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Timestamp: 2019-12-06 10:58:14+00:00

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La microespectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIRM) en el estudio de sistemas biológicos
versión impresa ISSN 0370-5943
Rev. latinoam. quím vol.41 no.3 Naucalpan de Juárez dic. 2013
Guillermo Barraza-Garzaa, Laura A. de la Rosaa, Alejandro Martínez-Martíneza, Hiram Castillo-Michelb, Marine Cotteb, Emilio Alvarez-Parrillaa*
a Departamento de Ciencias Químico Biológicas, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidad Autónoma de Ciudad Juárez, Anillo Envolvente del PRONAF y Estocolmo s/n, Ciudad Juárez, Chihuahua, CP 32310, México.
b X-ray and Infrared Microspectroscopy Beamline ID21, European Synchrotron Radiation Facility, 38043 Grenoble Cedex, B.P. 220, France
Dr. Emilio Alvarez-Parrilla. e-mail: ealvarez@uaci.mx,
tel: +52(656)6881800 ext 1562. Fax: +52(656)6881821.
Recibido Julio 2013.
Aceptado Septiembre 2013.
La microespectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIRM) es una técnica reciente que ha cobrado auge en el estudio de sistemas biológicos. Esta técnica es el resultado de la unión de la espectroscopia de infrarrojo (FTIR) con la microscopia óptica. El uso de la radiación de sincrotrón ofrece ventajas significativas en términos de brillantez, pero los recientes desarrollos en óptica (ATR) y en detectores (FPA) han permitido la expansión de esta técnica en los laboratorios. En ambos casos se pueden alcanzar resoluciones en la escala de los micrómetros. La imagen óptica generada permite delimitar un área de estudio y se usa a la radiación del infrarrojo medio (2.5 a 15 µm/ 4000 a 650 cm-1) para detectar los movimientos vibracionales de los grupos moleculares presentes en muestras biológicas. Los resultados que se obtienen permiten observar el estado bioquímico de una muestra, además de obtener información de todas las moléculas presentes en la misma lo cual permite la identificación, semi-cuantificación y precisa localización de una o varias moléculas de interés al interior de la célula o tejido. De esta manera se pueden identificar células de diferentes especies o en diversos estados metabólicos también se pueden analizar las variaciones bioquímicas generadas bajo diversas condiciones a las que sea sometida una muestra. Esta revisión informa sobre la FTIRM, dando un panorama general de la técnica y citando a varios estudios realizados con la misma en diversos sistemas biológicos.
Palabras clave: infrarrojo, microespectroscopía, FTIRM, espectroscopia, sistemas biológicos.
Fourier transform infrared microspectroscopy (FTIRM) is a recent technique that, over the last decade, has become more popular for the study of biological systems. It is the result of the union between FTIR spectroscopy and optical microscopy. The use of synchrotron radiation offers a significant gain in terms of brightness but recent developments on optics (ATR) and detectors (FPA) allow as well an important expansion of the technique in laboratories. In both cases, micrometric resolution can be reached. The generated optical image allows studying a particular area and uses the mid-infrared radiation (2.5 to 15 µm/ 4000 to 650 cm-1) to detect vibrational movements from the molecular groups present in biological samples. FTIRM results allow us to observe the biochemical state of a sample, and provide us with information about all molecules present therein, allowing identification, semi-quantification and precise localization of one or more relevant molecules. In this way it is possible to identify cells from different species or in different metabolic stages, or to analyze the biochemical changes generated in the samples under diverse experimental conditions. This review aims to inform about FTIRM, giving a general prospect of the technique and citing several studies made with it in various biological systems.
Key words: infrared, microspectroscopy, FTIRM, spectroscopy, biological systems.
Generalidades de la FTIRM
El estudio de los procesos bioquímicos que ocurren en células y tejidos ha visto un avance acelerado en las últimas décadas, debido en gran parte a la creación y mejora de métodos novedosos para el estudio de sistemas biológicos, que ayudan a enriquecer y complementar la información permitiendo una mejor comprensión de los fenómenos moleculares que ocurren en los seres vivos (Miller & Dumas, 2010). Una de estas técnicas es la microespectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIRM por sus siglas en inglés), que surgió de la integración de la microscopia óptica y la espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier (FTIR por sus siglas en inglés), permite realizar un análisis global del estado bioquímico de la célula, monitoreando los niveles de las principales biomoléculas presentes en el interior de la célula (Walker et al., 2009). La espectroscopia FTIR es una herramienta muy poderosa y bastante conocida. El principio básico de esta técnica se basa en la excitación de grupos moleculares por un haz de luz infrarroja (2.5 a 15 µm; equivalentes a número de onda comprendido entre 4000 a 650 cm-1), que genera movimientos vibracionales en los enlaces de la molécula (Carr & Williams, 1997; Kowalskaa & Gajdab, 2012). Los movimientos vibracionales se distinguen por el tipo de desplazamiento generado en los enlaces, conociéndose como vibraciones de tensión o flexión. Las tensiones provocan un estiramiento o estrechamiento del enlace y las flexiones generan una deformación del enlace (figura 1). Si el número de átomos que forman un enlace es de tres o más, los movimientos también pueden presentarse como simétricos y antisimétricos (Bonda et al., 2011; Gazi et al., 2005; Miller & Dumas, 2010). Los movimientos simétricos se caracterizan porque los enlaces se desplazan en direcciones contrarias y los movimientos antisimétricos se caracterizan por un movimiento en la misma dirección o sentido (Gazi et al., 2005; Miller & Dumas, 2010).
El análisis de una muestra por FTIR provee como resultado un espectro de absorción de infrarrojo el cual proporciona información de la estructura y concentración molecular. Todas las moléculas pueden manifestar una serie de bandas de absorción, cada banda corresponde con un movimiento de vibración de un enlace específico dentro de la molécula, a este conjunto de señales se les conoce como la "huella dactilar" del compuesto (Colagar et al., 2011; Matthäus et al., 2008; Miller & Dumas, 2010). La mayoría de los componentes de un enlace químico tienen movimientos vibracionales con frecuencias dentro del infrarrojo medio (4000 a 650 cm-1), moléculas tales como lípidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos y otras presentes en una muestra biológica tienen cada una un espectro de infrarrojo específico (Carr & Williams, 1997; Kowalskaa & Gajdab, 2012). La radiación es absorbida por un enlace cuando la frecuencia vibracional de la onda electromagnética usada es la misma que la del propio enlace, haciendo posible la asignación de picos de absorción a grupos funcionales específicos (figura 2) (Bonda et al., 2011; Didonna et al., 2011). Estructuras químicas grandes como es el caso de las biomoléculas tienen picos de absorción predecibles, los cuales pueden variar ligeramente dependiendo de las distintas interacciones moleculares y propiedades físicas de las muestras. El número de onda absorbida por un enlace vibracional depende de los átomos que forman el enlace, el tipo de enlace formado y el tipo de vibración inter e intramolecular (Bonda et al., 2011; Miller & Dumas, 2010).
En muestras complejas como las biológicas el conocimiento de los distintos constituyentes permite identificar el origen de un enlace en particular en el espectro infrarrojo. Por ejemplo los enlaces C=O absorben el infrarrojo en un número de onda cercano a los 1650 cm-1, las moléculas que contienen un número significativo de enlaces C=O como los presentes en los grupos amida de una proteína presentaran un pico de absorción en este número de onda. Si la muestra no fuese un tejido biológico y se observara dicha banda, esta correspondería a cualquier molécula presente en la muestra analizada, que contenga este grupo funcional, como amidas, ácidos carboxílicos, cetonas o aldehídos. Los espectros de absorción obtenidos de una muestra biológica normalmente son tomados en los números de onda comprendidos entre los 4000 cm-1 y 650 cm-1, en donde se tienen dos principales zonas de interés, la primera abarca entre los ~3400 cm-1 y 2800 cm-1 y la segunda entre los ~1800 cm-1 y 900 cm-1 (Cuadro 1). En estos dos intervalos es donde se pueden observar la mayoría de los enlaces de interés biológico, siendo las biomoléculas las que generarán una mayor atención en los estudios con radiación infrarroja (Szczerbowska-Boruchowska et al., 2007). Por ejemplo las principales bandas de absorción de los lípidos se encuentran en la región de 3000 a 2800 cm-1 donde las vibraciones de los enlaces C-H de los metilos se encuentran en las bandas 2956 y 2874 cm-1, mientras las vibraciones de los CH2 se encuentran en las bandas 2922 y 2852 cm-1. Adicionalmente existe una banda de absorción entre los 1750 y 1720 cm-1 la cual corresponde al grupo éster presente en los lípidos. El espectro de los ácidos nucleicos también contiene grupos éster; pero las bandas correspondientes a estos se encuentran en los 1717 cm-1 para las purinas y los 1666 cm-1 en las pirimidinas, además en la región comprendida entre los 1000 cm-1 y 1500 cm-1 contiene a los grupos fosfato antisimétricos (1224 cm-1) y simétricos (1087 cm-1) (Cuadro 1) (Miller & Dumas, 2010).
Los resultados que son obtenidos del análisis de la muestra se observan en forma de espectros de infrarrojo (figura 2). La interpretación de estos datos depende en gran medida del conocimiento de las propiedades espectroscópicas de la muestra (Jackson & Mantsch, 2000). Mientras el uso de espectros de IR para muestras puras es relativamente simple y directo, en la FTIRM, el análisis de células o tejidos biológicos es mucho más complejo, ya que en este caso la técnica no solo detecta una sola molécula, sino que permite observar la composición química de toda la célula (Cakmak et al., 2012).
La asignación de valores que indican alguna característica particular en un espectro de IR de una muestra biológica, es solo un parámetro de referencia ya que los valores de éstos varían entre las distintas muestras analizadas dependiendo de las características propias de la misma (Miller & Dumas, 2006).
Los primeros microespectrómetros de infrarrojo para el análisis de áreas muy pequeñas, mediante el acoplamiento de un microscopio al espectrómetro, datan de mitad del siglo XX; pero la relación señal/ ruido era tan baja que resultaba en una sensibilidad muy reducida, obteniéndose espectros con muy baja resolución (Bellisola & Sorio, 2012). Sin embargo el desarrollo de nuevas fuentes de radiación infrarroja, por ejemplo la fuente de sincrotrón la cual puede dar haces de luz entre 10-3 µm2, nuevos desarrollos en óptica y detectores (p.ej., cristal de reflexión total atenuada con detectores de arreglo de plano focal) durante las últimas décadas permitió la unión definitiva entre la espectroscopia de infrarrojo y la microscopia convencional, permitiendo la creación de la microespectroscopía para su uso en sistemas tan complejos como las células y los tejidos de los seres vivos (Bellisola & Sorio, 2012; Miller & Dumas, 2010). La FTIRM presenta la ventaja de que la radiación emanada de estas fuentes no es ionizante, lo que permite extender los experimentos desde los mili-segundos hasta varias horas de duración sin que exista una degradación del sistema estudiado (Bellisola & Sorio, 2012; Meade et al., 2010; Miller & Dumas, 2010). La integración del microscopio óptico al espectrómetro FTIR, permitió el uso de una imagen para, generar un mapa a micro-escala de la muestra, permitiendo un análisis de la composición química de una muestra heterogénea como es el caso de una célula. Un espectro de FTIRM de una muestra biológica corresponde a la superposición del espectro individual de miles de constituyentes, por lo que su análisis implica serias dificultades. Sin embargo y a pesar de dicha complejidad se ha demostrado que la técnica es bastante sensible a pequeños cambios en la composición química de la célula (Bellisola & Sorio, 2012; Cakmak et al., 2012; Miller & Dumas, 2010).
TÉCNICA DE FTIRM
En términos generales, la FTIRM sigue los siguientes pasos: a) análisis de la muestra, b) preparación de la muestra, c) interpretación y análisis de resultados.
a) Análisis de las muestras.
Se realiza mediante la incidencia de un haz de luz infrarroja sobre la muestra, éste puede ser utilizado en modo de transmisión o reflexión del haz, el principal parámetro a tomar en cuenta es la relación señal/ruido. La calidad de los resultados obtenidos en estos experimentos varía dependiendo del tipo de fuente de radiación de infrarrojo utilizada y la relación señal/ruido obtenida de la fuente (Matthäus et al., 2008; Miller & Dumas, 2006). Los dos tipos de fuentes de radiación de infrarrojo más comunes para los estudios de FTIRM son: la fuente termal convencional (p. ej., globar, que es una fuente de radiación de cuerpo oscuro) y la fuente de sincrotrón (Chwiej et al., 2010). La principal diferencia entre estas fuentes de radiación es la divergencia, y como consecuencia la resolución espacial que se puede obtener con cada una de ellas. La resolución espacial es dependiente del número de onda utilizada y de la apertura por la cual atraviesa el haz de luz del instrumento óptico utilizado (Miller & Dumas, 2006). La apertura utilizada confina al haz de infrarrojo a explorar una zona de interés, el problema radica en generar un haz de luz que pueda generar resultados en los cuales la calidad señal/ruido sea la adecuada debido a que el número de onda del infrarrojo medio (4000 a 650 cm-1) es muy cercana a las números de apertura utilizadas. La proporción señal/ruido va disminuyendo en función del tamaño de la apertura, generando un límite práctico de resolución espacial entre los 2 a 10 µm. Esto sucede debido a que la cantidad de fotones que llegan al detector disminuye conforme se aproxima al límite práctico (Miller & Dumas, 2010). Aquí es donde la radiación de sincrotrón juega un rol importante ya que a partir de la pequeña apertura (5 a 10 µm), es una fuente de 100 a 1000 veces más intensa que las fuentes convencionales, lo que permite que se puedan llevar a cabo ensayos en donde se requiere de una mejor relación señal/ruido para obtener una mayor resolución espacial o espectral (Dumas et al., 2006; Miller & Dumas, 2006). El haz de luz que se obtiene de este tipo de fuente de infrarrojo mejora de manera considerable los resultados obtenidos en estos estudios.
La radiación IR generada en un sincrotrón es emitida por electrones que son acelerados en una trayectoria circular por acción de magnetos posicionados alrededor de un anillo aislado en alto vacío. El haz extraído es de solo unos micrones y dentro de sí contiene el rango de las números de onda del espectro medio del IR, este haz después es focalizado e introducido en un espectrómetro FTIR como una fuente de radiación (Creagh et al., 2006; Dumas et al., 2006). En comparación una fuente IR de cuerpo oscuro (p.ej., globar) emite su radiación con una distribución de 360 grados, lo que se traduce en una menor eficiencia y brillantez de la fuente (Bellisola & Sorio, 2012). A pesar de que se puede obtener bastante información usando una fuente IR convencional, el uso de una fuente de sincrotrón mejora drásticamente los resultados que se pueden obtener en un estudio con FTIRM (Miller & Dumas, 2010).
El análisis de la muestra se completa cuando la señal es captada por un detector. Los microscopios de infrarrojo generalmente se encuentran equipados con detectores de teluro de mercurio-cadmio enfriados con nitrógeno liquido (MCT por sus siglas en inglés) (Bellisola & Sorio, 2012; Matthäus et al., 2008; Miller & Dumas, 2010). Sin embargo los desarrollos más recientes en detectores de infrarrojo, han generado los detectores de arreglo de plano focal (FPA por sus siglas en inglés) que consisten de cientos de elementos detectores de infrarrojo, permitiendo obtener imágenes de grandes áreas con una alta resolución espacial significando un gran ahorro de tiempo en comparación de los detectores MCT, sin embargo en la actualidad los detectores FPA aún tienen una relación señal/ruido inferior a la de los detectores MCT (Kazarian & Chan, 2013). Avances en el área prometen una mejora en los detectores FPA lo que permitirá tener mejores resoluciones espaciales y mayores avances técnicos en los estudios con células vivas, mejorando tanto la resolución, como los tiempos de observación (Miller & Dumas, 2010)
b) Preparación de la muestra.
Varía dependiendo del tipo de muestra utilizada, en el caso de trabajar con un tejido se llevan a cabo cortes de las muestras seleccionadas en micrótomo, estos cortes varían entre de 5 a 30 µm de grosor (Leskovjan et al., 2009; Pijanka et al., 2009), las muestras pueden ser usadas directamente o ser embebidas en una matriz para mantener su integridad. Sin embargo lo más recomendable es no utilizar muestras embebidas, ya que las matrices utilizadas absorben energía en la región del infrarrojo medio (2.5 a 15 µm) interfiriendo con las biomoléculas presentes en la muestra. Desafortunadamente, el uso de esta técnica de montaje es casi obligado, debido a que son pocas las muestras de tejido que pueden analizarse directamente tras el corte realizado por el micrótomo, por ello siempre es importante balancear la cantidad de ruido que generará el método de conservación de muestras en los resultados (Magne et al., 2001; Miller & Dumas, 2006). Una vez obtenido el corte, la muestra será montada en un portamuestras para ser observada.
En función de su capacidad de permitir el paso de la energía, los portamuestras pueden ser de transmisión, reflexión de infrarrojo o con un cristal de reflexión total atenuada (ATR) , dependiendo si permiten o no el paso de energía infrarroja. En el caso de utilizarse un método de transmisión de infrarrojo se requiere de un portamuestras el cual está fabricado con un material transparente a la radiación de infrarrojo, normalmente se usa fluoruro de calcio (CaF2), fluoruro de bario (BaF2), seleniuro de zinc (ZnSe), sulfuro de zinc (ZnS) o nitruro de silicio (Si3N4). En el caso de usar un método de reflexión de infrarrojo se utilizan portamuestras con recubrimiento de oro o aluminio y otros cristales de baja emisión térmica (lowe). En el caso de utilizarse un cristal ATR, este permite realizar el estudio de células vivas y sin fijación, las células deben de cultivarse en placas hechas con ATR el cual permite la observación de las células en su medio con una alta resolución espacial, la única desventaja de este método es que solo se pueden observar 1 o 2 µm a partir de la superficie celular, por lo que zonas como el núcleo normalmente no pueden ser analizadas (Matthäus et al., 2008; Miller & Dumas, 2010; Kazarian & Chan, 2013). Dependiendo del tipo de material se debe de tomar en cuenta el grosor de las muestras que pueden ser observadas, en el caso de transmisión el tamaño máximo recomendado es de 20 µm, cuando son usadas muestras para reflexión el tamaño es de 12 µm y si es utilizado ATR no existen límites establecidos de grosor ya que de esta manera solo pueden ser observados los primeros micrómetros que forman la muestra (Kazarian & Chan, 201; Miller & Dumas, 2010).
Cuando el experimento se realiza con células individuales en un medio acuoso, el procedimiento más utilizado es la fijación de la muestra para preservar los componentes estructurales y los constituyentes bioquímicos de las células lo más cercano posible a su estado nativo en vivo (Buriankova et al., 2010; Pijanka et al., 2009).
Uno de los métodos de fijación más utilizados es el secado al aire, donde la muestra se deja evaporar a temperatura ambiente, esperando la fijación de ésta en el portamuestras. Si bien el secado al aire permite tener muestras sin ninguna contaminación externa, puede causar una deslocalización de las biomoléculas como resultado de la tensión superficial asociada con la interfase aire-agua que se genera en la célula. La obtención de células de medios de cultivo con un pH estable para su posterior secado puede provocar cambios en la presión osmótica de la célula, provocando variaciones de la estructura celular, ya que esta puede encogerse o su membrana celular se puede romper (Gazi et al., 2005). Una técnica similar al secado al aire es el método de secado por centrifugación de la muestra, el cual reduce el tiempo de secado y por ende los efectos asociados con la interfase aire-agua. Sin embargo esta técnica parece modificar la localización espacial de las moléculas al interior de la célula (Tobin & Chesters, 2004).
Otros procedimientos comunes para la fijación de muestras son los procedimientos químicos, entre los que se encuentran la fijación por formalina (solución de formal-dehído estabilizada con metanol), paraformaldehído y gluteraldehído-tetroxido de osmio, siendo la fijación por formalina la más común de ellas (Croxford et al., 2011; Matthäus et al. , 2008). La formalina actúa como un fijador coagulante de proteínas, que tiende a preservar adecuadamente lípidos y proteínas, el alto contenido de agua de esta solución hace que esta técnica requiera de un secado adicional, para evitar el movimiento molecular. A pesar de que la fijación química es muy efectiva no siempre es utilizada, ya que algunos fijadores químicos absorben números de onda del infrarrojo medio afectando los resultados obtenidos. Un estudio reciente ha demostrado que el uso de la formalina como fijador no genera ruido considerable en las muestras y recomienda esta solución como fijador químico (Gazi et al., 2005).
La fijación también es necesaria debido a que, una vez que son removidas de su medio de crecimiento, las células comienzan un proceso autolítico a menos que se aplique una fijación adecuada. El proceso autolítico comienza cuando las enzimas contenidas en los lisosomas inician la degradación de proteínas y la defosforilación de nucleótidos, fosfolípidos y proteínas. Este proceso también propicia la compactación de la cromatina, la fragmentación nuclear y la fragmentación y condensación citoplasmática. Los efectos de los procesos autolíticos son particularmente nocivos para aquellos estudios en los cuales se tiene el interés de estudiar una vía bioquímica especifica al interior de la célula (Gazi et al., 2005).
c) Interpretación y análisis de los resultados.
La interpretación de los espectros de infrarrojo requiere de un sofisticado análisis de datos el cual sigue evolucionando gracias al desarrollo de métodos de análisis multivariables. Uno de los métodos más utilizados para el análisis de datos es conocido como análisis de componentes principales (PCA); este análisis requiere de un proceso matemático que transforma a un número de variables correlacionadas en un grupo más pequeño de variables no-correlacionadas llamadas componentes principales. Cada uno de estos componentes principales corresponde a la mayor variabilidad posible registrada en el grupo de datos analizados, siendo la primera componente la que contiene la mayor variabilidad y va disminuyendo en los subsecuentes (Bellisola & Sorio, 2012; Matthäus et al., 2008; Miller & Dumas, 2010). Otro método común de análisis de datos es conocido como análisis de agrupamientos (clusters), el objetivo de este tipo de análisis es encontrar la mejor forma de agrupar datos multivariables, lo suficiente como para encontrar agrupamientos significativamente distintos, pero que los datos al interior de cada agrupamiento sean similares. Para llevar a cabo este tipo de análisis se han desarrollado diferentes tipos de algoritmos los cuales se dividen en tres tipos: i) Los aglomerativos, en donde en cada paso del análisis se generan agrupamientos de datos; ii) Los divisorios, los cuales agrupan todos los datos obtenidos en un solo grupo inicial, el cual se va dividiendo en dos mas con cada paso del análisis; iii) Los particionales, los cuales asignan los datos a distintos agrupamientos sin utilizar una jerarquización para la división (Didonna et al., 2011; Matthäus et al., 2008). La varianza observada en los datos obtenidos por estos análisis es resultado de las diferencias bioquímicas entre las muestras.
Existen ocasiones en las que algunas de estas variaciones también pueden ser resultado de efectos físicos, especialmente cuando el tamaño de las células es similar al número de onda utilizado, a este efecto se le conoce como fenómeno de dispersión de tipo Mie, el cual puede provocar distorsiones en la posición e intensidad de las bandas de absorción observadas (Miller & Dumas, 2010; Saulou et al., 2010). La dispersión Mie puede resultar en una amplia oscilación sinusoidal en la línea base del espectro lo que puede llevar a distorsiones tanto en la posición como en la intensidad de la banda de absorción. Además la eficiencia de este análisis de dispersión es dependiente del índice de refracción de la muestras y cambia en el pase a través de una resonancia de absorción, en un efecto llamado "resonancia de dispersión Mie". Por ejemplo un incremento en la dispersión Mie es observado comúnmente en células que se vuelven más redondeadas, debido a la acción de agentes citotóxicos (Bassan et al., 2009; Kohler & Sule-Suso, 2008; Pijanka et al., 2009).
USO DE LA FTIRM EN EL ESTUDIO DE SISTEMAS BIOLÓGICOS
Como se ha mencionado, esta técnica genera información de utilidad en el estudio de sistemas biológicos. Debido a la mejora en la tecnología aplicada, su uso se ha diversificado. Los experimentos con FTIRM se pueden clasificar, en función del tipo de muestra analizada en el estudio, en dos grupos: estudios de tejidos (cuadro 2) y estudios celulares (cuadro 3). En los estudios de tejidos no se obtienen imágenes con las posiciones espaciales de las células analizadas, sino que se lleva a cabo un análisis estadístico de las poblaciones celulares presentes en el tejido utilizado en el ensayo. Por otro lado, los estudios celulares tienen importantes implicaciones en la biomedicina, ya que además de evaluar el estado bioquímico de la célula, hace uso de imágenes observando la localización de moléculas de interés al interior de la misma, generando resultados de mayor precisión, los cuales son muy útiles en el estudio de vías bioquímicas e identificación de células.
En función de su objetivo, los estudios en células y tejidos podrían agruparse de la siguiente manera: i) Estudios que permiten detección de "huellas dactilares" bioquímicas y biomarcadores que permiten identificar células o tejidos con características específicas. ii) Caracterización química y estructural de una muestra en particular. iii) Identificación de variaciones bioquímicas presentes en dos o más condiciones. iv) Evolución de una ruta bioquímica. v) Mejoramiento de las capacidades metodológicas de la técnica.
Los estudios más prácticos realizados por medio de FTIRM son aquellos que buscan identificar biomarcadores o "huellas dactilares" bioquímicas; es decir, la identificación y reconocimiento de bandas espectrales específicas las cuales son constantes y corresponden a ciertas características únicas (Buriankova et al., 2010; Nakamura et al. , 2010), esta aplicación, es una clara herencia de uno de los usos más extendidos de la FTIR, que es la identificación cualitativa de compuestos: ha permitido el uso de la FTIRM para identificar células de distintos tipos (Nakamura et al., 2010) en distintas condiciones que van desde etapas celulares como la totipotencialidad y la apoptosis (Buriankova et al., 2010; Nakamura et al., 2010), enfermedad (Didonna et al., 2011) y daño celular (Gautam et al., 2012). Este tipo de análisis se usa principalmente para generar un proceso práctico y confiable que permita discriminar e identificar a una muestra específica. Mediante este tipo de estudios se han podido discriminar a levaduras pertenecientes a distintas cepas y especies, analizando los espectros FTIRM en su conjunto, obteniendo resultados confiables en un periodo inferior a las 24 horas, en comparación con los 5 días requeridos para realizar este análisis discriminatorio con un equipo FTIR convencional (Wenning et al., 2002). La identificación de "huellas dactilares" bioquímicas también ha permitido explorar los usos de la FTIRM como herramienta diagnóstica en la identificación de células cancerígenas (Bellisola & Sorio, 2012; Pijanka et al., 2010; Walsh et al., 2008).
También existen estudios orientados a dilucidar cuales son los componentes químicos y estructurales específicos de células y tejidos, estos estudios no solo permiten saber la composición química de un muestra y determinar la concentración y proporcionalidad de sus componentes, en ocasiones esta información es novedosa ya que existen células y tejidos los cuales no habían sido caracterizados químicamente, como se aprecia en los cuadros 2 y 3, en estos casos se buscan moléculas que son conocidas y características de las células o tejidos de interés. Los tejidos cartilaginosos han sido objeto de este tipo de estudios los cuales intentan determinar la composición y distribución de sus biomoléculas, observando el contenido y distribución del colágeno y proteoglicanos de la matriz extracelular en el tejido cartilaginoso bovino (Camacho et al., 2001) y en condrocitos individuales de tejido articular canino (Yin & Xia, 2011). El conocimiento estructural obtenido se puede considerar el primer paso para una mejor comprensión del tejido y el desarrollo de estudios posteriores para profundizar en el conocimiento de tejidos cartilaginosos, sus enfermedades y tratamientos (Camacho et al., 2001; Yin & Xia, 2011). Así mismo se han desarrollado estudios en tejido vegetal con la finalidad de conocer su estructura, composición química y su calidad nutricional. Por ejemplo, se ha cuantificado la cantidad de polisacáridos y proteínas presentes en granos de interés alimenticio, tales como trigo (Robert et al., 2010), cebada (Saulnier et al., 2009) y maíz (Walker et al., 2009). En estos estudios se ha encontrando que variaciones en las concentraciones relativas de polisacáridos y proteínas influyen en la digestión en el rumen de becerros, observando que a una mayor cantidad de proteínas existe una menor absorción de polisacáridos (Saulnier et al., 2009; Walker et al., 2009). El conocimiento estructural y de componentes químicos no solo se limita a biomoléculas, existen padecimientos clínicos en los cuales participan otros componentes como los minerales. Por lo que el análisis de su nivel de oxidación y localización en un tejido puede ayudar al diagnóstico oportuno y preciso de padecimientos tales como osteoporosis y calcificación ectópica hepática (Boskey et al., 2005; Dessombz et al., 2011). En casos de la desmineralización ósea la concentración y composición mineral permite determinar el grado de severidad con el cual se presenta una enfermedad como la osteoporosis (Boskey et al., 2005). Cuando la formación de cristales provoca daño a tejidos, el conocer la composición de los cristales presentes permite dilucidar la causa de su aparición y con ello poder generar tratamientos específicos (Dessombz et al., 2011).
Algunos de los estudios más novedosos realizados por medio de FTIRM son aquellos que nos permiten comparar el estado bioquímico de células o tejidos en dos o más condiciones distintas. A diferencia de los tipos de estudios mencionados anteriormente aquí se da un gran énfasis en las variaciones de bandas de absorción IR específicas y su relación con las diversas condiciones estudiadas (Gautam et al., 2012; Saulou et al., 2010). Las bandas de absorción de mayor interés son las que corresponden a los grupos funcionales que forman a las principales biomoléculas: proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos, siendo las proteínas de particular interés. Kowalskaa y Gadjab en el 2012 estudiaron la modificación en la proporción entre hélices-α y láminas-β en ateromas de un modelo murino ateroesclerótico provocado por cambios en la dieta utilizando un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina como suplemento en el alimento. El aumento en la banda de absorción correspondiente a las láminas-β también se ha visto relacionado con varios padecimientos neurodegenerativos tales como el Alzheimer (Leskovjan et al., 2009), mal de Parkinson (Szczerbowska-Boruchowska et al., 2007), enfermedad de Huntington (Bonda et al., 2011) y enfermedades priónicas espongiformes (Didonna et al., 2011; Kretlow et al., 2008). Modificaciones en el balance de estructuras secundarias se han relacionado con estados celulares como la apoptosis, en donde, en las fases iniciales del proceso, se ha observado un aumento en la proporción de proteínas con estructura de lámina-β (Buriankova et al., 2010; Chio-Srichan et al., 2008; Szczerbowska-Boruchowska et al., 2007). Los cambios que ocurren en el conjunto de enlaces amida normalmente se encuentran asociados a variaciones en la concentración de proteína total o de algunas proteínas específicas de la muestra, debido principalmente a procesos de desnaturalización proteica (Chwiej et al., 2010; Croxford et al., 2011; Magne et al., 2001) o a mecanismos de sustitución proteica como en el caso de la mineralización ósea, proceso que cambia la composición del tejido óseo, con un contenido proteico que disminuye conforme el hueso madura, hasta la mineralización completa del tejido (Boskey et al., 2005; Fuchs et al., 2008)
El análisis correspondiente a los lípidos se encuentra ligado al seguimiento del metabolismo lipídico, en particular al proceso de peroxidación lipídica el cual es un indicador del estrés oxidativo y la presencia de especies reactivas de oxígeno (Bonda et al., 2011; Cakmak et al., 2012; Chwiej et al., 2010; Dulinska et al., 2012). Existen distintas bandas de absorción que pueden ayudar al análisis de la peroxidación lipídica, entre las que se encuentran las bandas de 2958 cm-1 a 2921 cm-1 (Chwiej et al., 2010) y 3012 cm1 (Cakmak et al., 2012). El proceso de peroxidación lipídica ha sido observado en tejidos ateroescleróticos (Kowalskaa & Gajdab, 2012), tejido cancerígeno (Chwiej et al., 2010), tejido con daño tisular por radiación ionizante (Cakmak et al. , 2012), tejido con daño hepático (Gautam et al., 2012) y con daño neurológico (Dulinska et al., 2012).
El análisis de las números de onda correspondientes a los carbohidratos y ácidos nucleicos normalmente es usado para la cuantificación de dichas moléculas. Variaciones de estas biomoléculas normalmente se encuentran asociadas al tipo de muestra analizada, y también pueden deberse a la pérdida o fragmentación de las mismas. Como se había mencionado anteriormente las cuantificaciones de polisacáridos de membrana son importantes para determinar el valor nutricio de una semilla como trigo (Robert et al., 2010), cebada (Saulnier et al., 2009) y maíz (Walker et al., 2009). Kerr y colaboradores en el 2013 pudieron evaluar la pérdida de carbohidratos en la hoja de E. camaldulensis durante el proceso de putrefacción vegetal. Además se han estudiado carbohidratos en combinación con proteínas; observando la perdida de proteoglicanos en matriz extracelulares, por acción de anticuerpos inductores de artritis reumatoide en ratones (Croxford et al. , 2011). Szczerbowska-Boruchowska y colaboradores en el 2007 asociaron la pérdida de material genético al daño sufrido por degradación y que al parecer se encuentra ligado a la desnaturalización de proteínas y oxidación de lípidos en la substantia nigra en casos de enfermedad de Parkinson.
A pesar de que la mayoría de los estudios se han limitado a observar condiciones puntuales, existen algunos estudios cinéticos, donde se ha llevado a cabo el seguimiento de señales específicas asociadas a distintos procesos bioquímicos por periodos temporales extendidos, tal es el caso de los estudios de procesos de mineralización ósea (Cuadro 2) (Boskey et al., 2005; Fuchs et al., 2008; Magne et al., 2001), donde se estudiaron las concentraciones de grupos fosfato y carbonato a lo largo del tiempo. También se han estudiado procesos neurodegenerativos en los cuales el principal indicador al que se le da seguimiento, es la concentración de láminas-β en distintas etapas de un padecimiento (Kretlow et al., 2008). También se han realizado este tipo de estudios en plantas, en donde se ha analizado el proceso de descomposición del follaje en presencia de hongos, monitorean-do las bandas correspondientes a la amida I, a los carbohidratos y a la lignina (1530 cm-1 a 1480 cm-1) (Kerr et al., 2013).
Por último, existen diversos estudios que tienen por finalidad ampliar los conocimientos relacionados a la técnica, así como encontrar soluciones a problemas que aquejan a la FTIRM. Uno de los temas de mayor interés es el fenómeno de dispersión Mie. Ahora se sabe que el fenómeno de dispersión Mie puede generar una resonancia provocando otros artefactos de dispersión que se pensaban ajenos al fenómeno Mie, también se descubrió que el fenómeno de dispersión no solo está asociado a los bordes celulares, sino que es generado en buena medida por pequeños componentes celulares tales como el núcleo (Bassan et al. , 2009) y que la dispersión generada por el núcleo genera espectros de IR totalmente distintos al de toda la célula en su conjunto (Pijanka et al. , 2009). Este conocimiento ha permitido desarrollar estrategias adecuadas para poder separar la información generada por cambios bioquímicos de aquellos generados por fenómenos físicos por medio de soluciones matemáticas como es el caso del algoritmo RMieS-EMSC (Bassan et al., 2010; Hughes et al., 2010). También se han llevado a cabo estudios para observar las ventajas y desventajas de distintos métodos de fijación, los cuales han sugerido el uso de formalina como agente fijador es el más recomendable para los estudios realizados con FTIRM (Gazi et al., 2005).
La FTIRM pasó de ser una técnica con muchas limitaciones en sus inicios, para el estudio de sistemas biológicos, a una técnica que no se limita a corroborar la información experimental obtenida por otras técnicas, pero también se ha posicionado como una herramienta robusta que ha permitido el desarrollo de nuevas investigaciones. Como se ha podido observar, el uso de esta técnica para el estudio de sistemas biológicos es muy amplio, debido a su alta sensibilidad permite obtener información detallada de lo que ocurre con el estado bioquímico de células y tejidos bajo distintas condiciones, esto le permite la plasticidad suficiente para cumplir funciones desde herramienta diagnóstica y de identificación, hasta ayudarnos a dilucidar lo que ocurre en un proceso bioquímico específico a manera de estudio de punto final o en seguimiento a lo largo del tiempo. Gracias a ella podemos rastrear una multitud de moléculas sin necesidad de usar marcadores específicos, además el uso de una radiación no ionizante y por lo tanto, no destructiva, permite estudios en tiempo real con los que observamos el cambio de propiedades moleculares en el momento en que ocurren, y cómo éstos se relacionan con las distintas condiciones estudiadas.
La utilización de la fuente de sincrotrón le ha permitido superar las limitantes de resolución inherentes a la técnica FTIRM con fuente convencional (p. ej. globar), la cual se enfrenta a problemas tales como la baja calidad señal/ruido. Sin embargo, el costo de llevar a cabo este tipo de experimentos con una fuente de sincrotrón aún es muy elevado, debido a los costos de mantenimiento y operación de las instalaciones utilizadas, a pesar de que con el paso del tiempo estos se han vuelto más prácticos. Los resultados obtenidos no son fáciles de procesar ya que son una representación de todas las moléculas presentes en la muestra, la presencia de ruido en la señal y distintos artefactos (fenómeno de dispersión Mie), que, a pesar del desarrollo de herramientas matemáticas para el manejo de datos, aun representan problemas en la interpretación de los mismos. Todas estas ventajas y desventajas generan una técnica que aún se encuentra en constante crecimiento y evolución, generando nuevos estudios, aplicaciones, mejorando y optimizando los equipos y materiales utilizados, así como las técnicas para el análisis de datos. Por lo que sin duda es una técnica que vale la pena tomar en cuenta cuando se piense realizar cualquier nueva investigación que requiera del estudio de muestras biológicas.
Los autores agradecen a CONACYT, México (CB-2011-01-167932 y CB-2011-01-167164) por el financiamiento económico. Guillermo Barraza-Garza. Agradece a CONACYT (225974) por la beca para realizar sus estudios de Doctorado en Ciencias Químico Biológicas. Se agradece a M. en C. Alejandra Vargas Caraveo por la colaboración en la obtención de la figura 2.
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