Source: https://www.jove.com/t/60273?language=Spanish
Timestamp: 2020-08-10 19:38:39+00:00

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Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy | Protocol (Translated to Spanish)
Los efectos de los inhibidores migratorios en la migración de células cancerosas de glioma en ensayos de invasión tridimensionales (3D) utilizando un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) se caracterizan por una microscopía confocal de alta resolución.
El descubrimiento y desarrollo de fármacos en la investigación del cáncer se basa cada vez más en pantallas de drogas en un formato 3D. Se están descubriendo nuevos inhibidores dirigidos al potencial migratorio e invasivo de las células cancerosas, y en consecuencia a la propagación metastásica de la enfermedad, y se consideran tratamientos complementarios en cánceres altamente invasivos como los gliomas. Por lo tanto, se requiere generar datos que permitan el análisis detallado de las células en un entorno 3D después de la adición de un medicamento. La metodología descrita aquí, combinando ensayos de invasión esferoide con captura de imágenes de alta resolución y análisis de datos mediante microscopía de escaneo láser confocal (CLSM), permitió la caracterización detallada de los efectos del potencial inhibidor antimigratorio MI-192 en células de glioma. Los esferoides se generaron a partir de líneas celulares para ensayos de invasión en placas de 96 pocillos de bajo adherente y luego se prepararon para el análisis de CLSM. El flujo de trabajo descrito se prefirió sobre otras técnicas de generación de esferoides de uso común debido a la facilidad y la reproducibilidad. Esto, combinado con la resolución de imagen mejorada alcanzada por microscopía confocal en comparación con los enfoques convencionales de campo ancho, permitió la identificación y el análisis de cambios morfológicos distintos en las células migratorias en un entorno 3D tratamiento con el fármaco migratorio MI-192.
Las tecnologías de esferoides tridimensionales para el descubrimiento de fármacos preclínicos y el desarrollo de fármacos potenciales contra el cáncer se están favoreciendo cada vez más con las pantallas de fármacos convencionales; por lo tanto, hay más desarrollo de medicamentos migratorios —prevención de migración e invasión—. Los fundamentos de estos desarrollos en el tratamiento del cáncer son claros: los ensayos de esferoides 3D representan un enfoque más realista para la detección de posibles fármacos contra el cáncer, ya que imitan la arquitectura de tumores 3D más fielmente que las culturas monocapa celular, recapitular las interacciones droga-tumor (cinética) con mayor precisión, y permitir la caracterización de la actividad farmacológica en un entorno relacionado con el tumor. Además, el aumento de la resistencia a los medicamentos quimiotóxicos en muchos tipos de cáncer y las altas tasas de mortalidad entre los pacientes con cáncer debido a la metástasis potenciada por la capacidad de las células cancerosas para migrar a sitios tumorales distantes apoya la inclusión de agentes quimioterápicos el potencial migratorio de las células cancerosas como tratamiento adyuvante en futuros ensayos clínicos de cáncer1. Este es particularmente el caso en cánceres altamente invasivos, como los glioblastomas de alto grado (GBM). El manejo de GBM incluye cirugía, radioterapia y quimioterapia. Sin embargo, incluso con el tratamiento combinado, la mayoría de los pacientes recaen dentro de 1 año del diagnóstico inicial con una mediana de supervivencia de 11-15 meses2,3. En los últimos años se han realizado enormes avances en el campo de la tecnología 3D: sistemas rotativos, estructuras microfabricadas y andamios 3D, y otros ensayos individuales se están mejorando continuamente para permitir realizar pruebas rutinarias a gran escala4, 5,6,7. Sin embargo, los resultados obtenidos de estos ensayos deben analizarse de manera significativa porque la interpretación de datos a menudo se ve obstaculizada por los intentos de analizar datos generados por 3D con sistemas de análisis de imágenes 2D.
A pesar de ser preferible en términos de velocidad de adquisición de imagen y reducción de la fototoxicidad, la mayoría de los sistemas de campo ancho siguen estando limitados por la resolución8. Por lo tanto, aparte de las lecturas de datos relacionadas con la eficacia de los medicamentos, los efectos detallados de la acción del fármaco en las estructuras celulares 3D de las células migratorias se pierden inevitablemente si se imágen utilizando un sistema de campo amplio. Por el contrario, la microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) captura imágenes de alta calidad seccionadas ópticamente que se pueden reconstruir y renderizar en 3D después de la adquisición utilizando software informático. Por lo tanto, CLSM es fácilmente aplicable a las estructuras celulares 3D complejas de imágenes, lo que permite el interrogatorio de los efectos de los inhibidores antimigrastres en las estructuras 3D y análisis en profundidad de los mecanismos de migración celular. Esto sin duda guiará el desarrollo futuro de fármacos migratorios. Aquí, se describe un flujo de trabajo combinado de generación de esferoides, tratamiento de fármacos, protocolo de tinción y caracterización mediante microscopía confocal de alta resolución.
1. Generación de esferoides celulares
Prepare el medio de cultivo estándar según lo requiera la línea celular bajo investigación.
Llevar a cabo todos los pasos asociados al cultivo de tejido en una campana de cultivo de tejido utilizando técnicas de manejo estéril.
Triptiza y cuenta las células cancerosas. Utilice 20 ml de suspensión celular por placa. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados.
Agregue un número predeterminado de celdas a cada pocal. Tanto el número inicial de células como el tamaño final de los esferoides requeridos depende de la tasa de proliferación de la línea celular que se está investigando.
NOTA: Para las líneas celulares de glioma establecidas como U251 y KNS429,10, 5 x 103 células/ml producirán un esferoide microscópicamente visible (200 u 800 m) después de 4 días de incubación.
Resuspenda las células en tubos universales mediante una inversión suave para evitar el aglutinamiento celular. Pipetear 200 l de la suspensión celular en cada pocal de una placa de 96 pocillos. Si no se requieren todos los pozos, es aconsejable añadir 200 éL de 1x PBS a cada pozo vacío para evitar la evaporación.
Incubar las células en una incubadora de forma normal a 37 oC.
NOTA: Las líneas celulares como las líneas celulares del cáncer de glioma formarán esferoides dentro de 24 h. Permitir que se forme la arquitectura celular 3D incubando el esferoide durante 72 h.
Compruebe las células mediante microscopía de campo brillante después de 24 h. Dependiendo de la línea celular, las células pueden haber formado un esferoide detectable en la parte inferior del pozo.
NOTA: Las líneas celulares de cáncer de glioma establecidas forman fácilmente esferoides dentro de las 24 h. Las líneas celulares de cáncer de glioma derivadas del paciente pueden tardar hasta 1-2 semanas.
2. Ensayo de invasión de colágeno
Colocar colágeno, medio de cultivo 5x, 1 M NaOH y un tubo de 20 ml sobre hielo.
Añadir con cuidado y lentamente 10,4 ml de colágeno frío en un tubo de cultivo refrigerado. Evite las burbujas. Esta cantidad de colágeno es suficiente para una placa de 96 pocillos. La ampliación es posible, pero se recomienda preparar un tubo de 20 ml por placa a la vez.
Añadir suavemente 1,52 ml de medio de cultivo 5x estéril frío. Evite las burbujas.
Justo antes de su uso, agregue suavemente 72 ml de frío estéril 1 M NaOH. Mantenga la solución en hielo.
Mezcle suavemente pipeteando. Evite las burbujas. La mezcla eficiente conduce a un cambio de color (de rojo a rojo anaranjado (pH 7.4) en el medio. Deje la mezcla sobre hielo hasta su uso.
Paso crucial: Retire 190 ml de sobrenadante de la placa de 96 pocillos preparada en el día 1. Tenga mucho cuidado de no molestar a los esferoides que se formaron en la parte inferior del pozo. Utilice la pipeta en un ángulo hacia el lado, no el centro, del pozo.
Agregue suavemente 100 s de la mezcla de colágeno a cada poca. Para evitar cualquier perturbación esferoide, pipetee la mezcla por el lado del pozo. Evite las burbujas. Mantenga cualquier mezcla de colágeno restante en el tubo de 20 ml a temperatura ambiente para evaluar la polimerización.
Incubar la placa en la incubadora durante al menos 10 minutos para permitir que el colágeno se polimerice. Como pauta, si el colágeno sobrante se ha puesto, convirtiéndose en semisólido y similar a una esponja, los esferoides están listos para ser tratados con inhibidor.
Añadir los fármacos o inhibidores a la concentración 2x al medio de cultivo. Añadir el medio suavemente a cada pocal (100 ml por pozo). Una vez más, pipetear el medio por el lado del pozo para evitar la perturbación de los esferoides.
Observe e ilumine cada esferoide mediante microscopía de campo brillante a veces T a 0 h, 24 h, 48 h y 72 h para evaluar la actividad del fármaco. A continuación, devuelva la placa a la incubadora.
NOTA: Dependiendo del comportamiento invasivo de la línea celular, la migración lejos del núcleo esferoide original se puede observar a partir de las 24 horas en adelante.
3. Preparación de esferoides integrados de colágeno y células migratorias para microscopía confocal
Coloque la placa en una capucha de cultivo de tejido y retire suavemente el sobrenadante (200 l). Una vez más, tenga cuidado de no molestar al esferoide y evitar tocar el colágeno, ya que esto puede interferir con el tapón de colágeno.
Sustituya el sobrenadante por 100 s de 1pbS. Repita este paso de lavado 3x.
Retire el lavado final y sustitúyalo con un 4% de formaldehído en 1PBS (100 ml por poca).
PRECAUCION: El formaldehído es un carcinógeno potencial. Manipule con cuidado de acuerdo con las pautas de salud y seguridad.
Coloque la placa de 96 pocillos en un banco de laboratorio, cubra con papel de aluminio y déjela durante 24 horas a temperatura ambiente.
Retire cuidadosamente el formaldehído y sustitúylo por 1pbS. Repita este 1x lavado PBS 3x.
Preparar 0.1% Triton X-100 en 1x PBS. Retire el lavado de 1x PBS y sustitúyalo por 100 ml de la solución Triton X-100. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo con 1 x PBS y 0.05% leche desnatada en polvo y mezcle bien.
Retire Triton X-100 y lave 3x con 1pbS. Añadir 100 sL de solución de bloqueo a cada poca y incubar durante 15 min.
Diluir el anticuerpo primario requerido en el tampón de bloqueo a la concentración predeterminada. Aquí, utilice anticuerpo anti-ratón IgG acetilado de tubulina (1:100).
Centrifugar la mezcla tampón de bloqueo de anticuerpos primaria durante 5 min a 15.682 x g. Retire con cuidado la solución de bloqueo y agregue el sobrenadante (25 x 50 l) a cada poca. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h.
Retire la solución de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).
Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración recomendada o predeterminada, además de las manchas fluorescentes adicionales. Aquí, utilice 1:500 anti-ratón fluoróforo-488 anticuerpo conjugado, faloidin-594 (1:500) para la tinción de la actina, y la mancha de ADN (DAPI).
Una vez más, centrifugar la solución de anticuerpos secundarios durante 5 min a 13.000 rpm.
Retire la solución de bloqueo de cada pocal y añada 25 x 50 l de la mezcla secundaria de anticuerpos/phalloidin/DAPI. Incubar en la oscuridad durante 1,5 h a temperatura ambiente.
Retire la solución secundaria de anticuerpos y lave 3 veces con 1 pbS (100 ml por poca).
Levante con cuidado tapones de colágeno individuales mediante succión con una pipeta de plástico (200 l) en el centro de un portaobjetos de vidrio liso de alta calidad.
Agregue una gota de un mountante adecuado al tapón de colágeno, asegurándose de que el enchufe esté completamente cubierto. Evite las burbujas.
Aplicar el cubreobjetos del espesor óptimo para el objetivo del microscopio que se utilizará para la toma de imágenes y permitir que se ajuste durante la noche. Guarde los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Microscopía de fluorescencia
Capture imágenes fluorescentes utilizando un microscopio confocal adecuado.
La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones entre fármacos y tumores porque es más representativa del entorno específico del cáncer. La generación de esferoides se puede lograr de varias maneras; en este protocolo se utilizaron placas de baja adherencia de 96 pocillos. Después de probar varios productos de diferentes fabricantes, las placas utilizadas aquí fueron elegidas porque constantemente tuvieron el mejor desempeño en términos de producción exitosa de esferoides y uniformidad. El paso de reemplazo, donde el medio de crecimiento se sustituye por la matriz de colágeno, es un punto crítico del protocolo; se debe tener mucho cuidado para eliminar la mayor parte del medio sin molestar a la esferoide en sí. Las imágenes automatizadas para la caracterización de los efectos inducidos por fármacos mediante microscopía de campo ancho pueden considerarse para eliminar cualquier sesgo de controlador, pero los instrumentos disponibles comercialmente siguen siendo considerablemente más caros que los enfoques de imágenes aquí se describe.
La microscopía de epifluorescencia de campo ancho permite examinar el efecto de la actividad farmacológica en la migración e invasión celular. Sin embargo, la resolución alcanzada a partir de la microscopía de campo ancho no es lo suficientemente buena como para permitir una interpretación detallada de los resultados con respecto al efecto farmacológico sobre la morfología celular(Figura 1). Aquí, se describe la preparación de esferoides de glioma y células migratorias a través de protocolos de tinción fácilmente reproducibles, seguidos de imágenes utilizando un microscopio confocal. A partir del análisis de imágenes de microscopía de campo ancho, era evidente que se habían producido diferentes cambios morfológicos en las células del glioma después del tratamiento con el inhibidor MI-192, pero faltaban detalles claramente definidos. La microscopía confocal confirmó los hallazgos iniciales, y estas imágenes de mayor resolución permitieron la evaluación del efecto de MI-192 aún más. Se hicieron evidentes las diferencias significativas entre los esferoides no tratados (control), las células migratorias(Figura 2)y las esferoides y células tratadas (Figura 3). Mientras que la línea de células de glioma adulto U251 parecía migrar en "picos", irradiando lejos del núcleo esferoide original con un solo desprendimiento de células, la línea celular pediátrica KNS42 adoptó un patrón de migración similar a una hoja con pocos picos celulares distintos. Anteriormente, se observaron diferentes patrones de migración entre diferentes líneas celulares (aquí la línea de células glioma adultas U251 y la línea celular pediátrica KNS42), potencialmente reflejando el tipo de célula del que surgieron y el sitio del aislamiento tumoral. Fundamentalmente, también se descubrió un aumento de la tubulina acetilada con un aumento de la concentración de inhibidores (de 0,1 a 10 m), no sólo en las células migratorias, sino también en las células asociadas a los esferoides. Esto no era evidente en las imágenes iniciales de la microscopía de campo ancho adquirida. Las imágenes adicionales también permitirían el análisis cuantitativo de los niveles de expresión de proteínas como respuesta celular al tratamiento con inhibidores migratorios.
En este estudio, se demostró que las células cambiaron morfológicamente en respuesta al tratamiento; el redondeo celular se hizo evidente con el aumento de las concentraciones de inhibidores y la muerte celular a la concentración de inhibidores más alta (10 M), con la fragmentación nuclear evidente en las células U251 y los microtúbulos colapsados y la fragmentación nuclear en KNS42. Estos hallazgos están en consonancia con observaciones anteriores de que la actividad antimigratoria de MI-192 en las líneas celulares de glioma depende de la concentración dependiente13,14. El flujo de trabajo general del protocolo se muestra en la Figura 4.
Figura 1: Invasión de células esferoides en colágeno imaginado por microscopía de campo ancho. Las imágenes representativas de las líneas celulares U251 y KNS42 se muestran después del tratamiento con el inhibidor MI-192 a la concentración antirmigratoria de 1 M y a intervalos de 24 h. También se muestra un esferoide de control sin tratamiento. Los posibles efectos antirmigratorios o promigratorios se detectan como resaltados (flechas). Esto es especialmente notable en KNS42 con aparentemente ninguna migración en el control o esferoides tratados. Todas las imágenes fueron tomadas en 4x. Barra de escala a 1.000 m. Escala de barras en imágenes ampliadas para SF188 a 200 m, KNS42 a 1.000 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El efecto del inhibidor migratorio MI-192 en la línea de células de glioma U251 revelado por microscopía confocal. Los esferoides y células migratorias de glioma fijos y manchados muestran fenotipos migratorios distintos. Se muestran las células migratorias cercanas a los bordes esferoides originales. Los esferoides de células U251 se caracterizan por picos que se alejan del esferoide original con un aumento del redondeo celular en las células aparentes con el aumento de la concentración de inhibidores (la flecha indica el pico celular). Barra de escala a 10 m. Etiquetas: rojo , actina, verde, túbulina acetilada, azul a DAPI. Para cada imagen, se capturó una única sección óptica representativa con todos los ajustes con captura previa y posterior a la imagen mantenida con fines comparativos. Todas las imágenes fueron procesadas posteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: El efecto del inhibidor migratorio MI-192 en la línea celular glioma KNS42 revelado por microscopía confocal. La migración de KNS42 se caracteriza por protuberancias de hoja con picos de celda única (la flecha indica la hoja de celdas). En la concentración de inhibidores más baja este fenotipo parece ser pronunciado pero se pierde con el aumento de la concentración de inhibidores (barra de escala de 10 m); etiquetas: rojo , actina, verde, túbulina acetilada, azul a DAPI. Para cada imagen se capturó una sola sección óptica representativa, con todos los ajustes con captura previa y posterior a la imagen mantenidas con fines comparativos. Todas las imágenes fueron procesadas posteriormente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resumen del flujo de trabajo. En este flujo de trabajo se incorpora la generación de esferoides, que se incorporan en colágeno, tratamiento farmacológico, fijación, tinción e imágenes mediante microscopía confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Se describe una forma novedosa de crear esferoides de células cancerosas para la identificación de la actividad de los medicamentos migratorios mediante microscopía confocal de alta resolución. El uso de placas de bajo adherente sobre otras técnicas, como las gotas colgantes15,ha facilitado un medio de generación de esferoides reproducibles y uniformes para su uso en los ensayos de migración e invasión de colágeno. Los puntos críticos de este protocolo son la eliminación del medio de crecimiento de la placa de 96 pocillos antes de la incrustación de esferoides celulares en una matriz de colágeno y el manejo cuidadoso de los tapones de colágeno que contienen los esferoides a partir de entonces. Las nuevas tecnologías, como la microfluídica digital16, ya están disponibles y, aunque son más caras, podrían proporcionar una alternativa a la extracción manual de medios y fluidos. La principal limitación del protocolo descrito es que consume mucho tiempo cuando se toma una imagen de una sola esferoides y luego se analiza manualmente mediante microscopía de campo brillante con el fin de evaluar la actividad de los fármacos inhibidores. Además, los reactivos necesarios para todos los pasos del proceso son caros, y también se requiere un equipo especializado, a saber, un microscopio confocal de alta resolución. Los números celulares óptimos necesarios para la sembración y el tiempo necesario para obtener un esferoide celular del tamaño requerido también deben ser predeterminados antes del comienzo del ensayo de invasión de colágeno.
El desarrollo de medicamentos dirigidos a las células cancerosas, la detección de drogas a gran escala y la caracterización de la actividad farmacológica para la modificación y mejora de fármacos dependen cada vez más de los ensayos y la tecnología de las células 3D. Este protocolo se puede optimizar y adaptar para su uso con otros ensayos experimentales y numerosos otros tipos de células de importancia en otros sistemas de enfermedades. Hasta la fecha, la interpretación de los datos generados microscópicamente se ha visto obstaculizada por la aplicación de microscopía de campo ancho, con imágenes adquiridas que ofrecen una resolución limitada y plagadas de desenfoque de imagen inherente resultante de la luz procedente de la plano focal. Las imágenes de microscopía de campo ancho que se muestran aquí se adquirieron manualmente utilizando un sistema de imágenes EVOS, un proceso que llevaba mucho tiempo y que podía introducir un sesgo de controlador. Las nuevas tecnologías, incluidas las estaciones de trabajo automatizadas y las plataformas de análisis17,18, ya están disponibles, pero siguen siendo costosas y, por lo tanto, siguen sin estar disponibles para muchos laboratorios de investigación. Además, otros desarrollos de software podrían ayudar en el análisis de imágenes renderizadas en 3D de alta resolución para cuantificar con precisión los cambios fenotípicos como los aquí señalados, y por lo tanto la eficacia de los inhibidores en la migración celular. Además, la aplicación de técnicas de imágenes fluorescentes de superresolución que se están convirtiendo cada vez más en estándar en muchos laboratorios de investigación proporcionará una visión más detallada sobre el comportamiento migratorio y la morfología de las células cultivadas en esferoides 3D estructuras y tratadas con fármacos inhibidores.
Se estableció que es posible fijar y manchar esferoides, después del tratamiento con un inhibidor migratorio, cuando se incrusta en colágeno. Este método era fácil de realizar, con todos los pasos completados en placas de 96 pocillos, seguido de montar los tapones de colágeno que contienen los esferoides en los cubresítos para la toma de imágenes. Al evaluar el efecto de la actividad de los inhibidores en la morfología de las células cancerosas, se utilizó la microscopía confocal para dilucidar la actividad farmacológica. Los hallazgos iniciales sobre el efecto antimigratorio del inhibidor MI-192 a partir de imágenes de baja resolución fueron confirmados por microscopía confocal de alta resolución. Este inhibidor en particular se dirige a la histona deacetilasa 3 (HDAC3). Los HDAC son enzimas implicadas en la regulación epigenética de la expresión génica y recientemente han sido de creciente interés como objetivos potenciales en el desarrollo de fármacos contra el cáncer. Experiencias previas con MI-192 han demostrado que, a bajas concentraciones, regula la acetilación de la tubulina, lo que conduce a la hiperacetilación y estabilización de los microtúbulos. Los microtúbulos estabilizados son menos dinámicos, con un efecto potencial en las actividades migratorias de las células. Se comprobó que el efecto observado estaba presente tanto en las líneas representativas de células de glioma pediátricas como adultas. Se descubrió un aumento dependiente de la concentración en el estado de acetilación de la tubulina de ambas líneas celulares de glioma, un hallazgo que tiene implicaciones para la preselección de pacientes al considerar el tratamiento complementario con fármacos migrastáticas.
Nos gustaría dar las gracias al profesor Chris Jones por contribuir con la línea celular KNS42. El microscopio confocal Zeiss LSM880 con AiryScan utilizado en este trabajo es parte del Proyecto de Innovación e Incubación de Huddersfield (HIIP) financiado a través del Acuerdo de Crecimiento de la Asociación Empresarial de la Región de la Ciudad de Leeds (LEP). Crédito para la imagen del microscopio Figura 3: Carl Zeiss Microscopy GmbH, microscopy@zeiss.com.

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