Source: https://www.slideshare.net/ruth1992/quimica-analitica-12906272
Timestamp: 2017-06-28 16:43:04+00:00

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CROMATOGRAFÍA by Marco Vinicio Rob...
by sequeraclaudia
at Consultorio Veterinario "Riveros"
Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química Química Analítica Instrumental II Técnicas Cromatográficas Diciembre de 2007 2.
Introducción a los métodos de separaciónCapítulo 1.Introducción a los métodos de separación1.1 Introducción a la cromatografía En 1906, el botánico Ruso M. Tswett realizó un experimento que condujo al descubrimiento de loque hoy conocemos como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la partesuperior de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio (CaCO3). Al agregar éter, observó que lamezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que descendían a través de la columna adiferentes velocidades. Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases; dispuestas de tal maneraque mientras una permanece estacionaria dentro del sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lolargo de él (fase móvil). La clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que semueve cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de distribución). En elexperimento de Tswett, la separación de los pigmentos vegetales se logró gracias a que cada uno deellos tenía una afinidad diferente por las fases. En general, los componentes más afines a la faseestacionaria avanzan lentamente (más retenidos) mientras que los más afines a la fase móvil (menosretenidos) se mueven con mayor rapidez. Por consecuencia, el medio cromatográfico (columna, placa opapel) funciona como un controlador de la velocidad de cada sustancia que constituye la mezcla,logrando así su separación y mediante el uso de un detector, su caracterización química.Aunque los principios fundamentales son los mismos, se acostumbra clasificar los métodoscromatográficos según el estado físico de la fase móvil:Cromatografía líquida. La fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes y la fase estacionaria unsólido que interactúa con las sustancias que se desea separar (cromatografía líquido-sólido), o bien unlíquido inmiscible con la fase móvil, depositado en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido). Esta forma de cromatografía puede realizarse con diferentes arreglos experimentales: encolumna, en capa delgada o en papel. En el primer caso, la fase estacionaria se encuentra rellenando untubo; en el segundo, se dispersa sobre una lámina de vidrio o aluminio formando un lecho de espesoruniforme; en la cromatografía en papel, la fase estacionaria es la solución acuosa contenida en el interiorde las celdas formadas por las fibras de la celulosa, y es por tanto una forma de cromatografía líquido-líquido.Capítulo 1 1 3.
Introducción a los métodos de separaciónCromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas inerte (helio o nitrógeno) y la faseestacionaria es un sólido (cromatografía gas-sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte(cromatografía gas-líquido). Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la únicamanera de que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La columnapuede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la cromatografía líquida, o bien la faseestacionaria puede depositarse sobre las paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo(hasta 100m). Este tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayorcapacidad de separación. De acuerdo con el mecanismo de retención, la cromatografía se puedeclasificar en los siguientes tipos:  adsorción (normal, de fase reversa)  permeación sobre gel  partición líquido-líquido  de afinidad  intercambio iónicoLas áreas de aplicación son muy diversas y abarcan prácticamente todas las actividades en las queinterviene la química, por ejemplo: se emplea en:El análisis de drogas y fármacos en fluidos biológicos como la saliva, la sangre, la orina;Seguir la transformación de las sustancias responsables de la transmisión neurológica;Determinar la presencia de contaminantes en el medio ambiente;Descifrar la composición de los combustibles fósiles;Realizar el control de calidad de los productos químicos y farmacéuticos manufacturados; en fin, la listade ejemplos es interminable.1.2 Cromatografía en papel La cromatografía en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisiscualitativos ya que pese a no ser una técnica potente no requiere de ningún tipo de equipamiento. Lafase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita enun extremo colocando pequeñas gotas de la disolución y evaporando el disolvente. Luego el disolventeempleado como fase móvil se hace ascender por capilaridad. La separación se realiza en función de laafinidad de los solutos con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca del punto donde seaplicó la muestra, y las menos solubles en agua y más solubles en el disolvente llegarán más lejos. Lassustancias separadas se identifican mediante diversos procedimientos físicos o químicosCapítulo 1 2 4.
Introducción a los métodos de separación La cromatografía en papel es una técnica utilizada para análisis inorgánico cualitativo, permite llevara cabo la separación e identificación de iones, trabajando con cantidades mínimas de sustancia.Pertenece al tipo de “Cromatografía de partición” se fundamenta en que las sustancias problema,pueden tener diferentes coeficientes de reparto en dos disolventes de inmiscibilidad limitada, unopermanece fijo en la superficie del papel “fase estacionaria” generalmente en agua, la fase móvilconstituida generalmente por una mezcla de disolventes parcialmente miscibles en ella. Hay varios tiposde cromatografía, la ascendente (papel hacia arriba), descendente (papel invertido), radial y deseparación de zonas y sectores. Al entrar en contacto con los disolventes empieza su fase de movilidad lo que produce unasmanchas características sobre el papel, generalmente, estas no son coloreadas y se revelan con unalámpara fluorescente, los contornos se marcan con lápiz. Como medida en cromatografía sobre papel seemplea el Rf (Retention factor), el cual se define como el cociente de dividir el recorrido de la sustanciapor el disolvente, esto es, la distancia media desde el origen hasta el centro de la mancha (X) dividida porla distancia que media desde el origen hasta el frente del disolvente (S). 𝑋 𝑅𝑓 = 𝑆 [1] En la cromatografía en papel se utiliza como fase estacionaria una hoja de papel de celulosa deelevada pureza recubierta de una capa de agua asociada a las fibras de celulosa. La fase móvil, en la queirá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige en función de los componentesque se pretenden separar.1.3 Cromatografía en capa fina La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de unadsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, unadsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro paraCapítulo 1 3 5.
Introducción a los métodos de separaciónaplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es precisotambién poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será uncomponente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma quelos componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodoscromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa) ya que el utillaje que precisa es más simple. Eltiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separación esgeneralmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían elcromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que seaun método adecuado para fines analíticos. Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas deladsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también sele puede añadir un adherente.En la elección del eluyente influyen varios factores:  Precio.  No utilizar compuestos muy volátiles.  Pureza.  Evitar que contengan trazas de metales  No utilizar mezclas de eluyentes (catalizadores). (reproducibilidad).La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del componente yprobar con eluyentes cada vez menos polares.Capítulo 1 4 6.
Introducción a los métodos de separación Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados conlos componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempocon lo que es conveniente señalar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con loscomponentes orgánicos produciendo manchas negras. Sin embargo debe tenerse en cuenta que eltamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de componente separado.1.4 Cromatografía de permeación en gel La cromatografía de permeación en gel, también conocida como cromatografía de exclusión esuna variante de la CLAE que consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que laspartículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el fin deque las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y no en el pesomolecular. Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y sonarrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de “camade vacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porquetiene más espacio de columna que recorrer debido a un fenómeno de difusión hacía los poros que tienenaccesibles. Las moléculas de tamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a lacantidad de poros por los que puedan pasar.Empaquetamientos de columna. Existen distintos tipos de empacamientos columna. Entre ellos estánlos polímeros macromoleculares semirígidos, los entrecruzados, las sílices rígidas ó las de “porocontrolado”. Los materiales semirígidos se hinchan ligeramente se debe tener cierto cuidado en su usoya que se limitan a una presión de 300psi. Las cuentas de poliestireno parcialmente sulfonado que tienenun tamaño usual de 5µm, son buenas para usarse con sistemas acuosos mientras los no sulfonados soncompatibles con sistemas no acosos.Capítulo 1 5 7.
Introducción a los métodos de separaciónOtro tipo de empacamiento hidrofílico poroso es preparado mediante una polimerización porsuspensión de metacrilato de 2-hidroxietilo con dimetacrilato de etileno. Estos empacamientos resistenpresiones de hasta 3000psi y pueden ser usados con sistemas acuosos y una amplia gama de disolventesorgánicos polares.Disolventes. La cromatografía de exclusión requiere un solo disolvente durante el análisis en el cual sepueda disolver la muestra. El único inconveniente que pude presentarse con los disolventes es larelación de viscosidades. Cuando la viscosidad de la muestra inyectada difiere mucho con la viscosidadde la fase móvil se pueden dar, una distorsión en los picos cromatográficos y cambios anómalos en lostiempos de retención.1.5 Cromatografía de exclusión de iones Una variante de la cromatografía de permeación en gel o cromatografía de exclusión, es cuandose realiza para la exclusión de iones. Mediante esta modificación, se tienen separaciones que dependende factores como tamaño de partícula de la resina, forma iónica e incluso distribución de isómeros. Estopermite separar especies que de otra forma eluirían al mismo tiempo. Las separaciones se llevan a caboen resinas de intercambio con base en poliestireno de alta capacidad como eluyentes, ácidos mineralesdiluidos. Mucho del trabajo en la industria de alimentos y bebidas (vino, cerveza, jugo de frutas, etc.) o demuestras fisiológicas en donde la mayoría de los ácidos del ciclo de Krebs están presentes, puede serhecho fácilmente mediante el uso de una columna de exclusión aniónica. El uso de las columnas deexclusión aniónica, en su modalidad con iones de calcio, se extiende a la separación de oligosacáridosusando agua como eluyente a una temperatura de 90ºC, aplicando también la separación por exclusiónestérica.1.6 Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico se lleva a cabo con empaques de columna que tienegrupos funcionales cargados unidos a una matriz polimérica. Los grupos funcionales enlazadospermanentemente y asociados con contraiones de carga opuesta. El mecanismo de retención máscomún es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase móvil con el grupo cargado de lafase estacionaria. En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catiónicas.Los más comunes son los sulfónicos, los cuales son fuertemente ácidos y tiene las propiedades de losCapítulo 1 6 8.
Introducción a los métodos de separaciónácidos fuertes cuando está en la forma H. los empaques cargados positivamente se utilizan para elintercambio con especies aniónicas. Los más comunes son las aminas cuaternarias, las cuales sonfuertemente básicas y en su forma OH presentan las propiedades de una base fuerte. Ambos gruposfuncionales están totalmente disociados. Así, sus propiedades de intercambio son independientes del pHde la fase móvil. La cromatografía de intercambio iónico puede efectuarse con alguno de los varios tipos deempaques. El tipo pelicular consiste en un recubrimiento de resina, alrededor de 1-2m de espesor,sobre una cuenta de vidrio con diámetro de 30-40m. Las resinas superficialmente porosas se obtienenrecubriendo cuentas de vidrio con un lecho delgado de microesferas de sílice en el que se impregna oenlaza un intercambiador de iones. Para ambos tipos de empaques la capacidad de intercambio es baja:0.01- 0.1 meq/g.El intercambiador puede también estar enlazado a macropartículas de sílice por medio de reacciones desililación o polimerizado dentro de los poros de un gel suficientemente poroso.El proceso primario en la cromatografía de intercambio iónico involucra la adsorción/desorción demateriales iónicos cargados en la fase móvil con una fase estacionara permanentemente cargadas (designo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en contacto con una soluciónque contiene iones K+, existe un equilibrio: resina, H + K+ resina, K+ + H+Las diferencias de retención están gobernadas esencialmente por las propiedades físicas de los ionessolvatados. La fase de resina presenta preferencia por: 1. El ion de carga mayor. 2. El ion con menor radio solvatado. 3. El ion que tenga mayor polarizabilidad.Aplicaciones de intercambio catiónico:Los cationes inorgánicos se pueden determinar en alimentos, tales como los alimentos dietéticos bajosen sodio, y en muestras de orina.Aplicaciones de intercambio aniónico:Se pueden separar los ácidos HCN, carbónico, silícico y bórico de los ácidos fosfórico, sulfúrico yclorhídrico. Los metales que forman complejos cloruro y floruro.Capítulo 1 7 9.
Introducción a los métodos de separación1.7 Cromatografía de fluidos supercríticos La temperatura crítica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no puede existiren la fase líquida independientemente de la presión. La presión crítica es la presión de vapor de unasustancia a su temperatura crítica. Una sustancia a temperaturas y presiones por encima de sutemperatura y de su presión crítica (punto crítico) se denomina fluido supercrítico.Los fluidos supercríticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que son intermedias entrelas características de esa sustancia en estado gaseoso y en estado líquido.Comparación de las propiedades de los fluidos supercríticos con las de gases y líquidos. (Los datos sóloindican el grado de magnitud). GAS FLUIDO SUPERCRÍTICO LÍQUIDO Densidad (g/cm3) (0,6-2)*10-3 0,2- 0,5 0,6- 2 Coeficiente de difusión (cm2/s) (1-4) * 10-1 10-3 – 10-4 (0,2 – 2)* 10-5 Viscosidad (g cm-1 s-1) (1-3)* 10-4 (1-3) * 10-4 (0,2- 3)* 10-2 Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la cromatografía de gases,líquidos y fluidos supercríticos, así como la extracción de fluidos supercríticos. Una propiedad importantede los fluidos supercríticos, que está relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es sunotable capacidad para disolver moléculas grandes no volátiles. Por ejemplo, el dióxido de carbonosupercrítico disuelve fácilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30 átomos de carbono. Una segundapropiedad notable de los fluidos supercríticos es que los analitos disueltos en ellos pueden serfácilmente recuperados por el procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con laatmósfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos supercríticos es que sonbaratos, inocuos y no son sustancias tóxicas, por lo que se pueden dejar evaporar libremente en laatmósfera sin efectos ambientales dañinos. La cromatografía de fluidos supercríticos (SFC) es una modalidad híbrida entre la cromatografíade gases y de líquidos que combina algunas características de cada una de ellas. Esta técnica es una delos tres tipos importantes de cromatografía en columna, ésta permite la separación y determinación decompuestos que no son manipulados ni por la cromatografía de gases ni por la de líquidos: compuestosno volátiles o térmicamente lábiles para los que la cromatografía de gases es inaplicable y (2) losCapítulo 1 8 10.
Introducción a los métodos de separacióncompuestos que tienen grupos funcionales que no son detectables por las técnicas espectroscópicas oelectroquímicas empleadas en cromatografía de líquidos. Los equipos instrumentales para la cromatografía de fluidos supercríticos son bastante parecidosen lo referente a los componentes instrumentales a los equipos de HPLC. Existen, sin embargo, dosdiferencias importantes: (1) Es necesario un horno, similar para mantener la columna termostatizada yademás proporcionar un control preciso de la temperatura de la fase móvil; (2) un restrictor o undispositivo de contrapresión, que se utiliza para mantener la presión en la columna en el nivel deseado ypara convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un gas, y arrastrarlo al detector. Las variaciones de presión en cromatografía de fluidos supercríticos tienen un efecto muymarcado sobre el factor retención o de capacidad, k’. Este efecto es una consecuencia del incremento dela densidad de la fase móvil a medida que aumenta la presión. Tal incremento de la densidad origina unaumento de la capacidad disolvente de la fase móvil, lo cual acorta los tiempos de elución. La mayoría delos perfiles de presión utilizados en cromatografía de fluidos supercríticos son: presión constante(isobárica) para un período de tiempo dado seguida de un aumento lineal o asintótico de la presión hastaalcanzar el valor de la presión final.Fases estacionarias. En SFC se emplean tanto las columnas abiertas como las columnas rellenas, aunquelas primeras son las más empleadas. Las columnas abiertas son similares a las columnas de sílice fundidacon recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos enlazados y de enlaces cruzados. Las columnastienen una longitud de 10 a 20 m y un diámetro interno de 0,05 a 0.10 mm. El espesor de la película varíaentre 0.05 1 micrómetro.Fases móviles. La fase móvil más utilizada en SFC es el CO2. Es un disolvente excelente par un conjunto demoléculas orgánicas no polares. Además, es una sustancia transparente en el ultravioleta, es colora, notóxica, fácilmente disponible y muy barata cuando se compara con otras fases móviles cromatográficas.La temperatura crítica del CO2 ES 31° C y su presión crítica 72,9 atmósferas, lo cual permite jugar con unabanda amplia de temperaturas y presiones sin superar las condiciones de operación de un equipo deHPLC moderno. Sustancias como etano, butano, óxido nitroso, diclorodifluorometano, éter dietílico,amoníaco y tetrahidrofurano han sido utilizadas como fases móviles de cromatografía de fluidossupercríticos.Detectores. La principal ventaja de la SFC frente al HPLC es que se pueden utilizar como en lacromatografía de gases, detectores de ionización de llama. Este detector es de respuesta universal acompuestos orgánicos, de elevada sensibilidad. Los espectrómetros de masas también se puedenCapítulo 1 9 11.
Introducción a los métodos de separaciónadaptar como detectores más fácilmente para SFC que para HPLC. Otros detectores utilizados son deabsorción en el ultravioleta y en el infrarrojo, de emisión de fluorescencia, termoiónico y fotométrico dellama. La cromatografía de fluidos supercríticos se ha aplicado a la separación de un amplio conjunto desustancias, entre los que se cuentan productos naturales, fármacos, alimentos, pesticidas y herbicidas,tensoactivos, polímeros, aditivos de polímeros, combustibles fósiles y explosivos y propelentes.1.8 Cromatografía de afinidad La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad defijación de ligandos. Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porqueestán unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener unaestructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentesdisociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida.Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos,esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). Cuando lasproteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con soluciónque contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmentepor el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible,se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modificanlas características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína paracontinuar con la regeneración de la columna cromatográfica. La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención deproteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un camporestringido para la separación. Esquema de cromatografía de afinidad: En el primer vaso, se encuentra una mezcla de proteínasque se añaden a la columna, la cual contiene un ligando específico ligado al polímero, para la proteína deinterés. En el segundo matraz se encuentra una solución de ligando, el cual se añade a una probeta paraque eluya a la proteína de interés. La bureta de en medio indica que las proteínas deseadas se lavan através de la columna. Los puntos rojos representan la proteína de interés, los negros, el ligando y las bolas beigeunidas a los puntos negros, representan el ligando acoplado con el polímero.Capítulo 1 10 12.
Introducción a los métodos de separación1.9 Cromatografía de líquidos de alta resolución La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más ampliamenteutilizada. Las razones son la sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas,es ideal para la separación de especies no volátiles o termolábiles y por su gran aplicabilidad a sustanciasque son de interés en la industria. Algunos ejemplos son: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos,hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especiesorganometálicas y gran variedad de sustancias inorgánicas. La fase móvil es un líquido y la faseestacionaria es una columna que puede ser de acero inoxidable.1.10 Electroforesis Los orígenes de ésta técnica se remontan a los trabajos de Tiselius en 1973, quien logró separarmezclas de proteínas (micelas cargadas eléctricamente) por su distinta movilidad en un soporte porosoal que se aplicaba un campo eléctrico. Posteriormente se ha aplicado a la separación de cualquierespecie cargada o alrededor de una doble capa eléctrica. El fundamento de la técnica consiste en depositar sobre un medio poroso una mezcla deespecies cargadas. Por aplicación de un campo eléctrico entre los extremos del soporte poroso lasespecies se separan en función de sus cargas y su movilidad iónica en ese medio. Cuanto más elevadosean el voltaje y la intensidad en menos tiempo se produce la separación; sin embargo valores altos deestas variables provocan un aumento de temperatura, con la consiguiente evaporación del disolvente yacumulación de sales del tampón, lo cual es indeseable. Para favorecer el paso de corriente se utilizan disoluciones fondo conductoras (electrolitos) queson disoluciones reguladoras en las que se empapa previamente el soporte poroso, debidamenteescogidas para que no formen precipitados con las especies del problema. Como soportes se hanutilizado alúmina, lana de vidrio, almidón, agar-agar, gel de sílice, etc.Capítulo 1 11 13.
Introducción a los métodos de separaciónElectroforesis capilar La sección transversal del aparato de electroforesis se puede reducir se forma drástica al realizarla electroforesis en el interior de un tubo capilar de diámetro interno menor a 0.1mm y una longitud de50cm a 1m. Es efectivo llevar de ésta forma la técnica porque la resistencia eléctrica de la disolución estan alta que la corriente se mantiene baja, en consecuencia se pueden mantener voltajes más altos sincalentamiento excesivo. La técnica tiene gran poder de resolución y se han desarrollado métodos parallevar a cabo la electroforesis incluso en moléculas neutras no iónicas. Además, las zonas de analitos separados por electroforesis capilar se pueden detectar de igualmodo que en una cromatografía en columna. El inconveniente de utilizar un capilar es que el volumen demuestra debe ser de alrededor de un nanolitro o menos, y después de la separación, cada uno de losanalitos está en volúmenes inferiores al nanolitro. Con volúmenes de líquido tan pequeños, muy pocosmétodos de detección se pueden usar eficazmente. Fig. 1. Diagrama de las partes básicas de un instrumento de electroforesis capilar con detección espectroscópica. La muestra penetra por la parte de la izquierda introduciendo el final del capilar en la disolución de la muestra y cargándolo, bien hidrodinámicamente, bien electrocinéticamente. Toda la unidad de la ilustración funciona a temperatura constante. El capilar está enrollado alrededor de un soporte. Durante el análisis los niveles de las dos disoluciones tampón deben ser iguales como se indica con la línea punteada) para evitar el flujo de masa debido a una diferencia de presión.1.11 Bibliografía‫چ‬ Braithwaite, A. Métodos cromatográficos, 4ª ed., ED. Chapman & Hall, Londres, 1985. Páginas 216- 217, 271-272.‫چ‬ Burriel Marti, Felipe Lucena Conde, Siro Arribas Jimeno, Jesús Hernández Méndez, Química Analítica Cualitativa, Ed. Thompson, España, 2003 pp 321-322.‫چ‬ Garrido, A., Fundamentos de química biológica. Interamericana Mc Graw-Hill. España. 1991.‫چ‬ Kenneth A. Rubinson, Judith F. Rubinson, Análisis Instrumental, Ed. Prentice Hall, España 2004, pp 730-739.‫چ‬ Lehninger, Albert. L. Principios de Bioquímica. Segunda Edición. Ediciones Omega. Barcelona, 1995, pp 137Capítulo 1 12 14.
Introducción a los métodos de separación‫چ‬ McCABE / SMITH /HARRIOTT. “Operaciones Unitarias en Ingeniería Química” 1991. Cuarta Edición en Español. Editorial McGraw Hill S.A. España‫چ‬ PERRY, ROBERT H. “Manual del Ingeniero Químico” 1992. Sexta Edición. Tercera Edición en Español. Editorial McGraw Hill. México‫چ‬ Skoog A. Douglas. Principios de análisis instrumental, 5ª ed., Saunders Collage Publishing, Espana, 2001, págs.: 785- 791 y 831- 836.‫چ‬ Willard Hobart, Métodos instrumentales de análisis. 7ª. Ed., Compañía de publicaciones Wadsworth, California, 1988, Páginas 644-650.‫چ‬ http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/cromatografia.ht m‫چ‬ http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_de_afinidad.pdf‫چ‬ http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina‫چ‬ http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_papelhttp://www.monografias.com/trabajos13/sepal/sepal.shtmlCapítulo 1 13 15.
Parámetros cromatográficosCapítulo 2Parámetros cromatográficos2.1 GlosarioAnchura de base: suele ser el intervalo de longitud de frecuencia de un pico; el intervalo pasa por unseparador de banda.Banda: Es una situación ideal, es una distribución gausiana. La cantidad de compuesto que sale decromatografico o de una columna electroforética.Coeficiente de difusión: Medida de la movilidad de una especie en unidades de cm2/s.Coeficiente de reparto: constante de equilibrio que describe la distribución de un soluto entre dos fases,para definir el coeficiente de partición solo se utiliza una forma de un soluto (kD).Coeficiente de selectividad: medida de la sensibilidad de un método para un interferente dado encomparación con su sensibilidad para el analito (KA,I).Cola: prolongación final de un pico cromatográfico, generalmente debida a la presencia de lugares muyactivos en la fase estacionaria.Constante de disociación: constante de equilibrio de una reacción en la que un complejo metal- ligandose disocia para formar un ión metálico libre y un ligando (kD).Constante de equilibrio: K’ Constante que se basa en las concentraciones molares al equilibrio, su valornumérico de K’ depende de la fuerza iónica del medio.Cromatografía: separación en la que los solutos se distribuyen entre fase móvil y estacionaria.Cromatografía gaseosa: técnica cromatográfico en la que la fase móvil es un gas.Cromatograma: registro de la señal de detección en función del tiempo de elusión o del volumen.Eficiencia de la columna: medida del grado de ensanchamiento de una banda cromatográfico, se sueleexpresar en términos de la altura H, de los platos o del número N de platos teóricos. En la medida en quela distribución del analito dentro de la banda es gausiana, la altura de los platos está dada por la varianzadividida entre la longitud de la columna del empacado.Capítulo 2 14 16.
Parámetros cromatográficosEnsanchamiento de banda: aumento de la anchura de base de un soluto a medida que se desplazadesde el punto de inyección al detector.Factor de capacidad: medida de la fortaleza con la que la fase estacionaria retiene en soluto dado (k’).Factor de selectividad: cociente de los factores de capacidad de dos solutos que muestra la selectividadde la columna para uno de ellos (α).Factor de separación: medida de la eficacia de una separación en lo que se refiere a la separación entreel analito y el interferente.Fase estacionaria: fase extractante que permanece en posición fija.Fase móvil: fase extractarte que se desplaza a través del sistema.Número de platos teóricos: característica de una columna cromatográfica que se emplea para medir sueficiencia.Plato teórico: medio cuantitativo para evaluar la eficacia de una columna y que consiste en tratar unacolumna, como si estuviera compuesta de pequeñas zonas o platos, en las que tiene lugar el repartoentre las fases móvil y estacionariaRelación de distribución: cociente que expresa la concentración total de soluto en una fase en relacióncon una segunda fase; en su definición participan todas las zonas del soluto (D).Resolución: separación entre dos bandas cromatográficas (R).Selectividad: Medida de la ausencia de interferencia de un método que se mide ante el cociente deselectividad del mismo.Tiempo de retención: es el tiempo entre la inyección en una columna cromatográfica y la llegada a unpico de analito al detector.Tiempo muerto: tiempo necesario para que una especie no retenida pase a través de la columna.Capítulo 2 15 17.
Parámetros cromatográficos Un parámetro es una cantidad que puede tener distintos valores y que caracteriza un proceso,una operación o un resultado. La parametrización de datos en cromatografía, como en otros métodosfacilita la tabulación y la comunicación de dichos datos. Se puede parametrizar la forma, la posición y laresolución de las bandas de una cromatografía. Estos pueden correlacionarse satisfactoriamente condescripciones de los procesos moleculares que tienen lugar durante la separación.2.2 Constantes de Distribución Al encontrarse un soluto disperso en una fase que entra en contacto con otra, ocurre unfenómeno de distribución, en el cual dicho soluto puede tener mayor afinidad a alguna de las dos fases.De esta manera, se genera un equilibrio entre la cantidad de soluto que existe en una fase y en otra. Laconstante asociada es la llamada constante de distribución, que se define para un soluto A como: 𝐴 1 𝐷𝐴 = 𝐴 2donde [A]1 y [A]2 son la concentración de A en la fase 1 y 2 respectivamente. Concretamente, encromatografía la fase 1 es la fase estacionaria y la fase 2 es la fase móvil y el soluto A es el analito deinterés. Esta constante es específica para cada compuesto con cada determinada fase estacionaria y fasemóvil.2.3 Factores de influencia en la retención La retención que ocurre del soluto en la fase estacionaria, se debe generalmente a la diferenciade polaridades entre las fases estacionaria y la móvil, promoviendo que el soluto se reparta entre ellassegún su coeficiente de distribución. De esta manera, al separarse una mezcla que contenga solutos conpolaridad distinta, y por lo mismo coeficientes de distribución distintos, la retención será diferente paracada uno. En la cromatografía de gases, el to, es evaluado convenientemente a partir del tiempo deretención del “pico de aire”. En la cromatografía de líquidos, cualquier compuesto no retenido puedeusarse como muestra para medir el to. El tiempo muerto de la columna puede usarse para determinar el llamado tiempo de retenciónajustado o corregido, t’R. tR = tR – toCapítulo 2 16 18.
Parámetros cromatográficos Una medida conveniente y útil de la retención del soluto está dada por el factor de capacidad (ofactor de retención), k’ 𝑡´𝑟 𝑘´ = 𝑡0FIG. 1. Cromatograma que muestra diferentes picos con tiempos de retención diferentes, así como el tiempo muerto. Los valores de k’ no tienen un significado simple en un gradiente de elución o en temperaturaprogramada, y usualmente no son reportados cuando esos procedimientos son usados. Los valores de k’pueden ser determinados a partir del tiempo de retención, tR. En los modos de retención de cromatografía se tiene: k’ > 0, que significa que no hay bandaseluidas antes del tiempo muerto, to. A menudo es útil expresar el tiempo de retención o el volumen entérminos del factor de capacidad, k’. tR = to (1+ k’) VR = Vm (1 + k’)La retención del soluto en la fase estacionaria depende de la afinidad, y de los factores que puedanafectar a la misma. El fenómeno de adsorción depende fuertemente de la temperatura, a mayor sea éstase fomentará la desorción, y debe por tanto controlarse dependiendo de la naturaleza del análisis.2.4 Retención y Equilibrio en Cromatografía El soluto se encuentra en un equilibrio de distribución entre la fase móvil y la estacionaria, ydependiendo del desplazamiento de dicho equilibrio es la retención del mismo. Una separacióncromatográfica típica se muestra en la figura 2. La separación está fuertemente afectada por laproximidad de bandas adyacentes en el cromatograma.Capítulo 2 17 19.
Parámetros cromatográficos Una importante medida de la proximidad de bandas es el llamado factor de separación, α, dondedos bandas adyacentes, teniendo los valores k1 y k2: α = k2 / k1 El factor de separación, α, es usualmente identificado con la selectividad del sistemacromatográfico, es decir, la habilidad del sistema a prever diferentes tiempos de retención para doscompuestos específicos. Dicho factor debe tener un valor mayor a uno, pues esto significaría que no hayseparación, pero es recomendable que sea menor a dos puesto que tiempos de retención muy largos setraducen en tiempo desperdiciado durante la operación experimental. Los valores de α depende de losdos solutos y de 1) La composición química de la fase estacionaria. 2) La composición química de la fase móvil (excepto en cromatografía de gases). 3) La temperatura.En cromatografía de fluidos supercríticos, la presión también puede afectar a α al cambiar la densidad dela fase móvil. FIG. 2. Separación de una muestra de un compuesto nitrado con 10 componentes por cromatografía de líquidos .2.5 Eficiencia de separación de una columna Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una de lascuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos fases. Cada una de estaszonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay N en cada columna). La longitud de unacolumna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras. ElCapítulo 2 18 20.
Parámetros cromatográficosvalor numérico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito. Laaltura del plato está relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro dela columna, X: σ2 𝐻= Xdonde σ es un estándar de desviación de la banda gaussiana. Para los picos gaussianos simétricos laanchura de la base es igual a 4σ y la anchura del pico al punto de inflexión, ωi es igual a 2σ. Por lo tantoel valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.El número de platos teóricos en la columna entera viene dado por: 𝐿 𝐿∗ 𝑋 𝑁= = 2 𝐻 σdonde L es la longitud de la columna. Si consideramos la posición del pico a X = L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ω,obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con más pendiente del pico, es igual a 4σ, laecuación anterior se convierte en 16 ∗ 𝐿2 𝑁= W2 Si en lugar de medir L y ω en unidades de longitud se hace en tiempo, la ecuación quedará: 𝑡𝑅 2 𝑁 = 16 𝑊 La medición del ancho del pico es más confiable cuando se realiza a la mitad de la altura del pico,con lo cual se puede utilizar 2 𝑡𝑅 𝑁 = 5.545 𝑊1/2 También puede hacerse en función de la altura y área del pico 2 𝑡𝑅 𝑁 = 2𝜋 á𝑟𝑒𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 Es importante que tanto 𝑡 𝑅 , W ó W1/2 ó á𝑟𝑒𝑎 𝑎𝑙𝑡𝑢𝑟𝑎 se expresen en las mismas unidades yaque N es adimensional.Capítulo 2 19 21.
Parámetros cromatográficosPara que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de película delgados ycolumnas de poco diámetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de lafase móvil también afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad óptima para obtener elmáximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de éste para no perder demasiadotiempo en análisis.2.6 Procesos de ensanchamiento de banda El número de platos de una columna (eficiencia, N) es una medida del ensanchamiento de labanda cromatográfica. Cuando inyectamos un pequeño volumen de analito en una columna forma unabanda estrecha en su inicio, pero a medida que el analito migra la banda se va ensanchando. La anchurade pico aumenta con la raíz cuadrada de la longitud que la banda ha recorrido. Según la ecuación de VanDeemter 𝐴+ 𝐵 𝐻= 𝑣+ 𝐶∗ 𝑣 A representa el término de caminos múltiples. Esto es porque las moléculas no siguenúnicamente un camino, hay multicanales, que se deben a la densidad de empacado de la faseestacionaria y afecta según el tamaño y forma de la partícula. B representa la difusión axial, la cual depende de la movilidad de las moléculas en las fases. Elsoluto se difunde desde la zona central que es la más concentrada hacia las regiones más diluidas. Enesto influye la velocidad v , pues a velocidades muy altas no se alcanza a difundir y predomina el términoA. Para encontrar la velocidad óptima puede trazarse una curva de Van Deemter al graficar H en funciónde v.Por último, C representa la resistencia a la transferencia de masa. Es necesario éste término porque enrealidad los fenómenos que ocurren están fuera del equilibrio. Esto es porque las corrientes de la fasemóvil como la capa de fase estacionaria tienen una anchura determinada. Por lo que las moléculas deanalito necesitan primero migrar desde el centro de ellas hasta la interfase donde ocurre latransferencia, y este retraso temporal se traduce en ensanchamiento de bandas.2.7 ResoluciónLa separación relativa de dos bandas a menudo se refiere a su resolución, Rs. La resolución se definecomoCapítulo 2 20 22.
Parámetros cromatográficos 𝑡2 − 𝑡1 𝑅𝑠 = 1 (𝑤 + 𝑤2 ) 2 1 Aquí, t1 y t2 se refieren a los tiempos de retención (tR) de la primera y la segunda banda, y W1 y W2son el ancho de dichas bandas. La figura 3 ilustra la separación de dos bandas adyacentes como unafunción de sus valores de Rs y su tamaño relativo. Se observa que la separación mejora sistemáticamentea mayores valores de Rs, y la separación es generalmente mejor para dos bandas de igual tamaño (y elmismo valor de Rs.). Esto es, mayores valores de Rs se requerirán normalmente para la separación de lasbandas desiguales. Fig 3. Separación de dos bandas como una función de la resolución (Rs) y el tamaño relativo de banda. La resolución depende de la retención y selectividad de manera proporcional. A mayorselectividad y retención k´, mayor resolución. Para tener una buena separación se recomienda utilizar k´> 2, y generalmente se trabaja con α ≈1. Para el análisis cuantitativo es deseable (pero no siempre práctico) alcanzar la resolución de almenos Rs = 1.5, desde que esto corresponde a la separación a la línea base de bandas de tamaño similar.La separación de la línea base hace que los sistemas de datos midan el tamaño de cada bandaapropiadamente y esto significa una cuantificación fiable. Una resolución pobre puede deberse a que el método utilizado no es apropiado, pues nodiscrimina entre los solutos, o que hay mucha muestra en proporción a la columna cromatográfica.Capítulo 2 21 23.
Parámetros cromatográficos2.8 Cuantificación en cromatografía Para llevar a cabo un análisis cuantitativo, es necesario que los datos obtenidos sean confiables,tanto para la construcción de la curva de calibración como para el tratamiento del analito mismo.Primero es necesario llevar a cabo un análisis cualitativo, en el cual se encuentren las condicionesóptimas. Para evaluar esto, se calculan los parámetros cromatográficos de cada ensayo que sirven comoreferencia. De ésta manera se eliminan fuentes de error, pues se trabaja en las mejores condicionesposibles, acercándose a resultados reproducibles y por tanto precisos, y lo más exactos que ésta técnicanos permite. Si no se obtiene una buena resolución, primero debe repetirse el ensayo con menor cantidad demuestre, sino puede probarse utilizando una fase móvil distinta, y si esto no ayuda, puede utilizarse otrafase estacionaria. En caso de que la selectividad no sea buena, debe revisarse la temperatura de trabajo,y analizar la naturaleza química de las distintas fases así como solutos, para probar con otra fase seaestacionaria o móvil. No debe perderse de vista, que a menor tiempo de operación mejor, y que una vezencontradas las mejores condiciones, no deben alterarse. Para realizar la curva de calibración puede usarse el método de estándar externo o interno,siendo el segundo apropiado para eliminar posibles errores de operación.2.9 Resumen La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la diferencia de distribución queexiste entre dos componentes de una mezcla en las fases estacionaria y móvil. Así, cada soluto tendrá untiempo de retención distinto y podrán analizarse por separado. Los parámetros cromatográficos son claves para el diseño de un análisis, pues son herramientasque ayudan a evaluar las condiciones en las que se está llevando a cabo. Cada soluto tendrá asociado un tiempo de retención distinto que se puede expresar como elfactor de capacidad, y la relación de los tiempos de retención o factores de capacidad de los solutos nosindicará si la selectividad del sistema es buena. Al calcular la resolución se podrá evaluar si la separaciónentre los tiempos de retención se los solutos es suficiente o excesiva. El cálculo de los platos teóricos nosindicará la eficiencia del sistema. Una vez evaluados los parámetros cromatográficos, se podrá determinar si el cromatogramaobtenido es aceptable, o si es necesario modificar alguna condición para optimizarlo.Capítulo 2 22 24.
Parámetros cromatográficos2.10 BibliografíaHeftmann, E. Chromatography: Fundamentals and Applications of chromatography and relateddifferential migration methods, Elsevier Science Publishers B.V,5a. edición, EUA, 1992, pp. 2-14Rojo Callejas F., Manual de Química Analítica Instrumental II, Anexo III, Facultad de Química UNAM,México 2002http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografiahttp://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/Trabajo5.pdfhttp://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/apquim-an-instr-14/skoog/26d.htmlCapítulo 2 23 25.
Cromatografía en fase líquida a columna abiertaCapítulo 3Cromatografía en fase líquida a columna abierta3.1 Procedimientos de empaquetamiento En cromatografía de fase líquida, la fase móvil es un líquido y éste desciende a través de lacolumna. La fase estacionaria es frecuentemente un líquido que recubre el interior de un tubo capilar ola superficie de partículas sólidas empaquetadas dentro de la columna. Alternativamente, las mismaspartículas sólidas pueden ser la fase estacionaria (como se muestra en la figura 1, en cualquier caso, elreparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria dan lugar a la separación.Fig 1. Representación esquemática de una separación cromatográfica. El soluto A, que tiene una mayor afinidadque el soluto B para la fase estacionaria, permanece en la columna más tiempo. Las columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llenacon partículas que contienen la fase estacionaria y los materiales más usados para los tubos de lascolumnas son de acero inoxidable y de vidrio, siendo el primero preferido por la manipulación más fácil.Para el caso de la columna de tubo abierto, se trata de un capilar hueco estrecho con la faseestacionaria cubriendo las paredes interiores. En las columnas empaquetadas, el soporte debe ser un sólido poroso con gran área superficial,inerte y con una buena resistencia mecánica. Los compuestos empleados para empaquetamiento varían,entre los cuales podemos encontrar: tierra de diatomeas (más empleado en CG), alúminas, resinas deintercambio iónico o compuestos de sílice como SiO2 amorfo, sin embargo, éste debe de someterse a untratamiento para hacerlo aún más inerte y que pueda ser empleado sin problemas. Es característico queCapítulo 3 Página 24 26.
Cromatografía en fase líquida a columna abiertael tamaño de las partículas y de los poros deben ser lo más uniforme posible. El procedimiento delempaquetado es muy sencillo y se resume en los dos siguientes pasos: 1. Colocación de la fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento de manera uniforme y compacta en la columna (longitud y diámetro apropiados). 2. Verificación de ausencia de espacios vacíos en la columna (para evitar que los picos del cromatograma sean más anchos y de menor eficiencia.2.2 Aplicación de la muestra Una vez que la columna se encuentra correctamente empaquetada, se procede a la aplicación dela disolución de la muestra. Cuando se introduce en la columna cierta cantidad de muestra, ésta sequeda en una zona de cierta altura en la columna. Si entonces se introduce el disolvente, comienza eldesplazamiento de la zona a lo largo de la columna. La parte superior de la zona se disuelve poco a pocoy, empujado por la disolución que se forma, el frente de la zona avanza hacia la base de la columna. Si eldisolvente utilizado para la elusión es el mismo que la disolución problema, los platos teóricoscomprendidos en la parte central de la zona, reciben una fase móvil en equilibrio con ellos y lasconcentraciones permanecen estacionarias. El movimiento de la zona sólo es aparente en sus extremospor lo que su estudio se puede hacer sobre una zona que se supone no tiene más espesor de un platoteórico.2.3 Procedimientos de elución La diferente capacidad de los distintos disolventes para eluir un determinado soluto esprácticamente independiente de la naturaleza del soluto. Se puede describir la elución como eldesplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente.Para el caso específico de cromatografía de adsorción, existe una ordenación de los disolventes deacuerdo a su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado adsorbente, llamada serieeluotrópica. La fuerza eluyente es una medida de energía de adsorción del disolvente, supuesto valorcero para el sistema pentano/sílice pura. Cuanto más polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyenterespecto a la sílice en cromatografía de adsorción.Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto más rápidamente se eluirán los solutos de lacolumna.Capítulo 3 Página 25 27.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta La cromatografía de adsorción sobre sílice pura es un ejemplo de cromatografía de fase normal,que se caracteriza por usar una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. Un disolvente máspolar tiene fuerza eluyente mayor. La cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, secaracteriza porque la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es más polar. Undisolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografía de fase inversa elimina las colasde los picos porque la fase estacionaria tiene pocos puntos que adsorban con fuerza a ningún solutooriginando colas. La cromatografía de fase inversa también es menos sensible a impurezas polares (comoel agua), que pueda haber en el eluyente.2.4 Elución isocrática y gradienteLa elución isocrática se lleva a cabo con un único disolvente (o una mezcla de disolventes fija). Si undisolvente no permite una elución suficientemente rápida de todos los componentes, se puede usar unaelución gradiente. En este caso, se van añadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A,produciendo un gradiente continúo.Fig 1. Las moléculas del disolvente y las moléculas del soluto compiten entre sí en su reacción con los puntos activosde la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza del eluyente, más fácilmente se desplaza el soluto.2.5 Cromatografía de absorción y de partición de columnaEstas son dos técnicas de análisis cromatográfico, la diferencia entre ellas es que la retención del analitoen la columna depende de la naturaleza de su interacción con la fase estacionaria.En el dibujo de abajo, observamos las diferentes formas en que interacciona el soluto, nuestro analito,con la fase estacionaria, en la de absorción, vemos que de pega a la superficie, mientras que en la departición de columna, el analito se disuelve dentro de la fase estacionaria.Capítulo 3 Página 26 28.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta2.6 Cromatografía de adsorción La absorción es un fenómeno de superficie, por lo tanto físico, en el cual diversas sustancias sonatrapadas en la superficie de un material, es decir, se acumulan en una determinada superficieinterfacial, formándose una película del material retenido en la superficie del cuerpo adsorbente, seasólido o líquido, aunque este proceso implica una interacción de diferentes fuerzas, sean estas físicas oquímicas, por ello se habla de fisisorción, cuando la naturaleza de las fuerzas que retienen al material essolo física, y quimisorción, cuando la retención implica enlaces con el adsorbente. Así pues, en lacromatografía de adsorción, se aprovecha esta propiedad del analito que queremos separar, dado que sies en una mezcla, cada componente de la mezcla se adsorbe con distinta fuerza, lo cual origina que elanalito se retenga en la fase estacionaria, es decir, se adsorba, y los demás componentes se eliminen. Durante la separación, se filtra una solución a través de una columna de adsorbente, que es lafase móvil, esta es adsorbida en la superficie de la fase estacionaria sólida, formando una “cama” departículas que se dividen de modo que el área de absorción sea máxima, o sea, se distribuyen a lo largodel sólido para atrapar la mayor cantidad posible del analito, estos se llaman sitios de absorción. El equilibrio entre la fase estacionaria y móvil permite la separación del analito. Si vemos lailustración de abajo, los puntos negros representan el analito, y la mancha gris con protuberancias es lafase sólida, los huecos en ella son los sitios de absorción, donde el analito interacciona con la faseestacionaria y se retiene. Como fase estacionaria se han usado muchos materiales, aunquegeneralmente encontramos la Hidroxiapatita (Ca3(PO4)2.Ca(OH)2), alumina (Al2O3) y carbonato demagnesio.Capítulo 3 Página 27 29.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta Aplicaciones. Esta es una de las técnicas cromatográficas mas antiguas, su uso depende deltipo de compuesto que estemos separando, o sea de su naturaleza química, en particular se usa para laseparación de compuestos isoméricos, especies no polares, hidrocarburos alifáticos, y para compuestoscon grupos funcionales capaces de formar puentes de hidrógeno fuertes, por ello es utilizada paraseparar azúcares, especialmente azucares aminados y glicoproteinas así como oligosacáridos, y tambiénse ha usado para obtener proteínas biliares.2.7 Cromatografía de partición de columna Esta técnica se basa en la retención del analito en una columna sólida como granos de fibra ocualquier otro material inerte químicamente, sobre la cual hay distribuida una capa fina de un disolventeafín al analito; y una fase móvil liquida o gaseosa; cuando la fase móvil pasa a través de la columna, elequilibrio entre esta y la estacionaria esta mediado por el analito, que se reparte entre ambas y queda alfinal disuelto en la fase estacionaria. En el dibujo de abajo, vemos las flechas, que son el flujo de la fasemóvil y que llevan el analito, pasan por la fase estacionaria, los círculos, alrededor de los cuales hay unacapa donde se quedan retenidos los analitos, esta capa es de un material que interacciona con el analito,donde este se disuelve. Las moléculas del analito se equilibran entre la fase estacionaria y la móvil, a esto se le llamapartición puesto que se distribuyen, o sea se reparten dependiendo de la fisicoquímica del sistema, entrelas dos fases. La retención depende de la solubilidad del analito con la capa de sorbente adherida a lamatriz sólida, y de que tanto la fase móvil pueda arrastrarlo al fluir, en el dibujo de abajo, vemos como elanalito, los puntos negros, se quedan disueltos en la superficie de la fase estacionaria, dentro de la capaCapítulo 3 Página 28 30.
Cromatografía en fase líquida a columna abiertade solvente adherida a la matriz sólida, y como vemos también, el analito se distribuye entre la capa desolvente de la fase estacionaria y otra entre la fase estacionaria, a esto se le llama reparto, y como estasobre una columna, por ello se le llaman partición de columna.La solubilidad en ambas fases esta dada por el coeficiente de partición, KD: 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑚ó𝑣𝑖𝑙 𝐾𝐷 = 𝑎𝑛𝑎𝑙𝑖𝑡𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑓𝑎𝑠𝑒 𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎 Eso se debe a que el analito tiene diferentes afinidades para las dos diferentes fases, o sea tienediferentes preferencias por estar en una u otra fase, de esta forma, la separación del analito de la mezclase logra por migración diferencial de este, y dada la afinidad que tiene el analito pro el disolvente de lacolumna, el reparto en esta será mayor que en la fase móvil. Aplicaciones. Esta técnica se usa para separa sustancias en la misma fase, o líquidosinmiscibles.2.8 Cromatografía en gel. La separación basada en el tamizado molecular se puede llevar a cabo en sustancias sin cargadurante una migración osmótica a través de geles. La filtración en gel es el método de separación queconsiste en la separación de moléculas basado en el tamaño relativo de las mismas. En la cromatografía en gel, la fase estacionaria es una matriz porosa polimérica cuyos poros sellenan con el solvente que se usará en la fase móvil. El flujo de la fase móvil provocará que moléculas mayores pasen a través de la columnalibremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículas más pequeñas tardarán más tiempo ensalir dependiendo de la penetración que tengan sobre el gel. Los componentes de una mezcla emergende la columna de acuerdo a masa molecular relativa.Capítulo 3 Página 29 31.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta El volumen total de la columna, Vt es la suma del volumen del líquido afuera de la matriz de gel(V0, volumen de la fase móvil que eludirá a una molécula completamente excluida ), el volumen dellíquido dentro de la matriz (Vi) y el volumen de la matriz de gel (Vm).El volumen de elusión (Ve) se puede relacionar con V0 y Vi: Ve  V0  K d ViKd es el coeficiente de distribución volumétrica: K d  (Ve V 0) / ViKd caracteriza el comportamiento de retención del soluto. Representa la fracción del volumen del gelque es accesible a la molécula en cuestión. Si Kd se grafica contra el logaritmo del peso molecular se unaserie de solutos similares en forma y densidad molecular, se obtiene:En un rango pequeño de Kd, el rango de fraccionamiento, la curva se aproxima a una línea recta: K d  A  B log M La separación por cromatografía en gel está influenciada por las propiedades de los poros de lared tridimensional, y la naturaleza del material que forma el poro. Se distinguen dos tipos de materialpara el gel: xerogeles y aerogeles. Los xerogeles son geles simples; consisten en polímerosentrecruzados que se engrosan en contacto con el solvente para formar un medio porosos relativamentesuave. Los aerogeles son sólidos porosos que son penetrados por el disolvente; algunos ejemplos es elvidrio y silica porosos. El nombre de los geles más comúnmente utilizados: Sephadex, Strygel, BiogelCapítulo 3 Página 30 32.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta Aplicaciones. Desalinización: Largas moléculas de origen biológico son separadas de especiesionizables o inorgánicas. Un ejemplo en la separación de la hemoglobina y NaCl en un gel Sephadex. La cromatografía en gel se utiliza para separar proteínas, péptidos, ácidos nucléicos,polisacáridos, enzimas, hormonas y los químicos en polímeros, para determinar distribuciones de pesosmoleculares en mezclas de polímeros.2.9 Cromatografía de intercambio iónico. El intercambio iónico es un proceso donde una solución de un electrolito se pone en contactocon una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina son remplazados por las especiesiónicas de carga similar del analito. Ocurre un intercambio de iones de signo igual entre una solución yun sólido esencialmente insoluble en contacto con la solución. Las resinas cambiadoras de iones están constituidas por una red tridimensional de cadenaspolímeras entrelazadas con cadenas cortas que tienen grupos funcionales ionizables. Se tiene una faseinsoluble con sitios iónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria semueven libremente a su alrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga, a condición deque se mantenga la electroneutralidad. Una resina típica se prepara por polimerización de estireno ydivinilbenceno.Cambiadores catiónicos. Los grupos funcionales ácidos se pueden introducir fácilmente, tienen elprotón disociado, pero no libres para abandonar la resina, excepto cuando se sustituyen por otros ionespositivos.Cambiadores aniónicos. Si se introducen grupos funcionales básicos, la resina intercambia aniones. Loscambiadores aniónicos se preparan con aminas, obteniéndose in grupo amonio, y por tanto, un mediobásico.Las propiedades más importantes que determinan el funcionamiento de una resina: o Tamaño de las partículas – velocidad de intercambio y permeabilidad de la columna. o Naturaleza de los grupos funcionales – tipo de los iones intercambiables. o Fuerza de los grupos funcionales – coeficiente de distribución. o Número de grupos funcionales – capacidad de la resina.Capítulo 3 Página 31 33.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta A partir de la sustitución de cantidades equimolares de iones de cargas iguales, se obtienenequilibrios de intercambio. Se aplica la ley de acción de masa, donde K(coeficiente de selectividad), es laconstante de equilibrio del sistema. Y donde el coeficiente de distribución KD: K [ HR] KD  [H  ]Efecto del pH del eluyente. La carga eléctrica de una especie se puede aumentar, disminuir o invertirpor cambio del pH. Disponemos de un medio para influir sobre la relación de distribución o evitar unintercambio total. El efecto del pH sobre la elusión:Efecto de agentes complejantes. Los aniones complejan muchos iones metálicos dando iones complejosde carga negativa. En esta forma, los cationes metálicos que se separen mal en cambiadores catiónicos,se pueden complejar y separar en cambiadores aniónicos.Aplicaciones. Eliminación de iones. Un agua completamente desionizada se obtiene pasándola através de un cambiador de cationes, y después a través de un cambiador de aniones.Separación de aminoácidos. La naturaleza anfótera de este grupo permite cambiar el signo de su carga oeliminar la carga neta, de modo que un ácido determinado se puede intercambiar en una resinaaniónica, en una resina catiónica o en ninguna de las dos, mediante control de pH de la solución.2.10 Cromatografía covalenteEs un sistema especial de cromatografía, el cual es altamente selectiva la fase estacionaria, en el que seforma un enlace covalente reversible entre la fase estacionaria y la biomolécula a separar, lasseparaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de la biología molecular; por lo cual esmuy utilizado en esta área, además de tener un pequeño inconveniente de que al ser tan selectiva, solose puede separar un solo analito.Capítulo 3 Página 32 34.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta2.11 Conformación de la cromatografía covalentea) Ligandos: Se trata de biomoléculas que se encuentran en una base sólida, siendo estas lasresponsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Los ligandos se pueden clasificar de 2maneras: Ligandos específicos, como los anticuerpos, que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, ylos ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como laslectinas y nucleótidos.b) Soportes: Es la superficie en donde se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad Debeposeer propiedades como tener una gran superficie, porosidad controlable, carácter suficientementehidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica,en especial para trabajar a alta presión, estos soportes generalmente geles orgánicos derivados de lospolisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.2.12 Fundamento de la cromatografía de afinidad Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en lacolumna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazadocovalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre esteligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido. Se procede a laelusión de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en elacoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase móvil que desactiva el acoplamiento poralteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos;generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos de estamanera se eluye el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de lacolumna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil siendo una etaparápida.Capítulo 3 Página 33 35.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta2.13 Cromatografía FlashEs un método cromatográfico, el cual nos permite separar de una manera rápida, fiable y económica;principalmente utilizada para la separación y purificación de proteínas.La Cromatografía Flash consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para laseparación puede llevarse a cabo con relativa rapidez.El sistema incluye dos bombas de flujo continuo en la depuración de las columnas (variables por elusuario), una bomba peristáltica puede utilizarse para deposito en la columna, seguido de la radiaciónultravioleta para detectar las biomoléculas en la columna, un mezclador para producir un gradiente deelusión, las válvulas de motor puede ser utilizados para ayudar en la inyección de la muestra, la selecciónde la columna o corriente de inversión, y un controlador con una función de integracióncomputadorizada, en el cual se muestran los resultados de el análisis.Aplicaciones. En farmacia la cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) se utiliza para ladepuración de grandes cantidades de diferentes biomoléculas (es decir, las proteínas y el ADN).2.14 ResumenLas columnas pueden ser empaquetadas o de tubo abierto. Una columna empaquetada se llena conpartículas que contienen la fase estacionaria y la columna de tubo abierto, es un capilar hueco estrechocon la fase estacionaria cubriendo las paredes interiores. El procedimiento del empaquetado consta dedos sencillos pasos: a) colocación de fase estacionaria y/o compuestos de empaquetamiento, y b)Verificación de compactación (no espacios vacíos).El desplazamiento de la muestra a través de la columna, depende de la afinidad por ésta y del disolventeempleado para el proceso.Capítulo 3 Página 34 36.
Cromatografía en fase líquida a columna abiertaLa elución es el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por un disolvente. Existen dos tiposde elusiones: Elusión por gradiente (cambio continuo de la composición del eluyente en sentido deaumento de fuerza eluyente) y elusión isocrática (un solo disolvente).Cromatografía de adsorción: esta técnica aprovecha el fenómeno de la absorción de sustancias en unasuperficie para separar analitos de mezclas al hacerlos pasar por una columna con un materialadsorbente, que retiene el analito cuando este pasa a través de su superficie.Cromatografía de partición de columna: sta técnica permite separar analitos al hacerlos pasar por unacolumna sobre la cual hay una capa fina de un disolvente químicamente similar al analito, en el que estequeda disuelto y retenido cuando pasa la fase móvil, se separa cuando se da un reparto entre las fases,en el que se espera que la mayor parte se quede en el disolvente de la columna.Cromatografía en gel: consiste en la filtración en gel que consiste en la separación de moléculas basadoen el tamaño relativo de las mismas. El flujo de la fase móvil del sistema provocará que moléculasmayores pasen a través de la columna libremente, sin penetrar la matriz del gel, mientras que partículasmás pequeñas tardarán más tiempo en salir dependiendo de la penetración que tengan sobre el mismo.Los componentes de una mezcla emergen de la columna de acuerdo a masa molecular relativa.Cromatografía de intercambio iónico: el intercambio iónico es un proceso donde una solución de unelectrolito se pone en contacto con una resina de intercambio iónico y los iones activos de la resina sonremplazados por las especies iónicas de carga similar del analito. Se tiene una fase insoluble con sitiosiónicos fijos de una sola carga, muestra que las especies de carga contraria se mueven libremente a sualrededor se pueden sustituir por otros iones de la misma carga.Cromatografía covalente: las separaciones se basan en el acoplamiento “llave-cerradura” típico de labiología molecular; por lo cual es muy utilizado en esta área, además de tener un pequeñoinconveniente de que al ser tan selectiva, solo se puede separar un solo analito. Permite la separación deanticuerpos y enzimas.Cromatografía Flash: consiste en una bomba y una columna que permita resistir alta presión para laseparación puede llevarse a cabo con relativa rapidez. Es una técnica muy utilizada en el área debioquímica ya que nos permite separar biomoléculas y proteínas.Capítulo 3 Página 35 37.
Cromatografía en fase líquida a columna abierta2.15 BibliografíaBERMEJO, F. - Química Analítica General, Cuantitativa e Instrumental - Vol 1. - Ed. Paraninfo 7maedición, Madrid 1991.HARRIS, D. - Análisis Químico Cuantitativo - Ed. Reverté - 2ª edición - España, 2001.SKOOG, WEST, HOLLER, CROUCH - Química Analítica - 7ª ed - McGraw Hill – México, 2001.ROUESSAC - Métodos y técnicas instrumentales modernas. Análisis Químico - McGraw Hill – USA, 2003.SHARON, N. - Complex Carbohydrates: their chemistry, Biosíntesis and Functions - Addison-Wesley - NewYork, 1975.PECSOK, Robert – Métodos Modernos de Análisis Químico – Editorial Limusa – México, 1981.BRAITHWAITE, SMITH – Chromatografic Methods – 4° edición - Chapman & Hall – UK, 1994.http://www.srigc.com/2003catalog/cat-86.htmhttp://holivo.pharmacy.uiowa.edu/separation/chromatography.pdfhttp://www.che.utexas.edu/cache/newsletters/spring2001_chemmicro.pdfhttp://www.resonancepub.com/chromtutorial.htmwww.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/www.um.es/bbmbi/AyudasDocenteswww.um.es/bbmbi/AyudasDocenteswww.gmi-inc.com/Products/PharmaciaFPLC.htmCapítulo 3 Página 36 38.
Cromatografía de gasesCapítulo 4Cromatografía de gases Esta técnica permite el análisis rápido y exacto de gases, vapores líquidos; permite identificar loscomponentes individuales de las mezclas gaseosas. Iniciada a finales de 1952, se ha desarrolladonotablemente en separación, identificación y determinación de compuestos volátiles (gases y líquidos)de puntos de ebullición de hasta 350-400°C. El método tiene las ventajas de ser sensible, rápido ysencillo, y si se maneja con suficiente cuidado, suministra información cuantitativa exacta con cantidadesmuy pequeñas de muestra. En cromatografía de gases (GC) la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columnacromatográfica. La elución se produce por el flujo de un fase móvil de un gas inerte a diferencia de losotros tipo de cromatografía, la fase móvil no interaccionan con la moléculas del analito; su única funciónes la de transportar el analito a través de la columna.Existen dos tipos de cromatografía de gases:lacromatografía Gas-Sólido (GCS) y la cromatografía gas liquido (GLC).La cromatografía gas liquido tienegran aplicación en todos los campos de la ciencia y su denominación se abrevia normalmente comocromatografía de gases (GC). En la cromatografía gas sólido se produce la retención de los analitos de una fase estacionariacomo consecuencia de la absorción física. La cromatografía gas sólido ha tenido una aplicación limitadadebido a la retención semipermanente de las moléculas activas o polares y a la obtención de picos deelusión con colas muy significativas (como consecuencia del carácter no lineal del proceso de absorción),de modo que esta técnica no ha encontrado una gran aplicación excepto para la separación de ciertasespecies gaseosas de bajo peso molecular. La cromatografía gas líquido se basa en la distribución delanalito entre una fase móvil gaseosa y una fase líquido inmovilizada sobre la superficie de un sólidoinerte.4.1 Instrumentación Los componentes básicos de un instrumento para la cromatografía de gases se muestran acontinuación, el caudal de gas se divide antes de entrar en la columna, este tipo de disposición se utilizacuando el detector empleado mide un cambio en las propiedades de la corriente de gas por lapresencia de las moléculas de analito.Capítulo 4 37 39.
Cromatografía de gases Gas portador. Entre los gases portadores deben ser químicamente inertes, se encuentran elhelio, nitrógeno y el hidrogeno, con el suministro de gas se encuentran asociados los reguladores depresión, manómetros y medidores de caudal. Además el sistema de gas portador contiene a menudo untamiz molecular para eliminar el agua u otras impurezas. Los caudales se controlan normalmentemediante un regulador de presión de dos niveles colocando en el cilindro de gas, y algún tipo deregulador de presión o regulador de flujo instalado en el cromatógrafo. Sistema de inyección de muestra. La eficacia de la columna requiere que la muestrasea de un tamaño adecuado y que sea introducida como un <tapón> de vapor, la inyección lenta de lamuestras demasiado grandes provoca un ensanchamiento de la bandas y una pobre resolución .Elmétodo mas común de inyección de muestra implica el uso de una micro jeringa para inyectar unamuestra liquida o gaseosa a través de un diafragma o <septum> de goma de silicona en una cámara devaporización instantánea situada en la cabeza de la columna (la cámara demuestra normalmente estaunos 50°C por encima del punto de ebullición del componente menos volátil de la muestra. Configuración de la columna y del horno para la columna. En cromatografía degases se usan dos tipos generales de columnas, las rellenas, y las abiertas o capilares. Hasta la fecha lamayor parte de las cromatografía de gases se ha realizado con columnas rellenas. Sin embargo, en laactualidad esta situación está cambiando rápidamente y parece probable que en un futuro próximo,Capítulo 4 38 40.
Cromatografía de gasesexcepto para ciertas aplicaciones especiales, las columnas de relleno sean sustituidas por columnasabiertas más eficaces y rápidas. Las columnas cromatográficas varían desde menos de 2 hasta 50m delongitud o más. Están construidas con acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. La temperatura de la columna es una variable importante para que un trabajo preciso ha deregularse a las décimas de grado, por ello la columna normalmente se introduce dentro de un horno detemperatura controlada , la temperatura optima de la columna depende del punto de ebullición de lamuestra y del grado de separación requerida. Sistemas de detección. El detector ideal para cromatografía de gases tiene las siguientescaracterísticas.1.- adecuada sensibilidad2.- buena estabilidad y reproducibilidad3.-respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud4.-intervalo de temperaturas de trabajo comprendido desde la temperatura ambiente hasta al menos400°C5.-tiempos de respuesta cortos que sean independientes del caudal6.-alta fiabilidad y manejo sencillo7.-respuesta semejante para todos los soluto s o por el contrario una respuesta selectiva y altamentepredecible para uno o más tipos de soluto8.-no destructivo de la muestra. Resolución (Rs). Existe una magnitud que expresa el poder de resolución de la columna yque se denomina resolución de la columna y se define: 2 𝑡 𝑟2 − 𝑡 𝑟1 𝑅𝑠 = 𝑊 𝑏1 + 𝑊 𝑏2Si se toma W como el ancho medio de los picos, la ecuación queda: 2 𝑡 𝑟2 − 𝑡 𝑟1 𝑅𝑠 = 𝑊 Para los picos que están próximos entre sí Wb1 y Wb2 serán lo suficientemente parecidos comopara que baste medir sólo uno.Capítulo 4 39 41.
Cromatografía de gases Como lo muestra la figura, la resolución 1.5 nos da una separación prácticamente completa delos solutos, mientras que una resolución de 0.75 no lo hace. A una resolución de 1, la zona X contienecasi 4% de Y y viceversa, a una resolución de 1.5 la superposición es de aproximadamente 0.3%. Para elmismo tipo de empaque, la resolución puede mejorarse alargando la columna y por lo tantoaumentando el número de platos teóricos. Tipos de Columnas. Existen dos tipos de columnas, principalmente, de relleno y capilares osemicapilares. Contiene la fase estacionaria y en ella tiene lugar la separación cromatográfica Las columnas de relleno suelen ser de cobre, acero inoxidable, aluminio, vidrio y teflón; con undiámetro interior entre 2 y 4 mm y una longitud entre 2 y 3 m. La eficacia está en torno a 1.000-2.000(platos teóricos/m). Suelen emplearse para muestras poco complejas, máximo 10 componentes. Lacolumna está rellena de un material sólido (soporte), finamente dividido y homogéneo; recubierto, poruna capa de 0,05-1 μm de espesor, de fase estacionaria líquida. Está configurada en forma helicoidal, conun diámetro de unos 15 cm, para poder ser instalada en el horno termostatizado Fase estacionaria. Elección de la fase estacionaria de una columna cromatográfica ha de reuniruna serie de requisitos como: o  Baja volatilidad, su punto de ebullición debe de ser por lo menos 100 C superior a la temperatura máxima de operación de la columna.  Estabilidad térmica.Capítulo 4 40 42.
Cromatografía de gases  Inercia química.  Los valores del factor de capacidad (k´) y del factor de selectividad (α) de los analitos deben estar dentro de los intervalos aconsejados. La separación en cromatografía gas-líquido se debe a los diferentes coeficientes de reparto delanalito entre la fase móvil y la fase estacionaria y tiene que haber un cierto grado de solubilidad de loscompuestos con la fase estacionaria. Por ello, una característica muy importante de la fase estacionariaes la polaridad. Siguiendo el principio de "semejantes disuelven a semejantes" los solutos se retienenmás en las fases líquidas de polaridad parecida, lo que permiten obtener mejores separaciones. Las fases estacionarias compuestas de hidrocarburos y de dialquilsiloxanos son poco polares, lascompuestas por poliéster son muy polares. En cuanto a posibles compuestos objeto de separación, losalcoholes, ácidos y aminas son polares; los ésteres cetonas y aldehidos tienen polaridas intermedia; yson de baja polaridad los hidrocarburos saturados. Otro factor a tener en cuenta son los límites de temperatura que puede soportar la faseestacionaria, el límite inferior será el punto de fusión o temperatura a la que la viscosidad de la faselíquida es muy elevada, lo que haría disminuir la eficacia. El límite superior es la temperatura a la que la opresión de vapor de esta fase sea 0,1 mm Hg (250 C inferior al punto de ebullición) por encima de estatemperatura se produce arrastre de la fase líquida, lo que lleva consigo efectos en el detector (ruido,suciedad), interferencias con los solutos y en suma, deterioro de la columna. En una fase líquida cualquiera, una serie homóloga se eluye según orden creciente de número deátomos de carbono. Si la fase es no polar, los solutos no polares eluyen según orden creciente de puntode ebullición. En una fase polar se retendrán más los solutos polares que los no polares a igualdad depuntos de ebullición. Otro aspecto a desarrollar, relacionado con la fase estacionaria, es el soporte sólido empleado en lascolumnas de relleno; el objetivo es el de proporcionar una superficie elevada donde depositar la faselíquida en forma de película muy fina para proporcionar una mayor superficie de contacto entre fasemóvil y fase estacionaria. 2 Las características de los soportes sólidos son, una elevada superficie específica (1m /g); unasuperficie homogénea; estabilidad térmica; geometría adecuada; baja dispersión de tamaño de laspartículas, entre 150-250 μm; dureza mecánica; inercia química y naturaleza porosa.Capítulo 4 41 43.
Cromatografía de gases Los soporte, más generalizados, son los de silíceo como las tierras de diatomeas o sintéticos; devidrio y de polifluorocarbonados (teflón). Los soportes de diatomeas están constituidos por residuos dealgas unicelulares diatomáceas que se unen formando filamentos. Hay unas 10.000 especies de diatomeas con esqueletos diferentes, pero parecida estructura. Tienen 2una superficie específica de 1 m /g. El constituyente mayoritario es de anhídrido silícico SiO (90%), 2 otratado con un fundente alcalino a 1.600 C se obtiene el producto comercial conocido como ChromosorbW de superficie poco adsorbente por lo que es muy útil para separar compuestos polares. Otro soporte es el de polvo de ladrillo refractario conocido como Chromosorb P, C-22 y Sterchomel,tiene mayor resistencia mecánica y superficie específica que el anterior, pero es muy activo y no sepuede utilizar con compuestos polares. Los soportes de silicatos en columnas de relleno y en las paredes interiores de sílice fundida, en lascolumnas capilares, provocan adsorciones no deseadas de analitos polares, lo que da como resultadopicos cromatográficos distorsionados. Se ha demostrado que este fenómeno se debe a los grupos silanol (-SiOH) que se forman en lasuperficie de los silicatos debido a la humedad. El silanol tiene gran afinidas por las moléculas orgánicaspolares. Este proceso puede desactivarse por sililación con dimetilclorosilano , Cl Si(CH ) , que elimina el 2 3 2H del silanol formando ClH. Columnas capilares. Las columnas capilares son de dos tipos básicos: WCOT, de pared recubierta y SCOT, de soporte recubierto. Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finísima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de relleno donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente alas WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última, ya que en su fabricación se emplean mayorescantidades de fase estacionaria, al ser la superficie de intercambio mayor. Por orden de eficacia, enprimer lugar están las WCOT, luego las SCOT y por último las columnas de relleno. Las columnas WCOT se fabrican a partir de sílice fundida, conocidas como columnas tubularesabiertas de sílice fundida o FSOT. Estas columnas se fabrican a partir de sílice especialmente pura, sinCapítulo 4 42 Recommended
CROMATOGRAFÍA Marco Vinicio Robles Aguilar

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