Source: https://www.jove.com/video/55996/localizacin-cuantitativa-de-una-protena-de-golgi-por-su-masa-centro?language=Spanish
Timestamp: 2019-02-21 04:20:29+00:00

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Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass | Protocol (Translated to Spanish)
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Localización cuantitativa de una proteína de Golgi por su masa centro de fluorescencia de imagen
Visualización de los Efectos de una experienciainicial positiva, Estímulo Táctil, sobre dendríticas morfología sináptica y la conectividad con Golgi-Cox tinción…
Published 9/25/2013
Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFPotoactivable…
Preparación de las muestras, imágenes y análisis protocolos para la microscopía de barrido filo de la navaja…
Análisis de SCAPem> N…
doi: 10.3791/55996
La localización precisa de los residentes de Golgi es esencial para la comprensión de las funciones celulares de lo Golgi. Sin embargo, la microscopía óptica convencional es incapaz de resolver la estructura sub-Golgi. Aquí describimos el protocolo para un método de súper-resolución microscopia convencional basado determinar cuantitativamente la localización sub-Golgi de una proteína.
Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).
El complejo de Golgi consta de cisternas apiladas en serie de membrana que pueden categorizarse aún más en las regiones sub-Golgi, incluyendo cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi y trans-red de Golgi. Funciones celulares de lo Golgi son determinadas por la distribución característica de sus proteínas residentes. La resolución espacial de microscopía óptica convencional es insuficiente para resolver la estructura sub-Golgi o cisternas. Así, la microscopía electrónica de inmuno-oro es un método de elección para localizar una proteína a nivel sub-Golgi. Sin embargo, la técnica y el instrumento están más allá de la capacidad de los laboratorios de biología celular la mayoría. Aquí describimos nuestro método de super-resolución recientemente desarrollado llamado localización de Golgi proteína por imágenes centros de masa (GLIM) sistemáticamente y cuantitativamente localizar una proteína de Golgi. GLIM se basa en protocolos de etiquetado estándar de fluorescencia y convencional campo amplio o microscopios confocales. Se trata de la calibración de la aberración cromática desplazamiento del sistema microscópico, la adquisición de la imagen y el análisis después de la adquisición. La localización de sub-Golgi de una proteína prueba cuantitativamente se expresa como el cociente de localización. Hay cuatro principales ventajas de GLIM; es rápida, basada en métodos convencionales y herramientas, el resultado de la localización es cuantitativo, y que ofrece ~ 30 resolución práctica de nm en el eje de Golgi. Aquí describimos el protocolo detallado de GLIM localizar una prueba de proteína de Golgi.
El aparato de Golgi juega un papel esencial en el tráfico endocíticas/secretoras de proteínas y lípidos (en lo sucesivo cargos) en células de mamífero1,2,3. En el Golgi, cargas son no sólo ordenan a varios compartimientos celulares pero también modificados por diversos tipos de glicosilación. El complejo de Golgi mamífero comprende numerosas pilas de Golgi conectadas lateralmente, que típicamente consiste en 4-11 sacos de membrana firmemente junto y planos llamados cisternas. Las cisternas de Golgi apiladas en serie tienen más la categoría, de un extremo al otro, medial, cisy trans-cisternas. En el trans-lado de una pila del Golgi, trans-saco de membrana la mayoría se convierte en una red de membrana tubular y retículo llamada trans-red de Golgi (TGN)4. En la vía secretoria, cargas derivados del retículo endoplásmico (ER) Introduzca un stack de Golgi en su cis-lado y entonces pasan secuencialmente por medial y trans-cisternas. Cargos eventualmente salir de Golgi en el trans-Golgi o TGN destinando a la membrana plasmática, endosomas o gránulos secretores.
Los mecanismos moleculares y celulares de cómo cargas de tránsito un stack de Golgi y cómo el Golgi mantiene su organización cisternal siguen siendo misterios y actualmente todavía están en un acalorado debate1. Una de las dificultades en este campo es que cisternas de Golgi sólo pueden resolverse en la microscopia electrónica (EM) desde la resolución de un microscopio óptico (~ 200 nm) es insuficiente para resolver los cisternas de Golgi (< 100 nm en ambos grueso cisternal y la distancia). Por lo tanto, la localización sub-Golgi de proteínas residentes y cargas de tránsito se determinan convencionalmente por la EM de inmuno-oro. Sin embargo, el inmuno-oro EM muy técnicamente es exigente y está más allá de la capacidad de los laboratorios de biología celular la mayoría. Aunque la resolución de la EM puede ser sub-nanométrica, la resolución de la EM de inmuno-oro es obstaculizada grandemente por el tamaño del anticuerpo complejo (primaria más el anticuerpo secundario) y la partícula de oro, y puede ser peor que 20 nm. Además, se obtienen las imágenes de la EM de secciones delgadas 2D en lugar de una visión global 3D de Golgi, que puede dar lugar a conclusiones erróneas según la posición relativa y orientación de la sección 2D5. Por ejemplo, estudiar una única sección de la EM es incapaz de distinguir confiablemente una vesícula de la vista ortogonal de un túbulo puesto que ambos pueden mostrar perfiles idénticos de membrana redonda. El advenimiento reciente de técnicas de microscopía de superresolución, tales como microscopía de iluminación estructurada en 3D (3D-SIM), estimuló el agotamiento de la emisión (STED), microscopía de localización fotoactivado (PALM) y estocástico reconstrucción óptica microscopia ( La tormenta), permite resolver las estructuras sub-Golgi en microscopios de luz6. Sin embargo, hay al menos cuatro desventajas que pueden limitar significativamente su uso en el estudio biológico de la célula del Golgi. 1) Super-resolución actual técnicas requieren configuración hardware caro y especial que está más allá de más laboratorios de biología celular. 2) protocolos de etiquetado fluorescencia especiales son necesarios para algunas técnicas de superresolución. 3) aunque, bajo las mejores condiciones, estas técnicas tienen 20-110 nm de resolución espacial, la resolución práctica obtenida en muestras reales puede ser mucho peor. 4) en comparación con microscopia convencional, estas técnicas de superresolución todavía tienen dificultades en la realización de multicolores, 3D o viven imágenes de celular, ya sea individualmente o en combinación. Probablemente lo más importante, inmuno-oro EM y las técnicas de microscopía de superresolución rendimiento cualitativo en vez de datos cuantitativos de localización.
Intentar solucionar parcialmente problemas mencionados anteriormente, recientemente hemos desarrollado un método de microscopía de luz convencional basado, que es el nombre de localización de Golgi proteína por imágenes centros de masa (GLIM), sistemáticamente y cuantitativamente localizar un Golgi proteína con una resolución equivalente a la de la inmuno-oro EM7. En este método, el Golgi en células mamíferos cultivadas se dispersa como mini-pilas de Golgi por el tratamiento de nocodazole, una droga despolimerizantes de microtúbulos. Estudios extensos han demostrado que inducida por nocodazole Golgi mini-pilas (en adelante mini-pilas de Golgi) asemejan nativas pilas de Golgi en la organización y las funciones celulares8,9,10, 11. El cociente de localización (LQ) de una proteína de prueba puede ser adquirido a través de GLIM y denota la localización sub-Golgi cuantitativa. Puede compararse con los valores numéricos de LQs y una base de datos LQ de más de 25 marcadores de Golgi ha estado disponible.
En GLIM, mini-pilas de Golgi son triple marcado por GM130 endógeno o exógeno expresado, mCherry GalT y la prueba de proteína (x). GM130 y GalT-mCherry, cis- y trans-marcadores de Golgi respectivamente12,13, proporcionar puntos de referencia. La fluorescencia triple, rojo (R), verde (G) y far-red (B), se muestran de forma artificial como rojo, verde y azul, respectivamente. Centro de masa de fluorescencia (en adelante centro) se adopta para lograr la resolución de sub-pixel. El eje de Golgi se define como el vector desde el centro de GM130 que mCherry GalT. La pila pequeña de Golgi se modela como una estructura cilíndrica con infinita simetría rotacional alrededor del eje de Golgi. Por lo tanto, una mini-pila de Golgi se puede modelar más como una estructura unidimensional en el eje de Golgi. LQ de la prueba de la proteína x se define como dx/d1, en el que dx es la distancia desde el centro de la x a la de GM130, d1 es la distancia desde el centro de GalT-mCherry de GM130. Si el centro de x fuera del eje, la distancia de proyección axial se utiliza para el cálculo. Las variables, incluyendo Golgi eje, ángulo axial, dx, d1, ángulo α y β del ángulo, GLIM se ilustran esquemáticamente en la figura 1. LQ es independiente del ángulo axial Golgi Aunque mini-pilas de Golgi se orientan aleatoriamente en una celda.
Mini-pilas de Golgi aparecen no homogéneas en imágenes. Hemos desarrollado tres criterios para seleccionar mini-pilas de Golgi analizables para GLIM. 1) el criterio de relación señal a ruido, en la que el cociente de la intensidad total de una mini-pila de Golgi a la desviación estándar (SD) del fondo es ≥ 30 en cada canal. Este criterio es asegurar la precisión del posicionamiento del centro de masa, que depende de los cocientes signal-to-noise de mini-pilas de Golgi. 2) el criterio ángulo o distancia axial, que requiere d1≥ 70 nm. d1 disminuye con el aumento del ángulo axial de Golgi. Cuando el ángulo axial se aproxima a 90 º o vertical, la mini pila llega a ser no puede resolver como d1 se acerca a 0. d1≥ 70 nm puede excluir con eficacia cerca vertical mini-pilas de Golgi. 3) el criterio de la colinealidad, en cual | tan α | o | tan β | es ≤ 0.3. Este criterio asegura que los tres centros de una pila de mini son suficientemente co-lineales para el modelo unidimensional de la pila pequeña de Golgi. Todos los microscopios ópticos sufren de aberración cromática que puede distorsionar seriamente las posiciones relativas de fluorescencia roja, verde y far-red centros. Aberración cromática de los sistemas del microscopio está calibrado experimentalmente por proyección de imagen 110 perlas de nm, que son triple marcado por fluorescencia roja, verde y far-red. Para cada imagen de grano, el centro de la red se define como la posición del talón y cromática-turnos de centros verdes y far-red están equipados de funciones polinómicas de primer orden. Centros de mini-pilas de Golgi están sujetos a las funciones polinómicas para corregir los cambios cromáticos-canales verdes y far-red.
A través de GLIM podemos alcanzar una resolución de ~ 30 nm en el eje de Golgi bajo condiciones estándar. Lo importante, proporciona un método sistemático para asignar cuantitativamente cualquier proteína de Golgi. GLIM puede realizarse por microscopios convencionales, como gran campo o microscopios confocales, con protocolos comunes de etiquetado de la fluorescencia. La proyección de imagen y procesamiento de datos pueden tomar tan cortos como una hora. A través de GLIM, hemos directamente demostrado la transición progresiva de la carga secretor de la cis- para trans-lado de la de Golgi7.
Nota: Abajo se encuentra un protocolo paso a paso de GLIM para determinar la tyrosylprotein LQ de EGFP-tagged sulfotransferasa 1 (TPST1), una enzima residente de Golgi en células HeLa.
1. preparación de Mini-pilas de Golgi marcados con fluorescencia
Preparar el vidrio cubreobjetos
Alícuota 0,3 mL estéril Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) en un pocillo de una placa de 24 pocillos en una campana de cultivo de tejidos.
Limpiar un pedazo de Φ 12 mm No.1.5 vidrio cubreobjetos utilizando papel de tejido suave aplicó con etanol al 70% para eliminar la suciedad en la superficie del cubreobjetos de vidrio. Utilice un par de pinzas afiladas brevemente tomar el cubreobjetos en etanol al 70%, transferir a la placa de 24 pocillos y hundirlo en el fondo del bien que contienen DMEM estéril.
Nota: Cubreobjetos de vidrio se esterilizan convencionalmente por llamas. Sin embargo, cubreobjetos bajo dicho tratamiento fácilmente crack posteriormente manipulación. remojo de etanol 70% es eficaz en la esterilización de vidrio cubreobjetos sin dañarlos.
Con la tapa cubierta, deje la placa de 24 pocillos en el 37 ° C CO2 incubadora hasta su uso.
Células de la semilla
Cultura HeLa (células de ahora en adelante) en un matraz T-25 en DMEM suplementado con 10% Fetal Bovino suero (FBS) (medio completo en adelante) en una incubadora de 37 ° C CO2 suministrada con 5% CO2. Los antibióticos no son necesarios aquí.
Cuando las células llegan a ~ 80% de confluencia, aspirar el medio de cultivo. Añadir 1 mL de 0.25% tripsina-EDTA en el matraz e incubar las células en una incubadora de 37 ° C CO2 para medio completo de 2 minutos agregar 1 mL en el matraz y lavar suavemente las células de la pared del matraz mediante pipeteo.
Transferir las células separadas a un tubo de centrifugación estéril y centrifugado a 500 x g durante 2 minutos para que sedimenten las células. Aspirar el sobrenadante y suspender el precipitado de células en medio completo 1 mL.
Aspire el medio en el pozo de placa de 24 pocillos que contienen el cubreobjetos de cristal esterilizada y la semilla ~ 1 x 105 células en el pozo. Reponer el volumen del pozo con medio completo a 0,5 mL. Incubar en una incubadora de 37 ° C CO2 suministrada con 5% CO2. Las células de la cultura ~ 80% de confluencia.
Transfectar las células
Nota: Las células bien extendidas son ventajosas para imágenes mini-pilas de Golgi dispersadas.
Transfectar ~ 80% células confluentes con 80 ng mCherry GalT7 y 320 ng TPST1-EGFP (véase Tabla de materiales) plásmidos de ADN utilizando un reactivo de transfección según el protocolo proporcionado por el fabricante. Incubar en una incubadora de 37 ° C CO2 . Cambiar el medio después de 4-6 h de incubación. Las células están listas ~ 12 h más tarde.
Tratamiento nocodazole generar mini-pilas de Golgi
Preparar una solución stock nocodazole (33 mM) 10 mg de polvo de nocodazole en dimetilsulfóxido 1 mL de disolución. Alícuota de la solución y almacenar a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
Diluir 1 μl de la solución madre nocodazole (33 mM) medio completo de 37 ° C de 1 mL (concentración final 33 μm). Centrifugar a velocidad máxima para quitar materia de partículas.
Aspire el medio en el pozo y añadir 0,5 mL de 33 nocodazole μm que contiene el medio completo. Incubar las células en una incubadora de 37 ° C CO2 para 3 h. proceda a inmunofluorescencia etiquetado (sección 1.5).
Inmunofluorescencia de etiquetado
Nota: Mantenga las células en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo de GalT-mCherry y TPST1-EGFP.
Preparar los reactivos de inmunofluorescencia de etiquetado
Para preparar solución de paraformaldehído al 4%, disolver el polvo de paraformaldehído al 4% (p/v) en caliente 1 X de tampón fosfato salino (PBS) y filtrar la solución con filtro de 0.45 μm. La solución puede conservarse a-20 ° C.
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es tóxico y cancerígeno y puede causar irritación de la piel. Use el apropiado equipo de protección personal (EPP).
Para preparar el tampón de dilución de la fluorescencia (FDB), mezcle 5% FBS (v/v) y el 2% (w/v) albúmina sérica bovina (BSA) en PBS 1 x. Filtrar la solución con filtro de 0.45 μm y la solución a-20 ° C.
Disolver 5,35 g de NH4Cl en polvo en 1 L de agua para preparar 100 mM NH4Cl y la solución a temperatura ambiente.
Disolver el polvo de saponina del 10% (p/v) en agua para preparar 10% saponina, alícuota y la solución a-20 ° C.
Enjuague una vez bien con 0,5 mL 1 x solución de PBS y agregar solución de paraformaldehído al de 4% 0,5 mL. Incubar por 20 min a temperatura ambiente. Enjuague dos veces con PBS de 1 x 0.5 mL y dos veces con 0,5 mL 100 mM NH4cl. Enjuague bien el bien dos veces con 0,5 mL 1 x PBS. Pueden mantener las células en PBS 1 x a 4 ° C durante la noche en la oscuridad.
Fluorescencia de etiquetado
Diluir 1 μl ratón anti-GM130 anticuerpo primario en 500 μl FDB que contiene 0.1% la saponina. Invierta la tapa de la placa de 24 pocillos y aplicar 10 μl de anticuerpo primario mezcla sobre la tapa.
Utilizar un par de pinzas afiladas para extraer y transferir el vidrio cubreobjetos sobre la gota de anticuerpo mezcla asegurándose que el lado de la célula está en contacto con la mezcla. Incubar las células con la mezcla de anticuerpo primario por 1 h a temperatura ambiente.
Nota: La tapa con el cubreobjetos puede colocarse en una bolsa de plástico humedecida en la oscuridad.
Utilizar un par de pinzas afiladas para extraer y transferir el cubreobjetos al pozo con la parte de la célula hasta y enjuague en 0,5 mL 1 x PBS tres veces ≥ 30 min agitación es innecesario.
Diluir 1 μl far-red fluoróforo conjugada cabra anti-ratón IgG (anticuerpo secundario) en 500 μl FDB que contiene 0.1% la saponina.
Lavar y limpiar la superficie del reverso de la tapa de la placa de 24 pocillos. Aplique 10 μl de anticuerpo secundario far-red mezcla sobre la tapa. Repita los pasos 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
Prepare el soporte de montaje mediante la mezcla de glicerol 1 g, poly(vinyl alcohol) g 2,2 (MW ~ Da 31.000), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) y 8,8 mL H2O. disolver la mezcla en un baño de agua de 60 ° C con Vortex de vez en cuando. La solución a-20 ° C.
El medio de montaje de descongelar y transferir 10 μl sobre un portaobjetos de vidrio. Superponer el cubreobjetos (lado de la célula hacia abajo) en la gota de medio de montaje. Incube el portaobjetos de cristal en 37 ° C por 30 minutos o a temperatura ambiente durante 1 h para endurecer el medio de montaje. Sellar el cubreobjetos con esmalte de uñas incoloro y almacenar el portaobjetos de cristal a-20 ° C.
2. preparación de perlas fluorescentes para la corrección de cambio cromático
Cubreobjetos de limpieza
Coloque cuidadosamente un trozo de 25 mm No.1.5 cubreobjetos de cristal sobre un bastidor de plástico.
Transferencia de la rejilla con el cubreobjetos un vaso de precipitados de 400 mL llena con 300 mL de 1 M NaOH y someter a ultrasonidos en un sonicador de baño (35 Watts) durante 15 minutos brevemente enjuague la rejilla en un vaso de precipitados de 400 mL se llena con 300 mL de agua desionizada. Transferencia de la bandeja un vaso de precipitados de 400 mL con etanol al de 99% 300 mL y someter a ultrasonidos en el sonicador de baño durante 15 minutos brevemente enjuague la rejilla en un vaso de precipitados de 400 mL se llena con 300 mL de agua desionizada.
Repita el paso 2.1.2 dos veces más.
Enjuague la rejilla con el cubreobjetos en 300 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados de 400 mL durante 10 minutos repetir el paso dos veces más. Transferencia de la bandeja a un horno de 60 ° C y el cubreobjetos por 1 h. tienda cubreobjetos secado en una placa Petri libre de polvo en seco.
Inmovilización de cuentas fluorescentes sobre el cubreobjetos de vidrio
Diluir 110 nm multi color fluorescente perlas 80-fold en 1 x PBS conteniendo 0,1 μg/μl BSA. Brevemente vortex el tubo para dispersar a los agregados de grano. Extensión 60 bolas de μl diluidas en limpio Φ 25 mm No.1.5 vidrio cubreobjetos (ver sección 2.1) utilizando una pipeta. Secar el cubreobjetos en un desecador conectado a una bomba de vacío en la oscuridad y montar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio en 50 μl de medio de montaje (ver paso 1.5.4.2).
3. adquisición de la imagen
Nota: GLIM requiere imágenes de alta relación de señal a ruido (SNR) para el cálculo del centro de masas de alta precisión. La imagen puede ser adquirida por microscopios convencionales tales como el láser de barrido confocal, microscopio confocal o campo amplio de disco giratorio. Un microscopio de campo amplio equipado con plan apocromática lentes del objetivo y un sensor de imagen de poco ruido, como un dispositivo de carga acoplada (CCD) y científico semiconductor complementario de óxido metálico (sCMOS) puede ser utilizado. Parámetros para el sensor de la imagen se ajustan para asegurar un bajo leer-ruido y alto rango dinámico. El microscopio debe estar equipado con la configuración óptima de filtros de fluorescencia verde, mCherry y fluoróforo far-red, y debe tener fluorescencia insignificante la diafonía. Idealmente, el sistema de proyección de imagen consigue una velocidad de muestreo de Nyquist en el x, eje y y z, que requiere normalmente la x, y y z tamaño de voxel a menos de 100, 100 y 200 nm, respectivamente. X e y tamaño de lo voxel siempre son igual y se denominan pixel_size. El pixel_size puede calcularse dividiendo el tamaño de sensor de cámara por la ampliación del sistema.
Perlas de varios colores de imagen
Abalorios de varios colores de imagen en canales verdes, rojo y far-red al principio y al final de cada sesión de imagen.
Nota: Aquí, imágenes fueron adquiridas a través de un microscopio de epifluorescencia convencional campo amplio (invertido) equipado con 100 X NA 1.4 objetivo plan apocromática, etapa motorizada, fuente de luz de haluro de metal de 200 vatios y 16-bit sCMOS cámara. Las longitudes de onda (pasabanda) del filtro de la excitación, espejo dicroico (pase largo) y filtro de emisión (pasabanda) del cubo del filtro de canal verde son 465-495, 505 y 515-555 nm; para el cubo del filtro de canal rojo son 528-553, 565 y 578-633 nm; y los del cubo del filtro de canal far-red 590-650, 660 y 663-738 nm. Durante la adquisición, el tamaño de un voxel a lo largo de x, eje y y z es 64, 64 y 200 nm, respectivamente.
Encontrar un campo de visión con la densidad del grano bueno.
Adquirir pilas de imagen 3D en verdes, rojos y far-red canales (canalG, canalR, canalB, respectivamente). Tomar 3 secciones por encima y por debajo del plano focal mejor (7 secciones por grupo). Guarde las pilas en tres como tres archivos TIFF.
Nota: El tiempo de exposición para cada canal se determina empíricamente para maximizar el rango dinámico, evitar la saturación de píxeles y minimizar el fotoblanqueo. Otros parámetros, tales como filtros y la x, y y z tamaño de voxel, son elegidos según lo discutido arriba.
Imagen mini-pilas de Golgi
Uso TPST1-EGFP y GalT mCherry transfectadas y fluorescencia etiquetada diapositivas (sección 1.5) para encontrar las células expresa TPST1-EGFP y un nivel medio o bajo de GalT-mCherry. Adquirir pilas de imagen 3D como se describe en el paso 3.1.3.
Adquirir centros de perlas fluorescentes
En ImageJ, abra un conjunto de imágenes de grano que consta de tres archivos TIFF (archivo > Imagen > abrir).
Promedio de 3 secciones consecutivas alrededor de la mejor sección enfocada en el canalR imagen > pilas > Proyecto Z. Introducir el número de la sección de "Inicio slice" y "Stop" y entre las opciones de "tipo de proyección", seleccione "Intensidad media".
Dibujar las regiones de interés (ROIs) que no contienen granos en la imagen con "Selecciones del polígono". En "Analyze > Set medidas", comprobar sólo "Valor medio de gris" y "Desviación estándar". Luego ejecutar "Analyze > medida" para obtener la media y del ROI.
Calcular la intensidad de fondo como "media + 6 × SD". Restar la imagen con los valores correspondientes de la intensidad del fondo por "proceso > Matemáticas > restar", el valor de intensidad de fondo correspondiente a este canal.
Repita los pasos 4.1.2 a 4.1.4 de canalG y canalB imagen pilas usando el mismo principio y detener la rebanada y el mismo fondo de retorno de la inversión. Tenga en cuenta que el retorno de la inversión utilizada en el paso 4.1.3 puede copiarse a canalG y canalB imágenes.
Unir las tres imágenes de fondo-restar (imagen > Color > Merge canales) seleccionando canalR en rojo, canalG como verde y canalB como azul. Se obtiene una sola imagen compuesta que consta de tres canales.
El administrador de ROI (Analyze > Herramientas > ROI Manager). Dibujar un ROI cuadrado alrededor solo cuentas asegurando que es sólo un grano en cada retorno de la inversión. Añadir el ROI a gerente de ROI pulsando "t" en el teclado. Repita este proceso y agregar tantos de la ROI posible.
En "Analyze > Set medidas", comprobar sólo "centro de masa".
Seleccione canalR, en el ROI Manager, haga clic en "Medir" para obtener centros; dos columnas correspondientes a x e y, coordenadas de centros de ROIs se mostrará en la ventana "Resultado". Copie y pegue las dos columnas en una hoja de cálculo.
Repita el paso 4.1.9 para canalG yB.
Arreglar las coordenadas de los centros en una sola hoja de cálculo en el siguiente orden: xR, yR,g, yG, xBe yB. Guarde la hoja de cálculo en formato ".csv" como "beads.csv". No dejar ningún espacio en el nombre del archivo.
Seleccionar y medir mini-pilas de Golgi
Instalar dos macros (adjunta en Materiales complementarios) en ImageJ, "Macro-Golgi ROI inspección" y "Macro-salida 3 canales de datos" por Plugins > instalar ". Claro ROI manager y ventana de resultados.
Abrir un conjunto de imágenes de mini-stack de Golgi que consta de tres archivos TIFF (archivo > Imagen > abrir).
Repita los pasos 4.1.2 - 4.1.5 y guardar las imágenes de fondo restan tres para su uso posterior. Registro el fondo SDs para canalR,G y canalB como SDR, SDG y SDB, respectivamente, para uso posterior.
Duplicar las tres imágenes de fondo resta generadas a partir de paso 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
En "proceso > Calculadora de imagen", primero agregue el fondo resta canalG imágenes canalR . Agregar la imagen resultante a la imagen de fondo resta canalB . A la imagen resultante, en "imagen > ajustar > umbral", seleccione "set" de entrada "1" como "Nivel umbral". Después de presionar "Aplicar", se dio lugar a una imagen binaria blanco y negro.
En "Analyze > analizar las partículas", el rango de tamaño para la entrada "tamaño (pixel ^ 2)". Entrada de "50-infinito". Compruebe "Excluye los bordes" y "añadir a". ROIs que contiene mini-pilas de Golgi se agregan ahora al Gerente de ROI.
Nota: El rango de tamaño y debe ser determinado empíricamente a excluir ruidos que son generalmente pequeños.
Unir las tres imágenes de fondo-restar (imagen > Color > Merge canales) de paso 4.2.3 seleccionando canalR en rojo, canalG como verde y canalB como azul. Se genera una sola imagen compuesta que consta de tres canales.
Ejecute la macro "Inspección de Macro-Golgi ROI" seleccionando "Plugins > inspección de ROI de Macro-Golgi". En el cuadro de diálogo interactivo, visualmente cada retorno de la inversión para mantener o rechazarlo. Seleccione ROIs que contienen un único objeto en los tres canales.
Nota: Después de ejecutar esta herramienta, ROIs rechazados se eliminan desde el administrador de ROI.
Ver sólo "Área", "Valor de gris medio" y "Centro de masa" "Analyze > Set medidas". Adquirir datos con el lanzamiento de la herramienta de macro "Macro-salida 3 canales de datos" (Plugins > Macro salida 3 canales de datos).
Nota: Áreas, intensidades medias y centros (x e y) de ROIs en canalR,G y canalB se muestran en la ventana "Resultado".
Copia x e y coordenadas de los centros en una hoja de cálculo y organizar en el siguiente orden: xR, yR,g, yG, xBe yB. Guarde la hoja de cálculo como un archivo ".csv" (ministacks.csv). No dejar ningún espacio en el nombre del archivo. Proceder a la corrección de cambio de cromática de los centros (sección 4.3) y el cálculo de LQ (sección 4.4).
Corrección cromática-cambio de centros de
Instalar Matlab Compiler Runtime (MCR).
Instalar los siguientes archivos en una carpeta de trabajo dedicado: my_train.exe y my_test.exe. Copiar y pegar "beads.csv" y"ministacks.csv" archivos en la misma carpeta.
Inicie "El símbolo del sistema" de Windows y vaya a la carpeta de trabajo escribiendo el siguiente comando " cd path_of_working_folder".
Generar un archivo de calibración cromática cambio mediante centros de granos. Escriba el siguiente comando "my_train.exe granos.csv calibraciónMat 1". Se crea un archivo llamado"calibraciónMat" en la carpeta de trabajo. Ignorar otros archivos que se generan.
Corregir el cambio cromático de centros de mini-pilas de Golgi escribiendo el siguiente comando "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv calibraciónMat 1".
Nota: Se crea un archivo llamado"corrected_ministacksCSV" en la carpeta de trabajo. Contiene cambio de cromática corregidas coordenadas de los centros, que se arreglan en la orden deG, yG,B y yB. Ignorar otros archivos que se crean. Tome nota que el canal rojo se define como libre de aberración cromática y, por tanto, xR y yR son los mismos como datos sin procesar.
Cálculo de LQs
Lanzar el software de análisis de datos y copiar y pegar, en la por debajo de la secuencia, significa valores de gris, zonas, fondo SDs de paso 4.2.3 (colocarlos en fila 1) y cromática cambio corregido x e y coordenadas de mini-pilas de Golgi en el canalR en un hoja de cálculo de columnas A E. Asimismo, transferir datos correspondientes para canalG yB a las columnas F a J y K a O, respectivamente.
Añadir ocho nuevas columnas P a W, llamado "integrada intensidad de canal I", "intensidad integrado de canal G", "intensidad integrado de canal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) y LQ.
Haga clic derecho en la parte superior de la columna correspondiente y seleccione "Establecer los valores de la columna" para calcular los valores de cada columna. Para la columna P, de entrada "Col(A)Col(B)"; para la columna Q, entrada "Col(F)Col(G)"; para la columna R, entrada "Col(K)Col(L)"; para la columna S, entrada "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" donde "pixel_size" es el tamaño del pixel en nm; para la columna T, entrada "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; para la columna U, la entrada "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; para la columna V, entrada "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; para la columna W, entrada "Col (T) / Col (S)".
Filtro mini-pilas de Golgi de los tres criterios descritos en la Introducción.
En el software de análisis de datos, ir a la "hoja de trabajo > consulta de hoja de cálculo" y seleccione las variables de la columna para prueba "If". Asignar los siguientes alias I1, I2, I3, d1, A y B para columnas "integrada intensidad de canal I", "intensidad integrado de canal G", "intensidad integrado de canal B", d1, ABS(tan a) y ABS (tan b), respectivamente. En el "si condición" caja, entrada "I1 > =30*cell(1,3) y I2 > =30*cell(1,8) y I3 > =30*cell(1,13) y d1 > = 70 y (A < = 0.3 o B < = 0.3)".
Seleccionar "Extraer a la nueva hoja de cálculo", haga clic en "Aplicar". Columnas A-w de mini-pilas de Golgi analizables son extraídos a una nueva hoja de cálculo.
En la hoja de cálculo nueva, haga clic derecho la parte superior de la columna W, seleccione "estadísticas de columna > diálogo abierto". Verificación "N total", "Media", "SE de media", "Histogramas". Luego se muestra el análisis estadístico de LQs.
El microscopio óptico de grado investigación moderna equipado con una lente apocromática de plan, como el utilizado en nuestro laboratorio, muestra mínima aberración cromática (figura 2A). Sin embargo, un examen cuidadoso de la imagen del grano fluorescente varios colores puede revelar el cambio de imágenes de diferente color del grano mismo (figura 2B). Definimos que el canal rojo está libre de la aberración cromática y por lo tanto centros de fluorescencia roja son las verdaderas posiciones de granos. Los cambios cromáticos relativa de la fluorescencia verde y far-red se pueden representar por vectores verdes y azules procedentes del centro de la fluorescencia roja (figura 2C). El cambio cromático en el plano de la proyección de imagen se ilustra empíricamente por el vector verde y azul para cada grano (figura 2D). Para nuestro microscopio cromático-cambios no son uniformes como magnitudes y direcciones del cambio de turnos según x y y. El cambio cromático puede afectar significativamente la precisión de GLIM como el cambio de centros de far-red puede ser tanto como 50 nm. Por lo tanto, debe corregirse el cambio cromático. Una vez que se adquieren centros de granos, contamos con primer orden polinómico guarnición para calibrar y corregir posteriormente las cromática cambios de centros. La aberración cromática desplazamiento es mejorada por este método (figura 2 D-G).
En células de mamíferos, el complejo de Golgi se agregan en el área perinuclear que generalmente no puede ser resuelto bajo un microscopio óptico convencional (figura 3A). Después del tratamiento nocodazole durante 3 horas, el perinuclear de Golgi desaparece y decenas de mini-pilas de Golgi montan en los sitios de salida de retículo endoplásmico en el citoplasma (figura 3B). Grandes trozos de membrana de Golgi y mini-pilas de Golgi agregadas están presentes y no son seleccionados para el análisis. Una imagen de ejemplo que ilustra la selección de mini-pilas de Golgi se muestra en la figura 3C. Con la herramienta de "Inspección de Macro-Golgi ROI", Golgi seleccionado 40 mini pilas aparecen en la figura 3D. Después de aplicar los tres criterios, 21 mini-pilas de Golgi fueron analizables y elegido para el cálculo de LQs de TPST1-EGFP (D;figura 3como "L"), con sus estadísticas se muestra en la figura 3E. En total, se seleccionaron 111 analizable Golgi mini-pilas de 12 celdas y el LQ de TPST1-EGFP fue medido para ser 0,04 0,76 (media ± SEM; n = 111) (figura 3F). El LQ de TPST1-EGFP lo posiciona entre giantin (LQ = 0,59) y Rab6 EGFP (LQ = 1.04)7. Está cerca de GS15 (LQ = 0,83) y ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Hemos definido las regiones sub-Golgi según LQs analizando datos cualitativos de localización de la literatura: ERES/ERGIC, < -0.25; cis, ± 0.00 0.25; medial, ± 0.50 0.25; Trans-Golgi, 1,00 ± 0.25 y TGN, 1.25-2.00. El LQ de TPST1-EGFP indica por lo tanto, su trans-localización de Golgi, que está de acuerdo con un anterior estudio14.
Figura 1 . Ilustraciones esquemáticas mostrando Variables utilizadas en el cálculo de GLIM. Vista de xz (A) de una mini-pila de Golgi que tiene centros de co-axial de GM130, mCherry GalT y proteína x fluorescencia que Golgi eje, ángulo axial, dx y d1. La imagen de la pila pequeña de Golgi es su proyección sobre el plano de imagen. (B) vista de xy de un stack de Golgi mini con centro fuera del eje de la proteína x mostrando el ángulo α, el ángulo β y la proyección axial distancia dx. A y B son adaptados de la figura 1E yF de la figura 1de nuestra anterior publicación7, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Corrección de la cromática cambio. (A) la imagen combinada tricolor de 110 nm multicolor los granos adquiridos por un microscopio de campo amplio. Cada grano emite verde, rojo y far-red (artificial de color azul) fluorescencia. Escala de la barra, 10 μm. (B) Vista ampliada de una imagen de grano solo combinada con un notable cambio cromático. Escala de la barra, 200 nm. (C) A diagrama esquemático que muestra que cambios de imágenes de grano verde y far-red pueden ser representadas por vectores del centro de la imagen de grano rojo (0,0) a centros de verde (verde vector) y far-red (vector azul) del grano, respectivamente. (D, E) El efecto de la corrección de cambio cromático. Dentro del campo mismo de la imagen, vectores verdes y azules se trazan antes y después de cambio de corrección. Para visualizar el pequeño cambio, la magnitud de cada vector es amplificada 200-fold. (F, G) Dispersión de parcelas centros de demostración de cuentas de far-red (puntos azules) y verde (puntos verdes) antes y después de la corrección de cambio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Un ejemplo típico de GLIM, adquiriendo aquí LQ TPST1-EGFP. Una célula HeLa expresar TPST1-EGFP (verde) y GalT-mCherry (rojo) fueron manchadas para GM130 endógena (azul). (A) A la célula típica. (B, C, D, E) Una célula con nocodazole era reflejada (B). De la imagen, mini-pilas de Golgi analizables fueron seleccionadas como se muestra en C. Las mini-pilas de Golgi están marcadas por números de identificación. Imágenes de estos mini-pilas de Golgi enmascaradas se muestran a continuación en D con sus números de identificación. "L" indica que la mini-pila de Golgi es válida para el cálculo de LQ (pilas mini de Golgi analizables). Histograma de LQs de 21 mini-pilas de la celda se muestra en E. (F) histograma de LQs de 111 mini-pilas de 12 celdas. El valor se muestra en el histograma es media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Materiales complementarios: Macro-Golgi ROI inspection.ijm, Macro-salida 3 canales data.ijm, códigos de Matlab, template.opj My_train.exe, My_test.exe y hoja de cálculo.
Previamente, la localización de una proteína de Golgi en la microscopía se cuantificó principalmente por el grado de correlación o superposición de la imagen de la proteína con la imagen de un marcador de Golgi de localización conocidos15,16, 17. La correlación resultante o superposición coeficiente refleja cómo está cercano la proteína prueba es el marcador de Golgi espacial. Hay al menos tres advertencias para este enfoque. En primer lugar, la correlación o coeficiente de la superposición no es lineal y no indica directamente la distancia espacial. En segundo lugar, el grado de correlación es críticamente dependiente de la resolución del sistema microscópico. Por lo tanto, el coeficiente entre dos proteínas de Golgi no es una constante independiente del sistema. Tercero, dos proteínas de Golgi con la misma localización axial pero diferente distribución lateral a lo largo de cisternas pueden tener coeficientes distintos. Por lo tanto, la correlación o coeficiente de la superposición no indica la localización axial de una proteína de Golgi. En un método alternativo propuesto por Dejgaard et al., cis, trans-Golgi marcadores y la proteína de interés son triple-etiquetados en nocodazole tratados pilas mini de Golgi, similares a GLIM. Dentro de cada pila de Golgi pequeño, se adquieren posiciones de los tres píxeles de intensidad máxima y la posición relativa de la prueba de proteína se calcula como un cociente de la distancia del18. Sin embargo, su método es incapaz de lograr la resolución de sub-pixel, que limita enormemente su aplicación. En comparación con los métodos cuantitativos anteriores, GLIM, que fue desarrollado de forma independiente pero que tiene un concepto similar a la de Dejgaard et al., es capaz de cuantificar la localización axial de una proteína de Golgi con consistencia y precisión sin precedentes.
Presentamos el protocolo de GLIM adquirir LQ de exógeno expresa proteína GFP-tagged-TPST1-EGFP. LQ de proteína endógena se puede determinar si su anticuerpo está disponible. Dependiendo de la especie del anticuerpo primario, ratón o conejo, y un anticuerpo anti-GM130 conejo o ratón, respectivamente, puede utilizarse en el protocolo de etiquetado triple. Anticuerpos anti-GM130 conejo y ratón para inmunofluorescencia etiquetado están comercialmente disponibles. Previamente hemos demostrado que anticuerpos anti-GM130 conejo y ratón dan los mismos resultados en GLIM7. Si la proteína prueba es intrínsecamente roja en la emisión de fluorescencia, como fusión de mCherry, un Golgi tagged GFP proteína marcador con LQ conocido en combinación con GM130 anticuerpo etiquetado puede utilizar células triple etiqueta y deducir indirectamente el LQ de la proteína prueba. Suponiendo que el marcador proteico LQ es LQm y la distancia desde el centro de la proteína del marcador hasta que GM130 es dm, LQ de la proteína prueba x puede calcularse como (dx/dm) × LQm. Una de las mayores ventajas de GLIM en comparación con la microscopía de superresolución es que fácilmente puede aplicarse a la proyección de imagen de células vivas en las configuraciones microscópicas convencionales. Hemos intentado una combinación de tres proteínas de fluorescencia, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 y GalT-iRFP670, para monitorear dinámicamente el LQ de GFP-Golgin84 en solo Golgi pilas mini7.
En GLIM, el paso más lento es el análisis después de la adquisición, sobre todo en la selección de mini-pilas de Golgi analizables. Como mini-pilas de Golgi son heterogéneas tanto en tamaño como en composición molecular19, no está claro si la distribución de LQs (figura 3F) representa la arquitectura heterogénea de mini-pilas de Golgi o la incertidumbre de nuestro cálculo de la LQ. Independientemente de las causas, encontramos que es importante tener un gran número de analizable Golgi mini-pilas (n) para asegurar la exactitud de la LQ, que es cuando n es pequeño. Por lo general, los datos con n ≥ 100 de varias celdas rendimientos LQs confiables. Por lo tanto, GLIM da los datos de localización promedio de conjunto, oscurecimiento de la individualidad de mini-pilas de Golgi. Otra limitación de GLIM es que asume que todas las proteínas de Golgi tienen una distribución estrecha alrededor de un centro único. Algunas proteínas de Golgi, como COPI subunidades, ARF1 y soluble N-etilmaleimida-sensible factor accesorio proteína del receptor (trampas)20,21, se han divulgado para distribuir ampliamente de la cis a la trans- Golgi y el TGN. Es probablemente inadecuado para el estudio de su localización de Golgi por LQ. GLIM actualmente implica la selección manual de las mini-pilas de Golgi, que es laborioso y subjetiva, el desarrollo futuro de GLIM será implementar una herramienta de software para seleccionar automáticamente mini-pilas de Golgi con mínima interferencia humana.
¿Qué es la resolución espacial de GLIM? Ya que LQ es un cociente, que es sin unidades, no indica una distancia espacial. Aquí, intentamos dar una estimación muy aproximada. La resolución espacial de GLIM puede definirse como la distancia axial más pequeña entre dos proteínas de Golgi puede resolver. Examen de LQs de varias proteínas de Golgi7, encontramos que SEMs de conjuntos de datos con gama 100 ≥ n alrededor de 0.03. Suponiendo que dos proteínas de Golgi tienen el mismo n = 100 y SEM = 0.03, el Golgi dos proteínas tienen diferente localización significativa por t-test (p < 0.05), es decir, puede resolver, si la diferencia entre sus LQs es ≥ 3 x SEM = 0,09. De los datos de EM, podemos estimar que la longitud axial de la pila pequeña de Golgi, que es también la distancia entre GM130 y GalT mCherry en GLIM, es ~ 300 nm8. Por lo tanto, la resolución de GLIM se estima 0.09 × 300 = 30 nm en el eje de Golgi. En GLIM, un n mayor rendimientos generalmente SEM más pequeños, que a su vez resulta en una mayor resolución.
Es probablemente inadecuado comparar directamente la resolución de GLIM de inmuno-oro EM ya que la última técnica no cede directamente los datos cuantitativos de localización. Similar a GLIM, la resolución de la EM de inmuno-oro a lo largo del eje de Golgi puede definirse como la distancia más pequeña entre dos marcadores de Golgi puede resolver. Para medir su resolución requiere el estudio de inmuno-oro doble etiquetado de dos proteínas de Golgi que están cerca adyacentes a lo largo del eje de Golgi. Tal estudio sistémico es probablemente de carácter según nuestro conocimiento. Como comentamos en la introducción, uno de los factores limitantes en la resolución espacial de la EM de inmuno-oro es el gran tamaño del anticuerpo complejo, que hace la resolución a ser peor que ~ 20 nanómetro. Otro factor limitante importante de la resolución de imagen es la densidad del etiquetado de las moléculas de antígeno. Según la teoría de muestreo de Nyquist, debe haber al menos dos partículas de oro por la unidad de resolución. En la mayoría de los estudios inmuno-oro EM, las distancias entre las partículas de oro vecino no se < 15 nm debido a la muy baja etiquetado eficiencia; Esto hace difícil esta técnica lograr una resolución de imagen inferior a 30 nm. Desde este punto de vista, estimamos que la resolución de GLIM es al menos comparable a la de la EM de inmuno-oro.
GLIM es un método robusto que da resultados muy consistentes. Es independiente del tipo de microscopio. Hemos probado microscopios confocal de disco de gran campo y spinning produjo los mismos resultados. LQs de las proteínas de Golgi mismo adquiridas en diferentes lotes de experimentos fueron también en buen acuerdo con los demás. Se ha generado una base de datos LQ que consiste en un proteínas residentes de la diversa gama de Golgi para la comparación e interpretación. Esperamos que más uso de GLIM en la comunidad de investigación ampliará significativamente la base de datos. Por lo tanto, una base de datos mas cuantitativo que describe la localización de un gran número de proteínas de Golgi será de gran ayuda en la comprensión de la organización y función del complejo de Golgi.
Nos gustaría agradecer a D. Stephens (Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido) por el plásmido de ADN TPST1-EGFP, como Lakshmi Narasimhan Govindarajan para ayudar con la optimización de software. Este trabajo fue financiado por becas del Consejo Nacional de investigación médica (NMRC/CBRG/007/2012), Ministerio de Educación (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 y RG132/15 y AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) a L.L.
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody
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