Source: https://es.scribd.com/doc/102786166/FINAL-Informe-Fibras-2009-05-04
Timestamp: 2016-02-08 02:43:41+00:00

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FINAL Informe Fibras 2009-05-04
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Matriz(MALDI)5.3.La matriz5.4.El láser5.5.MALDI a presión atmosférica (AP-MALDI)6.Analizador de masa6.1.Introducción a los analizadores de masas6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)6.2.1.Analizador TOF Lineal6.2.2.Analizador TOF Reflector6.2.3.Analizador TOF / TOF6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron
Resonance)7.Detector7.1.Detector de copa de Faraday7.2.Multiplicador de electrones secundarios7.3.Detector "Channeltron"7.4.Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de
centelleo)7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia7.4.2.Descripción de los detectores Daly7.5.Detectores multicanal o microcanal7.6.Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas8.Espectros moleculares9.Introducción a la Espectroscopía Infrarroja9.1.La Espectroscopía9.2.Espectrometría infrarroja9.3.Sobre las vibraciones moleculares9.4.Modelos vibracionales10.El espetrómetro infrarrojo10.1.Funcionamiento y descripción10.2.Fuente de radiación10.3.Sistema óptico de dispersión10.4.Sistemas de detección10.5.Preparación de las muestras. Cubetas portamuestras11.Aplicaciones analíticas del espetrómetro infrarrojo12.Bibliografía y Agradecimientos12.1.Bibliografía12.2.AgradecimientosEspectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja.1
Departamento de Ing. Electrónica Cátedra: Fibras Ópticas para comunicaciones
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja
ALUMNO: Galasso Christian L.
christian_galasso81@yahoo.com.ar
Resumen: Determinar la distribución de tamaño de micropartículas es un problema que está adquiriendo cada vez una importancia mayor para la industria en general y la de procesos en particular, ya que impacta directamente en las tecnologías de separación de fase y en especial en las tecnologías medioambientales. La espectroscopia es una rama de la Ciencia Físico-Química que se ocupa del estudio de los "espectros" para conocer la forma de obtenerlos, la forma de medirlos y la aplicación al análisis químico. En el presente informe se verán dos técnicas utilizadas para la obtención de los espectros de los distintos materiales, ambas involucran el uso del láser; una de ellas es la espectrometría de masas MALDI y la otra es la espectrometría infrarroja, también conocida como espectroscopía infrarroja.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 2
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 3
1. Espectroscopia y Espectrometría, ¿Que son?.................................5
1.1.Métodos espectrométricos ...............................................5
1.1.1.Según la naturaleza de la excitación medida.........................5
1.1.2.Según el proceso de medida..........................................6
2. Introducción a la Espectrometría L.A.S.E.R.................................7
2.1.¿Que es la Espectrometría de Masas?.....................................7
2.2.Principios de la técnica................................................7
2.3.Implementación..........................................................8
2.4.Algunas definiciones....................................................9
3. Descripción general del espectrómetro.....................................12
3.1.Sobre los procesos asociados a la espectrometría.......................12
4. Entrada de la muestra.....................................................14
4.1.Entrada por sonda directa..............................................14
4.2.Sistemas de entrada cromatográficos[4,5]...............................15
4.2.1.Cromatografía de gases/Espectrometría de masas.....................15
4.2.2.Cromatografía HPLC/Espectrometría de masas.........................16
5. Fuente de ionización......................................................17
5.1.Descripción de las múltiples fuentes de ionización.....................17
5.2.Introducción Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz(MALDI).....18
5.3.La matriz..............................................................19
5.4.El láser...............................................................20
5.5.MALDI a presión atmosférica (AP-MALDI).................................21
6. Analizador de masa........................................................22
6.1.Introducción a los analizadores de masas...............................22
6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)...................22
6.2.1.Analizador TOF Lineal..............................................23
6.2.2.Analizador TOF Reflector...........................................24
6.2.3.Analizador TOF / TOF...............................................24
6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)..........24
7. Detector..................................................................26
7.1.Detector de copa de Faraday ...........................................26
7.2.Multiplicador de electrones secundarios................................27
7.3.Detector "Channeltron".................................................27
7.4.Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de centelleo).......28
7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia.......................28
7.4.2.Descripción de los detectores Daly.................................29
7.5.Detectores multicanal o microcanal.....................................29
7.6.Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas..................30
8. Espectros moleculares.....................................................31
9. Introducción a la Espectroscopía Infrarroja...............................33
9.1.La Espectroscopía......................................................33
9.2.Espectrometría infrarroja..............................................33
9.3.Sobre las vibraciones moleculares......................................34
9.4.Modelos vibracionales..................................................35
10. El espetrómetro infrarrojo...............................................37
10.1.Funcionamiento y descripción..........................................37
10.2.Fuente de radiación...................................................40
10.3.Sistema óptico de dispersión..........................................40
10.4.Sistemas de detección.................................................40
10.5.Preparación de las muestras. Cubetas portamuestras....................41
11. Aplicaciones analíticas del espetrómetro infrarrojo......................43
12. Bibliografía y Agradecimientos...........................................45
12.1.Bibliografía..........................................................45
12.2.Agradecimientos.......................................................45
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 4
Da: Daltons (unidad de masa).
UMA: Unidades de masa atómica.
MALDI: Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz, del inglés: Matrix-
assisted laser desorption.
TOF: Analizador de tiempo de vuelo, del inglés: Time-of-flight
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1.Espectroscopia y Espectrometría, ¿Que son?
La espectroscopia surgió con el estudio de la interacción entre la radiación y la materia como función de la longitud de onda (λ). En un principio se refería al uso de la luz visible dispersada según su longitud de onda, por ejemplo por un prisma. Más tarde el concepto se amplió enormemente para comprender cualquier medida en función de la longitud de onda o de la frecuencia. Una extensión adicional del alcance de la definición añadió la energía (E) como variable, al establecerse la relación E=hν para los fotones. El análisis espectral en el cual se basa, permite detectar la absorción o emisión de radiación electromagnética a ciertas longitudes de onda, y relacionar éstas con los niveles de energía implicados en una transición cuántica. El espectro se define como una representación gráfica o fotográfica de la distribución de intensidades de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia, en función de la longitud de onda de dicha radiación. Los espectros son debidos a transiciones entre estados de energía característicos de la materia. Los espectros pueden ser de emisión, que se obtienen excitando adecuadamente la materia para que emita radiación electromagnética y de absorción, obtenidos sometiendo a la materia a una radiación electromagnética continua y representando la proporción de radiación absorbida por la misma en función de la frecuencia o longitud de onda. La espectrometría es la técnica espectroscópica para tasar la concentración o la cantidad de especies determinadas. En estos casos, el instrumento que realiza tales medidas es un espectrómetro o espectrógrafo. La espectrometría a menudo se usa en física y química analítica para la identificación de sustancias mediante el espectro emitido o absorbido por las mismas. También se usa mucho en astronomía y detección remota. La mayoría de los grandes telescopios tienen espectrómetros, que son usados para medir la composición química y propiedades físicas de los objetos astronómicos, o para medir sus velocidades a partir del efecto Doppler de sus líneas espectrales.
Figura 1-1: Dispersión de luz en un prisma triangular.
1.1.Métodos espectrométricos 1.1.1.Según la naturaleza de la excitación medida
El tipo de espectrometría depende de la cantidad física medida que normalmente es una intensidad de energía absorbida o producida. La naturaleza de la excitación puede ser:
Electromagnética: Basada en interacciones de la materia con radiación electromagnética como la luz.
De electrones: Utiliza interacciones con haces de electrones. La espectroscopia Auger implica inducir el efecto homónimo mediante la incidencia de un haz de electrones. En este caso la medida considera la energía cinética del electrón como variable.
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De masa: la interacción de especies cargadas con campos magnéticos y/o eléctricos, dando lugar a un espectro de masas. El término "espectroscopia de masas" no resulta representativo, ya que la técnica se emplea principalmente como una forma de medida de la energía cinética de la partícula, aunque produzca realmente un espectro para la observación y tenga a la masa (m) como variable.
Acústica: La energía es provista por ondas de sonido.
Dieléctrica: Mediante un campo eléctrico externo se ponen en evidencia las propiedades dieéctricas del material en función de la frecuencia.
Mecánica: Emplea la energía de un estrés mecánico externo, por ejemplo una torsión aplicada a un trozo de material.
1.1.2.Según el proceso de medida
● De absorción. Usa el rango de los espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia absorbe. Incluye la espectrometría de absorción atómica y varias técnicas moleculares, como la espectrometría infrarroja y la resonancia magnética nuclear (RMN).
● De emisión. Usa el rango de espectros electromagnéticos en los cuales una sustancia irradia (emite). La sustancia primero debe absorber la energía. Esta energía puede provenir de una variedad de fuentes, que determina el nombre de la emisión subsiguiente, como la luminescencia. Las técnicas de luminescencia moleculares incluyen la espectrofluorimetría.
● De dispersión. Mide la cantidad de luz que una sustancia dispersa en ciertas longitudes de onda, ángulos de incidencia y ángulos de polarización. El proceso de dispersión es mucho más rápido que el proceso de absorción/emisión. Una de las aplicaciones más útiles es la espectroscopia Raman.
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2.Introducción a la Espectrometría L.A.S.E.R.
2.1.¿Que es la Espectrometría de Masas?
La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica microanalítica usada para identificar compuestos desconocidos, para cuantificar compuestos conocidos, y para elucidar la estructura y propiedades químicas de moléculas. La detección de compuestos puede ser llevada a cabo con cantidades realmente pequeñas (algunos pico-moles = 1*10
-12 moles) de muestra y provee información característica como el peso y algunas veces la estructura del analito. En todos los casos, alguna forma de energía es transferida a las moléculas a analizar para efectuar la ionización. En la técnica clásica de impacto electrónico (electrón ionization: EI), algunas de las moléculas ionizadas del analito “explotan” en una variedad de fragmentos ionizados. Tanto el patrón de fragmentación resultante así como los iones residuales determinan el espectro de masas. El espectro de masas de cada compuesto es único y puede ser usado como su “huella química” para caracterizar el analito. Para muestras grandes, tales como biomoléculas, las masas moleculares pueden ser medidas con una precisión de 0,01% del total de la masa molecular de la muestra. Por ejemplo: para una muestra de 40.000 [Da] o unidades de masa atómica (UMA), tendríamos un error de 4 [Da]. Esto es suficiente para permitir que el menor cambio de masa, sea detectado; por ejemplo: la sustitución de un aminoácido por otro o una modificación post-traslacional. Para el caso de moléculas orgánicas pequeñas, la masa molecular puede ser medida con una precisión de 5 [ppm] o menos; dicha precisión es a menudo suficiente para confirmar la fórmula molecular del compuesto, y también es un requisito estándar para la publicación en una revista de química a nivel científico. La información estructural puede obtenerse usando cierto tipo de espectrómetros de masa, generalmente de aquellos con múltiples analizadores, los cuales son conocidos como espectrómetros de masas en tándem. Esto se consigue mediante la fragmentación de la muestra en el interior del instrumento y el análisis de los productos generados.
Figura 2-1: Esquema de la espectrometría de masas.
2.2.Principios de la técnica
El proceso de análisis por espectrometría de masas comienza llevando el compuesto a analizar a fase gaseosa. La muestra debe tener una presión de vapor de 10
[torr], debido a que las moléculas deben migrar por difusión desde el sistema de entrada hacia la cámara de ionización. Las muestras pueden ser introducidas al espectrómetro de masas usando una sonda directa o por entrada en lote (batch) para sólidos puros o líquidos volátiles. Ya que las moléculas neutras difunden en forma aleatoria por la fuente de ionización, solo una porción es ionizada. El proceso de ionización más común en análisis en fase gaseosa es el de ionización electrónica (EI). En este se transfiere energía a la molécula neutra en estado de vapor, para lograr la expulsión de uno de sus electrones y de ese modo tener un ion con carga positiva y un electrón libre. La molécula ionizada puede recibir excesiva Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 8
energía provocando la rotura de varios enlaces químicos y la consecuente producción de fragmentos ionizados cuya masa es igual a la suma de las masas atómicas de un grupo de átomos que retienen la carga positiva durante el proceso de fragmentación.
Para compuestos no volátiles, iones de la molécula intacta son producidos al pasar la solución por un campo eléctrico (electrospray ionization) o por bombardeo de partículas (fast atom bombardment) o por interacción con especies fotoexcitadas (matrix-assisted laser desorption). Después de producir los iones, el siguiente paso es su análisis en el analizador de iones de acuerdo a su relación masa/carga (m/z). La carga eléctrica de los iones permite controlarlos por medio de campos eléctricos y separarlos por su valor m/z en el analizador de masas. Existen diferentes tipos de analizadores de masas: magnéticos, trampa de iones magnética, cuadrupolar, trampa de iones cuadrupolar, tiempo de vuelo (time-of-flight). Los iones son analizados de acuerdo a su abundancia (o sea, de acuerdo a su mayor o menor cantidad, véase figura 2-3) a lo largo de la escala m/z. Durante el proceso de adquisición de datos provenientes del detector, los datos pueden ser organizados en forma tabular o en formato de gráfica de barras para dar finalmente el espectro de masas de la muestra analizada.
Figura 2-2: Esquema de un espectrómetro de masas por impacto electrónico (EM-IE).
En Resumen: En un espectrómetro de masa se convierte a las macromoléculas (analito) en iones gaseosos y éstos son diferenciados por el analizador según su relación m/z (z, carga del ion; m, masa molar o peso molecular del ion), obteniéndose así información de su peso molecular.
2.3.Implementación
Los Espectrómetros de masas se utilizan en la industria y en los ambientes académicos con fines de investigación. La siguiente lista es solo un breve resumen de las principales aplicaciones:
Biotecnología: Análisis de proteínas, péptidos, oligonuclótidos.
Farmacéutica: Descubrimiento de fármacos, química combinatoria, farmacocinética, metabolismo de drogas.
Clínica: neonatal, análisis de hemoglobina, análisis de drogas.
Medio ambiente: PAHs, PCBs, calidad de agua, contaminación de alimentos
Geológica: composición del petróleo.
Otros: Análisis elementales de semiconductores, biosensores y cadenas poliméricas complejas.
A continuación se presenta una lista de implementaciones específicas de la espectrometría de masas, Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 9
orientada al uso cotidiano de la misma:
● Monitorear los gases de la respiración en pacientes durante cirugía.
● Determinar la composición de materiales provenientes del espacio exterior.
● Determinar la adulteración en la miel de abeja.
● Localizar depósitos petroleros (midiendo precursores del petróleo en rocas).
● Monitorear fermentaciones en linea (industria biotecnológica).
● Detectar contaminantes orgánicos en aire, agua, suelo y alimentos.
● Determinar algunos tipos de envenenamiento (criminalística).
Figura 2-3: Ejemplo de resultados obtenidos de la espectrometría de masas.
2.4.Algunas definiciones
Como se vio en la sección 2.3, el uso de la espectrometría de masas abarca áreas relacionadas a la química, muy específicas, por lo que a continuación definiremos algunas palabras que se suelen encontrar íntimamente ligadas a la espectrometría.
Genoma: Información genética completa constituída por la codificación de las cuatro bases químicas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Secuencia que produce 3000 millones de letras de código o pares de bases en el genoma humano.
Proteoma: Término sugerido en 1994 por Marc. R. Wilkins, de Proteoma Systems en Sydney, para designar la totalidad de las proteínas codificadas por un genoma.
Proteómica (Proteomics):La proteómica es el estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas expresadas de un genoma (proteoma). Las técnicas de proteómica abordan el estudio de este conjunto de proteínas. La Proteómica permite identificar, categorizar y clasificar las proteínas con respecto a su función y a las interacciones que establecen entre ellas. De este modo, se pueden caracterizar las redes funcionales que establecen las proteínas y su dinámica durante procesos fisiológicos y patológicos. La proteómica se está aplicando en la identificación de nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades, la identificación de nuevos fármacos, la determinación proteínas involucradas en al patogenia de enfermedades y el análisis de procesos de transducción de señales.
Glucómica, Lipómica y Metabolómica (Glycomics, Lipidics y Metabolomics): De la aplicación de las espectrometría de masa al análisis de otras familias de macromoléculas biológicas tales como hidratos de carbono, lípidos y metabolitos secundarios han surgido nuevas áreas de investigación denominadas “Glucómica”, “Lipómica” y “Metabolómica”.
Analito: Muestra de un elemento formada por macromoléculas, separada para su estudio con un espectrómetro de masas.
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Relación masa/carga: Esta expresión, abreviada m/z, es la relación del número de masa (m) de una partícula dada entre el número (z) de unidades cargadas electrostáticamente (e) que posee la partícula. Así, m/z es una relación adimensional que es el parámetro medido por el analizador de masas. La masa de una partícula dada es igual a la suma de sus masas atómicas (en Daltons) de todos los elementos que componen la partícula. El símbolo para las unidades masa es u, y corresponde a 1/12 de la masa del 12C, al que se la ha asignado un valor de 12.000000 por convención.
Iones doblemente cargados: Es posible para una molécula perder dos electrones durante el proceso de ionización. Estos iones que están doblemente cargados producirán un pico en el espectro de masas en un valor m/z numéricamente igual a la mitad de la masa molecular del ion. Los iones doblemente cargados son insignificantes en el espectro de masa para la mayoría de los compuestos. Sin embargo, para aquellas moléculas que los produzcan en forma estable, los picos correspondientes en el espectro de masas pueden ser usados en la interpretación de datos.
Ion molecular: El ion molecular resulta de la ionización de la molécula a analizar. Este ion representa la molécula intacta y es el último precursor de todos los iones fragmentados que componen el espectro de masas. El pico del ión molecular aparece a un valor m/z numéricamente igual al peso molecular del compuesto.
Pico base: Es el pico más intenso en el espectro de masas. Es usado como base para normalizar las intensidades de los otros picos. Al pico base se le asigna una intensidad relativa de 100%.
Intensidad relativa: La intensidad relativa de un pico representa su intensidad en comparación con el pico base. Se representa como un porcentaje respecto al pico base que es 100%. Por convención, este dato se indica en la izquierda del espectro de masas.
Porcentaje total de ionización: Este término expresa la abundancia de un ion individual comparado con la suma de las abundancias de todos los iones en un rango de masa especifico. La escala de porcentaje total de ionización esta representada a la derecha del espectro de masas con el símbolo (%Sn), este dato puede ser utilizado para comparar diferentes espectros de masas de diferentes compuestos.
Espectro de masas: Un espectro de masas es una gráfica de intensidad relativa del ion como función de la relación masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado como un histograma simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para establecer el peso molecular y estructura del compuesto a ser analizado. Debido a que ocurre la fragmentación del analito, las fracciones del ion aparecen en el espectro a valores m/z menores que la molécula completa ionizada (ion molecular) a partir de es tos datos se deduce la estructura y peso molecular de la molécula completa.
Desorción: (Del inglés “Desorption”), Desabsorción. Emisión de sustancia previamente absorbida; Emisión de la pared de la cámara de vacío de combustible o impurezas, previamente absorbidas. Para el caso del sistema MALDI, se refiere a los iones que son arrancados de la muestra de materia por el láser, es decir, los iones que son desabsorbidos del analito por la acción del láser.
Figura 2-4: Desorción, moléculas de analito previamente absorbidas por la matriz son des-absorbidas por efecto del láser.
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Espectrometría de masas en tándem: Un instrumento utilizado en laboratorios médicos que consta de dos espectrómetros de masa en serie conectado por una cámara conocida como célula de colisión. La muestra que va a ser examinada es esencialmente clasificada y pesada en el primer espectrómetro de masas, luego es rota en pedazos en la celda de colisión, para ser nuevamente clasificada/s y pesada/s en el segundo espectrómetro de masa. La espectrometría de masas en tándem se utiliza en análisis de recién nacidos para detectar moléculas como los aminoácidos (los componentes básicos de las proteínas) y ácidos grasos. Espectrometría de masas en tándem puede ser abreviado como tándem MS o MS / MS.
Cromatografía: La cromatografía de gases y líquidos, es una técnica separativa que tiene la cualidad de conseguir la separación de mezclas muy complejas.
Fotoionización: Ionización (extracción de electrones)por medio de la interacción de radiación electromagnética.
Péptidos: Los péptidos están formados por la unión de aminoácidos mediante un enlace peptídico. Este es un enlace covalente que se establece entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino del siguiente, dando lugar al desprendimiento de una molécula de agua[2,6,7].
Protonación: Aumento del número de protones o de átomos de hidrógeno en una molécula.
Deprotonación: Reducción del número de protones o de átomos de hidrógeno en una molécula.
Scintillator[2]: Es un material que exhibe la propiedad de luminiscencia cuando es excitado por radiación ionizante. Los materiales luminiscentes cuando son impactados por una partícula, absorben la energía de la misma para luego emitirla en forma de fotón en el rango de luz visible. El Scintillator se utiliza en investigación en física para detectar ondas electromagnéticas o partículas. Allí convierte la energía en luz de una longitud de onda que se pueda detectar por detectores tales como tubos fotomultiplicadores.
Efecto Auger (o electrón Auger): Cuando un electrón es arrancado de una de las capas internas de un átomo, dejando una vacante o hueco, un electrón de un nivel de energía externo puede caer en esta vacante, resultando en un exceso de energía. Este exceso de energía es frecuentemente liberada por la emisión de un fotón (flourescencia de rayos x), aunque también puede ser transferida a otro electrón, el cual es emitido del átomo. La energía del electrón Auger corresponde a la diferencia entre la energía de la transición electrónica primaria y la energía de ionización para la capa de la cual el electrón Auger fue emitido. Esos niveles electrónicos dependen del tipo de átomo y del ambiente químico en el cual se encontraba el átomo.
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3.Descripción general del espectrómetro
Un Espectrómetro de Masas es un instrumento que mide las masas de moléculas individuales que han sido convertidas en iones. No mide la masa molecular directamente, sino que mide la relación masa/carga de los iones formados a partir de las moléculas. Los espectrómetros de masas tienen siete componentes mayores: un sistema de entrada, una fuente de iones, un analizador de masas, un detector, un sistema de vacío, un sistema de control y un sistema de datos. El sistema de entrada, junto con la fuente de iones y el tipo de analizador de masas definen el tipo de espectrómetro y las capacidades del sistema. El diagrama de bloques de la Figura 3-1 muestra los componentes principales de los espectrómetros de masas. El objetivo del sistema de entrada es, el de introducir una pequeña cantidad de muestra (un micromol o menos) en el espectrómetro de masas, donde sus componentes se convierten en iones gaseosos. A menudo, el sistema de entrada contiene un medio para la volatilización de muestras sólidas o líquidas. La fuente de iones de un espectrómetro de masas convierte los componentes de una muestra en iones por bombardeo con electrones, iones, moléculas o fotones. Alternativamente, la ionización se lleva a cabo por energía térmica o eléctrica. En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinadas en un único componente. En ambos casos, lo que se obtiene es un haz de iones positivos o negativos (frecuentemente positivos) que es entonces acelerado en el analizador de masas. La función del analizador de masas es parecida a la de la rejilla de un espectrómetro óptico. En el primero, sin embargo, la dispersión está basada en las relaciones carga/masa de los iones del analito en vez de en la longitud de onda de los fotones. Existen diversos tipos de espectrómetros de masas, dependiendo de la naturaleza del analizador de masas. A1 igual que en un espectrómetro óptico, un espectrómetro de masas contiene un detector (para iones) que convierte el haz de iones en una señal eléctrica que puede ser entonces procesada, almacenada en la memoria de un ordenador y mostrada o registrada de varias maneras. Un hecho característico de los espectrómetros de masas, que no es común con los instrumentos ópticos (pero que se encuentra en los espectrómetros de electrones), es la necesidad de un sistema de vacio adecuado para mantener bajas presiones (10
[torr]) en todos los componentes del instrumento excepto el procesador de señal y dispositivo de lectura. Figura 3-1: Diagrama en bloques de un espectrómetro de masas.
3.1.Sobre los procesos asociados a la espectrometría
Los procesos básicos asociados con la espectrometría de masas abarcan desde la generación de iones en fase gaseosa de un analito hasta la medición de las relaciones masa/carga (m/z) de estos iones. La formación de iones de la muestra en fase gaseosa es un prerrequisito esencial en el proceso de verificación de masas moleculares o análisis. Aunque los primeros espectrómetros de masas requerían que la muestra estuviera en forma gaseosa, nuevos desarrollos han permitido incluir muestras en soluciones líquidas o en una matriz sólida. Dependiendo del tipo de entrada y técnica de ionización usada, la muestra puede ya estar en forma de iones en solución, o puede ser ionizada en conjunto con su volatilización por otros métodos en la fuente de iones. El hecho de estudiar el analito a través de iones en fase gaseosa le da a la espectrometría dos características fundamentales: Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 13
La primera es que el movimiento de los iones en fase gaseosa puede ser controlado en forma precisa por campos electromagnéticos . El hecho de que la movilidad de los iones es proporcional a la relación m/z del ion, nos permite la medición de la m/z y por lo tanto de la masa del analito. Los detalles concernientes a diferentes tipos de técnicas de análisis de masas y técnicas de ionización utilizadas determinan factores tales como la precisión y exactitud de la medición de m/z, la resolución, y el rango de m/z del analizador.
La segunda es que el uso de iones en fase gaseosa incrementa la sensibilidad del espectrómetro de masas. El movimiento preciso de iones en campos electromagnéticos que permiten medir m/z también les provee contención y enfoque. Durante el proceso de medida de m/z, los iones son transmitidos con gran eficiencia a los detectores de partículas que registran la llegada de estos iones. Estas llegadas son detectadas con gran sensibilidad debido a una combinación de señales de bajo fondo y la eficiente generación de electrones secundarios que pueden subsecuentemente ser multiplicados por factores de 10
5 o mayores. El mantenimiento de la precisión y exactitud de estos movimientos y por lo tanto de la sensibilidad del análisis requiere operación experta del sistema de espectrometría de masas. Algunas desventajas del uso de iones en fase gaseosa es la dificultad de la generación de los iones y de llevarlos a la fase gaseosa, además de la complejidad de los instrumentos utilizados en este tipo de experimentos. Dicha complejidad se traduce en altos precios de adquisición y mantenimiento de los mismos. Sin embargo, por un lado el desarrollo de la ionización por electrospray y MALDI han aportado dos importantes métodos para la producción de iones de péptidos y proteínas en fase gaseosa; y por otro, la sofisticación, productividad y reproducibilidad de los experimentos desarrollados puede justificar el costo de la espectrometría de masas que resulta proporcional a los costos asociados con otros componentes involucrados en los proyectos de investigación o desarrollo que requieren este tipo de análisis.
Nota: En las siguientes secciones se realizará una descripción de los componentes fundamentales que forman y, en algunos casos, dan nombre a los espectrómetros de masas.
COMPONENTE VARIANTES
Sistema de entrada a) Directo.
b) Columna capilar cromatografía líquida.
Fuente de iones a) Impacto electrónico.
b) Ionización Química.
c) Ionización de campo.
d) Deserción de campo.
e) Bombardeo con Átomos Rápidos.
f) Electrospray, incluyendo nanospray y microspray.
g) Matrix-assisted laser desorption (MALDI)
Analizador de masas a) Cuadrupolo.
b) Trampa de iones (Ion-trap).
c) Tiempo de vuelo (Time-of-flight TOF).
d) Analizador FT-ICR
Tabla 3-1: Variantes de componentes del sistema de espectrometría de masas.
Nota: En el presente informe nos avocaremos a estudiar los métodos de espectrometría que implementan L.A.S.E.R. Para mayor información sobre los demás métodos se recomienda ver la bibliografía[3].
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4.Entrada de la muestra
La finalidad del sistema de entrada es la de permitir la introducción de una muestra representativa en la fuente de iones con la mínima pérdida de vacío. Los espectrómetros de masas más modernos están equipados con dos tipos de entradas, la de sonda directa y las cromatográficas, con lo que son capaces de acomodar diversos tipos de muestras. 4.1.Entrada por sonda directa
Para sólidos razonablemente puros, la muestra es colocada sobre la punta de una barra o sonda que es introducida dentro del espectrómetro a través de un sistema de vacío (cámara intermedia). La cámara intermedia está diseñada para limitar el volumen de aire que puede entrar en la región de ionización durante la inserción de la sonda. Las sondas se utilizan también cuando la cantidad de muestra es limitada. Por tanto, los espectros de masas se pueden obtener a menudo con una cantidad de muestra tan pequeña como unos pocos nanogramos. En una sonda, la muestra se pone generalmente en la superficie de un vidrio o en un tubo capilar de aluminio, un alambre fino o una copa pequeña y la sonda se coloca a unos pocos milímetros de la fuente de ionización y de la rendija que conduce al espectrómetro. La muestra es entonces evaporada o sublimada en una fase gaseosa, usualmente por medio de calor. Gases y líquidos pueden ser introducidos a través de sistemas de entrada diseñados especialmente con un control de flujo, llamados sondas directas (direct probes), estos dispositivos transfieren la muestra desde el exterior a través de un sistema de vacío hacia la fuente de ionización que esta a alta presión; Figura 4-1 y 4-2. Estas sondas pueden ser diseñadas para soportar muestras para ser ionizadas por distintos métodos. Una vez que la muestra está es fase gaseosa es ionizada y frecuentemente fragmentada para proceder al análisis de masas. En algunas técnicas especializadas, la volatilización y la ionización de la muestra ocurren al mismo tiempo.
Figura 4-1: Esquema de un sistema de introducción de muestra por
sonda para introducir una muestra en la fuente de iones (DIP). Figura 4-2: Sondas directas (direct probes).
La baja presión del área de ionización y la proximidad de la muestra a la fuente de ionización a menudo hace posible la obtención de espectros de compuestos inestables térmicamente antes que se descompongan. La baja presión proporciona también una mayor concentración de compuestos relativamente no volátiles en el área de ionización, de modo que, la sonda permite el estudio de Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 15
materiales no volátiles tales como carbohidratos, esteroides, especies organometálicas y sustancias poliméricas de bajo peso molecular. El requisito principal de la muestra es que alcance una presión parcial de al menos 10
[torr] antes que empiece a descomponerse. 4.2.Sistemas de entrada cromatográficos[4,5]
Para obtener el espectro de masas de un compuesto simple de una mezcla, los componentes individuales deben ser separados antes del análisis de espectrometría de masas. La separación de los compuestos es necesaria para tener certeza de la identificación, ya que dos o más compuestos presentes en la muestra pueden crear espectros que se superpongan o mezclen, dificultando así el análisis de los datos obtenidos. Desde que en la década de los 60´s se acopló la cromatografía de gases (GC) a la espectrometría de masas, esta conexión permitó separar compuestos ya en fase gaseosa para su entrada al espectrómetro. Al entrar las distintas fracciones en diferentes tiempos en forma continua permite un análisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografía de líquidos (LC), cromatografía de fluidos supercríticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados para separar compuestos, se han comenzado a acoplar a espectrómetros de masas para análisis de muestras complejas. El acoplamiento de una columna cromatográfica a un espectrómetro de masas requiere la utilización de sistemas de entrada especiales, algunos de los cuales se describen a continuación.
Figura 4-3: Columnas de cromatografía.
4.2.1.Cromatografía de gases/Espectrometría de masas
Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografía de gases que pueden acoplarse directamente con distintos tipos de espectrómetros de masas de barrido rápido. El caudal de las columnas capilares en general es suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro de masas. Desde finales de los años setenta han aparecido en el mercado diversos espectrómetros de masas diseñados específicamente como detectores para cromatografía de gases. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 16
4.2.2.Cromatografía HPLC/Espectrometría de masas
Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografía de líquidos con la espectrometría de masas es el enorme contraste que existe entre los volúmenes relativamente grandes de disolvente de la primera y los requerimientos de vacío de la última. Para resolverlo se han desarrollado diversas interfaces. Las técnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la introducción y análisis de muestras líquidas, pueden clasificarse en dos grupos: las que solo introducen la muestra líquida en la fuente iónica del instrumento tales como las de haz de partículas (PB, Particle Beam) y las que además consiguen la ionización de la misma (TSP = Thermospray o termonebulización, LC-FAB = Liquid chromatography - Fast Atom Bombardment, ESI= Electrospray Ionization). En la Tabla 4-
1, se muestran algunas de las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas. Tipo Límite de
Rango de flujo del LC
Muestras no volátiles / termovolátiles
Rango de pesos moleculares
DLI XX X XXX XXXX XX XX
Cinta XX XXXXX XXXXX XXXXX X X(X)
TSP XX(XX) XXXXX XXXX XXXXX XXX(X) XXX(X)
LC/FAB XX(XX) X XXX XXXX XXXXX XXXX
PB XX XXX(X) XXXX XXXXX X(X) X(X)
ESI XXXX(X) X XX(X) XXXX XXXXX XXXXX
Tabla 4-1: Ventajas e inconvenientes de las interfaces LC/MS. Mayor número de X indica mayor rendimiento. Entre paréntesis se indica el rango de la respuesta. Figura 4-4: Métodos cromatográficos.
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5.Fuente de ionización
5.1.Descripción de las múltiples fuentes de ionización
Históricamente, los iones para análisis de masas se producían por bombardeo de los componentes de muestras gaseosas con electrones de elevada energía. A pesar de ciertas desventajas, esta técnica todavía tiene una gran importancia y es en la que se basan la mayor parte de las bibliotecas de espectros. Sin embargo, durante las dos últimas décadas se han desarrollado varias nuevas fuentes de iones que ofrecen ciertas ventajas sobre la clásica fuente de haz de electrones. La Tabla 5-1 da un listado de éstas. Normalmente, la mayoría de los espectrómetros de masas comerciales están equipados con accesorios que permiten el uso de varias de estas fuentes, intercambiables. Nótese que las fuentes que se indican en la Tabla 4-1 pertenecen a dos categorías. La primera corresponde a las fuentes de fase gas en las que la muestra es primero volatilizada y a continuación los componentes gaseosos son ionizados de diversas maneras. La segunda categoría de fuentes es la de fuentes de desorción en la que se prescinde de la vaporización de la muestra y en consecuencia, esta técnica requiere siempre la utilización de una sonda de muestra. En este caso, la energía se transmite a la muestra sólida o líquida, de maneras muy diversas produciendo la ionización y la transferencia directa de iones de la fase condensada al estado gaseoso iónico. La mayor ventaja de la ionización por desorción es que permite el examen de moléculas no volátiles y térmicamente inestables tales como las que se encuentran normalmente en bioquímica.
Las fuentes de iones se clasifican a menudo en duras o blandas. La fuente dura más importante es la fuente de impacto de electrones (para más detalles remítase a la bibliografía [3]). Estas fuentes duras comunican energías elevadas a los iones formados de manera que se encuentran en estados vibracionales y rotacionales excitados. La relajación de estos iones produce una gran cantidad de fragmentación y resultan espectros de masas complejos. Por el contrario, las fuentes blandas, tales como las fuentes de ionización química y la de desorción, producen relativamente poca excitación de los iones, de modo que, tiene lugar poca fragmentación, y los espectros son sencillos. Ambos tipos de espectros son útiles. Los espectros sencillos de las fuentes blandas permiten la determinación exacta del peso molecular del analito, mientras que los modelos espectrales más complejos de las fuentes duras a menudo permiten una identificación inequívoca del mismo. El método de ionización que se utilizará dependerá del tipo de la muestra, objeto de la investigación y el espectrómetro de masa disponible. A continuación se presenta una lista de los métodos de ionización:
Electron Impact (EI) - Ionización por impacto de electrones.
Fuentes de ionización química - (CI = Chemical ionisation).
Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) – Ionización química por presión atmosférica.
Fuentes de ionización a presión atmosférica (API).
Fuentes de ionización de campo (FI = Field ionisation).
Fuentes de desorción de campo (FD = Field desorption).
Fuentes de bombardeo por átomos rápidos (FAB=Fast Atom Bombardment) o iones (SIMS = Secondary ion MS).
Ionización por Electrospray (Electrospray Ionization ESI).
Thermospray Ionisation (TSP) – Ionización por termo spray.
Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) – Desorción / ionización láser asistida por matriz.
Nota: En el presente informe nos concentraremos en el método de espectrometría que usa ionizador láser.
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Nombre Abreviatura Tipo Agente ionizante
Ionización por electrones EI Fase gas Electrones energéticos
Ionización química CI Fase gas Iones reactivos
Ionización por campo FI Fase gas Electrodo de elevado potencial
Desorción por campo FD Desorción Electrodo de elevado potencial
Bombardeo con átomos rápidos
FAB Desorción Átomos energéticos
SIMS Desorción Iones energéticos
Desorción por láser LD Desorción Haz láser
Desorción por plasma PD Desorción Fragmentos de fisión de elevada energía
Desorción térmica Desorción Calor
Ionización electrohidrodinámica
EHMS Desorción Campo elevado
Ionización por termovaporización
ES Cargas positivas aplicadas sobre finas gotitas de la disolución de la muestra
Tabla 5-1: Fuentes de ionización.
5.2.Introducción Desorción/Ionización Láser Asistida por Matriz(MALDI)
La ionización MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, desorción/ionización mediante láser asistida por matriz), es una técnica de ionización suave, la misma permite el análisis de biomoléculas(biopolímeros, como proteínas, péptidos y azúcares), y de grandes moléculas orgánicas (como los polímeros, dendrímeros y otras macromoléculas), que tienden a ser frágiles y fragmentar cuando son ionizadas por los métodos convencionales de ionización. En lo que se refiere a su suavidad y a los iones producidos MALDI es muy similar a la ionización por electrospray. La ionización es provocada por un rayo láser (normalmente un láser de nitrógeno). Figura 5-1: Esquema de la espectrometría de masas MALDI.
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5.3.La matriz
En este método de ionización los analitos son disueltos en una solución de un compuesto que absorbe UV, llamado matriz (matrix), y colocado dentro del espectrómetro de masas. Debido a que los solventes se van secando, los compuestos de la matriz se cristalizan y los analitos quedan contenidos dentro de la matriz de cristales (se dice que el analito se co-cristaliza con la matríz). Figura 5-2: Matriz.
La matriz se utiliza para proteger a la biomolécula de ser destruida por el impacto directo del rayo láser y para facilitar la vaporización y la ionización; la misma actúa como intermediaria en el proceso de transferencia de energía del haz láser a los analitos. En el proceso de conversión de las moléculas neutras de analito a especies cargadas o iones (generalmente protonados), la matriz juega un papel fundamental al ceder protones (H+) a los analitos. Una solución para una matriz se hace, a menudo en una mezcla de agua muy purificada y un disolvente orgánico (normalmente acetonitrilo (ACN) o etanol). Ácido trifluoroacético (TFA) puede ser también añadido. Un buen ejemplo de una solución para matriz sería de 20 mg / ml de ácido sinapinic en ACN: agua: TFA (50:50:0.1). En la figura 5-2 se pueden observar los distintos compuestos utilizados en las matrices MALDI.
Figura 5-3: Distintos compuestos utilizados en matrices MALDI.
consideraciones: Los compuestos utilizados son de bajo peso molecular (para permitir la fácil vaporización), pero son lo suficiente mente grandes (con una presión de vaporización lo suficientemente baja) para que no se evapore durante la preparación de la muestra o mientras están en el espectrómetro.
Son ácidos, por lo tanto, actúan como una fuente de protones para fomentar la ionización del analito.
Tienen una fuerte absorción óptica en la gama de los UV, para absorber rápida y eficientemente la radiación del láser.
Son fusionados con grupos polares, lo que permite su uso en soluciones acuosas.
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La solución (analito-ácido) es colocada sobre un plato MALDI (generalmente una placa metálica diseñada para éste propósito). Los platos son de acero pulido, plata o cromo plateado
Figura 5-4: Contenedor de plata para 10 muestras, cada pozo mide 23 mm de diámetro(Izq.). Detalle del pozo 10 del contenedor; (Der.) el rectángulo muestra el lugar donde impactará el láser. La línea blanca es un rasguño. La muestra aplicada es una solución en acetona que formó una capa cristalina. Se necesitan entre 10-100 disparos del láser para evaporar la capa completamente.
Los solventes se vaporizan dejando solo la matriz recristralizada, pero ahora las moléculas del analito se han propagado por todos los cristales. Se dice entonces que la matriz y el analito se han co-cristalizado en la placa MALDI.
5.4.El láser
Pulsos de láser de luz UV son utilizados para vaporizar pequeñas cantidades de la matriz, donde se incluyen los iones del analito, y llevarlos a la fase gaseosa en el proceso (Figura 5-5). Figura 5-5: Esquema de la Desorción/Ionización Láser.
La ionización del analito se puede dar por deprotonación (protonación), al aceptar o ceder un electrón, por unión de cationes o fotoionización, por lo que los iones generados por MALDI son de una amplia variedad de moléculas, ya que dependiendo de la combinación entre el analito y la matriz será el tipo de iones predominantes en el espectro obtenido. Comúnmente la ionización ocurre por protonación en el ambiente ácido producido por los compuestos de la matriz y por la adición de ácido diluido en la muestra. La protonación de péptidos es particularmente eficiente en ambientes ácidos, haciendo de MALDI, un método efectivo para producir péptidos protonados. Debido a que con la desorción por láser la producción de iones es discreta y en pequeños paquetes, el MALDI esta comúnmente combinado con un analizador de tipo time-of-flight (TOF) dando un sistema de alta sensibilidad. Mientras que ESI es afectado por especies contaminantes, MALDI puede tolerar niveles variables de algunos contaminantes. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 21
Cada pulso láser genera una pequeña cantidad de plasma que se expande en vacío, del cual se extraen los iones (positivos o negativos) del analito que son acelerados por un potencial de 10-30 kV y controlados por medio de campos electromagnéticos.
El tipo de láser más común en ésta clase de espectrómetros es el de nitrógeno. Este es un láser de fácil montaje y numerosas aplicaciones. Debido a sus componentes de bajo coste y la abundancia del medio activo (N
o simplemente aire), el láser de nitrógeno puede ser construido con pocos recursos y con básicos conocimientos técnicos. Desde su descubrimiento en 1963, el láser de Nitrógeno molecular ha sido optimizado hasta obtener pulsos ultracortos y de gran potencia. En la actualidad se han registrado emisiones de pulsos ultravioleta del orden de 5ns, centrados en los 337.1nm y con potencias que van desde unas centenas de kW hasta los 5MW. Mejoras como el bombeo por descarga o por un haz de electrones han hecho que el láser de nitrógeno molecular sea hoy en día una herramienta versátil tanto en la industria como en la investigación. Las características diferenciales de la radiación láser son:
Alta direccionalidad (la desviación respecto a un haz exactamente paralelo es de sólo algunos miliradianes). Ello se debe al estricto alineamiento de los dos espejos situados en ambos extremos de la cavidad.
Monocromaticidad, debido a los límites impuestos por la ley de Planck y la condición de que la longitud de la cavidad láser debe ser un múltiplo entero de semilongitudes de onda.
Brillo extremadamente elevado, ya que el ángulo sólido en el que se distribuye la radiación es muy pequeño.
Coherencia espacial y temporal, debido a que las ondas asociadas a todos los fotones están en fase.
En el láser de nitrógeno se aplica un pulso de alto voltaje (20 kV de C.A.), disparado por un descargador o tiratrón, que atraviesa la cavidad.
Figura 5-6: Láser de nitrógeno.
5.5.MALDI a presión atmosférica (AP-MALDI)
MALDI a presión atmosférica es una técnica de ionización que, en contraste con MALDI en vacío, opera en condiciones de presión atmosférica. Los iones en MALDI en vacío se forman a una presión de 10 mTorr o menos, mientras que en la AP-MALDI, los iones se forman a presión atmosférica. La desventaja de este método es la limitación de la sensibilidad y del rango de masa. AP-MALDI se utiliza en una variedad de aplicaciones de la espectrometría de masa, que va desde la proteómica hasta el campo del descubrimiento de fármacos. La fuente de iones AP-MALDI es fácilmente acoplable a un espectrómetro de masas de trampa de iones o cualquier otro sistema de espectrometría equipado con ESI (ionización por electrospray) o fuente nano ESI.
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6.Analizador de masa
6.1.Introducción a los analizadores de masas
Los analizadores de masas llevan a cabo la separación de los iones producidos por diferentes métodos en una fuente de iones, de acuerdo a su relación masa/carga (m/z) para que puedan llegar al detector. La unidad para m/z es el Thomson (Th). En los experimentos de espectrometría de masas aparecen dos clases principales de iones, el ion molecular, que es la molécula completa del analito, y fragmentos iónicos, los cuales contienen solo una parte de la estructura. El peso molecular de una molécula puede ser calculado de la m/z del ion molecular, si la carga (z) es conocida, la información estructural se obtiene a partir de las m/z de los fragmentos del ion. Una variedad de analizadores de masas están disponibles para realizar estas mediciones, incluyendo cuadrupolo (quadrupole), trampa de iones (ion-trap), tiempo de vuelo (time-of-flight), sector magnético (magnetic sector), ciclotrón (ion
cyclotron resonance) y otros. Cada tipo de analizador posee características y aplicaciones especiales, así como beneficios y limitaciones. La selección del tipo de analizador a utilizar es en base a que aplicación se le dará, el costo y el rendimiento deseado, ya que el analizador determina varias características del resultado del experimento, entre estas la resolución y el rango de m/z de los iones que pueden ser medidos. Nota: En el presente informe nos limitaremos a los analizadores utilizados en los equipos de espectrometría láser.
6.2.Analizador de Tiempo de Vuelo (Time-of-flight - TOF)
El principio de operación del analizador de tiempo de vuelo (time-of-flight: TOF) involucra la medición del tiempo requerido por un ion para viajar desde la fuente de iones hasta el detector localizado a 1 o 2 mts. de la fuente. Todos los iones reciben la misma energía cinética durante la aceleración instantánea (3000 eV), pero debido a que tienen diferentes valores de m/z, se separan en grupos de acuerdo a su velocidad (por lo tanto m/z) como van recorriendo la región libre de campo entre la fuente de iones y el detector. Los iones chocan secuencialmente en el detector en forma de un incremento de m/z. Los iones de baja m/z llegan al detector antes que aquellos con m/z alta debido a que entre mas m/z tengan los iones tendrán una velocidad menor (Figura 6-1).
Figura 6-1: analizador TOF.
La energía cinética de un ion se define por:
Ec = eV =
; Ec6-1
La velocidad del ion:
2 z eV
; Ec 6-2
Debido a que es impráctico medir directamente la velocidad del ion; el tiempo de vuelo desde la fuente Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 23
de iones hasta el detector (separados por una distancia L) provee la información necesaria:
tof = L
; Ec6-3
El valor de m/z para un ion es determinado por su “tof” (tiempo de vuelo) al detector calibrado con los tof de al menos 2 iones de m/z conocida. El tiempo de tránsito de un ion de 3000 eV de 800 m/z es aproximadamente 30 µseg a través de un tubo de 1m de vuelo, el ciclo de producción de iones, aceleración y detección es completado en un periodo de aproximadamente 100 µseg para un rango mayor de 1000 m/z. Los iones que parten de la fuente de iones en un espectrómetro de masas TOF no tienen los mismos tiempos de partida ni exactamente la misma energía cinética, por lo que estos aparatos han sido diseñados para compensar estas diferencias. El analizador TOF es el analizador de masas más rápido, tiene alta transmisión de iones y el rango de masas más grande de todos los analizadores de masas. Algunas limitaciones son que en muchas ocasiones requieren exclusivamente de un método de ionización por pulsos y que la selectividad de los iones puede limitarse en algunos experimentos. Casi todos los sistemas MALDI están en conjunto con un analizador de TOF, los sistemas GC/MS con TOF poseen una alta velocidad de análisis.
Figura 6-2: Espectrómetro MALDI-TOF.
6.2.1.Analizador TOF Lineal
A la salida de la fuente de ionización los iones son acelerados en un campo eléctrico (30 kV de C.A) y conducidos a una zona de deriva libre de campos. Este voltaje de aceleración proporciona a todos los iones la misma energía cinética y, por lo tanto, distintas velocidades en función de sus relaciones masa-carga. Los iones más livianos viajarán a mayor velocidad a lo largo de la zona de deriva y llegarán antes al detector, el cual registra los “tiempos de vuelo” de los distintos iones. Dichos tiempos son del orden de entre 1 a 30 µs. A partir de los tiempos de vuelo pueden derivarse las relaciones masa-carga de los iones.
Figura 6-2: Analizador TOF lineal.
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6.2.2.Analizador TOF Reflector
La principal limitación de los analizadores TOF lineales es la relativamente baja resolución que alcanzan debido a la dispersión energética del paquete de iones generado y otros factores como la formación diferida de iones (iones que se forman en diferentes momentos) y los efectos espacio-carga. Se consigue una notable mejora añadiendo al dispositivo un reflectrón o espejo iónico que, mediante un campo electrostático, refleja los iones hacia un segundo detector. De esta manera, iones con la misma relación masa carga pero con energías cinéticas mayores penetran más profundamente en el reflectrón, retrasándose su tiempo de llegada al detector reflector respecto al de los iones de menor energía. Si un paquete de iones de una m/z dada contiene iones con diferentes energías cinéticas, el reflectrón disminuirá la dispersión de los tiempos de vuelo de los iones, mejorando la resolución del espectrómetro.
Figura 6-3: Analizador TOF Reflector.
6.2.3.Analizador TOF / TOF
Los analizadores TOF/TOF proporcionan un mejor enfoque de los iones y, por tanto, mayor resolución y precisión másica. En una primera etapa (TOF 1), los iones son acelerados a bajo voltaje (ca. 7 kV) en condiciones que favorecen la fragmentación metaestable. Un pulsador temporal permite seleccionar un determinado ion padre y sus iones fragmento y este paquete de iones es a continuación acelerado a un potencial mayor (ca. 20 kV). El analizador TOF 2 permite separar los iones que componen el paquete, ricos en energía pero con una distribución energética estrecha.
Figura 6-5: Analizador TOF-TOF.
6.3.Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance)
El analizador FT-ICR (Fourier-Transform Ion Cyclotron Resonance) es probablemente el método más complejo de análisis de masas. Esta técnica fue desarrollada en los 50´s, es altamente sensible, pero tiene limitaciones de resolución de masas (>106 Da). Este tipo de espectrómetros consisten principalmente de tres secciones, la primera es la fuente de iones (ESI y MALDI son las más comunes), después la región de transferencia de iones donde los iones producidos son captados, enfocados y transferidos a una región de alto vacío antes de entrar al analizador, y finalmente el analizador. El arreglo estándar para el analizador FT-ICR, es una trampa de iones localizada dentro de un campo magnético especialmente uniforme de una fuerza B
. El efecto del campo magnético es obligar a los iones incidentes a circular en una órbita (Figura 6-5), la frecuencia es determinada por la masa (m), la carga (z) y velocidad (v) del ion, por acción de la ley de Lorentz. El ion es llevado a una trayectoria Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 25
circular en un plano perpendicular al campo magnético. La frecuencia angular de los iones (wc) se define por la ecuación 2. El sentido contrario de rotación es experimentado por iones de carga opuesta.
; Ec 6-4
2¬m
; Ec 6-5
; Ec6-6
=campo magnético
=masa del ion
=carga del ion
v=velocidad incidente del ion
= frecuencia rotacional inducida(ciclotrón)
Figura 6-5: Analizador FT-ICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance).
La presencia de iones entre el par de electrodos (en la trampa) no producirá ninguna señal medible, por lo que es necesario excitar los iones de una m/z dada como un paquete a un radio orbital mayor al aplicar barrido de potencial RF de milisegundos. Una frecuencia excitará una m/z particular (la transformación de Fourier permite medir simultáneamente todas las frecuencias). La medición de la frecuencia angular (ω
) lleva a valores de m/z y al espectro de masas. Debido a que la frecuencia puede ser medida más exactamente que otras propiedades físicas, esta técnica de análisis tiene una gran resolución. Después de la excitación, los iones regresan a su estado normal. Este tipo de analizadores poseen la resolución de masas mas alta, alta capacidad, y acoplamiento a métodos de ionización por pulsos (MALDI); es un método no destructivo, pero posee un rango de masa limitado, puede sufrir efectos por cargas y por reacciones entre los iones, se deben cuidar muchos parámetros para tener buenas mediciones. Se acopla bien a MALDI y ESI.
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7.Detector
Comercialmente son asequibles varios tipos de detectores para espectrómetros de masas. En los primeros años predominaban los multiplicadores de electrones de detección puntual situados en el ambiente de alto vacío del espectrómetro. Estos mediante un proceso de avalancha, transforman las partículas incidentes en señales eléctricas mensurables. Mas tarde fueron apareciendo nuevos desarrollos para detección puntual, como los detectores "Channeltron" de bajo coste y uso general, y los sistemas de conversión fotónica mas sofisticados, sensibles y duraderos. También han aparecido sistemas de detección simultánea, tales como baterías de micromultiplicadores multicanal (Microchannel Plate o Multichannel Multiplier Array Detector), combinadas normalmente con posterior centelleo o conversión fotónica, cuya aportación a los nuevos desarrollos instrumentales en espectrometría de masas ha sido importante. La sensibilidad, precisión, y tiempo de respuesta son criterios importantes que distinguen los diferentes sistemas de detección de iones. Alta precisión y rápido tiempo de respuesta son características mutuamente excluyentes. Idealmente, la sensibilidad debe definir explícitamente la corriente de ion recibida por el detector. La definición debe incluir: (1) el nombre del compuesto de calibración, (2) el valor m/z del ion medido, (3) el poder de resolución del instrumento, (4) la cantidad de compuesto de calibración consumido por minuto, (5) la intensidad de la corriente de electrones y presión de la fuente de iones (para CI: ionización química), (6) la corriente del ion que llego al detector. Estas unidades de sensibilidad permiten comparar instrumentos, que en ocasiones es difícil ya que las diferentes compañías usan diferentes criterios.
7.1.Detector de copa de Faraday Este es un detector eléctrico convencional, iones positivos que impactan sobre el colector son neutralizados por electrones después de pasar a través de una resistencia. La caída de voltaje en la resistencia de acuerdo a un estándar es la medición de la corriente del ion. La señal del voltaje de la resistencia es entonces amplificada por un amplificador DC o por un electrómetro. La mínima corriente detectable es del orden de 10
A. El pequeño electrodo de metal que intercepta los iones positivos esta montado en una jaula de Faraday (Figura 7-1). La corriente del ion medida y amplificada es directamente proporcional al número de iones y al número de cargas de los iones. La respuesta de la copa faraday es independiente de la energía, la masa, o la naturaleza química de los iones. Este tipo de detector es simple, barato, resistente y fiable. Posee alta precisión, sensibilidad y produce poco ruido de salida. La principal desventaja es que tiene un gran retraso inherente a la simplificación del sistema. Por esto es que se utiliza para mediciones precisas o de corrientes de iones poco cargados y no debe ser usado para realizar examinaciones rápidas (por ejemplo en sistemas GC/MS). Se utiliza principalmente en sistemas para análisis de gases permanentes, en muestras ambientales, reactores, gases residuales, etc., normalmente combinado con un SEM (Multiplicador de Electrones Secundarios = Secondary Electron Multiplier), usándose uno u otro según la sensibilidad requerida y el vacío disponible. También tiene aplicación en los espectrómetros de masas para medida de Relaciones Isotópicas (IRMS = Isotopic Ratio Mass Spectrometer). En estos equipos se utilizan colectores múltiples, formados por una batería de copas de Faraday, cada una de las cuales se dedica a la detección de una única masa.
Figura 7-1: Diagrama esquemático del detector Copa de Faraday.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 27
7.2.Multiplicador de electrones secundarios
El multiplicador de electrones (electron multiplier) utiliza el principio de emisión secundaria de electrones para afectar la amplificación. En el dinodo discreto (discrete-dynode) los iones provenientes del analizador de masas son enfocados sobre un dinodo que emite electrones en proporción directa al número de iones bombardeados hacia él. Los electrones secundarios emitidos por el dinodo (convierte iones en electrones) son acelerados y enfocados hacia un segundo dinodo, el cual también emite electrones secundarios (multiplicación de electrones). De este modo, la amplificación es llevada a cabo a través de un “efecto cascada” de electrones secundarios de dinodo a dinodo, ya que el número de electrones que llegan a un dinodo es menor al que sale del mismo (Figura 7-2). Cada etapa es un dinodo de cobre-berilio conectado a un potencial sucesivamente mayor por un divisor de voltaje. Pueden llegar a tener de 10 a 20 etapas amplificando la señal en un orden de hasta 10
. Es un detector mucho más sensible que el de copa de Faraday, con una señal mínima detectable del orden de 10
A. Requiere alta tensión y un mayor vacío para operar, del orden de 10
-6 [torr] o mejor. Es un detector de vida limitada, pues se va desgastando con el uso, por lo que su ganancia va cambiando con el tiempo y requiere calibración frecuente. Es muy sensible a subidas de presión, pudiendo destruirse prácticamente si se produce una ruptura o accidente de vacío. La velocidad de respuesta del multiplicador de electrones, típicamente inferior a 50 ns, es mucho más rápida que la del detector Faraday, lo que permite mayores velocidades de barrido en el espectrómetro de masas. Figura 7-2: Multiplicador de electrones de dinodo discreto (discrete-dynodo).
Esta clase de detector lleva asociado sistemas electrónicos y mecánicos simples, aunque pueden no ser tan sensibles (al no tener amplificación de señal) y un tiempo de respuesta lento debido a alta impedancia en el amplificador. Es decir que si el amplificador de salida no es lo suficientemente bueno puede echar por tierra todas las ventajas que este tipo de detectores presenta.
7.3.Detector "Channeltron"
Este detector es uno de los más utilizados hoy en día en espectrometría de masas para uso general. Es similar al multiplicador de electrones clásico, con la principal diferencia de que no tiene múltiples dinodos discretos, sino que está formado por un tubo de vidrio en forma de corneta, a veces terminado en forma de espiral o caracol (figura 7-3), cuyo interior está recubierto por un óxido de plomo semiconductor de composición y características especiales. Si se desea detectar iones positivos, se aplica un potencial negativo en la boca del detector para que los iones procedentes del espectrómetro de masas, desviados de su trayectoria por una placa repulsora con potencial positivo sean atraídos a su interior y choquen con la cara interna, produciendo la emisión de un cierto número de electrones. El final del tubo del detector se sitúa a un potencial cercano a tierra, con lo que existirá un gradiente continuo de potencial desde la boca al fondo del detector. Debido a esto, los electrones arrancados en el impacto inicial del ion volarán en la dirección de los potenciales menos negativos, hacia potencial cero, produciéndose una gran cantidad de impactos en el camino, en cada uno de los cuales se multiplicará el número de electrones, con lo que se puede conseguir un efecto multiplicador del orden de 10
. A1 final del recorrido del tubo multiplicador se encuentran un cono colector con la electrónica de preamplificación y amplificación asociada. Si se desean detectar iones negativos, en principio basta con cambiar el signo de los potenciales aplicados a la placa repulsora y a la boca del channeltron. Por tanto, este detector es susceptible de ser empleado tanto para detectar iones positivos como negativos. El hecho de situar el detector fuera del "eje óptico" del espectrómetro, produce una ventaja importante, además de permitir la detección selectiva de iones positivos o negativos, como es la de evitar que alcancen el detector partículas o radiaciones no deseadas, tales como fragmentos neutros o fotones procedentes del filamento de la fuente, que podrían incrementar el ruido de fondo y originar señales parásitas. Otra ventaja de los "Channeltron" es que pueden exponerse a presión atmosférica sin ningún problema, siempre que el alto voltaje haya sido desconectado, lo que permite romper vacío en el sistema sin complicaciones. Requieren un vacío mínimo de trabajo del orden de 5 x 10
[torr], lo que no Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 28
debe ser problema en espectroscopia de masas donde es habitual trabajar con vacíos mejores que 10
-6 [torr] en el analizador. La vida de un detector "Channeltron", aunque superior a la de los multiplicadores de dinodos discretos, es también limitada y depende de la carga total acumulada, es decir, del voltaje aplicado y del número de iones detectados. A medida que la superficie interior se va agotando, se va haciendo necesario incrementar el alto voltaje aplicado para conseguir una señal adecuada. Cuando este fenómeno se acelera, es síntoma evidente de que el final de la vida útil del detector se acerca. Figura 7-3: Channeltron.
7.4.Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de centelleo)
Primero veremos una breve descripción de los elementos particulares que esta clase de detectores utiliza.
7.4.1.Detectores de centelleo y termoluminiscencia
Los detectores de centelleo y de termoluminiscencia (tld) son dos tipos de detectores que, si bien tienen un modo de funcionamiento y unas aplicaciones diferentes, poseen un principio básico de detección semejante. Existen unas sustancias cristalinas denominadas luminiscentes, a las que la radiación ionizante provoca unos defectos reversibles en la red cristalina. Se provoca por tanto un estado de mayor energía y, al volver espontáneamente a la conﬁguración de equilibrio, se emiten fotones en el rango de la luz visible. En las sustancias utilizadas en detectores de centelleo, por ejemplo sulfuro de cinc dopado con plata —ZnS(Ag)— o yoduro de sodio dopado con talio —NaI(Tl)— la vuelta al equilibrio de la red cristalina es casi instantánea, lo que los hace útiles para detección y medida de la radiación. En las sustancias utilizadas en los dosímetros de termoluminiscencia, como el ﬂuoruro de litio, la vuelta al equilibrio es un proceso extremadamente lento a temperatura ambiente, lo que hace que a efectos prácticos la red no presente efectos de reparación en períodos del orden del mes. Sin embargo,
frente a un calentamiento del material hasta temperaturas de 300◦C, el material vuelve rápidamente al equilibrio, emitiendo súbitamente todos los fotones correspondientes al cambio de la estructura cristalina. Esta propiedad lo hace muy útil como dosímetro, i.e., como sistema capaz de medir la dosis acumulada durante un período de tiempo y revelarla en un único proceso de lectura que, además, produce la recuperación del material para un nuevo uso. Durante el proceso de medida se produce una cantidad reducida de fotones, ya sea durante el proceso de irradiación en los detectores de centelleo o en el calentamiento para el caso de tld. Es pues necesario recogerlos en un sistema ampliﬁcador denominado fotomultiplicador. La recogida debe realizar en un ambiente de oscuridad total para no enmascarar las medidas. En el fotomultiplicador los fotones son convertidos a una señal eléctrica mediante un fotocátodo, material metálico compuesto usualmente por aleaciones de cesio-plata o semiconductores, con un potencial de ionización muy bajo, de modo que los fotones sean capaces de arrancar electrones de la red cristalina. Los electrones provenientes del fotocátodo son acelerados en etapas sucesivas contra electrodos intermedios llamados dinodos, buscando un efecto multiplicativo Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 29
al arrancar más electrones de éstos. En el último electrodo, el ánodo, se recoge una carga eléctrica proporcional a la inicialmente generada en el fotocátodo, pero ampliﬁcada por un factor del orden del millón. 7.4.2.Descripción de los detectores Daly
Este detector es uno de los más eficientes, sensibles y de más larga vida disponibles para detección puntual. Los iones procedentes del tubo de vuelo del espectrómetro de masas son desviados de su trayectoria mediante un potencial eléctrico. El voltaje aplicado es de signo contrario a la carga de los iones que se quieran detectar, para provocar su atracción y choque sobre el dinodo inicial. Este choque produce múltiples electrones que son atraídos, a su vez, por un voltaje más positivo que el del dinodo, y aplicado sobre una pantalla fosforescente. Figura 7-4: Esquema del detector Daly.
A1 recibir el impacto de los electrones, la pantalla de centelleo emite un gran número de fotones, los cuales se dirigen a un fotomultiplicador convencional sellado a vacío, produciéndose la consiguiente cascada de electrones que multiplica la señal. La señal es detectada al final de su recorrido por el interior del tubo fotomultiplicador, siendo posteriormente de nuevo amplificada, digitalizada y elaborada mediante circuitos electrónicos, para su manipulación por el sistema de tratamiento de datos del espectrómetro de masas. Una ventaja de este detector sobre los clásicos "Channeltron", aparte de su mayor sensibilidad y estabilidad, es su extraordinaria duración, ya que el elemento que envejece principalmente es el fotomultiplicador, que sufre en todo caso menos deterioro, pues recibe el impacto de fotones y electrones que causan menor daño que el impacto directo de los iones. Además, la sustitución del multiplicador no es nada costosa, ya que se trata de un componente normal, disponible en el mercado a bajo precio. 7.5.Detectores multicanal o microcanal
Existen varios tipos de detectores que pueden incluirse en esta denominación de multicanales. Se basan en un arreglo de capilares de vidrio huecos (de 10-25mm de diámetro), recubiertos internamente de un material semiconductor, emisor de electrones, formando microcanales. Manteniendo estos microcanales a un alto voltaje se obtiene la expulsión de electrones al golpear el material con iones, esto causa una avalancha, creando electrones secundarios con una ganancia de entre 10
(Figura 7-5). Cada microcanal actúa como multiplicador de electrones independiente y el conjunto se conecta eléctricamente en paralelo. Estos detectores son útiles en señales de baja intensidad. Luego de una o dos capas de baterías de micromultiplicadores, se coloca un sistema de detección mas o menos sofisticado y eficiente, encargado de detectar simultáneamente todas las señales. Este tipo de detectores reúnen la ventaja de los antiguos sistemas de fotoplacas, de ser capaces de detectar simultáneamente una amplia zona espectral, lo que aumenta enormemente el Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 30
tiempo de observación de cada ion. Ello conduce a una sensibilidad aumentada en muchos órdenes de magnitud. Los detectores de placas de microcanales pueden detectar tanto señales pequeñas como grandes con mínimos niveles de saturación y su tiempo de respuesta para la generación de voltajes de salida es muy corto en comparación con otros tipos de detectores. Existen distintas denominaciones de este tipo de detectores tales como: Multiple Channel Detector, Multiplier Array Detector, Microchannel Multipliers, Multichannel Photo Diode Array, ect.
Figura 7-5: Principio de funcionamiento del detector de microcanales.
Los microcanales pueden también emitir electrones a través de pantallas fosforescentes. Un detector de arreglo de fotodiodo es usado para convertir los fotones liberados en señales eléctricas. (Véase la figura 7-6).
Figura 7-6: Detector de arreglo de fotodiodo.
7.6.Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas
Con el fin de disponer de picos de masas conocidas se utilizan sustancias de referencia, de espectro bastante complejo pero muy bien conocido, para realizar la calibración de la escala de masas del espectrómetro. Lo que se hace es ajustar las distintas lentes y rendijas de la fuente para conseguir los valores óptimos de los iones fragmento del compuesto de referencia de los cuales se conoce su masa exacta así como las abundancias relativas de cada uno. A este proceso se le denomina “TUNE” (sintonía). Las sustancias de referencia más utilizadas son heptacosa (perfluorterbutilamina) para la calibración de las masas en equipos de baja resolución y el PFK (perfluorkeroseno) para los de alta. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 31
8.Espectros moleculares
Los espectros de masas obtenidos por ionización API o MALDI-TOF son totalmente diferentes a los conseguidos por otras técnicas de ionización, y consiste en una serie de señales discretas a lo largo de todo el dominio espectral, que corresponden, cada una de ellas, a una molécula intacta cargada con diferente número de cargas, y con un cierto número de protones añadidos. A modo de ejemplo en la figura 8-1, se muestra el espectro de masas del poliestireno.
Figura 8-1: Espectro de masas del poliestireno 7,600 obtenido por MALDI-TOF. Los siguientes son otros espectros de masas de diferentes materiales, también obtenidos por espectrometría MALDI o MALDI-TOF:
Figura 8-2: Espectro de un peptido usando ionización positiva MALDI y ácido alpha-cyano-4-hydroxycinnamic como matríz.
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Figura 8-3: Espectro de MALDI-TOF de los oligosacáridos liberados por hidrólisis parcial de un polisacárido del liquen L. pustulata[10]. Recordemos que el eje vertical es abundancia relativa y el horizontal es valor de la relación m/z.
Figura 8-4: Espectro MALDI-TOF del poliestireno.
Figura 8-5: Espectro MALDI-TOF del Poly(Propylene Glycol).
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9.Introducción a la Espectroscopía Infrarroja
9.1.La Espectroscopía
La espectroscopia es una rama de la Ciencia Físico-Química que se ocupa del estudio de los "espectros" para conocer la forma de obtenerlos, la forma de medirlos y la aplicación al análisis químico. El espectro se define como una representación gráfica o fotográfica de la distribución de intensidades de la radiación electromagnética emitida o absorbida por la materia, en función de la longitud de onda de dicha radiación. Los espectros son debidos a transiciones entre estados de energía característicos de la materia. Los espectros pueden ser de emisión, que se obtienen excitando adecuadamente la materia para que emita radiación electromagnética y de absorción, obtenidos sometiendo a la materia a una radiación electromagnética continua y representando la proporción de radiación absorbida por la misma en función de la frecuencia o longitud de onda. 9.2.Espectrometría infrarroja
La principal utilización de la espectrometría infrarroja ha sido la identificación de compuestos orgánicos, ya que los espectros correspondientes suelen ser complejos y contienen numerosos máximos y mínimos que pueden servir para realizar comparaciones. Con excepción de los isómeros ópticos, no existen teóricamente dos compuestos que absorban exactamente en la misma forma. Igualmente, la espectroscopía infrarroja se emplea cada vez más en el análisis cuantitativo. En este caso, su enorme ventaja reside en la gran selectividad, lo que posibilita a veces cuantificar una sustancia en una mezcla compleja sin realizar mucho trabajo previo de separación. Para absorber radiación infrarroja, una molécula debe experimentar un cambio neto en el momento dipolar como consecuencia de su movimiento vibratorio y rotatorio. Sólo en estas circunstancias puede interaccionar con la molécula el campo eléctrico alternante de la radiación y causar cambios en su movimiento. Si la frecuencia de la radiación iguala a la frecuencia de una vibración natural de la molécula, ocurre una transferencia neta de energía que da por resultado un cambio en la amplitud de la vibración molecular; la consecuencia es la absorción de la radiación. Análogamente, la rotación de moléculas asimétricas alrededor de sus centros de masa produce una fluctuación dipolar periódica; nuevamente, es posible la interacción con la radiación. La energía requerida para causar un cambio en el nivel rotatorio es muy pequeña. Los niveles de energía vibratoria están igualmente cuantizadas y las diferencias de energía entre estados cuánticos corresponden a las regiones fácilmente accesibles del infrarrojo de 13000 a 675 cm-1. Figura 9-1: Zonas espectrales. Origen de la radiación electromagnética. Técnicas instrumentales Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 34
El espectro infrarrojo de un gas consiste por lo general en una serie de líneas muy próximas entre sí debido a que existen varios estados energéticos rotatorios para cada estado vibratorio. Por otra parte en el estado líquido y sólido la rotación esta muy restringida, y desaparecen las líneas rotacionales discretas, dejando sólo picos vibracionales algo ensanchados. Una molécula puede ser modelada como un sistema de osciladores acoplados, descritos aproximadamente por un movimiento armónico cuántico, en consecuencia por compleja que sea una molécula‚ su modelo vibracional es una combinación de sus modos normales de vibración. En la figura 9-1 se muestran las regiones del espectro que se emplean con fines analíticos, los nombres de las técnicas espectroscópicas y las transiciones moleculares o atómicas a las que se debe la absorción o emisión de radiación en cada región.
9.3.Sobre las vibraciones moleculares
En moléculas sencillas es posible definir el tipo de vibraciones que tienen lugar entre los distintos átomos enlazados e identificar la radiación electromagnética que es absorbida para modificar su estado vibracional. En moléculas complejas esta posibilidad es más difícil tanto por el elevado número de vibraciones como por las interacciones entre los distintos centros vibracionales que se producen. Hay dos clases de vibraciones básicas o fundamentales, de tensión o alargamiento y de deformación o flexión, (figura 9-2). Las vibraciones de tensión producen un cambio continuo de la distancia entre los átomos sin abandonar el eje de enlace. Las vibraciones de deformación o flexión se caracterizan por un cambio en el ángulo de dos enlaces y se clasifican en cuatro tipos, de tijera, de oscilación en el plano o balanceo, de sacudida fuera del plano o cabeceo y de torsión fuera del plano o trenzado. En la moléculas de más de tres átomos, además de las vibraciones descritas, puede producirse interacciones o acoplamientos que dan lugar a cambios en las características de las vibraciones. Figura 9-2: Tipos de vibraciones moleculares. + indica movimiento desde el plano de la página hacia el lector; - indica movimiento desde el plano de la página alejándose del lector.
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9.4.Modelos vibracionales
Las características de una vibración atómica de tensión en una molécula biatómica son, en principio, similares a un modelo mecánico consistente en dos masas unidas por un muelle, (oscilador armónico). Para iniciar el desarrollo se considera la vibración de una masa unida a un resorte que cuelga de un objeto inmóvil, la energía potencial para un desplazamiento de la masa sobre su posición de equilibrio es, La curva de energía potencial para una oscilación armónica simple, obtenida a partir de la ecuación anterior, es una parábola, figura 9-3. En la posición de equilibrio, d=0, la energía potencial es nula y alcanza el valor máximo cuando el resorte está extendido o comprimido a máxima amplitud.
k :cte de fuerza
d : distancia recorrida por la masa
Figura 9-3: Curva de energía potencial en un oscilador armónico.
2¬ .
m: masa del objeto
Esta expresión de la frecuencia de vibración se puede aplicar a un oscilador armónico, formado por dos bolas de masas m1, m2; y a dos átomos unidos por un enlace y en movimiento vibratorio, v =
: masa delas bolas o delos átomos
µ: masareducida=(m
k :constante de fuerza del muelle odel enlace químico
Sin embargo, el movimiento vibratorio de dos átomos unidos por un enlace químico difiere del sistema de dos masas unidas por un muelle, debido a que la energía vibracional de los átomos en una molécula está cuantificada, figura 9-4, y solamente son permitidos ciertos niveles energéticos, según la siguiente Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 36
expresión, v =
hv = (
V : es el nº cuánticovibracional , toma valores de( 0,1, 2, 3, etc)
h: es la cte. Planck ,(h=6,625210
erg seg)
v : frecuencia devibración de enlace
µ: masareducida
La transición entre dos niveles energéticos vibracionales consecutivos corresponde a un ∆Evib, A E
La absorción de radiación con energía igual a esta diferencia da lugar a la transición vibracional que queda reflejada en el espectro. Las radiaciones electromagnéticas con esta energía se encuentra en la región infrarroja del espectro electromagnético. La cuantificación de la energía vibracional en un sistema molecular, no es la única diferencia existente entre 2 átomos unidos por un enlace (vibraciones moleculares) y un oscilador armónico definido por dos masas unidas por un muelle (mecánica clásica). Cuando 2 átomos se acercan entre sí, en el movimiento vibratorio, se produce una repulsión entre los dos núcleos con una fuerza que actúa en la misma dirección que la fuerza restauradora del enlace. Este efecto hace que en el extremo en el que los átomos se acercan, la energía potencial se eleve rápidamente; mientras que en el extremo, en el que los átomos se alejan al máximo, se produce una disminución de la fuerza restauradora y por tanto de la energía potencial, figura 9-4. Las curvas de energía potencial correspondientes a un oscilador armónico (dos masas unidas por un muelle) y un oscilador no armónico (vibraciones moleculares) son muy parecidas, sobre todo a energías potenciales bajas. Figura 9-4: Curvas de energía potencial en un oscilador armónico (1) y oscilador no armónico (2).
La transición desde el nivel v=0 al primer estado excitado v=1 absorbe intensamente la radiación electromagnética exterior dando lugar a bandas espectrales fundamentales. La absorción de luz entre niveles separados por dos o más unidades, ∆v=±2 ó ±3, origina bandas débiles, conocidas como sobretonos, a frecuencias dos o tres veces mayores que la frecuencia de la vibración fundamental. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 37
10.El espetrómetro infrarrojo
10.1.Funcionamiento y descripción
Con el fin de hacer medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja a través de la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida. Repetiendo esta operación en un rango de longitudes de onda de interés (por lo general, 4000-400 cm
) se puede construir un gráfico. Al examinar el gráfico de una sustancia, un usuario experimentado puede obtener información sobre la misma. Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y se usa mucho en química, en especial en química orgánica. Se pueden generar gráficos bien resueltos con muestras de una sola sustancia de gran pureza. Sin embargo, la técnica se utiliza habitualmente para la identificación de mezclas complejas. La zona de radiación infrarroja del espectro electromagnético está limitada por las regiones del espectro visible y del microondas. Como se muestra en la tabla 9.1, se distinguen tres zonas, siendo la del infrarrojo medio la que hasta el momento actual tiene mayor aplicación analítica. DENOMINACION INTERVALO ν (cm
) INTERVALO λ (µm) INFRARROJO PROXIMO 12500-4000 0,8-2,5 INFRARROJO MEDIO 4000-660 2,5-15,15 INFRARROJO LEJANO 660-50 15,15-200 Tabla 10-1: Zonas espectrales infrarrojas. Dos son los tipos de espectrofotómetros más utilizados, dispersivos de red, y con transformada de Fourier. Como se verá a continuación, existen claras diferencias entre los dos equipos; los espectrofotómetros con transformada de Fourier es un equipo más moderno que el espectrofotómetro dispersivo y presenta una serie de ventajas como las que se citan seguidamente:
● Los espectros se obtienen con gran rapidez, porque se miden simultáneamente la energía absorbida por la molécula a todas las longitudes de onda, en la zona espectral del infrarrojo medio. ● Esta rapidez permite hacer múltiples barridos espectrales para una misma muestra y calcular, posteriormente, la media de todos ellos; con lo que se mejora la relación (señal/ruido). ● La identificación de la longitud de onda que incide sobre la muestra es mucho más exacta, porque se utiliza un láser para el calibrado de la misma. ● El equipo tiene menos elementos a través de los cuales pasa la radiación electromagnética, por lo que la pérdida de intensidad de la radiación en su recorrido hacia la muestra es menor. Esto permite poder detectar absorciones de energía más débiles. Espectrofotómetros dispersivo: La figura 10-1 muestra un esquema de un espectrofotómetro convencional de doble haz, cuyo funcionamiento se indica a continuación:
● La radiación procedente de la fuente se divide en dos haces; uno se dirige a la célula muestra, y el otro a la célula referencia (vacía o con disolvente).
● El haz de referencia pasa por un atenuador y se dirige al divisor periódico.
● El divisor periódico es un disco impulsado por un motor que deja pasar alternativamente el haz de muestra y el de referencia.
● Se produce la dispersión de la radiación por el prisma (monocromador). ● Los haces llegan alternativamente al detector y dan lugar a una señal eléctrica. ● La señal se amplifica y pasa al rectificador sincrónico, aparato que está acoplado mecánica o eléctricamente al divisor periódico de forma que el interruptor del rectificador y el haz que abandona el divisor periódico cambien simultáneamente. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 38
● Si los dos haces son idénticos en potencia, la señal del rectificador es una corriente continua; si los haces difieren en potencia se produce una corriente fluctuante o alterna cuya polaridad viene dada por el haz que sea más intenso. ● La señal del rectificador es filtrada, modulada y amplificada para impulsar el motor sincrónico en una dirección u otra según la polaridad de la señal. El motor sincrónico está conectado al atenuador y a la pluma del registro, y hace que ambos se muevan hasta alcanzar la anulación.
● El atenuador del haz es el mecanismo por el cual la potencia del haz de referencia se reduce para igualarse a la del haz que pasa por la muestra. El mecanismo consiste en un peine de dientes finos que se estrecha hacia las puntas. Este peine se opone a la radiación eliminando una fracción del haz de la misma. El peine se pone en movimiento cuando el detector percibe una diferencia de potencial entre la muestra y referencia. ● Otro motor sincrónico impulsa el papel y varía la longitud de onda. Figura 10-1: Diagrama de un espectrofotómetro dispersivo de doble haz. Línea oscura gruesa indica enlace mecánico; línea delgada enlace eléctrico; línea de trazos trayectoria de la radiación.
Espectrofotómetro con transformada de Fourier: En la figura 10-2 se muestra un esquema óptico de un espectrofotómetro basado en la transformada de Fourier. En él se observa que el rayo infrarrojo es generado en la fuente A y, posteriormente, colimado y dirigido hacia el interferómetro C por medio de un espejo fijo toroidal B.
● El rayo del láser de Helio-Neón sigue a la radiación infrarroja a través del interferómetro con objeto de determinar el desplazamiento del espejo móvil y para conocer la longitud de onda a la que se produce la absorción de radiación. ● A la izquierda del compartimento de la muestra se encuentra un espejo toroidal ajustable D que conduce el rayo procedente del interferómetro a la muestra. Desde el compartimento de la muestra el rayo llega, a través de una rendija, a un detector térmicamente estable de tantalato de litio. El interferómetro, que sustituye al tradicional monocromador, es la parte esencial de este aparato, pues es el encargado de modular cada frecuencia del infrarrojo con el fin de realizar la transformada de Fourier. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 39
Figura 10-2: Diagrama de un espectrofotómetro por transformada de Fourier.
El esquema de un interferómetro se muestra en la figura 10-3 y consta de un divisor de haz B que refleja la radiación infrarroja hacia un espejo fijo C y hacia otro móvil D. Los dos haces reflejados se recombinan de nuevo en el divisor de haz, interfiriendo constructiva o destructivamente según cual sea el valor de la diferencia de camino óptico entre el divisor y cada uno de los espejos. Por ejemplo, para un desfase δ=0, λ, 2λ,... los dos rayos interfieren constructivamente y si δ=λ/2, 3λ/2, 5λ/2,... destructivamente; así, si se va cambiando el valor del desfase suavemente desde cero; se detecta una señal de intensidad modulada como una función cosenoidal. La señal de salida del interferómetro se denomina interferograma que es la suma de todas las ondas cosenoidales moduladas. Figura 10-3: Esquema del interferómetro. Los componentes básicos de que consta un espectrofotómetro de IR, que permite medir la absorción de radiación infrarroja por parte de las moléculas, son la fuente de radiación, el sistema óptico de dispersión (monocromador), el sistema de detección, el registrador del espectro y las cubetas portamuestras. En las subsecciones siguientes se hace una breve descripción de estos elementos concluyendo con el funcionamiento del espectrofotómetro. Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 40
10.2.Fuente de radiación
La fuente de radiación es un sólido inerte calentado eléctricamente a temperatura comprendida entre 1.500 y 2.000 K. Se produce una radiación continua que se aproxima a la de un cuerpo negro. El cuerpo ideal capaz de emitir el máximo de intensidad de radiación para una temperatura y longitud de onda determinada, recibe el nombre de cuerpo negro; se destacan las siguientes: ● Emisor incandescente de Nernst, es un cilindro de un diámetro 1 a 2 mm y 20 mm de longitud, construido de óxido de zirconio y pequeñas cantidades de óxidos de ytrio y torio. En los extremos del cilindro se alojan las resistencias de platino para el paso de la corriente eléctrica; lo que permite alcanzar temperaturas de 2.200 K, y una emisión de un 60 % con respecto al cuerpo negro. La máxima intensidad de radiación se produce entre 1 y 10 µm (10.000-1.000 cm
. ● Fuente Globar, es una barra de carburo de silicio de 5 cm de longitud y 0,5 cm de diámetro. Se calienta eléctricamente hasta temperaturas de 1.500 K. Tiene una radiación estable entre 1 y 40 µm (10.000-250 cm
) con una emisión del 75% respecto al cuerpo negro. Es semejante al emisor de Nerst excepto en la región inferior a 2.000 cm
donde el Globar tiene mejor rendimiento. ● Fuente de filamento incandescente, es una espiral de alambre de níquel-cromo calentado por el paso de la corriente eléctrica hasta una temperatura de 1.900 K. Produce menor intensidad que los anteriores pero tiene una vida más larga. ● El láser sintonizable de dióxido de carbono es una fuente infrarroja para monitorear algunos contaminantes atmosféricos y para determinar las especies de absorción en soluciones acuosas. 10.3.Sistema óptico de dispersión
Tiene por objeto seleccionar haces estrechos de radiación de pequeños intervalos de frecuencias y hacerlos incidir sobre el detector una vez que han pasado por la muestra. Como agentes dispersantes de la radiación se emplean prismas y redes de difracción. Los primeros han de ser construidos de un material transparente a la radiación infrarroja, considerándose desechable cuando la absorción es superior al 50 %. Los materiales más usados son el cuarzo fundido, solo aplicable a radiaciones del IR cercano, el cloruro sódico cristalizado cuando la radiación corresponde al IR normal (2.000-660 cm
) ampliable hasta 4.000 cm
; el bromuro potásico y el bromuro de cesio se emplean en el IR lejano. Las sales metálicas, de las cuales se construyen estos materiales, son higroscópicas por lo que es necesario mantener una atmósfera ausente de humedad. Las redes de difracción, como sistema óptico dispersante de la radiación, pueden ser construidas de material estable como vidrio o plástico, recubierto de aluminio. Ofrecen un mayor poder de resolución. 10.4.Sistemas de detección
Las radiaciones infrarrojas no se pueden medir con detectores eléctricos, similares a los utilizados para detectar radiaciones UV-Vis., debido a la insuficiente energía del fotón correspondiente. En los espectrofotómetros de dispersión los detectores son térmicos y térmicos piroeléctricos; en espectrofotómetros con transformada de Fourier los detectores pueden ser piroeléctricos o fotoconductores. En los detectores térmicos, la respuesta se produce por el efecto de calentamiento que sufre un cuerpo negro al incidir sobre él la radiación IR. El elemento sensible del detector ha de ser lo más reducido posible y tener una capacidad calorífica pequeña con el fin de que la diferencia de temperatura que se produzca sea lo mayor posible (del orden de 10-6 C). Asimismo, han de estar aislados de la radiación térmica que puedan emitir otros objetos próximos, dentro del equipo. A continuación se describen algunos detectores cuyo uso esta restringido a espectrofotómetros clásicos o dispersivos. ● Bolómetro, es un tipo de termómetro de resistencia construido de platino o níquel, denominado también, termistor. Estos materiales presentan cambios relativamente grandes en la resistencia al paso de la corriente eléctrica en función de la temperatura. Consiste en una cinta de platino o níquel, como elemento sensible, pintado de negro y montado sobre un puente de Wheatstone por el que pasa la corriente eléctrica; al incidir la radiación cambia la resistencia y varía la diferencia de potencial; el puente se desequilibra y la corriente que pasa por el galvanómetro es proporcional a la intensidad de la radiación.
Espectrometría L.A.S.E.R. e Infrarroja. 41
● Detector de Golay, es un termómetro de gas que contiene xenón en una pequeña cámara cilíndrica con una membrana negra. En un extremo del cilindro hay una ventana transparente al infrarrojo y en el otro un diafragma flexible que está plateado por la parte exterior. En la superficie plateada se refleja un haz de luz hacia el cátodo de un fototubo. Al incidir la radiación de infrarrojos la membrana negra, que hay en el interior del cilindro, se calienta y calienta al xenón; el resultado es un aumento de presión en el cilindro que hace variar la posición del diafragma plateado. Esto modifica la fracción de radiación que incide en el cátodo del fototubo y la detección del mismo. ● Termopares, consisten en uniones termoeléctricas de dos piezas metálicas diferentes (platino-
paladio, antimonio-bismuto, etc.). Entre las dos uniones se produce un potencial que varía con la diferencia de temperatura, entre dichas uniones, al encontrarse dentro de un circuito eléctrico. Una de las uniones (soldadura fría) se apantalla cuidadosamente y se mantiene a temperatura constante, exponiéndose la soldadura caliente a la radiación infrarroja con lo que aumenta su temperatura. La diferencia de potencial entre los extremos depende de la diferencia de temperatura entre las soldaduras y por tanto de la cantidad de radiación IR que incide sobre la soldadura caliente. El termopar es capaz de responder a diferencias de temperatura de 10-6 C.
● Detectores piroeléctricos, se construyen con láminas cristalinas de materiales piroeléctricos, como sulfato de triglicina. Situado el cristal piroeléctrico entre dos electrodos se produce una capacitancia que es sensible a la temperatura. Por tanto, al incidir la radiación infrarroja el cristal polielétrico se calienta y se modifica la distribución de cargas a través del cristal, que provoca una corriente en un circuito eléctrico externo. La intensidad de la corriente depende, entre otras cosas, de la velocidad de cambio de polarización con la temperatura. Una característica de este detector es que tiene respuestas muy rápidas; lo que permite medir las señales procedentes de un interferómetro instalados en equipos con transformada de Fourier.
● Detectores fotoconductores, son detectores de telururo de cadmio y mercurio y tienen una respuesta más rápida que los detectores polieléctricos; por lo que tienen una amplia aplicación en espectrofotómetros con trasformada de Fourier. Consisten en una delgada película de un material semiconductor colocada sobre una superficie de vidrio y sellada en una cámara al vacío. La absorción de radiación infrarroja hace que electrones de valencia no conductores pasen a ser conductores, disminuyendo la resistencia eléctrica del semiconductor. Se colocan en serie un fotoconductor, una fuente de voltaje y una resistencia; el descenso de voltaje en la resistencia está relacionada con la intensidad de la radiación electromagnética.
10.5.Preparación de las muestras. Cubetas portamuestras
En espectroscopia infrarroja no existen buenos disolventes que sean transparentes a todas las radiaciones espectrales, lo que entraña una dificultad para determinar con exactitud la absorbancia de radiación por parte de las moléculas. Se pueden analizar compuestos en estado sólido, líquido y gaseoso; el recipiente de la muestra será distinto según se presente la misma y ha de estar construido de un material transparente a la radiación.
Figura 10-4 y 5: Recipientes de las muestras a analizar (cuvettes). Gases Izq. Líquidos Der.
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● Muestras de Gas: El espectro de gas puede obtenerse al permitir que la muestra se expanda en una celda, también llamada cuvette.
● Soluciones: Las celdas de solución infrarroja constan de dos ventanas selladas y separadas por dos juntas delgadas de Teflón, cobre o plomo previamente humedecidas con mercurio. Las ventanas comúnmente están hechas de cloruro de sodio, cloruro de potasio o bromuro de cesio. Las muestras que son líquidas a temperatura ambiente son generalmente analizadas en forma pura o en solución. Los solventes más comunes son tetracloruro de carbono (CCl4) y disulfuro de carbono (CS2). Cloroformo, cloruro de metileno, acetonitrilo y acetona son solventes comunes para materiales polares.
● Sólidos: Polvos o sólidos reducidos a partículas pequeñas pueden examinarse como una pasta delgada o mullita. La mullita se forma triturando algunos miligramos de la muestra en presencia de una o dos gotas de aceite de hidrocarburo. La mullita resultante se examina luego entre dos placas de sal. Se coloca una ventana del mismo grosor en la trayectoria del haz. Otra técnica para sólidos es triturar un miligramo o menos de la muestra con alrededor de 100 miligramos de bromuro de potasio. La mezcla luego se presiona en una molde para crear un disco transparente. Se coloca un disco de bromuro de potasio puro en el trayecto del haz correspondiente.
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11.Aplicaciones analíticas del espetrómetro infrarrojo
La espectroscopia infrarroja tiene aplicaciones en análisis cualitativo y cuantitativo. Su principal utilización ha sido en la identificación de compuestos orgánicos, debido a que no existen, teóricamente, dos compuestos que absorban exactamente en las mismas frecuencias.La espectroscopia de IR está más centrada en el estudio de compuestos orgánicos. Si no se aplica a los compuestos inorgánicos se debe a que la mayoría de las vibraciones de estos compuestos están por debajo de la frecuencia de 400 cm
. A continuación se mostrarán diagramas obtenidos con espectrómetros infrarrojos.
Figura 11-1: Espectro infrarrojo de una muestra de pintura. Material identificado como “goma laca”.
Figura 11-2: Espectro del CO2.
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Figura 11-3: Espectro infrarrojo de compuesto químico
Figura 11-4: Espectro de ácido carboxílico.
Figura 11-5: Dominio de tiempo versus dominio de frecuencia: la transformada de Fourier (FT-IR).
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12.Bibliografía y Agradecimientos
12.1.Bibliografía
1. An Introduction to Mass Spectrometry. Dr Alison E. Ashcroft, Mass Spectrometry Facility Manager, Astbury Centre for Structural Molecular Biology, Astbury Building, The University of Leeds. 2. http://es.wikipedia.org
3. MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS - CURSO DE MÉTODOS - ESPECTROMETRÍA DE MASAS de GERMÁN PLASCENCIA VILLA. Instituto de Biotecnología – UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO.
4. IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS VOLÁTILES POR CG-MS. M.C. Gutiérrez, M. Droguet.
5. CROMATOGRAFIA PRINCIPIOS Y APLICACIONES. Rafael Gómez - Ullate Ricón - Alonso Serrano Álvarez.
6. www.monografias.com - Síntesis de péptidos.
7. http://macromoleculas.unq.edu.ar/Unidades/Qu%EDmica_prote%EDnas_A_2U1.doc 8. Fundamentos de Ingeniería Nuclear. Miguel Moro Vallina.
9. http://www.cem.msu.edu/~reusch/VirtualText/Spectrpy/MassSpec/mspec.htm#ms2
10. http://www.cib.csic.es/es/index.php (Centro de investigaciones biológicas)
11. http://www.espectrometria.com/ 12.2.Agradecimientos
Al Altísimo Dios, Creador del cielo y de la tierra, fuente de toda razón y justicia, y mi inspiración. A mi profe de Fibra Ópticas para las comunicaciones, Nestor H. Mata, por su gran paciencia y por su dirección para la realización de este informe ... y por aprobarme. A Diego y Patri, esos amigos y críticos, que en este y en mis otros informes han aportado esa muy necesaria realimentación, tomando tiempo para leerlos y corregir mis incontables errores; agradezco a Dios el haberlos puesto en mi camino para ayudarme a ser cada día mejor. A todos muchas pero muchas GRACIAS!!!
Dios les re bendiga!!!
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