Source: https://es.scribd.com/doc/149367113/Analisis-de-Imagenes
Timestamp: 2017-02-21 03:28:55+00:00

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Las técnicas de análisis de imagen tienen aplicaciones en astronomía, teledetección, y también en neurociencias.
ANÁLISIS DE IMÁGENES. ¿Qué es el análisis de imágenes? En su acepción más amplia, el término hace referencia a un conjunto de técnicas destinadas a obtener datos relativos a un sistema objeto de estudio a partir de imágenes de dicho sistema. Los datos de interés suelen ser casi siempre numéricos. Por ejemplo, en astronomía, el análisis de imágenes sirve para medir la distancia entre estrellas a partir de imágenes tomadas por telescopios. En geografía, sirve para estudiar la orografía de una región a partir de fotografías tomadas por un satélite. En neurociencias, el término se aplica a un conjunto de técnicas con fines tan diversos como medir el perímetro de una neurona o la longitud de su árbol dendrítico (morfometría), determinar la presencia de una determinada molécula en el tejido nervioso (densitometría), estimar el número de neuronas en un determinado núcleo cerebral (estereología), o producir una reconstrucción tridimensional de dicho núcleo (reconstrucción 3D). Lo normal es que las imágenes necesarias para el análisis se tomen mediante un microscopio.
Software gratuito de análisis de imágenes:
• NIH Image (para Macintosh): http://rsb.info.nih.gov/nih-image/Default.html • ImageJ (para Windows y Linux): http://rsb.info.nih.gov/ij/
Sitios web sobre técnicas de análisis de imágenes:
• http://www.imagingresearch.com/applications/densitometry.asp • http://support.universal-imaging.com/docs/T10012.pdf • http://ourworld.compuserve.com/homepages/tobiasinc/TApages/bulletin3.htm
Textos sobre análisis de imágenes:
• Russ, J.C. The Image Processing Handbook. 4 Ed. (CRC Press). 2002. • Gonzalez, R.C., Woods, R.E. Digital Image Processing. 2 Ed. (Addison-Wesley). 2002.
Textos sobre estadística básica:
• Lopez-Poveda, EA. Fundamentos de estadística. (Popular Libros, S.L., Albacete, España). 2002. ISBN: 84-932498-6-6. • Rowntree, D. Statistics witout tears: A primer for non-mathematicians. (Penguin Books, London). 1981. • Swinscow, T.D.V. Statistics at square one. (BMJ Books, London). 1996.
Este módulo tiene dos partes. En la primera de ellas, se dan sólo unas pinceladas generales sobre el análisis de imágenes digitales y su utilidad en neuronciencias. En concreto, se explican conceptos básicos de imágenes digitales, densitometría, y morfometría. En la segunda parte, se muestra cómo pueden aplicarse conceptos básicos de estadística al análisis de datos morfométricos y densitométricos obtenidos del análisis de imágenes digitales. Para seguir los ejemplos del módulo adecuadamente, el alumno deberá disponer del software de hoja de cálculo Microsoft Excel y del software de análisis de imágenes ImageJ, para Windows o Linux, o su equivalente NIH Image para Macintosh. En la ilustración se muestran algunos recursos on-line que resultarán útiles para completar y ampliar los conceptos del módulo.
Cámara fotográfica convencional Cámara fotográfica digital
¿Cómo se adquiere la imagen que se observa al microscopio? Las imágenes observadas al microscopio deben adquirirse mediante una cámara fotográfica o de vídeo. La técnica de adquisición de imágenes al microscopio mediante cámaras fotográficas recibe el nombre de fotomicroscopía. Las cámaras fotográficas empleadas pueden ser ópticas o digitales. Cada vez está adquiriendo más auge la fotomicroscopía digital debido a sus ventajas.
Fotomicroscopía convencional. ***MIGUEL***
Software de captura y análisis de imágenes digitales
Capturadora Capturadora de devídeo vídeo
Fotomicroscopía digital. Para tomar imágenes de microscopía en formato digital es necesario disponer de un microscopio, una cámara fotográfica (o de vídeo) digital, un computador y el software necesario para capturar y analizar las imágenes. Puede ser necesaria, además, una tarjeta de vídeo o una controladora de la cámara que sirve de interfaz entre la cámara y el computador. No debe confundirse la tarjeta de vídeo con la tarjeta gráfica que poseen todos los computadores.
Este es el rango dinámico del sensor. la cámara de la ilustración posee una resolución de 35×31 = 1085 píxeles. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. La luz muy brillante satura el sensor. La luz cuya intensidad está por debajo del umbral de sensibilidad de la cámara induce un voltaje que no puede discriminarse del ruido generado internamente por el CCD. Por ejemplo. su sensibilidad. Contiene un circuito integrado sensible a la luz que captura una imagen transformando cada uno de los elementos de la misma (denominados píxel) en una corriente eléctrica cuya intensidad es proporcional al color del píxel. y su rango dinámico. También se denomina cámara CCD – charged-coupled device. Algunas características fundamentales de una cámara digital son su resolución. La sensibilidad se refiere a la capacidad de la cámara para capturar imágenes con iluminación muy tenue. Cuanto mayor sea este rango mejor será la cámara.Enrique A.es
Cámara digital Dispositivo CCD
Horizontal = 35 píxeles Esta cámara posee una resolución de 35×31 píxeles. la obtención de imágenes de tejidos tratados con agentes fluorescentes exige cámaras muy sensibles. Las cámaras actuales poseen resoluciones superiores a 1024×768. La resolución de la cámara indica el número de píxeles que puede capturar Se determina multiplicando el número de píxeles horizontales de su CCD por el número de píxeles verticales (H×V). mayor será la definición de la imagen digital que la cámara puede capturar. Cuanto mayor sea la resolución. Así. La sensibilidad es inversamente proporcional a la luminosidad mínima que la cámara puede captar y que suele expresarse en unidades “lux”. Suele expresarse en decibelios: Rango dinámico (en decibelios) = 10×log10(luminosidad máxima tolerada sin saturación / luminosidad í i d d t t )
. La luz cuya intensidad está entre estos dos extremos inducirá un voltaje útil.
Vertical = 31 píxeles
La cámara digital. La luz incidente en la cámara digital induce un voltaje en el dispositivo CCD.
info. Por ejemplo.html) controlan el proceso de captura de imágenes mediante tarjetas de vídeo ScionTM y cámaras COHU y.Enrique A.es
El software ImageJ de análisis de imágenes para sistemas operativos Linux y Windows es gratuito.info. Es necesario diferenciar entre los procesos de captura y análisis de una imagen digital. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.nih.gov/nih-image/Default. http://rsb. permiten realizar prácticamente cualquier tipo de análisis morfométrico y densitométrico de las imágenes capturadas. rsb.nih. Dicho esto. En general.nih.gov/ij/) o su equivalente NIH-Image (para Macintosh.info. Cada uno de ellos se realiza con un software diferente. el software de captura se proporciona junto con la cámara mientras que el de análisis se adquiere aparte. o Neurolucida®. ImageJ (para Windows o Linux.gov/ij/
El software de captura y análisis de imágenes digitales. MetaMorph®.
. Puede descargarse desde: http://rsb. además. existen programas que permiten capturar y analizar imágenes. Otros ejemplos de software científico para análisis de imágenes son Visilog®.
La resolución máxima real de una imagen digital depende de la resolución máxima de la cámara digital. Por ejemplo. Con 16 bits pueden conseguirse 216=65536 tonos de gris diferentes. el número binario 11111111 (equivalente al número 255 en el sistema decimal) codifica el color blanco. En el sistema operativo Macintosh.
La imagen digital. Por el contrario. pueden conseguirse 28=256 tonos de gris diferentes.
. el código de colores es el opuesto. La resolución de una imagen digital depende del número de píxeles contenidos en la unidad de superficie (expresada en cm2 o pulgada2). cuando la imagen se codifica en 8 bits (8 dígitos) el número binario 00000000 (equivalente al número 0 en el sistema decimal habitual) codifica el color negro. Cuanto mayor sea el número de bits. mayor será la definición de color de la imagen. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. mayor será la resolución de la imagen. En este último caso. Las imágenes digitales se almacenan en archivos digitales.es
Imagen digital original
Imagen digital ampliada
Color del Número binario píxel equivalente
00000000 10000000 10110010 11111111
En esta ilustración (ampliada varias veces) se observa claramente el mosaico de puntos o píxeles que forman la imagen digital. Cualquier otra combinación de ocho dígitos binarios indica un tono de gris diferente entre el blanco y el negro. Cuanto mayor sea el número de píxeles por cada cm2. y a la resolución y al número de bits de la imagen digital. El nivel de gris de cada píxel se expresa mediante un número de N dígitos en sistema binario (o bits). el código 00000000 corresponde al color blanco. cada píxel posee un tono (o nivel) de gris diferente.Enrique A. Es decir. en el sistema operativo Windows. y mayor será su definición espacial. El tamaño del archivo es directamente proporcional al tamaño de la imagen original. Con 8 bits. Puede ser en color en escala de grises. Puede describirse como un mosaico de puntos denominados píxeles.
pero también a un tono verde en la imagen G. ahora el nivel de color de cada píxel de las imágenes en rojo. un mismo código de 8 bits (por ejemplo. y B. verde (G) y azul (B) mediante un prisma.
Código RGB 11000101 10001011 01010001
10110010 11111111
La imagen digital también puede ser en color. Durante el análisis de la imagen compuesta. 10110010 en la ilustración) corresponde a un tono determinado de rojo en la imagen R. Por ejemplo. Así. es necesario superponer los píxeles con códigos 11000101 (R). La imagen digital final se obtiene como la superposición de estas tres imágenes.
Número binario (8 bits) Color del píxel en cada imagen
Prisma separador de colores
R 00000000
El color de cada píxel se obtiene superponiendo el píxel correspondiente de cada una de las imágenes en rojo. De la misma forma que en una imagen en escala de grises el nivel de gris de cada píxel se expresa mediante N bits. G. y 01010001 (B). El color final del píxel se expresa mediante un código RGB que no es más que el número binario (o su número decimal equivalente) que se obtiene al concatenar los códigos R. El color final de un píxel en la imagen compuesta. La resolución de cada una de las tres imágenes componentes es igual a la de la imagen digital compuesta. verde o azul con el nivel de color adecuado. es posible trabajar con cada una de las tres imágenes componentes. se obtiene superponiendo los colores correspondientes a dicho píxel en las imágenes componentes. La cámara digital a color dispone de tres dispositivos CCD cada uno de lo cuales recoge la imagen correspondiente a uno de los tres colores básicos. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. para obtener el color marrón del píxel de la ilustración.Enrique A. verde y azul también se expresa mediante N bits. los colores de la imagen original se descomponen en los tres colores básicos rojo (R). o uno azul en la imagen B. 10001011 (G). Para capturar este tipo de imágenes.
Estos últimos formatos son inadecuados para el análisis densitométrico (véase más adelante).
El formato de la imagen resultante. Los formatos JPG o GIF ocupan menos espacio. Por ejemplo.BMP) son compatibles con prácticamente cualquier software de análisis de imágenes. cada software de análisis de imágenes puede utilizar su propio formato de almacenamiento de archivos. Los formatos JPEG (*.JGP) y GIF (*.PSD de Adobe Photoshop es incompatible con el programa ImageJ de análisis de imágenes.TIF) y BITMAP (*. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Estos formatos propios suelen ser incompatibles entre sí. Sin embargo. Su desventaja es que la imagen pierde resolución y definición de color.es
El espacio que ocupa cada archivo de imágenes depende del formato. La diferencia entre ellos está en la cantidad de información que guardan sobre la imagen. Contienen información completa y precisa sobre la imagen digital. Los formatos TIFF (*. Además.Enrique A. la calidad de la imagen puede ser menor. La imagen digital puede almacenarse en archivos con múltiples formatos.GIF) son útiles para intercambiar imágenes a través de internet ya que reducen el tamaño del archivo. el formato *.
) en el tejido nervioso. El nivel de gris indica la concentración del neurotransmisor. sirve. mayor es la concentración de GABA en su soma.. Se basa en medir la densidad óptica en cada región de una preparación histológica observada al microscopio.
DENSITOMETRÍA ÓPTICA. por ejemplo.. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. moduladores. para determinar cuantitativa y objetivamente la presencia de determinadas moléculas (proteínas. en general.Enrique A. En neurociencias.es
Densitometría óptica.
. neurotransmisores. Es una técnica que permite medir la cantidad de luz que absorbe un material. La figura muestra un corte de tejido nervioso inmunoteñido contra GABA. Cuanto más oscura aparece una neurona. y en las neuronas o en las células gliales en particular.
Su intensidad (Ie) es igual o menor que la de la luz incidente. I e Intensidad de la luz incidente. Luz incidente. I i
Opacidad (O) =
Intensidad de la luz incidente. si la intensidad de la luz emergente es igual a la de la incidente (Ie= Ii) existe un 100% de transmisión de luz y. Si la intensidad que emerge es un 10% de la incidente (transmisión del 10%).
Absorción por reflexión
Transmitancia (T ) =
Intensidad de la luz emergente. Su intensidad es Ii. por tanto. También se denomina absorbancia óptica (A). I e
Densidad óptica.es
Absorción por transmisión
Luz emergente. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.Enrique A. I i 1 = T Intensidad de la luz emergente. D = 0. entonces D = 1. D = log10 (Opacidad )
¿Qué es la densidad óptica (D)? Se define como el logaritmo del cociente entre la intensidad de luz que incide sobre sobre una imagen o una película translúcida (Ii) y la intensidad de luz que se refleja de la imagen o que se transmite a través de dicha película (intensidad emergente Ie).
. Por ejemplo. Objeto translúcido Objeto que absorbe luz por transmisión (izquierda) o por reflexión (derecha).
una fotografía convencional). en cambio. Los de reflexión se utilizan para medir la densidad óptica de una imagen impresa (por ejemplo. Los densitómetros funcionan haciendo incidir un haz de luz con una intensidad conocida sobre la imagen o la película fotográfica y midiendo la cantidad de luz reflejada o transmitida por la imagen. se utilizan para medir la densidad óptica de una película fotográfica en positivo (una radiografía.
Luz emergente (de menor intensidad)
¿Cómo se mide la densidad óptica? Se mide mediante un densitómetro. La medición es rápida y directa.Enrique A. Existen dos tipos de densitómetros: de transmisión y de reflexión. por ejemplo). Los de transmisión. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.
Enrique A. si se opta por utilizar una cámara digital. pues. el análisis de imágenes digitales resulta mucho más fácil y económico. En este sentido. Si se opta por la primera. de un problema de absorción de luz por transmisión. atraviesa la preparación y se capta mediante una cámara fotográfica. el resto de esta sección se dedica a exponer la técnica de densitometría basada en imágenes digitales. Por el contrario.es
Densidad óptica alta Densidad óptica baja
A veces es necesario estimar la densidad óptica de regiones muy pequeñas de la imagen. Se trata. la densidad óptica de la preparación puede estimarse indirectamente a partir de la fotografía resultante (en formato papel) mediante un densitómetro de reflexión. Esto resulta mucho más fácil y económico si la imagen es digital. mucha veces es necesario estimar la densidad óptica de pequeñas regiones de la imagen (neuronas. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Por tanto. La cámara fotográfica puede ser convencional o digital. la iluminación procede de la lámpara del microscopio. Por ello. la densidad óptica de la preparación puede estimarse indirectamente a partir del nivel de gris o del color de la imagen digital resultante.
. lo habitual es que se desee medir la densidad óptica de una preparación histológica vista al microscopio en la que las zonas más oscuras indican zonas de mayor concentración de una determinada molécula. ya que sería necesario ampliar la región de interés hasta que su tamaño sea comparable con el del detector del densitómetro. En una preparación histológica real. En este caso. la densidad óptica no es homogénea. por ejemplo).
En neurociencias. Hacerlo a partir de una fotografía impresa resulta complicado y caro.
el nivel de gris medio (Mean). o el nivel de gris modal. El contorno se marcará en amarillo. 5. 3. Aparecerá una ventana en la que puede seleccionar todas aquellas medidas que desee obtener sobre la partícula.es
Freehand selections Resultados del análisis de la partícula
Seleccione otras opciones para obtener más información densitométrica de la partícula Partícula seleccionada para el análisis
La densidad óptica de una región de la preparación puede estimarse indirectamente a partir de su imagen digital midiendo el nivel de gris medio sobre dicha región. la imagen corresponde a una sección del colículo inferior de la rata immunoteñida frente a GABA. A continuación se explica cómo hacerlo con el software ImageJ (para Windows). Elija el menú: “Analyze/Measure”. 2.Enrique A. elija el menú: “Analyze/Set measurements”. S l i ll did d l A t R it l
. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. En este caso. Seleccione el archivo de la imagen y haga clic en el botón “Abrir”. En ella. abra el menú: “File/Open”. El cursor del ratón se transformará en una cruz. Para ello. 4. se muestra el tamaño de la partícula (Area en píxeles). Haga clic sobre el botón “Freehand selections”. Haga clic en el borde de la partícula que desee analizar y sin soltar el botón del ratón marque el contorno de la partícula. el nivel de gris mínimo (Min) y el máximo (Max) dentro de la partícula. Puede obtener información adicional sobre la partícula. Se supone que su imagen es de 8 bits (256 niveles de gris). Si no es así. Para ello. puede obtener la desviación estándar de los niveles de gris contenidos en la partícula. Es decir. Busque la carpeta en la que se encuentre la imagen. mayor es la concentración de GABA en dicha región. Aparecerá una nueva ventana “Results”. Por ejemplo. Abra la imagen digital. cuanto más oscura aparece una región de la imagen. Los pasos necesarios son los siguientes: 1. elija el menú “Image/Type” y marque la opción “8-bit”.
. En otras palabras. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. los resultados obtenidos también dependen de la iluminación del microscopio. Para convertir los niveles de gris medidos en valores de densidad óptica es necesario calibrar la imagen. Por tanto. y de la configuración de la cámara. Debido a ello. ej.Enrique A. Aunque el nivel de gris medio obtenido depende de la densidad óptica. que los resultados serán idénticos si las mediciones se repiten. Para garantizar la reproducibilidad de los resultados es imprescindible tomar ciertas precauciones metodológicas. ¿la que se obtendría al medirla con un densitómetro? ¿Cambiarían los resultados al cambiar la iluminación del microscopio o al cambiar de cámara? El sistema microscopio/cámara digital empleado para medir el nivel de gris de la región de interés no mide la relación entre la intensidad de la luz emergente y la incidente en la preparación histológica.5 56
158 122. un nivel de gris mínimo de 7 y un máximo de 237. de la apertura). Es decir. no mide la densidad óptica de la preparación.7. del objetivo utilizado. es decir. Pero ¿cuál es la densidad óptica real de la partícula?.0 75
La partícula considerada en la diapositiva anterior posee un nivel de gris medio de 123.es
Niveles de gris de la partícula considerada en diferentes intensidades de iluminación Intensidad 1 Intensidad 2 Intensidad 3
Gris de la partícula Max Medio Min
135 95. es difícil (a veces imposible) obtener valores reales de densidad óptica a partir de los niveles de gris obtenidos de una imagen digital.0 0
171 103. también depende de la intensidad de la iluminación y de la configuración de la cámara digital (p.
. También es difícil garantizar que los resultados sean reproducibles.
Existen filtros en los que la densidad óptica cambia de manera gradual y otros en los que cambia “a saltos”. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.05 y 1.1 cuando está configurada de forma óptima (es decir.es
Filtro neutro de densidad óptica variable (7 pasos)
Nivel de gris de la imagen digital
Densidad óptica correspondiente
0. offset. Calibrar consiste en establecer una correspondencia entre los valores de gris de la imagen digital y sus valores correspondientes de densidad óptica (en unidades de densidad óptica). tal y como se obtendría si se midiese con un densitómetro.Enrique A. ajustando su ganancia.0
1. y su desplazamiento.2
1. gain.4
1. Colocando dos filtros superpuestos se aumenta el rango de densidades ópticas disponibles. debe colocarse el filtro (o los filtros superpuestos) en la platina del microscopio y capturar la imagen digital correspondiente a cada una de las densidades ópticas. Para calibrar los niveles de gris de una imagen de fotomicroscopía digital es necesario disponer de un filtro neutro de densidad óptica variable.
. Una cámara digital razonable debe capturar densidades ópticas entre al menos 0.0
Tipos de filtros neutros de densidad óptica variable
Lineal discontínuo
Radial continuo
Calibración en densitometría óptica. adecuadamente). Para calibrar. De esta forma. cuya densidad óptica cambia a lo largo del mismo. ya que la densidad óptica resultante es la suma de las dos individuales. Lo normal es utilizar filtros con densidades ópticas entre un mínimo de 0 y un máximo de 2 (unidades de densidad óptica). es posible establecer una correspondencia entre el nivel de gris medio de la imagen y la densidad óptica correspondiente. El aspecto de estos filtros es el de un porta de microscopio estándar (tamaño de 3×1 pulgadas).
Mida el nivel de gris medio de cada imagen y confeccione una tabla de calibración en la que figuren los niveles de gris y sus correspondientes densidades ópticas en sendas columnas.. Aparecerá una nueva ventana denominada “Calibrate Function”.. incluyen una opción de Calibración.Coloque el filtro en la platina del microscopio y obtenga una imagen digital por cada densidad óptica del filtro variable.4
9. El ajuste sería peor de haber elegido una función diferente. la gráfica muestra el grado en que la función elegida se ajusta a los datos de la tabla de calibración. 2. 4. escriba los niveles de gris que ha obtenido para cada uno de los filtros.4
1. 1. Aparecerá la ventana “Calibrate.0
Nivel de gris medio de la imagen digital
7.Enrique A.Haga click en “OK”.5 19.. A continuación se explica como calibrar una imagen con el programa ImageJ para Windows (o NIH Image para MacInsosh). En cada caso.8
Densidad óptica correspondiente Opciones de calibración Función de ajuste de los datos de calibración
0. de un sistema de fotomicroscopía digital y del software ImageJ. el ajuste es muy bueno (R^2 vale aproximadamente uno). deberá probar y elegir la función que mejor se ajuste a sus datos de calibración.Abra el menú “Analyze/Calibrate” de ImageJ.0
0. Es necesario disponer de un filtro de densidad óptica variable.. se ha seleccionado la función “y=a+b*ln(x-c)”. En la columna izquierda.0 93. Para ello. A partir de este momento cualquier medida del nivel de gris de
11. escriba sus densidades ópticas correspondientes.4
Dato de calibración
Densidad óptica correspondiente Niveles de gris Densidad óptica
Nivel de gris correspondiente (8 bits)
Es común que los programas de análisis de imágenes digitales permitan calibrar las medidas con el fin de obtener los resultados en unidades de densidad óptica en lugar de niveles de gris.9 226. En la columna derecha. En el cuadro “Unit:” escriba “Densidad óptica”. En el cuadro “Function:” elija la función matemática que crea que mejor se ajusta a los datos de su tabla de calibración. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.8
2. En la ilustración. En ella se muestran los datos de la tabla de calibración en forma de puntos y la función elegida mediante una línea continua.9 41. En otras palabras. En el ejemplo de la ilustración...”.
Fijar y anotar la configuración de la cámara (ganancia. si se cambiase la iluminación. etc). Utilizar el mismo equipo de medida y análisis. Utilizar condiciones idénticas en sucesivas sesiones de captura de imágenes.
8. Utilizar idénticas condiciones en sucesivas sesiones de captura de imágenes. Fijar y anotar las opciones de captura de imágenes en el software de captura. Aplicar los siete criterios previos en todos los casos. Fijar y anotar las condiciones de iluminación del microscopio. etc). apertura. 3. etc). comprobar que los niveles de gris correspondientes a las diferentes densidades
. condensadores. 6. 5.
Medidas para garantizar la reproducibilidad de los resultados. 3. apertura. La calibración no garantiza que los resultados sean reproducibles. cambiaría la densidad óptica correspondiente a un determinado nivel de gris. 5. Por ejemplo. Fijar y anotar la configuración del software de captura. Utilizar siempre el mismo equipo de medida y análisis. 4. condensadores. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. desplazamiento. Fijar y anotar las condiciones ópticas del microscopio (objetivos. 2. Fijar y anotar las condiciones de iluminación del microscopio. Para garantizar la reproducibilidad de los resultados de densitometría óptica es necesario cumplir los siguientes requisitos: 1. etc). Por ejemplo.Enrique A. Fijar y anotar la configuración de la cámara (ganancia. 6. Fijar y anotar las condiciones ópticas del microscopio (objetivos. filtros. 7. comprobar que los niveles de gris correspondientes a las diferentes densidades ópticas del filtro neutro de densidad óptica variable son aproximadamente los mismos en diferentes sesiones de captura. Recuerde que los niveles de gris dependen de la intensidad de la iluminación. 4. 2. Por tanto. Comprobar que para una misma preparación el nivel de gris obtenido es idéntico en sesiones de captura distintas. 7. Comprobar que para una misma preparación el nivel de gris obtenido es idéntico en diferentes sesiones de captura. filtros.es
Precauciones mínimas que deben tomarse para garantizar la reproducibilidad de los resultados de densitometría óptica digital: 1.
En tales casos. es cómo estimar la concentración de la molécula a partir de la densidad óptica. una buena solución es comparar la densidad óptica de una muestra del tejido objeto de estudio (tejido caso) con otra procedente de otro tejido que carezca de la molécula en cuestión (control negativo). el problema se reduce a un problema estadístico de comparación de densidades ópticas (o niveles de gris) de dos muestras. Sin embargo. se expone un ejemplo concreto de este tipo de problemas. En este tipo de problemas. En algunos casos.Enrique A. La pregunta.es
Nivelde degris grisdel del Nivel tejido objeto de tejido objeto de estudio estudio CONOCIDO CONOCIDO
Es posible realizar esta comparación. En este tipo de problemas.
. Más adelante. Ya se ha explicado cómo determinar la densidad óptica. incubado. será posible conseguir filtros de calibración que permiten establecer una correspondencia directa entre el nivel de gris y la concentración de la molécula objeto de estudio. El problema no es trivial. comparando la densidad óptica (o el nivel de gris) de los tejidos correspondientes
Concentraciónde dela la Concentración molécula molécula DESCONOCIDO DESCONOCIDO
Nivelde degris grisdel del Nivel tejido tejido controlnegativo negativo control CONOCIDO CONOCIDO
Concentraciónde dela la Concentración molécula en el tejido molécula en el tejido controlnegativo negativo control CONOCIDO CONOCIDO
La densitometría óptica digital puede aplicarse para investigar la presencia de determinadas moléculas en el tejido nervioso. es habitual además “normalizar” los datos. etc) de la misma forma. incluso permite estimar la concentración de dicha molécula en el tejido a partir de la imagen digital. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. teñido. en la sección relativa al Análisis de Datos. sin embargo. se supone que la densidad óptica es proporcional a la concentración de la molécula. estos filtros no existen para la mayoría de los problemas. ahora. De esta forma. Es imprescindible. En el mejor de los casos. que ambos tejidos procedan del mismo animal y que se hayan procesado (cortado.
O y0
Morfometría Entre las propiedades geométricas del soma neuronal seleccionado (en rojo).Enrique A. pueden interesar las siguientes: • Su posición o centro geométrico (x0. y0). • La superficie que ocupa (área).
MORFOMETRÍA ÓPTICA DIGITAL. • Su perímetro. entonces interesa conocer:
• La longitud de su eje mayor. Si consideramos que su forma puede asemejarse a una elipse. La morfometría tiene como objetivo realizar mediciones geométricas de regiones o de las partículas visibles en una imagen digital. Permite. o incluso estimar la longitud de los ejes de la elipse que mejor describe su forma. • La longitud de su eje menor. su perímetro. estimar el área de un soma neuronal. por ejemplo.
Aparecerá una ventana nueva titulada “Results”. abra la imagen de la figura. 2.Enrique A.es
El programa ImageJ permite realizar el análisis morfométrico de las partículas contenidas en una imagen digital. se muestran varias columnas con los resultados: • • El Area de la partícula muestra el número de píxeles que ocupa la partícula. “Set Measurements” elija las medidas que desee obtener de la partícula. y las coordenadas del centro de la partícula (Centroid). Por ejemplo. marque las opciones que se muestran en la ilustración para obtener el área de la partícula (Area). Veamos cómo analizar algunas propiedades morfométricas de uno de los somas neuronales que aparecen en la imagen de la ilustración. Haga clic en “OK”. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Observe que ll origen de coordenadas está en el extremo superior izquierdo de la imagen. X e Y son las coordenadas (en píxeles) del centro de la partícula (o centroid). En ella. Perim. En la opción de menú “Analyze/Set measurements”. 5. Seleccione la herramienta “Freehand Selections”. Marque el contorno de la partícula que desee estudiar. En la ventana. Desde el programa ImageJ. 4. su perímetro (Perimeter). 3. Observe que el contorno aparecerá en amarillo. 1. es el perímetro de la partícula (en píxeles).
Elija la herramienta “Straight line selections”. es decir. Sin embargo. la escala es de 115/50 píxeles/micras. conviene expresarlos en unidades del sistema internacional. la longitud es 115 píxeles. Aparecerá una línea recta amarilla sobre la barra de calibración cuya longitud es igual a la de dicha barra de calibración. Observe que la imagen incluye una barra de escala en la parte inferior izquierda. Elija la opción del menú “Analyze/Measure”. (Continua en la siguiente diapositiva). Los resultados obtenidos se expresan en unidades de píxel. haga lo siguiente: 1. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Haga clic sobre el extremo izquierdo de la barra de calibración.es
Calibración morfométrica. 3. en metros o micras.
. Para ello. Su longitud es de 50 micras y es necesario saber a cuántos píxeles corresponde. El cursor se transformará en una cruz.3 píxeles/micra. Por tanto.Enrique A. En este caso. 2. Aparecerá una ventana “Results” en la que se muestra la longitud (Length) de dicha línea medida en píxeles. Es posible configurar el programa ImageJ para que automáticamente exprese todas las medidas morfométricas en la unidad deseada. mueva el cursor hasta el extremo derecho de la barra de calibración. Manteniendo presionado el botón izquierdo del ratón. o lo que es equivalente: 2.
1. su longitud debería ser 50 (micra). todas las distancias que mida el programa se expresarán en micras según la escala configurada. Para confirmarlo.3 pixels/micra. En el cuadro “Distance in Pixels” (distancia en píxeles) introduzca el valor 115. Aparecerá la ventana “Set Scale” como la de la ilustración. En el cuadro “Known distance” (distancia conocida) introduzca el valor 50. 3. 4..es
Proceda a configurar la escala de medidas de ImageJ de la siguiente forma. Haga clic en “OK”. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. 5.
. vuelva a medir la barra de calibración de la figura. 6. En el cuadro “Unit of Length” (unidad de medida) introduzca “micra”. Observe que en la parte inferior de la venta aparece la escala correcta de 2. Abra la opción de menú “Analyze/Set scale..Enrique A. A partir de este momento.”. Si la configuración es correcta. 2.
Para conseguir esta imagen. Lopez-Poveda
Para configurar la escala en ImageJ. Importante! La imagen de la retícula de calibración debe capturarse con el mismo objetivo (a los mismos aumentos) que el utilizado para capturar las imágenes que se desean analizar. de 10 micras. visto al microscopio.
. de 100 micras. Consiste en un porta que. Cada subdivisión menor es. por tanto. La longitud total de esta escala es de 1 mm.Enrique A. basta. con capturar la imagen digital correspondiente a un porta de calibración de escala (también denominado retícula de calibración). ha sido necesario disponer de una imagen en la que se muestra correctamente la escala de calibración. en realidad. por tanto.es
Imagen de un porta de calibración vista al microscopio. Cada subdivisión mayor es. muestra una escala métrica de dimensiones conocidas.
1 mm 100 μm 10 μm Imagen vista con un objetivo de 5×.
Análisis densitométrico y morfométrico de múltiples partículas. en muchas ocasiones se desea analizar múltiples partículas (p. mantenga pulsada la tecla de mayúsculas ( ⇑ ) mientras marca el contorno de las partículas con la herramienta “Freehand Selections”. se han mostrado ejemplos de cómo utilizar ImageJ para analizar las propiedades densitométricas y morfométricas de una sóla partícula. perímetro. Suponga que desea obtener los siguientes datos sobre las partículas marcadas en amarillo en la imagen de la ilustración: a) Datos morfométricos: área. ImageJ permite realizar análisis multipartícula de una sola vez. Veamos un ejemplo. ej. Sin embargo. (Continúa en la siguiente diapositiva). Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. múltiples somas neuronales) de una misma imagen.Enrique A. b) Datos densitométricos: nivel de gris medio y desviación estándar del nivel de gris. Para seleccionar múltiples partículas.
2. Aparecerá una nueva imagen en blanco denominada “Partículas”. Abra la imagen “Partículas” y pegue las partículas copiadas eligiendo la opción de menú “Edit/Paste”. Determine las variables que desea medir en la opción de menú “Analyze/Set Measurements”. seleccione el menú “Image/Adjust/Threshold”. Para aplicar el umbral. Vuelva a la imagen original.. En ella.. Esto permite seleccionar sólo aquellas regiones de la imagen cuyo nivel de gris sea superior a un umbral estipulado por el investigador. introduzca las valores que aparecen en la ilustración. Aparecerá la ventana “New. 3. Cree una imagen nueva de las mismas dimensiones que la imagen original (véase la diapositiva anterior). es necesario aplicar un umbral (o Threshold) a la imagen. Para ello. Pulse “OK”.. Elija la opción de menú “Edit/Copy” para copiar las partículas marcadas en amarillo. Para poder analizar todas las partículas de la imagen Partículas.es
1. (Continúa en la diapositiva siguiente).”. 4. Lopez-Poveda
.”.Enrique A. Baje el umbral hasta que aparezca en rojo el área de todas partículas de la imagen Partículas. elija la opción de menú “File/New..
SPSS). elija las opciones de la ilustración y pulse OK. 7. En ella.es
5. se muestra el contorno de las partículas analizadas y el número que ImageJ les ha asignado automáticamente. Cada partícula ocupa una fila y cada variable una columna. Microsoft Excel) o programas estadísticos (por ejemplo.Aparecerá una nueva ventana llamada “Drawing of Partículas”. Aparecerá una nueva ventana llamada “Analyze particles”. Lopez-Poveda
. Esta organización es imprescindible si se pretende analizar los resultados mediante hojas de cálculo (por ejemplo.Enrique A. En ella. Importante! Observe la forma en la que aparecen ordenados los datos.Elija la opción de menú “Analyze/Analyze particles”.También aparecerá la ventana “Results” con los resultados correspondientes a cada partícula. 6.
Las siguientes diapositivas se dedican a exponer los conceptos básicos más importantes de esta actividad ilustrados con ejemplos reales aplicables al análisis de imágenes. Una actividad ligada habitualmente al análisis de imágenes es el análisis de los datos numéricos que resultan de analizar dichas imágenes.es
Análisis de datos numéricos
.Enrique A. CONEPTOS BÁSICOS DE ESTADÍSTICA. Lopez-Poveda
entre otras. Las cualitativas no son mensurables.es
Tipos de Variables y Datos Cualitativos (Clasificables en categorías) Cuantitativos (Numéricos)
Ordinales (Ordenables)
Discretos (Contables)
Continuos (Mensurables)
Sólo se expondrán algunas técnicas para analizar este tipo de datos. los individuos objeto de estudio eran las neuronas del colículo inferior de la rata. Los estadígrafos se denotan con letras latinas y los parámetros con sus correspondientes letras griegas. En el contexto actual. describen una cualidad. la región neuroanatómica a la que pertenece una neurona. Se denomina estadígrafo a un número que representa alguna característica o propiedad de una muestra. o su área. Las variables (y por consiguiente los datos) pueden ser de dos tipos: cuantitativas (o numéricas) y cualitativas. Se denomina muestra a un subconjunto de la población. a los estadígrafos propios de la población. por ejemplo. También es el valor que adquiere una determinada variable de interés. En los ejemplos de densitometría y morfometría digital expuestos anteriormente. Por ejemplo. persona. Se denomina población al conjunto completo de valores o datos. Una muestra es aleatoria cuando sus individuos se eligen al azar de entre todos los individuos de la población.
. es número o una etiqueta que representa algún atributo de un objeto. se entenderá la estadística como un método para interpretar y procesar los datos numéricos (o cuantitativos) obtenidos del análisis de imágenes.
¿Qué es un dato? En su acepción más general.Enrique A. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. la desviación típica (o desviación estándar) del nivel de gris. o animal. el perímetro de la neurona. Las variables de interés fueron el nivel de gris medio de la neurona. Sólo se expondrán técnicas de análisis de datos numéricos procedentes de muestras aleatorias. Se denomina parámetro. Las cuantitativas son mensurables y sus correspondientes datos pueden distribuirse en una escala de valores espaciados equitativamente. la media o la desviación típica son estadígrafos.
por ejemplo. En este caso. A veces en lugar del número de veces que aparece el dato.2 0. Una forma de representar gráficamente los datos cuantitativos de una muestra es mediante un histograma.8 1. Es decir.4
En un histograma se representa el número de veces que aparece un determinado dato.6 0. El histograma puede aparecer representado de dos formas: mediante un diagrama de columnas o mediante una línea continua (en rojo). un grupo de neuronas del colículo inferior de la rata.
. que haya valores (datos) mas frecuentes que otros. En él. ilustra el número de veces.0 1.
El histograma (o distribución). El histograma también recibe el nombre de distribución. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. se ilustra la frecuencia con la que aparece cada dato. o la proporción de veces que aparece en la muestra. sino que varía de unas neuronas a otras. Considere. Su densidad óptica no es homogénea. ya que ilustra la forma en la que se distribuyen los datos. En general.Enrique A. sin embargo. los datos de una muestra no son todos iguales. Es probable.4 0.es
7 6 5 4 3 2 1 0 0. se representa el número de neuronas que poseen una determinada densidad óptica. el porcentaje.2 1. se representa el porcentaje o la proporción de veces que aparece dicho dato en la muestra (o en la población).
más dispersos (más diferentes) son los datos entre sí y más ancho aparece el histograma. el que más se repite en la muestra (o en la población). Es decir.4
0. En este caso. también denominada desviación estándar. la mejor estimación de σ que se puede hacer con los datos de una muestra es: σ = S×√[N/(N-1)]. Sin embargo. Igualmente es necesario diferenciar entre la desviación típica de la muestra (S) y la de la población (σ). la desviación típica de la población es ligeramente mayor que la de la muestra (σ > S).2 0. La desviación típica (S).
1. La media (M) es el promedio de todos los datos de una muestra (o de una población).2 1. S2 es la varianza. La moda (Mo) es el dato más frecuente. En general.4 Mo M 0.0 1. Hay que diferenciar entre la media de una muestra (M) y la media de la población de la que procede dicha muestra (µ).6 S1 S2
Ambas distribuciones poseen la misma media (M) pero diferentes desviaciones típicas (S1<S2). la moda y la desviación típica (o estándar).es
μ≈M
∑ (xi − M )2
σ ≈S
Número de neuronas 7 6 5 4 3 2 1 0 0.
. Por ello.8
La media. informa sobre lo dispersos que están los datos de una muestra (o de la población). Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. puede saberse que los datos de la distribución 2 (en azul) están más dispersos entre sí que los de la distribución 1 (en rojo).Enrique A. Cuanto mayor es su valor. ambos valores son distintos. M es la mejor estimación de µ que se puede hacer con los datos disponibles en la muestra.
8 1. los valores de la media (M) y la moda (Mo) son iguales.8 1.2 1. el valor de la moda es menor que el de la media (Mo < M).es
S Mo M 0 0.
.Enrique A.2 0.0 1.0 1. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. la moda y la desviación típica proporcionan información sobre la forma del histograma. Si el histograma es simétrico. más ancho es el histograma. Si es asimétrico e inclinado hacia a la izquierda.6 0.2 1.4 Densidad óptica
Media > Moda
Media = Moda
Media < Moda
Los valores de la media.4 0.6 0.4 0. entonces Mo > M. Si es asimétrico e inclinado hacia a la derecha. Cuanto mayor es la desviación típica.2 0.2 0.0 1.4 0.4 Densidad óptica
0 0.2 1.8 1.6 0.4 Densidad óptica
El nivel de gris medio de la imagen de la neurona 1 es menor (Mean = 164. su histograma estaría ligeramente desplazado hacia niveles de gris más bajos con respecto al de la imagen correspondiente a la neurona 2. (Por cierto. Proceden del mismo núcleo. elija la opción de menú “Analyze/Histogram”). puede deberse a que la neurona 1 posea más cantidad de GABA. ¿Cómo diferenciar entre ambas posibilidades? Una solución posible es la siguiente. Suponga que desea comparar el nivel de gris de las dos neuronas marcadas en amarillo.005) que el de la imagen de la neurona 2 (Mean = 169.869. S = 11. aunque de secciones distintas (D3301 y D3302) próximas entre sí.Enrique A. en efecto.020) (recuerde que en el sistema operativo Windows. S = 11.41) que el de la neurona 1 (M = 105.es
Resultados de la neurona 1
Histograma de la figura en la que está la neurona 1
Resultados de la neurona 2
Histograma de la figura en la que está la neurona 2
Datos tipificados o estandarizados. La neurona 2 parece más clara. su nivel de gris es mayor (M = 129. tal y como se muestra en la ilustración. Las neuronas se han denominado 1 y 2 por conveniencia. (Continúa en la diapositiva siguiente)
. Considere el ejemplo de la ilustración.123. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Esto es. Entonces ¿cómo se puede decidir si la neurona 1 posee más o menos GABA que la 2? La solución está en trabajar con datos tipificados o datos normalizados. Por tanto. más clara es la imagen). Ambas han sido inmunoteñidas frente al neurotransmisor GABA. Si la sección en la que se encuentra la neurona 1 fuese más gruesa. Según lo visto en diapositivas anteriores. una explicación alternativa es que la neurona 1 se encuentra en una sección ligeramente más gruesa y que. absorbe más luz. para obtener el histograma de una imagen con ImageJ. cuanto mayor es el nivel de gris. Los niveles de gris de una imagen pueden expresarse mediante histograma. Sin embargo.924). lo que ocurre. En efecto. por tanto. entonces los niveles de gris de la sección serían menores en conjunto.
75 S2 53. Retomando nuestro ejemplo. Por tanto. por tanto la neurona 1 es más oscura que la 2 independientemente del grosor de la sección a la que pertenece.28 y z2 = –0. las neuronas son más oscuras que la imagen). que se muestran muy claros (su nivel de gris es muy alto).005 = = −1. Ahora bien. es razonable concluir que la neurona 1 posee más cantidad de GABA.004
x2 − M 2 129.75.924 = = −0. Por tanto. el valor de z indica cuánto difiere un dato de la media de su muestra.
Tipificar un dato (x) consiste en restarle la media de la muestra a la que pertenece (M) y dividir el resultado por la desviación estándar (S) de dicha muestra: z = (xM)/S.357
z1 es menor que z2. Podría ocurrir que la distribución de los niveles de gris de alguna de las dos imágenes esté afectada por la presencia grandes zonas excesivamente claras u oscuras. Cuanto mayor sea z en valor absoluto.28 S1 46. cuando en una de las imágenes hay muchos vasos sanguíneos.869 − 169.es
Tipificación de datos
x−M z= S
x = dato original M = media de la distribución S = desviación típica de la distribución z = dato tipificado
Nivel de gris tipificado
x1 − M 1 105. El dato tipificado suele denotarse por la letra z. que es menor. lo que significa que los niveles de gris de ambas neuronas son inferiores a la media de sus respectivas imágenes (es decir. indica que el dato es mayor que la media de la muestra. en valor absoluto z1 es mayor que z2. en promedio.123 − 164. Es muy probable. Si z es positivo. Esto significa que la neurona 1 es más oscura que la 2 incluso teniendo en cuenta el posible efecto del grosor de la sección. Esto ocurre.Enrique A. por ejemplo. En otras palabras. Ambos son negativos. si es negativo. el dato tipificado puede considerarse “normalizado” a la distribución de la muestra a la que pertenece. más difiere el dato de la media de su muestra. los datos tipificados para las dos neuronas son z1 = –1. que posea más cantidad de GABA en su interior. Existe todavía un inconveniente con este método. expresada la diferencia en unidades de desviación estándar. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. La solución para minimizar este tipo de problemas es excluir los vasos sanguíneos del análisis en la medida que sea posible.
Deseo realizar este Máster.7 = 0. Soy Licenciada en Medicina y mi nota media de licenciatura es de 6. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.7.
Tipificar los datos de una muestra.7
Licenciados en Física: • Nota media de la promoción = 5.7 = 0. desviación típica = 0.
Yo también deseo realizar este Máster. procede de la técnica estadística denominada tipificación o estandarización de datos. En el ejemplo anterior. Fue mayor el Z resultante para alumna de Físicas.9)/0. en realidad. aunque no está relacionado con el análisis de imagen.9 • Desviación típica de la promoción = 0. se ha explicado en qué consiste tipificar el nivel de gris medio de una neurona para comprobar cuanto destaca sobre el nivel de gris medio de la imagen. Por cierto. el comité de selección consiguió las estadísticas relativas a las promociones de cada uno de las dos alumnas: Nota media de los licenciados en Medicina = 5. por tanto.8.72 Como Zfísica > Zmedicina. La otra es licenciada en Física y su nota media fue de 6. Una de ellas es licenciada en Medicina y su nota media de licenciatura fue de 6.4 − 5. desviación típica = 1. ¡Compruébelo!
. Nota media de los licenciados en Física = 5.4.Enrique A.7. ¿Cuál de ellas tiene. más méritos para ser admitido en el Máster? Para tomar una decisión razonada.65 Zfísica = (6.7 • Desviación típica de la promoción = 1. Soy Licenciada en Físicas y mi nota media de licenciatura es de 6.
Licenciados en Medicina: • Nota media de la promoción = 5. por tanto. tipificó las notas de ambas alumnas utilizando las medias y desviaciones típicas de sus correspondientes promociones.7. la alumna de físicas destaca más entre su promoción que la de medicina y.7
Las notas tipificadas de ambas alumnas son: Zmedicina = (6.9. Esta técnica. en realidad.8.4. Suponga que dos alumnas solicitan realizar este Master On-line en Neurociencias. merece ser admitida en el Máster.8 − 5. A continuación. Dicha técnica resulta extremadamente útil para comparar datos que proceden de muestras diferentes y que.7)/1. la media de un conjunto de datos tipificados es siempre cero y su desviación típica es siempre uno. son difícilmente comparables entre sí. por lo que fue admitida en el Máster. Pongamos un ejemplo muy gráfico.
La idea es comparar estadísticamente la densidad óptica de la neurona del colículo con los de las neuronas grano.
ealopezpoveda@usal. entre ellos el estadístico. pueden clasificarse según su forma. Es decir. que no todas las neuronas del grupo tienen porqué ser idénticas. teniendo en cuenta. (Continúa en la diapositiva siguiente). La solución estadística consiste en calcular la probabilidad de que la neurona pertenezca al grupo en cuestión. Una pregunta habitual en neuroanatomía es “¿pertenece esta neurona a ese grupo?”. Para ello. Sin embargo. Suponga que ha inmunoteñido el cerebro de un animal frente al neurotransmisor GABA. por el contrario.es
La partícula de la izquierda es un poco más oscura que las de la derecha. ¿Será del mismo tipo?
¿De qué tipo es esta neurona? Las neuronas pueden clasificarse según numerosos criterios morfométricos y/o densitométricos. según la densidad óptica que presentan al teñirlas con determinados agentes. etc. Por técnicas de radioinmunoensayo. El problema puede abordarse desde muchos puntos de vista. Considere el siguiente ejemplo. sabe que el citosol de las células grano del cerebelo presenta una concentración muy baja de GABA.Enrique A. opta por realizar un estudio densitométrico y mide la densidad óptica de la neurona del colículo inferior y el de una muestra de 500 neuronas grano del cerebelo. Ahora desea saber si una determinada neurona del colículo inferior del mismo animal posee una concentración de GABA comparable a la de las células grano o. se parece mucho a ellas. por supuesto. su concentración es mayor o menor.
es razonable concluir que la neurona del colículo inferior es significativamente distinta de las neuronas grano. Pero. siempre existe el riesgo de errar en la afirmación. distinta de éstas? Según la distribución de los niveles de gris de las neuronas grano (véase la ilustración).6 M = 0. Suponga. En términos de probabilidad.01 es muy bajo.01 pueda ser una neurona grano. el porcentaje de estas neuronas que posee una densidad óptica de 0.01. que la densidad óptica de la neurona del colículo inferior es 0.. Se dice que es muy significativo cuando la probabilidad de que ocurra lo contrario es inferior al 1%. La pregunta es: ¿se puede concluir que la neurona del colículo es significativamente más oscura que las células grano y.Enrique A. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.3.3
M = 0. esto equivale a decir que es altamente improbable que una neurona con densidad óptica de 0.. Suponga que su media es M = 0. por tanto.6 y su desviación estándar S = 0. En estadística se dice que un resultado es significativo cuando la probabilidad de que ocurra lo contrario es inferior a 5%. Por tanto. ¿cómo puede calcularse exactamente la probabilidad de que la neurona del colículo inferior sea distinta de las neuronas grano respecto a su densidad óptica?
. Por supuesto. además.es
Porcentaje de neuronas
DISTRIBUCIÓN DEL NIVEL DE GRIS DE LAS NEURONAS GRANO DEL CEREBELO INMUNOTEÑIDAS FRENTE A GABA
S = 0.01 Densidad óptica de la neurona del colículo inferior
Resulta que el histograma de las neuronas grano es perfectamente simétrico (véase la ilustración). casi nulo.
Enrique A.2 0.6 0.6
Al elegir un individuo al azar.2
-0. mayor es la desviación estándar.1 0.25
0. de la muestra).0
0. lo cierto es que casi todas las variables que pueden medirse en la naturaleza se ajustan a sólo unos pocos tipos de distribuciones estadísticas. la t de Student. o la binomial. Cuanto mayor es la media. La más común y también la más importante es la distribución normal o Gaussiana. Es necesario conocer.10 0.
Al elegir un individuo al azar.00 -2 -1 Variable 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.8
1. la uniforme.4 0. pero existen otras.20 Frecuencia 0.15 0. es más probable que su dato correspondiente esté próximo a la media que alejado de ella.4
0.05 0.5 0.
Distribuciones estadísticas.es
0.05 0.3 0. por ejemplo. es más probable que su dato correspondiente esté ligeramente por debajo de la media.6
Distribución uniforme o rectangular a b
-1. en definitiva. por tanto.10 0. la de Poisson.20 Frecuencia 0. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.25 0. la geométrica.4
0.15 0. ya que en principio la forma del histograma es impredecible. Sin embargo.0 -2.
2. su dato correspondiente puede adquirir cualquier valor entre a y b con la misma probabilidad. Para calcular exactamente la probabilidad de que ocurra un determinado suceso es necesario saber la forma en la que se distribuyen los datos de la población de la que procede nuestra muestra.00 10 12 14 16 18 Variable 20 0 2 4 6 8
0. Esto puede parecer casi imposible.8
-0. la función matemática que describe la forma del histograma de la población (y.2
Al elegir un individuo al azar.
25 0.5 z 2 e 2π
La distribución normal o Gaussiana.20 Frecuencia 0. En la de la figura M = 4. Se dice que una distribución de datos es normal o Gaussiana cuando la forma del histograma puede describirse por la función matemática de la ilustración. La importancia de esta distribución reside en que cualquier variable x que pueda expresarse como suma de otras variables aleatorias. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. se trabaja con datos tipificados z. Esta propiedad se conoce como el teorema del límite central.05 0.10 0.5⎜ 1 f ( x) = e ⎝ S 2π ⎛ x−M ⎞ ⎟ S ⎠
donde f(x) es la frecuencia relativa (expresada como proporción) con la que aparece el dato x. y S es su desviación típica. Por ejemplo. x. el perímetro neuronal sigue una distribución normal ya que el perímetro puede expresarse como la suma de otras variables no relacionadas entre sí. Es decir. Otro ejemplo: la media de cualquier conjunto de datos aleatorios no relacionados entre sí siempre sigue una distribución normal.15 0. acabará por tener K promedios. el histograma de estos promedios se ajustará a una distribución normal.es
Si en lugar de trabajar con datos originales. entonces la fórmula queda:
1 −0. si elige K conjuntos de neuronas (K muestras) y calcula el perímetro medio de cada muestra.
. S=2.00 -2 -1 Variable 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
La función matemática que describe la forma del histograma correspondiente a esta distribución es:
−0. tales como el tamaño de las moléculas que forman la membrana celular. Pues bien. M es la media de la distribución.Enrique A. independientes y distribuidas arbitrariamente siempre sigue una distribución normal.
96S.58). M+2.Enrique A.62 micras y la desviación típica es S = 12. puede suponer sin temor a equivocarse que los datos de la muestra se ajustan a una distribución normal. Por tanto. Dicho de otra forma.58
Variable tipificada (z)
1. e) El área bajo la curva comprendida entre los valores (M-1.39 micras.96. b) Es simétrica.64 micras. o su correspondiente intervalo tipificado (-1.64). Faltaba por calc lar la probabilidad exacta de q e la ne rona del colíc lo inferior
. su perímetro esté fuera de ese intervalo. Veamos un ejemplo práctico. En tal caso. Suponga. puede afirmarse que el 95% de las neuronas posee un perímetro entre (50. Suponga que dispone de una muestra de 500 neuronas a las que le ha medido el perímetro. Conocer estas áreas resulta muy útil.58
95% 99% de todos los datos
Intervalos de probabilidad bajo la distribución normal. c) El área total bajo la curva f(x) es siempre 1.64) y (50. es el 68% del área total.96×12. es el 99% del área total. o su correspondiente intervalo tipificado (-2.58S.96×12.+1.58. M+1.96).+1). f) El área bajo la curva comprendida entre los valores (M-2. es el 95% del área total.96S). Las principales propiedades de la distribución normal son: a) Tiene forma de campana invertida. Como ya se ha explicado anteriormente.62+1.es
Proporciones del área bajo la distribución normal tipificada
68% de todos los datos
-1. entre 25. existe una probabilidad inferior al 5% de que al elegir al azar una neurona de su muestra.58S). que el perímetro medio es igual a M = 50. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. es decir. o su correspondiente intervalo tipificado (-1. M+S).96 -2.62-1.96 2.84 y 75. además.+2. Retomemos el ejemplo de la densidad óptica que dejamos inacabado. la variable perímetro cumple el teorema del límite central. d) El área bajo la curva comprendida entre los valores (M-S.
Podemos calcular dicha probabilidad fácilmente con Microsoft Excel utilizando su función estadística “DISTR.6)/0. Aparecerá el cuadro de diálogo “Pegar función”.9667. 1. El valor “1” indica que quiere calcular específicamente la probabilidad de que el dato sea mayor que la media o que sea menor que ella. Escriba 1. escriba “2” ya que nos da igual si es mayor o menor que la media. Pulse “Aceptar”. independientemente de que sea mayor o menor que la media. En el panel izquierdo denominado “Categoría de función” elija “Estadísticas”. 3.01-0. elija el menú “Insertar/Función”. 2. Lopez-Poveda
. Por simplificar.01 con respecto a la media y la desviación típicas de la muestra de neuronas grano. Grados_de_libertad: En este problema. En este caso. El resultado es z(0. Colas: Admite dos posibles valores: 1 ó 2.T sólo calcula la probabilidad para valores z positivos. es igual al tamaño de la muestra menos 1 (N-1).9667. escriba 500-1 = 499.3 = -1.01)=(0. Por tanto. Esta función permite calcular la probabilidad de obtener un determinado dato tipificado en una distribución t de Student.T”. denominado “Nombre de función” elija “DISTR.Enrique A. A continuación. El valor “2” indica que desea comprobar solamente si su dato es improbable en la distribución.9667.T” de Microsoft Excel. la distribución t de Student es un tipo particular de distribución Gaussiana (algunas de sus características se verán más adelante). En el recuadro derecho. Aparecerá una ventana en la que debe insertar los siguientes datos: • • • X es el dato tipificado positivo. Lo primero que debe hacer es tipificar el dato 0. Por tanto. La función DISTR. debe utilizar el valor z=+1.
como es el caso del perímetro. en comparar la forma de sus distribuciones.es
Dos muestras que se ajustan al mismo tipo de distribución pueden ser diferentes cuando su desviación típica es distinta (A). aunque sus medias sean iguales o parecidas. cuando su media es distinta (B). dos muestras son diferentes en los siguientes casos: a) Si sus medias son muy diferentes. Otro problema muy común en densitometría y morfometría es el de comparar dos grupos de neuronas para saber si son iguales o distintas con respecto a su densidad óptica o su forma. sigue una distribución normal o Gassiana. En otras palabras. por tanto. Una forma de responder a la pregunta es realizar una comparación estadística entre las dos muestras. Comparar dos muestras estadísticamente consiste. suponga que desea comprobar si las neuronas del lemnisco lateral son más grandes que las del colículo inferior. aunque sus desviaciones típicas sean iguales o parecidas. b) Si sus desviaciones típicas son muy diferentes. Si la variable en cuestión cumple el teorema del límite central y.
Comparación de muestras. en realidad.Enrique A. o cuando su media y su desviación típica son distintas (C).
. c) Si sus medias y sus desviaciones típicas son ambas muy diferentes. cuando la variable sigue una distribución normal. la comparación se reduce a comparar las medias de ambas muestras o su desviación estándar. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Por ejemplo.
La prueba t utiliza la diferencia entre las medias de las dos muestras y calcula la probabilidad de obtener dicha diferencia en el supuesto de que las muestras procedan de la misma población.es
Las partículas de la izquierda son. en calcular la probabilidad de que ambas muestras procedan de una misma población. Comparar dos muestras estadísticamente consiste. Cuando la probabilidad resultante es inferior al 5%. es muy probable que sus medias se parezcan entre sí.Enrique A.68
La prueba t de Student sirve para comparar las medias de dos muestras cuyas desviaciones típicas son similares. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. en promedio. es más probable que dicha diferencia sea pequeña que grande. En otras palabras. entonces puede concluirse que las muestras son diferentes. de distinto tipo?
Densidad óptica media DOA = 0.
. en realidad.81
Densidad óptica media DOB = 0. ¿Serán. La hipótesis de partida es que si se toman dos muestras aleatorias de una misma población. un poco más oscuras que las de la derecha. si toma dos muestras aleatorias de una misma población y calcula la diferencia entre sus medias. Cuánto más grande sea la diferencia. es necesario que la variable objeto de estudio siga una distribución normal. Para poder aplicarla. A continuación se expone un ejemplo de cómo aplicar esta prueba. en realidad. más probable será que las muestras sean diferentes.
pero desea confirmarlo estadísticamente. Para cada neurona de ambos grupos ha medido el nivel de gris medio de la neurona (M neurona). El grupo B (o grupo de estudio) está formado por 35 neuronas del colículo inferior (CI). El grupo A (o grupo control) está formado por 35 neuronas grano (GR) del cerebelo elegidas al azar. Las neuronas de ambos grupos se han procesado de forma idéntica. La ilustración muestra los datos obtenidos por el investigador.Enrique A. Suponga que desea comparar el nivel de gris de dos grupos de neuronas. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. Estas últimas se han seleccionado al azar de entre las neuronas que aparecen menos teñidas vistas al microscopio. La pregunta es: “¿son ambos grupos de neuronas iguales respecto a su tinción?”. El investigador ya intuye que no.es
Ejemplo de aplicación de la prueba t de Student con Microsof Excel para comparar dos muestras. Sus niveles de gris se han medido con el mismo equipo y en condiciones de iluminación y de captura idénticas. Ambos grupos de neuronas proceden del cerebro de una rata que se ha immunoteñido frente al neurotransmisor GABA. y el nivel de gris medio y la desviación típica de la imagen en la que se encuentra la neurona (M imagen y S imagen).
. pues las del colículo inferior parecen más claras.
Oscilan desde 91. Este resultado es extraño.es
=(B3-C3)/D3
Primer paso: Normalizar los niveles de gris de la neurona a los niveles de gris de la imagen. Para minimizar este efecto. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.07 a 166.
.Enrique A. a la presencia de vasos sanguíneos (zonas muy claras) en algunas de las imágenes. ya que las imágenes parecen homogéneas en cuanto a su contenido. Observe que los niveles de gris de las imágenes correspondientes a las neuronas del colículo inferior son muy variables.66. es conveniente normalizar los valores de gris de las neuronas con respecto a los del campo. Es decir. Por tanto. por ejemplo. Ya vimos que una posible forma de hacerlo es restar al nivel de gris de la neurona el nivel de gris medio de la imagen y dividir el resultado por la desviación estándar de la imagen: Z neurona = (M neurona – M imagen)/ S imagen. La ilustración muestra la fórmula a aplicar en Excel (recuadro azul) y los valores de gris normalizados (Z neurona) que resultan para cada neurona de los dos grupos. lo más probable es que reflejen que los cortes son desiguales respecto a su grosor. puede descartarse que el gran rango de valores se deba.
Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.063. por último.389 y Nb = -0. la media (M) y la desviación típica (S) del nivel de gris normalizado de ambos grupos. Observe. Observe también que la desviación típica de ambos grupos es muy parecida: Sa = 0. Los resultados se muestran en rojo.31126 y Sb = 0. que los niveles de gris normalizados medios son muy distintos para los dos grupos: Na = –1.
. Esta última condición es imprescindible para poder aplicar la prueba t. Las fórmulas concretas se muestran en los recuadros azules.31124. PROMEDIO(). Para ello. puede utilizar las funciones CONTAR(). y DESVESTP() de Microsoft Excel. Observe que ambas muestras tienen 35 individuos (Na = Nb = 35).Enrique A.es
=CONTAR(E3:E37)
=PROMEDIO(E3:E37)
=DESVESTP(E3:E37)
Segundo paso: Calcular el tamaño (N).
El estadígrafo t
t dif =
MB − MA N A −1 S2 A + N B −1
El estadígrafo tdif de la diferencia entre dos medias puede calcularse utilizando las desviaciones típicas de las muestras (SA y SB) o las de las poblaciones (σA y σB). Se calcula utilizando la fórmula de la ilustración.
Tercer paso: Calcule el estadígrafo t.
.Enrique A.
55.es
=(K39-E39)/RAIZ((E40^2/(E38-1))+(K40^2/(K38-1)))
La ilustración muestra el resultado de aplicar la fórmula del estadígrafo t de la diferencia a los datos del ejemplo: Tdif = 17.Enrique A. Lopez-Poveda
O. La probabilidad de obtener valores de t grandes es mayor cuando las muestras son de pequeño tamaño.Enrique A.es
N > 30 ∼ distribución normal N = 20 N = 10
La forma de la distribución t de Student depende del tamaño de las muestras (N).5 bajo el supuesto de que ambas muestras procedan de la misma población. más improbable es que procedan de la misma población y más probable es que sean distintas. Esto significa que dadas dos muestras que proceden de una misma población.
Cuarto paso: calcule la probabilidad de obtener el valor un valor de Tdif = 17. dando la vuelta al argumento. sin embargo.
. al calcular su correspondiente Tdif es más probable que su valor esté próximo a cero. más se parece a una distribución normal.
La ilustración muestra la distribución de valores t de la diferencia entre dos medias que proceden de una misma población. depende del tamaño de las muestras. cuanto mayor sea su correspondiente Tdif. la distribución ilustra el porcentaje de veces que aparecería cada valor del estadígrafo Tdif al calcularlo para las infinitas parejas de muestras posibles procedentes de una población determinada de tamaño infinito. Cuanto mayor sea el tamaño. Observe. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. La distribución está claramente centrada en torno al valor Tdif = 0. que la forma de la distribución y por tanto la probabilidad. dadas dos muestras cualesquiera. Es decir.
distintas.000000.T de forma parecida a cómo lo hicimos en uno de los ejemplos anteriores. La probabilidad resultante es 0. Para hacerlo. Este argumento es el que determina la forma de la distribución t en función del tamaño de las muestras. sólo deseamos comprobar si las dos muestras son distintas.
. de poblaciones distintas y son.T(E42. debe utilizar la función DISTR. no nos importa. es igual NA+NB-2. la probabilidad de obtener el valor Tdif = 17.E38+K38-2.es
=DISTR. •Colas: Escriba el valor 2.2)
Microsoft Excel permite calcular la probabilidad exacta de obtener el valor Tdif = 17. cual de las dos medias (MA o MB) es mayor.Enrique A. Por tanto. por tanto. Esto significa que: suponiendo que ambas muestras de neuronas proceden de una misma población.55 suponiendo que ambas muestras proceden de una misma población.55 es prácticamente cero. •Grados_de_libertad: En este problema. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal. ya que como se explicó en el ejemplo anterior. en realidad. resulta factible concluir que las muestras proceden. Los argumentos de esta función son: •X es el valor Tdif.
sólo hubiese uno (*) indicaría que el resultado es significativo. Es decir. Una forma gráfica de expresar que ambos grupos son estadísticamente diferente es mediante asteriscos. Esto significa que el resultado al que se refiere es muy significativo (probabilidad de error < 1%). Si aparece “(p < 0. El doble asterisco de la imagen significa que la comparación estadística de las medias de ambos grupos ha resultado muy significativa. •En el texto. entonces es que la probabilidad de error es inferior al 5%.5 Nivel de gris normalizado
0 -0.01)”.
. la probabilidad de que ambos grupos sean iguales es inferior al 1%. que la probabilidad de que sean iguales es inferior al 5%. La ilustración muestra el nivel de gris normalizado para ambos grupos de neuronas (Grano y Colículo). Es decir.5 -1 -1. Si en lugar de dos asteriscos.5 -2 Granos Colículo Grupo de neuronas
Las neuronas grano aparecen más claras que las neuronas del colículo (p < 0.es
Formas alternativas de expresar resultados estadísticos significativos.Enrique A. En la redacción de un trabajo científico.01). es común encontrarse con segmentos de texto tales como “(p < 0.
•Gráficamente. Lopez-Poveda
ealopezpoveda@usal.05)”.
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