Source: https://www.boe.es/diario_boe/txt.php?id=BOE-A-1997-3979
Timestamp: 2019-03-18 23:38:36+00:00

Document:
BOE.es - Documento BOE-A-1997-3979
Documento BOE-A-1997-3979
Real Decreto 138/1997, de 31 de enero, por el que se modifica parte de los anexos del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces.
«BOE» núm. 48, de 25 de febrero de 1997, páginas 6251 a 6256 (6 págs.)
BOE-A-1997-3979
https://www.boe.es/eli/es/rd/1997/01/31/138
El Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces, transpone al ordenamiento jurídico interno la Directiva 93/53/CEE, del Consejo, e incorpora en su anexo F la Decisión 92/532/CEE, que establece los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces.
Después de la adopción de la citada Decisión, se han producido nuevos avances prácticos y científicos que requieren una actualización de los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico. Dicha actualización afecta al tamaño de las muestras, las muestras que han de tomarse, el transporte de las mismas y el método de aislamiento de los virus que puedan presentarse en ellas.
Teniendo en cuenta la necesidad de proceder a realizar la citada actualización, se adoptó la Decisión 96/240/CE, de la Comisión, de 5 de febrero, que modifica la Decisión 92/532/CEE, por la que se establecen los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces, habiendo consultado para ello al Comité científico veterinario y ajustándose al dictamen del Comité veterinario permanente.
Por ello, la presente disposición se dicta para modificar el anexo F del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, en el que se recogía lo dispuesto en la Decisión 92/532/CEE, modificada por la Decisión 96/240/CE.
El presente Real Decreto se dicta de acuerdo con lo dispuesto en el artículo 149.1.16.ª de la Constitución, por el que se atribuye al Estado la competencia exclusiva en materia de bases y coordinación general de la sanidad.
En su virtud, a propuesta de la Ministra de Agricultura, Pesca y Alimentación, de acuerdo con el Consejo de Estado y previa deliberación del Consejo de Ministros en su reunión del día 31 de enero de 1997,
El anexo F del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, por el que se establecen las medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces, se sustituirá por el anexo del presente Real Decreto.
La disposición final primera del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio, se sustituye por la siguiente:
Se faculta a la Ministra de Agricultura, Pesca y Alimentación para dictar, en el ámbito de sus competencias, las disposiciones necesarias para el desarrollo del presente Real Decreto y, en particular, para efectuar las adaptaciones de los anexos a las modificaciones que introduzca la normativa comunitaria.»
Procedimientos de muestreo y de análisis
para el control de la SHV y la NHI
3. Preparación y envío de muestras de peces.-Antes de su envío o traslado al laboratorio, se extraerán de los peces partes de los órganos que deban examinarse, con tijeras y pinzas estériles, y se introducirán en tubos de plástico que contengan medio de transporte, es decir, medio de cultivo celular con un 10 por 100 de suero de ternera y antibióticos. Puede recomendarse la combinación de 200 UI de penicilina, a 200 lg de estreptomicina y 200 lg de kanamicina por ml, aunque podrán utilizarse asimismo otros antibióticos de eficacia probada. Los tejidos que se examinarán serán el bazo, la parte anterior del riñón y/o bien el corazón o el encéfalo. En algunas ocasiones, deberá examinarse fluido ovárico (cuadro I).
Los tubos se colocarán en recipientes aislados (por ejemplo, cajas de poliestireno de paredes gruesas) con una cantidad suficiente de hielo o de «bloques congelados» para garantizar la refrigeración de las muestras a una temperatura comprendida entre 0 y 5 ºC durante su traslado al laboratorio. Se evitará la congelación. La temperatura de la muestras durante el transporte nunca deberá exceder de 10 ºC y en el momento de la recepción todavía deberá haber hielo en el recipiente de transporte.
II. Preparación de las muestras para el examen
En caso de que surjan dificultades prácticas (por ejemplo, avería de la incubadora, problemas con los cultivos celulares, etc.) que impidan inocular las células en las cuarenta y ocho horas siguientes a la recogida de las muestras de tejidos, se podrá congelar el sobrenadante a -80 ºC y realizar el examen virológico en un plazo de catorce días.
Para cada dilución y cada línea celular se empleará al menos un área celular de 2 cm aproximadamente, correspondiente a un pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Se recomienda el uso de placas de cultivo celular, aunque también son aceptables otras unidades con áreas de cultivo similares o mayores.
2. Neutralización.-Se eliminarán las células del medio recogido mediante centrifugación (20004000 x g) o por filtración con filtros de membrana (0,45 lm) y se diluirá el medio a 1:100 y 1:10000 en un medio de cultivo celular.
De cada mezcla de suero y virus, se inocularán al menos dos cultivos celulares con 50 ll cada uno, y se incubarán a 15 ºC.
Los cultivos teñidos se prepararán utilizando solución salina de glicerol y se examinarán con luz ultravioleta incidente, utilizando oculares de 10 x o 12 x y objetivos de 25 x o 40 x con aperturas numéricas T 0,7 y T 1,3 respectivamente.
4. Prueba de inmunoabsorción enzimática (ELISA).-Los pocillos, de las placas de microtitulación (por ejemplo, inmunoplacas-Nunc, Maxisorp, Nunc, Dinamarca) se recubrirán durante una noche con las diluciones recomendadas de fracciones inmunoglobulínicas purificadas de proteína A de anticuerpos de calidad de referencia.
Tras aclarar los pocillos con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se incorporará a los pocillos el virus que se desee identificar en fases de dilución dobles o cuádruples y se dejará reaccionar con el anticuerpo de recubrimiento durante sesenta minutos a 37 ºC. Tras el aclarado con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se añadirán anticuerpos con biotinil de la especificidad correspondiente a la de los anticuerpos de recubrimiento y se dejará reaccionar durante sesenta minutos a 20 ºC. Después de efectuar otro aclarado como el anterior, se añadirá estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y se dejará reaccionar durante una hora a 20 ºC. Tras efectuar un último aclarado, se visualizará la enzima ligada utilizando sustratos ELISA adecuados (OPD u otros).
clínicas anuales:
años 1 y 2 / Peces en crecimiento:
número de peces utilizados
de órganos: años 1 y 2 / Reproductores: Número
de peces utilizados
para el análisis de fluido
ovárico: años 1 y 2
Zonas continentales:
a) Explotaciones con reproductores / 2 / 120 (1.ª inspección) (*) / 30 (1.ª inspección)
150 (2.ª inspección) / 150
b) Explotaciones con reproductores únicamente / 2 / 120 / 150 (1.ª ó 2.ª inspección)
c) Explotaciones sin reproductores / 2 / 150 (1.ª y 2.ª inspección) / 150
a) Explotaciones de salmónidos sin reproductores. / 2 / 130 (1.ª y 2.ª inspección) / 150
b) Explotaciones de no salmónidos sin reproductores. / 2 / 150 (1.ª y 2.ª inspección) / 150
c) Explotaciones con reproductores / 2 / 120 (1.ª inspección) / 530 (1.ª inspección)
años 3 y 4 / Número de peces utilizados
para el análisis de órganos:
años 3 y 4 / Reproductores: Número
ovárico: años 3 y 4
a) Explotaciones con reproductores / 2 / 120 (1.ª ó 2.ª inspección) / 10 (1.ª ó 2.ª inspección)
b) Explotaciones con reproductores únicamente / 2 / 120 / 30 (1.ª ó 2.ª inspección)
c) Explotaciones sin reproductores / 2 / 130 (1.ª ó 2.ª inspección) / 150
a) Explotaciones sin reproductores / 2 / 130 (1.ª ó 2.ª inspección) / 150
b) Explotaciones con reproductores / 2 / 120 (1.ª ó 2.ª inspección) / 510 (1.ª ó 2.ª inspección)
(*) Inspecciones clínicas.
Peces en crecimiento:
de órganos (1) / Número
clínicas anuales / Reproductores: Número
ovárico (1)
a) Explotaciones con reproductores / 2 / 20 (1.ª ó 2.ª inspección) / 10 (1.ª ó 2.ª inspección) (2)
b) Explotaciones con reproductores únicamente / 2 / 20 / 30 (1.ª ó 2.ª inspección) (2)
c) Explotaciones sin reproductores / 2 / 30 (1.ª y 2.ª inspección) / 50
a) Explotaciones sin reproductores / 1 / 30 (3) / 50
b) Explotaciones con reproductores / 2 / 20 (1.ª ó 2.ª inspección) / 10 (1.ª ó 2.ª inspección) (2)
(1) Las muestras sólo deberán ser recogidas rotativamente en un 50 por 100 cada año de las explotaciones piscícolas de la zona.
(2) En circunstancias excepcionales, si es imposible obtener fluido ovárico, se deberá tomar muestras de los órganos.
(3) Las muestras deberán haberse recogido a más tardar tres semanas después de haber trasladado los peces de agua dulce a agua salada.
Procedimientos de diagnóstico para la confirmación de la NHI y de la SHV en caso de brotes sospechosos
II.A Aislamiento convencional del virus y posterior
II.A.I.1 Selección de muestras.-Para el análisis se seleccionarán como mínimo 10 peces que muestren los síntomas típicos de la NHI o de la SHV.
II.A.I.2 Preparación y envío de muestras de peces.-Procédase del modo indicado en el apartado I.I.3.
II.A.I.3 Recogida de material suplementario para diagnóstico.-Procédase del modo indicado en el apartado I.I.4.
II.A.II Preparación de las muestras para el examen virológico.-Procédase del modo indicado en el apartado I.II.
II.A.III Examen virológico.-Procédase del modo indicado en el apartado I.III, salvo que podrán usarse bien células BF-2 o RTG-2 y células EPC o FHM para la inoculación con tejidos.
II.A.IV Identificación del virus.-Procédase del modo indicado en el apartado I.I.IV.
II.B Aislamiento e identificación serológica simultánea del virus
II.B.I.1 Selección de muestras.-Procédase del modo indicado en el apartado II.A.I.1.
II.B.I.2 Preparación y envío de muestras de peces.-Procédase del modo indicado en el apartado I.I.3.
II.B.I.3 Recogida de material suplementario para diagnóstico.-Procédase del modo indicado en el apartado I.I.4.
II.B.II.1 Homogeneización de los órganos.-Procédase del modo indicado en el apartado I.II.1.
II.B.II.2 Centrifugación del homogeneizado.-Procédase del modo indicado en el apartado I.II.2.
II.B.II.3 Tratamiento del sobrenadante con antisueros para diagnóstico.-La suspensión del órgano tratada con antibióticos y antisuero anti-virus de NPI se diluirá a 1:10 y 1:10000 en un medio de cultivo celular, las alícuotas se mezclarán a partes iguales con los reactivos enumerados en el apartado I.IV.2 y se incubarán durante sesenta minutos a 15 ºC.
II.B.III.1 Cultivos y medios celulares.-Se cultivarán las células BF-2 o RTG-2 y EPC o FHM a una temperatura comprendida entre 20 y 30 ºC en un medio adecuado, por ejemplo, MEM de Eagle (o sus modificaciones) con adición de un 10 por 100 de suero vacuno fetal y antibióticos en concentraciones normales.
II.B.III.2 Inoculación de los cultivos celulares.-De cada mezcla de suero y virus (preparada del modo indicado en el apartado II.B.II.3), se inocularán al menos dos cultivos celulares por línea celular con 50 ll cada uno.
II.B.III.3 Inoculación de los cultivos celulares.-Procédase del modo indicado en el apartado I.III.3.
II.B.III.4 Microscopía.-Se observarán diariamente a unos 40 aumentos los cultivos celulares inoculados para comprobar si se han reproducido ECP. Si se han logrado evitar la aparición de ECP gracias a alguno de los antisueros utilizados, el virus podrá considerarse identificado.
II.B.III.5 Subcultivos.-Si no se han observado ECP después de siete días, se realizarán subcultivos a partir de los cultivos inoculados con sobrenadante y medio (II.B.II.3) con arreglo al apartado I.III.5.
II.C Otras técnicas de diagnóstico
= / fibroblasto de «Leponis macrochirus» (línea celular).
= / efectos citopatogénicos.
= / prueba de inmunoabsorción enzimática.
= / «Epithelioma papulosum cyprini» (línea celular).
= / «Pimephales promeles» (línea celular).
= / isotiocianato de fluoresceína.
= / peroxidasa de rábano.
= / inmunofluorescencia.
= / prueba de fluorescencia indirecta para la detección de anticuerpos.
= / medio mínimo fundamental.
= / necrosis hematopoyética infecciosa.
= / necrosis pancreática infecciosa.
= / orto-fenilendiamina.
= / solución salina amortiguadora fosfatada.
= / gónadas de trucha arco iris (línea celular).
= / septicemia hemorrágica viral.
Tris HCI
= / Tris (hidroximetil) aminometano-HCI.
Esta norma se entiende implícitamente derogada por el Real Decreto 1614/2008, de 3 de octubre, (Ref. BOE-A-2008-16090).
SUSTITUYE el Anexo F) y modifica la disposición final primera del Real Decreto 1488/1994, de 1 de julio (Ref. BOE-A-1994-20802).
DE CONFORMIDAD con la Decisión 96/240/CE, de 5 de febrero (Ref. DOUE-L-1996-80430).
Directiva 93/53/CEE, de 24 de junio (Ref. DOUE-L-1993-81152).
Decisión 92/532/CEE, de 19 de noviembre (Ref. DOUE-L-1992-81874).
en Anexo Directiva 91/67/CEE, de 28 de enero (Ref. DOUE-L-1991-80142).

References: Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 artículo 149
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto