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Timestamp: 2017-10-18 23:41:56+00:00

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El estudio de las estructuras biológicas es difícil por dos razones: su pequeño tamaño y que son transparentes a la luz visible. La invención del microscopio hizo posible la observación y estudio de las células.
Otro inconveniente, las transparencias, se contrasta aumentando el contraste. Esto se hace utilizando diferentes tinciones.
Microscopio óptico: pueden ser simples (una sola lente) o compuestos (dos lentes:1-objetivo; 2-ocular). Los simples no se utilizan para el estudio de las células ya que son como una lupa. La lente objetivo es la que se encuentra cerca del objeto a examinar. La lente ocular se sitúa junto el ojo del observador. Si sustituímos el ojo por la cámara podriamos hacer fotos.
También pueden tener otras lentes intermedias al igual que dispositivos, como el condensador, que concentra la luz sobre lo objetivo. La parte también pode haber dispositivos para aumentar el contraste.
Lo importante del microscopio no son los aumentos si no el poder de resolución que se define como la capacidad de distinguir dos puntos muy cercanos como puntos separados.
El poder de resolución de un microscopio ven dado por la seginte fórmula:
Limite de resolución = 0.61 x alfa
n x seno (alfa)
n x sien (alfa) : apertura numérica.
n (índice de refracción): indica el cambio en la velocidad de la luz difractada de en medio situado entre el objeto y la lente. Cuando lo que hay entre lo objeto y la lente es aire, n = 1; cuando hay aceite de inmersión (se utiliza con el objetivo de cien porque es lo que más aumenta entonces n = 1,51.
alfa : ángulo de semiapertura de la lente. Nos interesa que la apertura numérica sea máxima y alfa sea mínima porque sería menor la distancia a la que podría distinguir dos puntos cercanos cómo separados.
Cuando el límite es mucho más pequeño el microscopio tiene un poder de resolución mayor.
Técnicas de preparación de muestras para microscopía óptica.
Para observar material biológico se requiere una serie de procesos:
1- La fijación: el objetivo de la fijación es conservar la morfología normal. Los fijadores coagulan, sobre todo las proteínas, desnaturalizándose y estableciendose jóvenes uniones que las vuelven insolubles e impiden que degeneren. Pude ser física, como por ejemplo, congelando. La congelación tiene que ser rápida para evitar la formación de cristales de agua que destruyan la formación de células y tejidos.
La fijación puede ser química como pueden ser el alcohol, el ácido acético, el ácido pirúvico o la combinación entre ellos: fixador de Boulin. Otros son el formaldehido y glutaraldehido o una mezcla de ellos (se pueden usar diferentes concentraciones para fijar).
2- Inclusión y corte: las muestras hay que embeberlas (cuando se empapa por todo en sustancias que presentan mayor dureza. Se utiliza parafina (como las magdalenas en la leche). Las muestras hay que deshidratarlas ya que la parafina no es miscible con agua. Para deshidratar se utiliza una serie de alcoholes o acetona de concentración creciente. Una vez la muestra esté en alcohol o acetona absoluta, utilizamos un compuesto miscible con el alcohol y la parafina como son el xileno y benceno. Por último llevamos la muestra a la parafina líquida dejándola como mínimo 24 horas. Por último vertimos parafina líquida en moldes, colocamos la muestra en estos moldes y dejamos que solidifique. Una vez incluidas las muestras tenemos que cortarlas. Los cortes para microscopía óptica tenemos que cortarlas entre 3 y 20 micras.
Los cortes se hacen con aparatos: microtomos (tiene una pieza que engancha el bloque y una manivela).
Una vez hechos los cortes los recogemos en portaobjetos y después hay que teñirlos.
3- Tinción: las sustancias utilizadas para esto son los colorantes que pueden ser de tres tipos:
- ácidos: van a teñir sustancias básicas. Conocida cómo, colorantes basófilos. Ej: eosina.
- básicos: tiñen sustancias ácidas. También conocidas cómo, colorantes acidófilos. Ej: azul metileno, hematosilina.
- neutros: tiñen sustancias que no son ni ácidas ni básicas: sustancias de vacío. Ej: sudán III.
Generalmente se emplea un colorante ácido y un básico. A esto se le llama: tincións duales. Ej: hematoxilina-eosina.
l-Microscopio de composición clara.
2-Microscopio de composición obscuro: el condensador es especial e ilumina el objeto oblicuamente. Con este condensador no entra luz directa en el objetivo y por lo tanto el objeto aparece brillante a causa de la dispersión de la luz, mientras que el fondo permanece obscuro.
3-Microscopio de fluorescencia: se basa en la propiedad que presentan algunos compuestos de absorver luz de una longitud de onda determinada y emitir luz de una longitud de onda diferente. Presenta dos sistemas de filtro. El primero sólo deja pasar las longitudes de onda emitidas por el compuesto fluorescente.
4-Microscopio de contraste de fases: se utiliza especialmente para el estudio de células vivas. Se basa en que la luz que atraviesa un objeto sufre un retardo o cambio de fase que normalmente no se detecta. En este microscopio la diferencia de fase se adelanta o se retrasa un cuarto de longitud de onda de manera que el retardo producido por las estructuras se magnifica.
5-Microscopio de contraste interferencial: lo de contraste de fases es un tipo de microscopio de interferencia pero hay otros tipos que usando complejas vías de luz y prismas proporcionan un notable efecto de relieve en la estructura de la célula viva. También se conoce con el nombre de Nomarski.
6-Microscopio óptico de barrido con focal: adapta un sistema de barrido mediante rayo láser. Este rayo se desplaza por un sistema de espejos y restrea punto por punto la preparación. La luz que emerge de la preparación es analizada y un ordenador elabora una imagen. También se pueden realizar reconstruccións en tres dimensiones en imágenes obtenidas las diferentes profundidades de la preparación. En este caso la muestra también tiene que ser fluorescente.
7-Microscopio de polarización: se basa en el comportamiento que tienen ciertos componentes de la célula y los tejidos cuando son observados con luz polarizada. Un material isótropo tiene el mismo índice de refracción en todas las direcciones. El material anisótropo tiene dos índices de refracción distintos. Este microscopio tiene dos elementos jóvenes: el polarizador que está debajo del condensador y el analizador que esta tirando por lo alto del objetivo.
En la posición cruzada no hay transmisión de luz polarizada a menos que la muestra sea birrefringente.
El microscopio electrónico se utiliza para el estudio de ultraestructuras de las células. Los electrones emitidos dentro de una columna al vacío son acelerados y luego son desviados por campos electromagnéticos que actúan como sí habían sido lentes ópticas. Tipos de gafas: condensador, objetivo y proyector. La imagen se visualiza sobre una pantalla fluorescente. El esquema del microscopio electrónico es semejante al del óptico con los elementos invertidos pero utiliza electrones en vez de luz visible, campos electromagnéticos por lentes de vidrio y debe trabajar en vacio para que los electrones no se desvíen.
La ventaja del microscopio electrónico es que el poder de resolución es mucho mayor. La resolución real está entre 0.5 y 1 nanómetros cerca del nivel molecular.
Técnicas de preparación de muestras para microscopía electrónica:
El proceso de preparación de muestras sigue pasos semejantes a la microscopía óptica, con algunas diferencias que iremos viendo.
- Fijación: para la microscopía electrónica se utiliza una doble fijación. Primero echamos formaldehído o glutaraldehído o una mezcla de ambos y después se utiliza otra fijación de tetróxido de osmio.
- Inclusión y corte: primero deshidratamos las muestras en series crecientes de alcohol o acetona. En este caso, las muestras no se van incluir en parafina sino que se incluyen en resinas sintéticas que son sustancias más duras.
- Los cortes son de un grosor de 60-80 nm y se realizan en ultramicrotomos que utilizan cuchillas de vidrio o diamante, ya que el metal usado en los microtomos no tendría hilo suficiente para realizar estos cortes tan finos. Finalmente los cortes se recogen en rejillas.
- Tinción: para la microscopía electrónica no se emplean colorantes, sino agentes que contengan átomos con peso atómico elevado para que contribuyan a la formación de la imagen. Son el acetato de uranilo y citrato de plomo.
- Los electrones que chocan contra los atomos de elevado peso atómico se reflejan y los que atraviesan la muestra llegan a la pantalla fluorescente y emiten luz. De esta forma vamos a tener zonas más o menos obscuras, es decir, zonas más o menos electrodensas: son imagenes en blanco y negro.
Otros tipos de microscopios electrónicos:
- De alto voltaje: en estos microscopios puede haber una diferencia de potencial de tres millones de voltios por lo que la aceleración de los electrones es mucho mayor, asi cómo el poder de penetración. Podemos examinar muestras más gruesas.
- De barrido: permite examinar la superficie de las muestras. Proceso:
Las muestras tienen que desecarse. Una vez secas sombreamos la superficie con átomos de elevado peso atómico. En este caso se utiliza platino o mezclas de oro paladio.
Los electrones se aceleran y la formación de la imagen basara en los electrones que son reflactados después de chocar con la muestra.
Técnicas de criofractura:
Los tejidos se congelan rápidamente (en nitrógeno líquido) para evitar la formación de cristales. Luego la muestra se rompe dándole un golpe con una cuchilla fría. Se hace un sombreado de la superficie rota con carbono y platino. Se destruye la muestra biológica y nos queda la superficie sombreada. Se denomina replica. Se pone en una rejilla y se observa al microscopio electrónico de transmisión. Las líneas de fractura ocurren donde las uniones son más débiles. Generalmente las membranas se separan entre las dos capas lipídicas.
Técnica citoquímica y histoquímica:
Las tinciones empleadas comúnmente nos informan por sí mismas a cerca de la naturaleza química de los componentes de las células y los tejidos. Pero hay técnicas específicas denominadas citoquímicas o histoquímias que permiten demostrar por medios morfologicos las modificaciones que ocurren a nivel molecular en las células y tejidos ya que las reacciones químicas dan un producto final que puede ser detectado al unirse a un colorante.
Técanicas de marcaje:
1º. Autoradiografía: se basa en suministrar moléculas marcadas con isótopos radiocativos. Como por ejemplo para detectar la replicación del ADN, se suministratará timidina tritiada que se va a introducir en el ADN que se esta replicando. Esto se hace en vivo. Una vez hecho esto se sacrifica el animal y se le cortan los órganos. Se pone una placa fotográfica sobre las secciones y si hubo incorporación de timidina tritiado los átomos radiactivos impresionarán la placa fotográfica detectandose donde hay replicación del ADN.
2º. Inmunocitoquímicas: el que se va a utilizar para reconocer un compuesto específico son anticuerpos contra ese compuesto. Después se utiliza un anticuerpo secundario que está unido a una sustancia colorante, asi ya podemos detectar el anticuerpo al microscopio.
3º. Hibridación in situ: se detecta la presencia de un ARNm determinado. El ARN es monocatenario, por lo tanto, se fabrica artificialmente un oligonucleótido de entre 30 y 50 nucleótidos que tenga la secuencia complementaria a la del ARNm que queremos detectar. Este oligonucleótido está marcado con un átomo radiactivo. Incubamos la sección de tejido en una solución que contenga nuestro oligonucleótido con el marcaje radiactiva. Se está presente el ARNm en algunas células, nuestro oligonucleótido ve hibridar con él. Después lo que realizamos es una autoradiografía.
Aislamiento y cultivo de las células:
Para aislar células a partir de un tejido hay que reducirlo a una suspensión celular. Generalmente con tratamientos con enzimas proteolíticas. A continuación se separan los distintos tipos celulares usando diferentes métodos. Una vez obtenida una población uniforme de células podemos realizar los cultivos celulares. Estos se realizan sobre una superficie de plástico sobre la que crecen las células. Hay que añadir diversos elementos necesarios para que las células se desenvuelvan como son los componentes de la matriz extracelular, vitaminas, sales minerales y factores de crecimiento. Los elementos de en medio de cultivo varían dependiendo del tipo celular ya que los distintos tipos celulares tienen diferentes requerimentos. Las células cultivadas presentan un número limitado de divisiones y después mueren. Sin embargo alguna variante celular puede reproducirse indefinidamente constituyendo una línea celular.
Podemos aislar una de estas células, cultivarla y obtener un conjunto de células denominado clon (todas las células son idénticas entre sí). También se pueden formar cultivos celulares de la fusión de dos tipos celulares diferentes. Formando una célula binucleada llamada: heterocarion. Estas células denominadas hibridas son útiles para estudiar las interacciones entre dos tipos celulares y la localización de determinados genes. Los cultivos celulares nos permiten experimentar la acción de distintos factores sube las células y determinar mejor las propiedades de las células. Esto es lo que se conoce como el estudio in vitro.
Fraccionamento celular:
Se utiliza con el fin de separar los diferentes orgánulos y componentes celulares para su estudio. La técnica más utilizada es la centrifugación diferencial que depende del principio de que las partículas de tamaño distinto viajan cara el fondo del tubo de la centrífuga a distintas velocidades. El proceso se inicia rompiendo las células en solución isotónica amortiguada (= homogenización). Después se somete el homogeneizado a una serie secuencial de centrifugación con fuerzas centrífugas cada vez mayores. En cada centrifugado los orgánulos mayores sedimentan y el sobrenadante se utilizara para el centrifugado siguiente.

References: resolución 
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