey-Miller S.: Handbook of Therapeutic Monitoring. Hervey Whitney Books Company, 1993 Tabela. Terapeutyczne monitorowanie leków wskazania kliniczne, czas do osiągnięcia stanu stacjonarnego i zakresy stężeń terapeutycznych wybranych leków Lek Leki nasercowe Digoksyna Digitoksyna Leki przeciwarytmiczne Chinidyna Lidokaina Dyzopiramid Prokainamid N-acetyloprokainamid Amiodaron Leki rozszerzające oskrzela Teofilina Leki przeciwpadaczkowe Fenytoina Karbamazepina Kwas walproinowy Fenobarbital Prymidon Antybiotyki Gentamycyna Tobramycyna Amikacyna Netylmycyna Wankomycyna Leki cytostatyczne Metotreksat Cyklosporyna A Tacrolimus Sirolimus Kwas mykofenolowy (mykofenoln mofetylu lub sodu) Lit Zakres stężeń terapeutycznych 0,5 1,2 ng/ml ng/ml 2 5 μg/ml 1,5 5 μg/ml 2 5 μg/ml 4 10 μg/ml 6 20 μg/ml 1 2,5 μg/ml 8 20 μg/ml (dorośli) 6 11 μg/ml (wcześniaki) μg/ml 4 10 μg/ml μg/ml μg/ml 5 15 μg/ml Maks μg/ml, Min. <2 μg/ml Maks μg/ml, Min. <2 μg/ml Maks μg/ml, Min. <5 μg/ml Maks μg/ml, Min. <3 μg/ml Maks μg/ml, Min μg/ml <10 μmol/l po 24 godz. <0,5 1 μmol/l po 48 godz. <0,05 0,1 μmol/l po 72 godz. (stężenia krytyczne po zakończeniu wlewu dożylnego) ng/ml (zależnie od przeszczepianego narządu) ng/ml 5 15 ng/ml 1 4 μg/ml 0,3 1,3 mmol/l Czas do osiągnięcia stanu stacjonarnego (przy prawidłowej czynności wątroby i nerek) 7 8 dni 4 tygodnie 2 dni 8 10 godz. 2 dni godz. 2 dni 7 8 miesięcy 2 dni (dorośli) 5 6 dni (wcześniaki) 10 dni 2 4 tygodnie 2 3 dni 3 4 tygodnie (dorośli), 1 2 tygodnie (dzieci) 1 4 dni 1 3 dni 1 3 dni 1 3 dni 1 3 dni 1 2 dni Maks. maksymalne stężenie w przedziale dawkowania, próbka pobrana 0.5 do 1 godz. po podaniu leku Min. minimalne stężenie w przedziale dawkowania, próbka pobrana bezposrednio przed podaniem kolejnej dawki leku Leki immunosupresyjne Leki przeciwdepresyjne 5 7 dni 5 6 dni dni 4 5 dni 4 5 dni Wskazania do TML niewydolność nerek, ciężka niewydolność serca, podeszły wiek, choroby tarczycy ciężka niewydolność serca, podeszły wiek, znaczne upośledzenie czynności wątroby wiek noworodkowy, dziecięcy i podeszły, palenie tytoniu; przerwanie palenia w trakcie leczenia, upośledzenie czynności wątroby, niewydolność serca (w tym serce płucne) leczenie stanu padaczkowego fenytoiną podawaną dożylnie, ciąża, upośledzenie czynności wątroby, niewydolność nerek wiek dziecięcy, ciąża, upośledzenie czynności wątroby wiek dziecięcy, czynności wątroby wiek dziecięcy, czynności wątroby, niewydolność nerek, ciąża i okres do 8 tyg. po porodzie wiek noworodkowy i podeszły, ciężkie, zagrażające życiu zakażenia, upośledzona czynność nerek, odwodnienie, hipowolemia, chorzy dializowani oraz po przeszczepie nerki, stan po urazach, oparzeniach, znaczne obrzęki lub wodobrzusze, stosowanie leku powyżej 7 dni, powtórne leczenie wiek: noworodkowy (szczególnie wcześniaki), podeszły, ciąża, upośledzenie czynności nerek, chorzy dializowani stosowanie leku w dużych dawkach, upośledzenie czynności nerek upośledzenie czynności wątroby, zaburzenia wchłaniania z przewodu pokarmowego, zaburzenia przepływu żółci upośledzenie czynności wątroby, zaburzenia wchłaniania z przewodu pokarmowego upośledzenie czynności wątroby, zaburzenia wchłaniania z przewodu pokarmowego upośledzenie czynności wątroby, zaburzenia wchłaniania z przewodu pokarmowego, upośledzenia inności nerek podeszły wiek, niewydolność nerek, zaburzenia gospodarki wodno-elektrolitowej, dieta ubogosodowa, ciąża, zmiana preparatu litu, nawrót objawów choroby psychicznej Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 1718 DBAJ O ZDROWIE Tadeusz Baranowski Purple in the morning, blue in the afternoon, orange in the evening. And green at night. Just like that. One, two, three, four ( Czerwona rano, niebieska popo³udniu, pomarañczowa wieczorem. I zielona w nocy. Tak po prostu. Raz, dwa, trzy, cztery ). Nie ma chyba lepszego cytatu na pocz¹tek tekstu o uzale nieniu od leków ni cytat z Sary Goldfarb, bohaterki filmu Darrena Aronofsky ego Requiem dla snu. JUST LIKE THAT Film Arronofsky ego opowiada historiê uzale nieñ od ró nych substancji. Syn Sary, Harry, jest heroinist¹ yje w wyimaginowanym œwiecie, z którego tylko czasem wydostaje siê do bolesnej rzeczywistoœci. Sara, wskutek kontaktu z nieuczciwym lekarzem, popada w uzale nienie od leku zawieraj¹cego amfetaminê (czerwone, niebieskie i pomarañczowe tabletki) oraz, dodatkowo, od pozwalaj¹cych jej usn¹æ w nocy leków benzodiazepinowych (tabletki zielone). Jej ycie stopniowo zamienia siê w koszmar, leki wywo³uj¹ u niej przera aj¹ce halucynacje, równoczeœnie doszczêtnie rujnuj¹c jej zdrowie fizyczne. Film ukazuje wiele przykrych prawd, z których jedn¹ mo na wyczytaæ z samego tylko przywo³anego wczeœniej cytatu. Just like that tak po prostu. To b³¹d, który na pocz¹tku swojej drogi pope³nia bardzo wiele osób. Z³udzenie, e magiczne pastylki rozwi¹ ¹ wszystkie problemy. Wystarczy je Ostrożnie z lekami Leki pomagają nam uporać się z różnymi dolegliwościami. Trzeba mieć jednak świadomość, że mogą również uzależniać i nadużywane bardziej szkodzić niż pomagać. kupiæ, po³kn¹æ, popiæ i gotowe cz³owiek staje siê zdrowy, zgrabny, szczêœliwy. Œwiat wko³o staje siê przyjazny i piêkny. Inn¹ prawd¹ jest ciekawy paradoks zestawienie przypadków matki i syna. Harry swój narkotyk zdobywa potajemnie od podejrzanych dealerów; jako jego posiadacz i u ytkownik jest napiêtnowanym spo³ecznie przestêpc¹. W koñcu zreszt¹ trafia do wiêzienia. Sara w szpony swojego na³ogu wpada ca³kowicie legalnie, w czystym gabinecie, badana przez cz³owieka z dyplomem uczelni medycznej, obs³ugiwana przez pielêgniarki... W rzeczywistoœci miêdzy tymi dwiema sytuacjami nie ma wielkiej ró nicy. Pogardzani, têpieni, b³¹kaj¹cy siê po melinach i zamykani w wiêzieniach narkomani, nie ró ni¹ siê szczególnie od osób, które swoje narkotyki kupuj¹ w czystych aptekach, a potem wyjmuj¹ w domu z eleganckich pude³ek i b³yszcz¹cych fiolek. WCI WIÊCEJ I WIÊCEJ Lekomania, czyli zale noœæ lekowa, to podobnie jak uzale nienie od narkotyków jedna z odmian toksykomanii, czyli uzale - nienia od przyjmowania okreœlonej substancji, która (w ogóle lub na skutek czêstego przyjmowania lub zwiêkszania dawek) ma szkodliwy wp³yw na zdrowie. Osoba uzale niona od danej substancji musi przyjmowaæ j¹, eby unikn¹æ dolegliwoœci albo eby wywo³aæ okreœlon¹ doraÿn¹ korzyœæ, tak¹ jak poprawa nastroju czy pobudzenie. Z czasem dolegliwoœci, których dziêki lekom unika, zaczynaj¹ wynikaæ bezpoœrednio z braku w organizmie ich substancji aktywnej. W tej sytuacji mo na ju mówiæ o objawach abstynenckich lub odstawczych, czyli wywo³anych wy³¹cznie brakiem uzale niaj¹cej substancji w organizmie. Poniewa regularne stosowanie i nadu ywanie danej substancji zwiêksza odpornoœæ organizmu na ni¹, osi¹gniêcie po ¹danego efektu wymaga od uzale nionego stosowania coraz wiêkszych dawek. W ten sposób od nieszkodliwej lub leczniczej iloœci uzale - niony przechodzi do dawek szkodliwych, czêsto nawet uznawanych za œmiertelne. Bywa, e prowadzi to do œmierci, choæ dziêki podwy szonej odpornoœci organizm uzale - nionego czêsto jest w stanie przyj¹æ dawkê w normalnej sytuacji zabójcz¹. Mo na to porównaæ do odpornoœci na kofeinê, jak¹ mo - na zaobserwowaæ u zaawansowanych kawoszy. S¹ oni w stanie wypiæ kilka czy kilkanaœcie mocnych kaw dziennie, podczas gdy osobê, która kawy nie pija, taka iloœæ kofeiny przyprawi³aby o atak serca. STOPNIE UZALE NIENIA Uzale nienie od leków, podobnie jak inne uzale nienia, narasta stopniowo. Zwykle pierwsze przychodzi uzale nienie psychiczne przyzwyczajenie, przywi¹zanie, rutyna, lêk przed efektem przerwania kuracji. Kolejnym stadium jest uzale nienie fizyczne, somatyczne. Na tym stadium odstawienie leku powoduje bardzo przykre i niebezpieczne dolegliwoœci, zmiany pracy narz¹dów wewnêtrznych np. serca, zaburzenia w oddychaniu, zmiany ciœnienia krwi i problemy z uk³adem pokarmowym. Wychodzenie z uzale nienia od leków przypomina terapiê uzale nionych od narkotyków. Konieczna jest sta³a opieka lekarza i terapeuty, którzy pomog¹ odstawiæ szkodliwe œrodki i przypilnuj¹, eby nie spowodowa³o to np. zgonu pacjenta. Lekowy abstynent do koñca ycia bêdzie musia³ wystrzegaæ siê pewnych substancji i to nie tylko tych, od których by³ uzale niony, ale równie takich, z którymi maj¹ one powi¹zania krzy owe (osoba uzale niona od danego œrodka jest nara ona na nawrót po za yciu innego œrodka, bêd¹cego z tym pierwszym w takim powi¹zaniu). Wnioski ³atwo wysnuæ samodzielnie. Leki lecz¹, ale nie ma z nimi artów. Nale y stosowaæ je pod kontrol¹ lekarza, nie wolno przekraczaæ dozwolonych dawek itd. Leki choæ pomog¹ uporaæ siê z wieloma schorzeniami nie naprawi¹ œwiata i nie rozwi¹ ¹ za nas wszystkich problemów. Nale y stosowaæ je z g³ow¹. I obejrzeæ Requiem dla snu. 18 Cała prawda w jednej kropli Biuletyn Informacyjny PZ CORMAY19 PRZYPADKI KLINICZNE Od przypadku do przypadku Dział Przypadki Kliniczne służy nauce, odświeżaniu i ugruntowaniu Państwa wiedzy. Opis przypadku hematologicznego zosta³ przygotowany przez Centralne Laboratorium Hematologii Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie. Każdy z Państwa może zaangażować się w tworzenie tego działu. Jeżeli spotkali się Państwo z interesującym, nietypowym przypadkiem chętnie go opublikujemy. Mamy nadzieję, że te przypadki będą edukacyjnym narzędziem w doskonaleniu Państwa umiejętności diagnostycznych. Dane kliniczne: 38-letnia kobieta z ß+talasemią (postać ciężka) z mutacją IVS-I-110 (G-> A) zgłasza się na ambulatoryjną kontrolę. Nr 2 (19), lato 2010 Cała prawda w jednej kropli 1920 Najmniejszy analizator 5-Diff Auto Loader na œwiecie Wybrane dane techniczne: Automatyczny podajnik próbek z 10 statywami (5 próbek w statywie) Możliwość ciągłego dodawania statywów z próbkami Zewnętrzny i wewnętrzny czytnik kodów paskowych Oznaczanie próbek pilnych Duży kolorowy ekran ciekłokrystaliczny Zewnętrzna klawiatura komputerowa (opcja) Trzy odczynniki do 22-parametrowej analizy Monitorowanie zużycia odczynników Dostêpny wkrótce! Pokazać jeszcze
Glukuronidacja centrum aktywnego proleku: Izolacja i charakterystyka oksymetyloglukuronidu powstającego z fosfenytoiny znaczenie w chemii klinicznej
Glukuronidacja centrum aktywnego proleku: Izolacja i charakterystyka oksymetyloglukuronidu powstającego z fosfenytoiny znaczenie w chemii klinicznej Opis badania podjętego w celu określenia struktury nowego, Bardziej szczegółowo Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas
Slajd 1 Spektrometria mas i sektroskopia w podczerwieni Slajd 2 Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas Masa cząsteczkowa Wzór związku Niektóre informacje dotyczące wzoru strukturalnego związku Bardziej szczegółowo 1 FILTR. Jak usun¹æ 5 zanieczyszczeñ za pomoc¹ jednego z³o a? PROBLEMÓW Z WOD ROZWI ZUJE. NOWATORSKIE uzdatnianie wody 5 w 1
Jak usun¹æ 5 zanieczyszczeñ za pomoc¹ jednego z³o a? 1 FILTR ROZWI ZUJE PROBLEMÓW Z WOD 1 TWARDOŒÆ 2 ELAZO 3 MANGAN 4 AMONIAK 5 ORGANIKA Zanieczyszczenia takie jak: twardoœæ, mangan, elazo, naturalne substancje Bardziej szczegółowo HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.
HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.pl Wrocław, dnia 22.06.2015 r. OPINIA przedmiot data Praktyczne Bardziej szczegółowo Od redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2.
Od redakcji Niniejszy zbiór zadań powstał z myślą o tych wszystkich, dla których rozwiązanie zadania z fizyki nie polega wyłącznie na mechanicznym przekształceniu wzorów i podstawieniu do nich danych. Bardziej szczegółowo warsztató OMNM ar n medk oafał ptaszewskii mgr goanna tieczorekjmowiertowskai mgr Agnieszka jarkiewicz
warsztató OMNM ar n medk oafał ptaszewskii mgr goanna tieczorekjmowiertowskai mgr Agnieszka jarkiewicz } Pacjent w badaniu klinicznym a NFZ } Kalkulacja kosztów } Współpraca z zespołem badawczym jak tworzyć Bardziej szczegółowo Efektywna strategia sprzedaży
Efektywna strategia sprzedaży F irmy wciąż poszukują metod budowania przewagi rynkowej. Jednym z kluczowych obszarów takiej przewagi jest efektywne zarządzanie siłami sprzedaży. Jak pokazują wyniki badania Bardziej szczegółowo Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami
Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami Cechy: Kolorowy i intuicyjny wyœwietlacz LCD Czujnik wysokiej jakoœci Inteligentne rozpoznawanie przeszkód Przedni i tylni system wykrywania Bardziej szczegółowo KWALIFIKACJA I WERYFIKACJA LECZENIA DOUSTNEGO STANÓW NADMIARU ŻELAZA W ORGANIZMIE
Opis świadczenia KWALIFIKACJA I WERYFIKACJA LECZENIA DOUSTNEGO STANÓW NADMIARU ŻELAZA W ORGANIZMIE 1. Charakterystyka świadczenia 1.1 nazwa świadczenia Kwalifikacja i weryfikacja leczenia doustnego stanów Bardziej szczegółowo PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc
PRAWA ZACHOWANIA Podstawowe terminy Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc a) si wewn trznych - si dzia aj cych na dane cia o ze strony innych Bardziej szczegółowo Ćwiczenie: "Ruch harmoniczny i fale"
Ćwiczenie: "Ruch harmoniczny i fale" Opracowane w ramach projektu: "Wirtualne Laboratoria Fizyczne nowoczesną metodą nauczania realizowanego przez Warszawską Wyższą Szkołę Informatyki. Zakres ćwiczenia: Bardziej szczegółowo ZAPYTANIE OFERTOWE. Tłumaczenie pisemne dokumentacji rejestracyjnej ZAPYTANIE OFERTOWE
ZAPYTANIE OFERTOWE Tłumaczenie pisemne dokumentacji rejestracyjnej Biofarm sp. z o.o. ul. Wałbrzyska 13 60-198 Poznań Poznań, 09 grudnia 2015r. ZAPYTANIE OFERTOWE I. Nazwa i adres Zamawiającego: Biofarm Bardziej szczegółowo Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą
Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą 1. 1. Opis Oferty 1.1. Oferta Usługi z ulgą (dalej Oferta ), dostępna będzie w okresie od 16.12.2015 r. do odwołania, jednak nie dłużej niż do dnia 31.03.2016 r. Bardziej szczegółowo Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI
Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI SKLAROWANEGO SOKU JABŁKOWEGO Skutecznym sposobem leczenia soku Bardziej szczegółowo TABELA ZGODNOŚCI. W aktualnym stanie prawnym pracodawca, który przez okres 36 miesięcy zatrudni osoby. l. Pornoc na rekompensatę dodatkowych
-...~.. TABELA ZGODNOŚCI Rozporządzenie Komisji (UE) nr 651/2014 z dnia 17 czerwca 2014 r. uznające niektóre rodzaje pomocy za zgodne z rynkiem wewnętrznym w zastosowaniu art. 107 i 108 Traktatu (Dz. Urz. Bardziej szczegółowo Lp. Tematyka Liczba godzin I. Wymagania edukacyjne
Anna Ulrych Plan wynikowy Przedmiot: Materiały fryzjerskie Kierunek : Technikum Usług Fryzjerskich- rok szkolny 05/ 06 Liczba godzin: 76 Liczba godzin w roku szkolnym: KL.II Lp. Tematyka Liczba godzin Bardziej szczegółowo spektroskopia UV Vis (cz. 2)
spektroskopia UV Vis (cz. 2) spektroskopia UV-Vis dlaczego? wiele związków organicznych posiada chromofory, które absorbują w zakresie UV duża czułość: zastosowanie w badaniach kinetyki reakcji spektroskop Bardziej szczegółowo DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15
DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15 Wykonawcy ubiegający się o udzielenie zamówienia Dotyczy: postępowania prowadzonego w trybie przetargu nieograniczonego na Usługę druku książek, nr postępowania Bardziej szczegółowo Wyznaczanie współczynnika sprężystości sprężyn i ich układów
Ćwiczenie 63 Wyznaczanie współczynnika sprężystości sprężyn i ich układów 63.1. Zasada ćwiczenia W ćwiczeniu określa się współczynnik sprężystości pojedynczych sprężyn i ich układów, mierząc wydłużenie Bardziej szczegółowo Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych
UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedra Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 2 OPTYMALIZACJA ROZDZIELANIA MIESZANINY WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW METODĄ Bardziej szczegółowo ZAPYTANIE OFERTOWE nr 4/KadryWM13
Białystok, dn. 16.01.2014r. ZAPYTANIE OFERTOWE nr 4/KadryWM13 DOTYCZY: postępowania opartego na zasadzie konkurencyjności mającego na celu wyłonienie najkorzystniejszej oferty dotyczącej realizacji szkoleń Bardziej szczegółowo Jacek Mrzyg³ód, Tomasz Rostkowski* Rozwi¹zania systemowe zarz¹dzania kapita³em ludzkim (zkl) w bran y energetycznej
Odpowiedzi na pytania zadane do zapytania ofertowego nr EFS/2012/05/01 1 Pytanie nr 1: Czy oferta powinna zawierać informację o ewentualnych podwykonawcach usług czy też obowiązek uzyskania od Państwa Bardziej szczegółowo Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach?
Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach? Czy masz niedosyt informacji niezbêdnych do tego, by mieæ pe³en komfort w podejmowaniu Bardziej szczegółowo Regulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów. Organizatorzy Konkursu
Regulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów 1 Organizatorzy Konkursu 1. Organizatorem Konkursu Start up Award (Konkurs) jest Fundacja Instytut Studiów Wschodnich Bardziej szczegółowo KONKURS CHEMICZNY DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW
KONKURS CHEMICZNY DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW WOJEWÓDZTWO WIELKOPOLSKIE Etap wojewódzki rok szkolny 2009/2010 Dane dotyczące ucznia (wypełnia Komisja Konkursowa po rozkodowaniu prac) wylosowany numer uczestnika Bardziej szczegółowo Regulamin Obrad Walnego Zebrania Członków Stowarzyszenia Lokalna Grupa Działania Ziemia Bielska
Załącznik nr 1 do Lokalnej Strategii Rozwoju na lata 2008-2015 Regulamin Obrad Walnego Zebrania Członków Stowarzyszenia Lokalna Grupa Działania Ziemia Bielska Przepisy ogólne 1 1. Walne Zebranie Członków Bardziej szczegółowo OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU
OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU Celem ćwiczenia jest zapoznanie z techniką atomowej spektrometrii absorpcyjnej z atomizacją Bardziej szczegółowo Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe
Projekt MES Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe 1. Ugięcie wieszaka pod wpływem przyłożonego obciążenia 1.1. Wstęp Analizie poddane zostało ugięcie wieszaka na ubrania Bardziej szczegółowo ET AAS 1 - pierwiastkowa, GW ppb. ICP OES n - pierwiastkowa, GW ppm n - pierwiastkowa, GW Analiza instrumentalna Spektrometria mas F AAS 1 - pierwiastkowa, GW ppm ET AAS 1 - pierwiastkowa, GW ppb ICP OES n - pierwiastkowa, GW ppm ICP MS n - pierwiastkowa, GW Bardziej szczegółowo Spektroskopia UV-VIS zagadnienia
Spektroskopia absorbcyjna to dziedzina, która obejmuje metody badania materii przy użyciu promieniowania elektromagnetycznego, które może z tą materią oddziaływać. Spektroskopia UV-VS zagadnienia promieniowanie Bardziej szczegółowo KOMPLEKSOWY PROGRAM NAUCZANIA FARMAKOLOGII I FARMAKOLOGII KLINICZNEJ DLA III, IV, V ROKU WYDZIA U LEKARSKIEGO
KOMPLEKSOWY PROGRAM NAUCZANIA FARMAKOLOGII I FARMAKOLOGII KLINICZNEJ DLA III, IV, V ROKU WYDZIA U LEKARSKIEGO Zajêcia odbywaja siê w formie wyk³adów, æwiczeñ i seminariów oraz tzw. symulacji sytuacji klinicznych. Bardziej szczegółowo POSTANOWIENIA DODATKOWE DO OGÓLNYCH WARUNKÓW GRUPOWEGO UBEZPIECZENIA NA ŻYCIE KREDYTOBIORCÓW Kod warunków: KBGP30 Kod zmiany: DPM0004 Wprowadza się następujące zmiany w ogólnych warunkach grupowego ubezpieczenia Bardziej szczegółowo Stechiometria równań reakcji chemicznych, objętość gazów w warunkach odmiennych od warunków normalnych (0 o C 273K, 273hPa)
Karta pracy I/2a Stechiometria równań reakcji chemicznych, objętość gazów w warunkach odmiennych od warunków normalnych (0 o C 273K, 273hPa) I. Stechiometria równań reakcji chemicznych interpretacja równań Bardziej szczegółowo SUMMIT INTERNATIONAL ANESTHESIOLOGY. 7 marca 2009, Marakesz,, Maroko
INTERNATIONAL ANESTHESIOLOGY SUMMIT 7 marca 2009, Marakesz,, Maroko GŁÓWNE TEMATY Znieczulenie ogólne anestezja wziewna. Intensywna terapia zastosowanie levosimendanu. Levobupivacaina zastosowanie w ortopedii Bardziej szczegółowo WZÓR SKARGI EUROPEJSKI TRYBUNAŁ PRAW CZŁOWIEKA. Rada Europy. Strasburg, Francja SKARGA. na podstawie Artykułu 34 Europejskiej Konwencji Praw Człowieka
WZÓR SKARGI EUROPEJSKI TRYBUNAŁ PRAW CZŁOWIEKA Rada Europy Strasburg, Francja SKARGA na podstawie Artykułu 34 Europejskiej Konwencji Praw Człowieka oraz Artykułu 45-47 Regulaminu Trybunału 1 Adres pocztowy Bardziej szczegółowo Koszty obciążenia społeczeństwa. Ewa Oćwieja Marta Ryczko Koło Naukowe Ekonomiki Zdrowia IZP UJ CM 2012
Koszty obciążenia społeczeństwa chorobami układu krążenia. Ewa Oćwieja Marta Ryczko Koło Naukowe Ekonomiki Zdrowia IZP UJ CM 2012 Badania kosztów chorób (COI Costof illnessstudies) Ekonomiczny ciężar choroby; Bardziej szczegółowo Regulamin Zarządu Pogórzańskiego Stowarzyszenia Rozwoju
Regulamin Zarządu Pogórzańskiego Stowarzyszenia Rozwoju Art.1. 1. Zarząd Pogórzańskiego Stowarzyszenia Rozwoju, zwanego dalej Stowarzyszeniem, składa się z Prezesa, dwóch Wiceprezesów, Skarbnika, Sekretarza Bardziej szczegółowo FORUM ZWIĄZKÓW ZAWODOWYCH
L.Dz.FZZ/VI/912/04/01/13 Bydgoszcz, 4 stycznia 2013 r. Szanowny Pan WŁADYSŁAW KOSINIAK - KAMYSZ MINISTER PRACY I POLITYKI SPOŁECZNEJ Uwagi Forum Związków Zawodowych do projektu ustawy z dnia 14 grudnia Bardziej szczegółowo Licencję Lekarską PZPN mogą uzyskać osoby spełniające następujące wymagania:
Uchwała nr III/46 z dnia 19 marca 2014 roku Zarządu Polskiego Związku Piłki Nożnej w sprawie zasad przyznawania licencji dla lekarzy pracujących w klubach Ekstraklasy, I i II ligi oraz reprezentacjach Bardziej szczegółowo Automatyzacja pakowania
Automatyzacja pakowania Maszyny pakuj¹ce do worków otwartych Pe³na oferta naszej firmy dostêpna jest na stronie internetowej www.wikpol.com.pl Maszyny pakuj¹ce do worków otwartych: EWN-SO do pakowania Bardziej szczegółowo nazwa...typ,... rok produkcji..., producent...,
APARAT DO WYKONYWANIA BADAŃ IMMUNODIAGNOSTYCZNYCH - Zadanie 1 Znak sprawy: Z/50/PN/10 Aparat do wykonywania badań immunodiagnistycznych 1 szt. 1. Aparat rok produkcji nie wcześniej niŝ 2008, wieloparametrowy, Bardziej szczegółowo LECZENIE NIEDOKRWISTOŚCI W PRZEBIEGU PRZEWLEKŁEJ NIEWYDOLNOŚCI
Warszawa, dnia 25 stycznia 2013 r. Szanowny Pan Wojciech Kwaśniak Zastępca Przewodniczącego Komisji Nadzoru Finansowego Pl. Powstańców Warszawy 1 00-950 Warszawa Wasz znak: DRB/DRB_I/078/247/11/12/MM W Bardziej szczegółowo SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA
SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA Temat lekcji Jak dowieść, że woda ma wzór H 2 O? Na podstawie pracy uczniów pod opieką Tomasza Bardziej szczegółowo Zapytanie ofertowe nr 3
I. ZAMAWIAJĄCY STUDIUM JĘZYKÓW OBCYCH M. WAWRZONEK I SPÓŁKA s.c. ul. Kopernika 2 90-509 Łódź NIP: 727-104-57-16, REGON: 470944478 Zapytanie ofertowe nr 3 II. OPIS PRZEDMIOTU ZAMÓWIENIA Przedmiotem zamówienia Bardziej szczegółowo Regulamin i cennik Promocji TV+INTERNET NA PRÓBĘ
Regulamin i cennik Promocji TV+INTERNET NA PRÓBĘ 1. Organizatorem promocji są: A) EVIO Sp. z o.o. z siedzibą w Poznaniu, 61-714, al. Niepodległości 27, wpisana w rejestrze przedsiębiorców KRS pod numerem Bardziej szczegółowo Instrument oceny 360 stopni zgodny z naukową metodologią, to jest możliwe! Analiza przypadku
Instrument oceny 360 stopni zgodny z naukową metodologią, to jest możliwe! Analiza przypadku dr Victor Wekselberg, Senior Konsultant Mirosława Achinger, Prezes Mispol SA Plan wystąpienia 1. Czym jest kwestionariusz Bardziej szczegółowo Waldemar Szuchta Naczelnik Urzędu Skarbowego Wrocław Fabryczna we Wrocławiu
1 P/08/139 LWR 41022-1/2008 Pan Wrocław, dnia 5 5 września 2008r. Waldemar Szuchta Naczelnik Urzędu Skarbowego Wrocław Fabryczna we Wrocławiu WYSTĄPIENIE POKONTROLNE Na podstawie art. 2 ust. 1 ustawy z Bardziej szczegółowo Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko
Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Karta pracy III.. Imię i nazwisko klasa Celem nauki jest stawianie hipotez, a następnie ich weryfikacja, która w efekcie Bardziej szczegółowo ZAPYTANIE OFERTOWE z dnia 03.12.2015r
ZAPYTANIE OFERTOWE z dnia 03.12.2015r 1. ZAMAWIAJĄCY HYDROPRESS Wojciech Górzny ul. Rawska 19B, 82-300 Elbląg 2. PRZEDMIOT ZAMÓWIENIA Przedmiotem Zamówienia jest przeprowadzenie usługi indywidualnego audytu Bardziej szczegółowo PROGRAMU PARTNERSKIEGO BERG SYSTEM
Regulamin PROGRAMU PARTNERSKIEGO BERG SYSTEM 1. Organizatorem Programu Partnerskiego BERG SYSTEM" jest KONEKT Sp. z o.o. z siedzibą w: 15-532 Białystok, ul. Wiewiórcza 111; NIP 966 210 20 23; REGON 363632084; Bardziej szczegółowo Młodzieńcze spondyloartropatie/zapalenie stawów z towarzyszącym zapaleniem przyczepów ścięgnistych (mspa-era)
www.printo.it/pediatric-rheumatology/pl/intro Młodzieńcze spondyloartropatie/zapalenie stawów z towarzyszącym zapaleniem przyczepów ścięgnistych (mspa-era) Wersja 2016 1. CZYM SĄ MŁODZIEŃCZE SPONDYLOARTROPATIE/MŁODZIEŃCZE Bardziej szczegółowo Zakład Produkcji Spożywczej JAMAR Szczepaniak sp.j Albertów 69, 42-165 Lipie
Zakład Produkcji Spożywczej JAMAR Szczepaniak sp.j Albertów 69, 42-165 Lipie Albertów 25.01.2016r Podstawowym celem praktyki zawodowej odbywanej w Firmie JAMAR sp. jawna jest nabycie umiejętności praktycznych, Bardziej szczegółowo Chemia i technologia materiałów barwnych BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ZWIĄZKÓW BARWNYCH WYKORZYSTANIEM SPEKTROFOTOMETRII UV-VIS.
Chemia i technologia materiałów barwnych Ćwiczenia laboratoryjne BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ZWIĄZKÓW BARWNYCH WYKORZYSTANIEM SPEKTROFOTOMETRII UV-VIS. Z Opracowanie: dr inŝ. Ewa Wagner-Wysiecka Politechnika Gdańska Bardziej szczegółowo Rudniki, dnia 10.02.2016 r. Zamawiający: PPHU Drewnostyl Zenon Błaszak Rudniki 5 64-330 Opalenica NIP 788-000-22-12 ZAPYTANIE OFERTOWE
Zamawiający: Rudniki, dnia 10.02.2016 r. PPHU Drewnostyl Zenon Błaszak Rudniki 5 64-330 Opalenica NIP 788-000-22-12 ZAPYTANIE OFERTOWE W związku z planowaną realizacją projektu pn. Rozwój działalności Bardziej szczegółowo 1. Rozwiązać układ równań { x 2 = 2y 1
Dzień Dziecka z Matematyką Tomasz Szymczyk Piotrków Trybunalski, 4 czerwca 013 r. Układy równań szkice rozwiązań 1. Rozwiązać układ równań { x = y 1 y = x 1. Wyznaczając z pierwszego równania zmienną y, Bardziej szczegółowo WYZNACZANIE PRZYSPIESZENIA ZIEMSKIEGO ZA POMOCĄ WAHADŁA REWERSYJNEGO I MATEMATYCZNEGO
Nr ćwiczenia: 101 Prowadzący: Data 21.10.2009 Sprawozdanie z laboratorium Imię i nazwisko: Wydział: Joanna Skotarczyk Informatyki i Zarządzania Semestr: III Grupa: I5.1 Nr lab.: 1 Przygotowanie: Wykonanie: Bardziej szczegółowo 2.Prawo zachowania masy
2.Prawo zachowania masy Zdefiniujmy najpierw pewne podstawowe pojęcia: Układ - obszar przestrzeni o określonych granicach Ośrodek ciągły - obszar przestrzeni którego rozmiary charakterystyczne są wystarczająco Bardziej szczegółowo Dotyczy zastosowania ww produktów w mikrobiologii klinicznej
Warszawa,14.11.2013 WAŻNE: Notatka bezpieczeństwa Dotyczy produktów: ZYM B (Nr kat.70493), API Listeria (Nr kat.10300), API NH (Nr kat.10400) nr serii: patrz załącznik 1 Dotyczy zastosowania ww produktów Bardziej szczegółowo GRUPA KAPITAŁOWA POLIMEX-MOSTOSTAL SKRÓCONE SKONSOLIDOWANE SPRAWOZDANIE FINANSOWE ZA OKRES 12 MIESIĘCY ZAKOŃCZONY DNIA 31 GRUDNIA 2006 ROKU
GRUPA KAPITAŁOWA POLIMEX-MOSTOSTAL SKRÓCONE SKONSOLIDOWANE SPRAWOZDANIE FINANSOWE ZA OKRES 12 MIESIĘCY ZAKOŃCZONY DNIA 31 GRUDNIA 2006 ROKU Warszawa 27 lutego 2007 SKONSOLIDOWANE RACHUNKI ZYSKÓW I STRAT Bardziej szczegółowo REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW. OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA NIEPEŁNOSPRAWNEGO LUB PRZEWLEKLE CHOREGO
Załącznik nr 1 do Uchwały Okręgowej Rady Pielęgniarek i Położnych w Opolu Nr 786/VI/2014 z dnia 29.09.2014 r. REGULAMIN WSPARCIA FINANSOWEGO CZŁONKÓW OIPiP BĘDĄCYCH PRZEDSTAWICIELAMI USTAWOWYMI DZIECKA Bardziej szczegółowo Turniej Piłkarski. Copa Manufaktura 2006
Turniej Piłkarski Regulamin Turnieju Piłkarskiego 1. Organizator, Termin, Miejsce 1. Głównym Organizatorem Turnieju Piłkarskiego Copa Manufaktura (zwanego dalej Turniejem) jest: 03-111 Warszawa, ul.podróŝnicza Bardziej szczegółowo Stanowisko Rzecznika Finansowego i Prezesa Urzędu Ochrony Konkurencji i Konsumentów w sprawie interpretacji art. 49 ustawy o kredycie konsumenckim
Prezes Urzędu Ochrony Konkurencji i Konsumentów Warszawa, 16 maja 2016 r. Stanowisko Rzecznika Finansowego i Prezesa Urzędu Ochrony Konkurencji i Konsumentów w sprawie interpretacji art. 49 ustawy o kredycie Bardziej szczegółowo APAp dla dzieci w zawiesinie
APAp dla dzieci w zawiesinie Paracetamol usp to skuteczny, wysokiej jakości lek o działaniu: II II przeciwgorączkowym przeciwbólowym Walory smakowe w przypadku leku dla dzieci są równie ważne jak skuteczność Bardziej szczegółowo Wykonanie podziału geodezyjnego działek na terenie powiatu gryfińskiego z podziałem na 2 zadania.
A / I N S T R U K C J A D L A W Y K O N A W C Ó W 1. Zamawiający Województwo Zachodniopomorskie - Zachodniopomorski Zarząd Dróg Wojewódzkich w Koszalinie, ul. Szczecińska 31, 75-122 Koszalin, tel. 94 342 Bardziej szczegółowo art. 488 i n. ustawy z dnia 23 kwietnia 1964 r. Kodeks cywilny (Dz. U. Nr 16, poz. 93 ze zm.),
Istota umów wzajemnych Podstawa prawna: Księga trzecia. Zobowiązania. Dział III Wykonanie i skutki niewykonania zobowiązań z umów wzajemnych. art. 488 i n. ustawy z dnia 23 kwietnia 1964 r. Kodeks cywilny Bardziej szczegółowo Dz.U. 2015 poz. 1302
Kancelaria Sejmu s. 1/6 Dz.U. 2015 poz. 1302 USTAWA z dnia 24 lipca 2015 r. o zmianie ustawy o pomocy osobom uprawnionym do alimentów, ustawy o emeryturach i rentach z Funduszu Ubezpieczeń Społecznych Bardziej szczegółowo Człowiek najlepsza inwestycja
Projekt Zostań przedsiębiorczym jest współfinansowany ze środków Europejskiego Funduszu społecznego, jest realizowany przez Starostowo Powiatowe w Siemiatyczach w partnerstwie w Polskim Centrum Edukacji Bardziej szczegółowo Seminarium 1: 08. 10. 2015
Seminarium 1: 08. 10. 2015 Białka organizmu ok. 15 000 g białka osocza ok. 600 g (4%) Codzienna degradacja ok. 25 g białek osocza w lizosomach, niezależnie od wieku cząsteczki, ale zależnie od poprawności Bardziej szczegółowo PROGRAM NR 2(4)/T/2014 WSPIERANIE AKTYWNOŚCI MIĘDZYNARODOWEJ
PROGRAM NR 2(4)/T/2014 WSPIERANIE AKTYWNOŚCI MIĘDZYNARODOWEJ IMiT 2014 1 1. CELE PROGRAMU Program ma na celu podnoszenie kwalifikacji zawodowych artystów tańca oraz doskonalenie kadry pedagogicznej i badawczo-naukowej Bardziej szczegółowo CHARAKTERYSTYKA PRODUKTU LECZNICZEGO
CHARAKTERYSTYKA PRODUKTU LECZNICZEGO 1. NAZWA PRODUKTU LECZNICZEGO Butamid, 1,5 mg/ml, syrop 2. SKŁAD JAKOŚCIOWY I ILOŚCIOWY Każdy ml syropu zawiera 1,5 mg butamiratu cytrynianu (Butamirati citras). Substancja Bardziej szczegółowo Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu
Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Jak ju wspomniano, kinesiotaping mo e byç stosowany jako osobna metoda terapeutyczna, jak równie mo e stanowiç uzupe nienie innych metod fizjoterapeutycznych. Bardziej szczegółowo WZORU UŻYTKOWEGO EGZEMPLARZ ARCHIWALNY. d2)opis OCHRONNY. (19) PL (n)62894. Centralny Instytut Ochrony Pracy, Warszawa, PL
RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej d2)opis OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 112772 (22) Data zgłoszenia: 29.11.2001 EGZEMPLARZ ARCHIWALNY (19) PL (n)62894 (13) Bardziej szczegółowo REGULAMIN RADY RODZICÓW Szkoły Podstawowej w Wawrzeńczycach
REGULAMIN RADY RODZICÓW Szkoły Podstawowej w Wawrzeńczycach Rozdział I Cele, kompetencje i zadania rady rodziców. 1. Rada rodziców jest kolegialnym organem szkoły. 2. Rada rodziców reprezentuje ogół rodziców Bardziej szczegółowo PODNOSZENIE EFEKTYWNOŒCI PRZEDSIÊBIORSTWA - PROJEKTOWANIE PROCESÓW
BAROMETR REGIONALNY 33 PODNOSZENIE EFEKTYWNOŒCI PRZEDSIÊBIORSTWA - PROJEKTOWANIE PROCESÓW mgr in. Adam Piekara, Doradca w programie EQUAL Podstaw¹ niniejszego artyku³u jest przyjêcie za- ³o enia, e ka Bardziej szczegółowo RAPORT KWARTALNY za pierwszy kwartał 2012 r. Wrocław, 11 maj 2012 roku
RAPORT KWARTALNY za pierwszy kwartał 2012 r. Wrocław, 11 maj 2012 roku SPIS TREŚCI: 1. PODSTAWOWE INFORMACJE O SPÓŁCE... 3 2. WYBRANE DANE FINANSOWE Z BILANSU ORAZ RACHUNKU ZYSKÓW I STRAT... 4 WYKRES 1. Bardziej szczegółowo SEKCJA I: ZAMAWIAJĄCY SEKCJA II: PRZEDMIOT ZAMÓWIENIA. Zamieszczanie ogłoszenia: obowiązkowe. Ogłoszenie dotyczy: zamówienia publicznego.
Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.infish.com.pl/przetargi Olsztyn-Kortowo: Dostawa i montaż pompy ciepła wraz z wyposażeniem i Bardziej szczegółowo Na podstawie art.4 ust.1 i art.20 lit. l) Statutu Walne Zebranie Stowarzyszenia uchwala niniejszy Regulamin Zarządu.
Na podstawie art.4 ust.1 i art.20 lit. l) Statutu Walne Zebranie Stowarzyszenia uchwala niniejszy Regulamin Zarządu Regulamin Zarządu Stowarzyszenia Przyjazna Dolina Raby Art.1. 1. Zarząd Stowarzyszenia Bardziej szczegółowo SPIS TREŒCI. Przedmowa przewodnicz¹cego Rady Naukowej Czasopisma Aptekarskiego... 13. Od Autora... 15. Rozdzia³ 1
SPIS TREŒCI Przedmowa przewodnicz¹cego Rady Naukowej Czasopisma Aptekarskiego........................... 13 Od Autora........................................... 15 Rozdzia³ 1 ROLA I ZNACZENIE FARMAKOEKONOMIKI Bardziej szczegółowo Sprawozdanie Rady Nadzorczej KERDOS GROUP Spółka Akcyjna
Sprawozdanie Rady Nadzorczej KERDOS GROUP Spółka Akcyjna z oceny sprawozdania Zarządu z działalności KERDOS GROUP S.A. w roku obrotowym obejmującym okres od 01.01.2014 r. do 31.12.2014 r. oraz sprawozdania Bardziej szczegółowo PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO. w Urzędzie Gminy Mściwojów
Załącznik Nr 1 Do zarządzenia Nr 92/2012 Prezydenta Miasta Konina z dnia 18.10.2012 r. Instrukcja sporządzania skonsolidowanego bilansu Miasta Konina Jednostką dominującą jest Miasto Konin (Gmina Miejska Bardziej szczegółowo JĄDROWY REZONANS MAGNETYCZNY
JĄDROWY REZONANS MAGNETYCZNY - pierwsze prace to rok 1946 E.M.Purcell, H.S.Torrey, R.V.Pound, Phys. Rev. 69(1946) 37 F.Bloch, W.W.Hansen, M.E.Packard, Phys. Rev. 69(1946) 127 - pierwsze prace polskie J.W.Hennel, Bardziej szczegółowo Automatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla oceny użyteczności produktów i usług
Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu Wydział Informatyki i Gospodarki Elektronicznej Katedra Informatyki Ekonomicznej Streszczenie rozprawy doktorskiej Automatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla Bardziej szczegółowo CONSTRUCTOR. Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych. Deepstor P90 DRIVE -IN
CONSTRUCTOR Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych Deepstor P90 CONSTRUCTOR Magazyn w miejsce korytarzy Rega³y wjezdne P90 daj¹ mo liwoœæ zwiêkszenia powierzchni magazynowania nawet o 90% w porównaniu Bardziej szczegółowo STATUT KOŁA NAUKOWEGO PRAWA MEDYCZNEGO. Rozdział I. Postanowienia ogólne
STATUT KOŁA NAUKOWEGO PRAWA MEDYCZNEGO Rozdział I. Postanowienia ogólne 1 Koło Naukowe Prawa Medycznego, zwane dalej Kołem, jest dobrowolną organizacją studencką. Funkcjonuje na Wydziale Prawa i Administracji Bardziej szczegółowo USTAWA. z dnia 29 sierpnia 1997 r. Ordynacja podatkowa. Dz. U. z 2015 r. poz. 613 1
USTAWA z dnia 29 sierpnia 1997 r. Ordynacja podatkowa Dz. U. z 2015 r. poz. 613 1 (wybrane artykuły regulujące przepisy o cenach transferowych) Dział IIa Porozumienia w sprawach ustalenia cen transakcyjnych Bardziej szczegółowo Klasyfikacja i oznakowanie substancji chemicznych i ich mieszanin. Dominika Sowa
Klasyfikacja i oznakowanie substancji chemicznych i ich mieszanin Dominika Sowa Szczecin, 8 maj 2014 Program prezentacji: 1. Definicja substancji i mieszanin chemicznych wg Ustawy o substancjach chemicznych Bardziej szczegółowo 7. REZONANS W OBWODACH ELEKTRYCZNYCH
OBWODY SYGNAŁY 7. EZONANS W OBWODAH EEKTYZNYH 7.. ZJAWSKO EZONANS Obwody elektryczne, w których występuje zjawisko rezonansu nazywane są obwodami rezonansowymi lub drgającymi. ozpatrując bezźródłowy obwód Bardziej szczegółowo REGULAMIN KONKURSU..Pilanie dbaj¹ o zasady i zawsze segreguj¹ odpady"
REGULAMIN KONKURSU..Pilanie dbaj¹ o zasady i zawsze segreguj¹ odpady" 1 Postanowienia ogólne ORGANIZATORZY Organizatorem konkursu jest Miejski Zak³ad Oczyszczania Wysypisko z siedzib¹ w Pile, ul. Kusociñskiego Bardziej szczegółowo Kuratorium Oświaty w Lublinie
Kuratorium Oświaty w Lublinie ZESTAW ZADAŃ KONKURSOWYCH Z CHEMII DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW ROK SZKOLNY 2014/2015 KOD UCZNIA ETAP OKRĘGOWY Instrukcja dla ucznia 1. Zestaw konkursowy zawiera 12 zadań. 2. Przed Bardziej szczegółowo ZAPYTANIE OFERTOWE. z dnia 21.04.2016. na stanowisko: specjalista systemów VR
ZAPYTANIE OFERTOWE z dnia 21.04.2016 na stanowisko: specjalista systemów VR 1. Nazwa Zamawiającego Signum Project sp. z o.o. Ul. Myśliwska 61/110, 30-718 Kraków 2. Postanowienia ogólne Niniejsze postępowanie Bardziej szczegółowo Szczegółowe wyjaśnienia dotyczące definicji MŚP i związanych z nią dylematów
1 Autor: Aneta Para Szczegółowe wyjaśnienia dotyczące definicji MŚP i związanych z nią dylematów Jak powiedział Günter Verheugen Członek Komisji Europejskiej, Komisarz ds. przedsiębiorstw i przemysłu Mikroprzedsiębiorstwa Bardziej szczegółowo Wniosek o rejestrację podmiotu w Krajowym Rejestrze Sądowym 1) FUNDACJA, STOWARZYSZENIE, INNA ORGANIZACJA SPOŁECZNA LUB ZAWODOWA
KRS-W20 Sygnatura akt (wypełnia sąd) CORS Centrum Ogólnopolskich Rejestrów Sądowych Krajowy Rejestr Sądowy Wniosek o rejestrację podmiotu w Krajowym Rejestrze Sądowym 1) FUNDACJA, STOWARZYSZENIE, INNA Bardziej szczegółowo CD-W00-00-0 Przetwornik stężenia CO 2 do montażu naściennego. Cechy i Korzyści. Rysunek 1: Przetwornik stężenia CO 2 do montażu naściennego
Karta informacyjna wyrobu CD-W00 Data wydania 06 2001 CD-W00-00-0 Przetwornik stężenia CO 2 do montażu naściennego W prowadzenie Johson Controls posiada w swojej ofercie pełną linię przetworników przekształcających Bardziej szczegółowo 4.1. Transport ISK SKIERNIEWICE, PL
TRANSPORT 18 4.1. Transport Transport, w szczególności towarów niebezpiecznych, do których należą środki ochrony roślin, jest zagadnieniem o charakterze przygotowawczym nie związanym ściśle z produkcją Bardziej szczegółowo INSTRUKCJA BHP PRZY RECZNYCH PRACACH TRANSPORTOWYCH DLA PRACOWNIKÓW KUCHENKI ODDZIAŁOWEJ.
INSTRUKCJA BHP PRZY RECZNYCH PRACACH TRANSPORTOWYCH DLA PRACOWNIKÓW KUCHENKI ODDZIAŁOWEJ. I. UWAGI OGÓLNE. 1. Dostarczanie posiłków, ich przechowywanie i dystrybucja musza odbywać się w warunkach zapewniających Bardziej szczegółowo 2016 © DocPlayer.pl Polityka prywatności | Warunki świadczenia usług | Zwrotny adres

References: art. 107
 Art.1
 art. 2
 art. 49
 art. 49
 art. 488
 art. 488
 art.4
 art.20
 art.4
 art.20
 Art.1