Source: https://www.jove.com/video/55334/seguimiento-vivo-del-desarrollo-del-edema-y-patologa-microvascular-en?language=Spanish
Timestamp: 2018-07-17 17:52:45+00:00

Document:
In Vivo Tracking of Edema Development and Microvascular Pathology in a Model of Experimental Cerebral Malaria Using Magnetic Resonance Imaging | Protocol (Translated to Spanish)
La malaria es un importante problema de salud mundial. 1 La malaria severa se caracteriza en parte por la afectación cerebral y es a menudo un factor pronóstico deficiente. La afectación cerebral es frecuente en niños menores de cinco años en áreas de alta transmisión de la malaria y representa la principal causa de muerte relacionada con el paludismo en ese grupo de edad. 1 Aunque el tratamiento agresivo puede salvar vidas, la detección de la malaria cerebral, especialmente en las primeras etapas, puede ser difícil. Los procesos patológicos implicados en la malaria cerebral incluyen la interrupción microvascular y el edema cerebral, que puede conducir a la hinchazón cerebral severa. En este artículo, presentamos un protocolo de resonancia magnética (MRI) que permite el cerebro entero de imágenes in vivo de la malaria experimental cerebral (ECM). Métodos de imágenes de alta resolución de cerebro entero han sido ampliamente subutilizados en esta enfermedad, a pesar de que se sabe poco sobre cómo ECM inicia en el centroSistema nervioso o qué mecanismos específicos conducen a la enfermedad. La RMN in vivo , que abarca todo el cerebro, representa una importante herramienta de investigación para obtener una mejor comprensión de la patología de la ECM. La RM es capaz de evaluar la inflamación cerebral cerebral global, que recientemente se ha reconocido que es un importante predictor de la muerte no sólo en ECM, sino también en la malaria cerebral humana. La inflamación cerebral grave ocurre en la enfermedad mortal y representa una de varias características patológicas entre los modelos ECM y la enfermedad humana, una enfermedad que se caracteriza por alteraciones tanto inflamatorias como microvasculares. 4
La ECM puede inducirse en ratones CBA o C57BL mediante la infección con el ANKA letal de Plasmodium berghei. 5 El inicio de la MEC ocurre típicamente entre los días 6 y 10 después de la infección y resulta en ajuste, ataxia, dificultad respiratoria y coma, que conducen al rapMuerte. 4 La Escala Rápida de Coma y Comportamiento Murino (RMCBS) es una puntuación útil para evaluar los síntomas clínicos de ECM. Consta de 10 parámetros, cada uno puntuado de 0 a 2, con una puntuación máxima posible de 20. 6 Recientemente, hemos mostrado un buen acuerdo entre la gravedad de las puntuaciones RMCBS en ratones ECM y los cambios patológicos demostrados por la RM. En este protocolo, describimos la inducción de ECM en ratones y la resonancia magnética in vivo de ratones con ECM.
Todos los experimentos con animales descritos en este artículo se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices estándar de la Federación de Asociaciones de Científicos de Laboratorio (FELASA) y de la Sociedad de Laboratorios de Zoología (GV-SOLAS) y fueron aprobados por las autoridades alemanas locales en Karlsruhe (Regierungspräsidium Karlsruhe , Alemania). Tenga en cuenta que el nivel 2 de biosavianza se aplica al trabajo con esporozoítos de mosquitos y Plasmodium berghei ANKA.
Infectar los mosquitos Anopheles stephensi con Plasmodium berghei ANKA alimentándolos durante 15 min en un ratón gametocitó- mico. Mantenga los mosquitos infectados a 80% de humedad y 21 ° C.
Recoger a los mosquitos hembras de su jaula de 17 a 22 días después de la comida de sangre. Colóquelos en hielo para anestesiarlos.
Usando fórceps, coloque de tres a cuatro mosquitos en una lámina de vidrio cubierta con una gota de medio RPMI frío. Coloque la diapositiva debajo de un microscopio.
<Li> Usando una pinza, estirar cuidadosamente el mosquito entre la cabeza y el cuerpo. Aísle la glándula salival usando una jeringa y una aguja. Repita este procedimiento con los mosquitos restantes.
Recoger las glándulas salivales de la diapositiva de vidrio por succión con una pipeta de vidrio y recogerlos en un tubo de centrifugación de 1,5 ml.
NOTA: Dependiendo de las tasas de infección, por lo general se pueden obtener de 8.000 a 15.000 esporozoitos infecciosos por glándula salival.
Durante aproximadamente 3 min, aplastar las glándulas salivales aisladas dentro del tubo de centrífuga con un pequeño bastón de plástico para aislar los esporozoitos del tejido de la glándula salival.
Centrifugar durante 3 min a 1.000 xg y 4 ° C para purificar los esporozoitos del tejido restante.
Pipetear el sobrenadante, que contiene los esporozoítos (SPZ), a un nuevo tubo de centrífuga y contar los esporozoitos purificados en un hemocitómetro Neubauer.
Ajustar la concentración de esporozoitos purificados a 10.000 / ml añadiendo phSolución salina tamponada con osphate.
Inyectar un total de 1.000 esporozoitos (0.1 ml) en las venas de la cola de ratones C57BL / 6 consanguíneos para iniciar la infección. Para facilitar las inyecciones, coloque los ratones C57BL / 6 en un contenedor y coloque las colas en agua caliente (aproximadamente 37 ° C) para ayudar con la visualización de las venas de la cola;
NOTA: La inyección en sí es un procedimiento corto que se puede realizar en pocos segundos.
Una vez al día, verifique la parasitemia en la sangre en los frotis de sangre desde el día 3 en adelante después de la infección SPZ.
NOTA: La monitorización de la parasitemia se ha visualizado previamente en un artículo JoVE de Mueller et al. 8
Evalúe los ratones una vez al día con la puntuación Rapa Murina Coma y Escala de Comportamiento (RMCBS), comenzando a partir del día 5 después de la inyección de esporozoitos.
NOTA: Una descripción detallada de este procedimiento, incluyendo una demostración en video, ha sido publicada por Caroll et al. 6
EvaluarLos ratones con imágenes por resonancia magnética de acuerdo con la puntuación RMCBS y la pregunta de investigación a tratar. 6
2. Configuración de imágenes de resonancia magnética
Realice resonancia magnética en un escáner de animales pequeños de 9.4T usando un resonador de volumen para la transmisión de radiofrecuencia y una bobina receptora de superficie de 4 canales en fase. Encienda el baño de agua con temperatura controlada a 42 ° C para mantener la temperatura corporal del ratón.
Inducir la anestesia en una cámara utilizando 2% de isoflurano y aire comprimido hasta que el ratón ya no reacciona a una pitada de dedo. Mantener la anestesia en 1-1.5%.
Coloque un catéter de vena de la cola en la vena de la cola del ratón. Coloque el ratón para MRI colocándolo propenso y con una espalda crunched en una cama de animal equipada con un headlock y barra de dientes para minimizar el movimiento de la cabeza. Tenga cuidado de no enderezar la columna cervical del ratón.
Conecte un sistema de inyección de agente de contraste al catéter de la vena de la cola. Utilice un sistema de inyección a medida lleno de una jeringuilla de Gd-DTPA (0,3 mmol / kg) o utilice un tubo de PE conectado a una jeringa de Gd-DTPA (0,3 mmol / kg).
Aplique el ungüento para ojos dexpantenol en ambos ojos. Coloque la bobina de la cabeza del receptor de superficie de 4 canales en fase en la cabeza del ratón. Coloque una almohadilla de respiración en la parte posterior del ratón y conéctelo a un dispositivo de monitorización de la respiración.
3. Protocolo de imágenes
NOTA: Elija secuencias de imágenes del protocolo que se enumeran a continuación de acuerdo con las preguntas de investigación que se tratarán. Todos los parámetros listados son válidos para el software de MRI, pero puede que tenga que ajustarse si se utilizan otros programas de software.
Comience realizando una exploración de localización para asegurarse de que el cerebro del ratón está en el isocentro del imán.
Para evaluar cualitativamente el edema vasogénico, utilice imágenes ponderadas en 3D T2 seleccionando una secuencia RARO de varias secciones.
Ingrese el siguiente paEn el software MRI: tiempo de repetición = 2.000 ms, tiempo de eco = 22 ms, resolución isotrópica = 0.1mm, campo de visión = 20 x 10 x 12 mm 3 ; Matriz = 200 x 100 x 120, ángulo de vuelco = 90-180 °; (Spin-echo) y factor raro = 8. Inicie la secuencia y espere 10 min 48 s para adquirir las imágenes en bruto.
Para evaluar cuantitativamente el edema vasogénico, realice una relajometría T2 seleccionando una secuencia de eco de spin múltiple y múltiples hendiduras.
Utilice los siguientes parámetros: tiempo de repetición = 3.100 ms, tiempo de eco = 8-136 ms en incrementos de 8 ms, número de rebanadas = 17, grosor de corte = 0.7 mm, en resolución plana = 0.116 mm x 0.116 mm, campo de visión 20 X 20 mm ^ { 2 }, matriz = 172 x 172, ángulo de vuelco = 90 - 180 grados; (Spin-echo). Inicie la secuencia y espere 8 min 53 s para adquirir las imágenes en bruto.
Para evaluar cuantitativamente el edema vasogénico y el edema citotóxico, llevar a cabo difusión ponderada de imagen / coeficiente de difusión aparenteFficient (ADC) seleccionando una secuencia de difusión de EPI de spin-eco.
Utilice los siguientes parámetros: tiempo de repetición = 3.400 ms, tiempo de eco = 20 ms, grosor de corte = 0.7 mm, número de rebanadas = 17, número de direcciones sensibilizadas a la difusión = 30, valor b = 1.500 s / mm2, δ = 3 ms , Δ = 9 ms, factor de aceleración de codificación de Fourier parcial = 1,51, campo de visión = 12 x 15 mm2, matriz = 96 x 128, resolución en el plano = 0,125 mm x 0,117 mm, ángulo de inclinación = 90-180 grados y Número de cortes de saturación (sagital) = 1. Inicie la secuencia y espere 7 min 56 s hasta que se adquieran las imágenes en bruto.
Para evaluar las microhemorragias, utilice la proyección de imagen ponderada 3D T2 *. Seleccione una secuencia FLASH compensada por flujo.
Introduzca los siguientes parámetros en el software MRI: tiempo de repetición = 2.000 ms, tiempo de eco = 22 ms, resolución isotrópica 0.08 mm, campo de visión = 32 x 15 x 8 mm 3 , tamaño de la matriz = 400 x 188 x 100 y fÁngulo del labio = 12 grados. Inicie la secuencia y espere 15 min 40 s para adquirir las imágenes en bruto.
Para evaluar la permeabilidad arterial, use el tiempo de angiografía de vuelo seleccionando una secuencia 3D FLASH.
Utilice los siguientes parámetros en el software MRI: tiempo de repetición = 16 ms, tiempo de eco = 3,5 ms, grosor de corte = 0,07 mm, resolución en el plano = 0,104 x 0,104 mm, campo de visión = 20 x 10 mm 3 , matriz = 192 x 192 x 142 y ángulo de giro = 15 grados. Inicie la secuencia y espere 7 min 16 s hasta que las imágenes sean adquiridas.
Para evaluar la disrupción de la barrera hematoencefálica, utilice imágenes 3D ponderadas T1 antes y después de una inyección de agente de contraste de 0,3 mmol / kg. Seleccione una secuencia FLASH de frecuencia de radio estropeada con una excitación global de radiofrecuencia.
Utilice los siguientes parámetros de secuencia en el software MRI: tiempo de repetición = 5 ms, tiempo de eco = 1,9 ms, resolución isotrópica = 0,156 mm, campo de visión 20 x 18,7X 18,7 mm ^ { 3} , matriz 128 x 120 x 120 y ángulo de vuelco = 8,5 ° ;. Inicie la secuencia y espere 1 minuto 14s hasta que las imágenes sean adquiridas.
Para analizar la disrupción de la barrera hematoencefálica, restar imágenes 3D no mejoradas T1 de imágenes mejoradas T1 con la herramienta aritmética o calculadora de imágenes en ImageJ. Evaluar las imágenes de sustracción para un aumento de la señal, que corresponde a la barrera hematoencefálica. 9
Para analizar el volumen cerebral, utilice 3D nativo T1 o 3D ponderada conjuntos de datos. Delinear el cerebro del bulbo olfatorio al cerebelo usando el editor de segmentación. 10
Procesar los datos de relaxometría T2 con software de MRI o usar un procedimiento de ajuste de mínimos cuadrados no lineal. 11 Proceso de difusión de los datos ponderados para obtener mapas ADC utilizando MRI sofTware o caja de herramientas FDT (ver Tabla de Materiales ).
Colocar las regiones de interés manualmente en las diferentes regiones anatómicas.
NOTA: La colocación automática de regiones de interés puede registrarse incorrectamente debido a una hinchazón cerebral significativa. Los valores T2 y ADC de las regiones anatómicas elegidas se obtienen de esta manera.
Para analizar el volumen de la microhemorragia, se delinean las microhemorragias, que aparecen como focos ovoides, oscuros en conjuntos de datos ponderados T2 *, utilizando el editor de segmentación.
En los ratones C57BL / 6, los primeros síntomas clínicos de ECM pueden observarse entre los días 6 y 10 después de la infección con esporozoitos de P. berghei ANKA . ECM se desarrolla en 60-80% de los ratones infectados y rápidamente progresa al coma y la muerte en 24 a 48 h. En contraste, los ratones que no desarrollan ECM mueren después de la segunda semana después de la infección de la anemia grave debido a la hiperparasitemia. 12
En la RM, los signos más tempranos de ECM son visibles en el bulbo olfatorio, que pertenece al sistema olfativo del ratón y se encuentra en la parte rostral del cerebro. Un aumento de la disrupción de la barrera hematoencefálica (observada en imágenes ponderadas con contraste T1) y un aumento de fluido (aumento de la señal T2 en las imágenes ponderadas en T2, relajometría T2 y imágenes ponderadas por difusión) indican edema vasogénico tempranoEn el bulbo olfatorio que ya está presente en la enfermedad leve (puntuación RMCBS 20-16) y comienza a propagarse a medida que aumenta la gravedad de la enfermedad. Las imágenes relativas de la señal T1 ayudan a detectar la disrupción sutil de la barrera hematoencefálica ( Figura 1 ). La disrupción de la barrera hematoencefálica y el edema vasogénico progresan de una manera específica. Estos cambios patológicos se extienden a lo largo de la corriente migratoria rostral, una ruta migratoria para los neuroblastos, hacia el tronco encefálico, que se alcanza en la enfermedad muy grave (RMCBS dolor 9-0). En los mapas T2, la gravedad del edema vasogénico puede cuantificarse dibujando regiones de interés en regiones anatómicas específicas, como se demuestra en la Figura 2 . Para cada región, se puede obtener un tiempo de relajación T2 que aumenta con el aumento del edema. Junto con el edema vasogénico y la alteración de la barrera hematoencefálica, la inflamación cerebral comienza a medida que aumenta la gravedad de la ECM. El volumen cerebral indicativo de edema comienza a aumentar significativamente en ratones moderadamente enfermos como comEn comparación con la línea de base y un aumento adicional en los ratones gravemente enfermos ( Figura 3 ).
La patología microvascular, que se evidencia por microhemorragias y un aumento del contraste de susceptibilidad vascular (correspondiente al flujo lento), se produce después de los primeros signos de alteración de la barrera hematoencefálica y edema vasogénico y puede visualizarse con imágenes ponderadas T2 *. Las microhemorragias predominan en el bulbo olfatorio ( Figura 4 ). El número de microhemorragias aumenta con la enfermedad progresiva. Con la enfermedad progresiva las microhemorragias también son evidentes en la corteza, los ganglios basales, el cerebelo, la sustancia blanca y el tronco encefálico.
Disminución de la permeabilidad arterial se ve por el tiempo de vuelo de angiografía como un signo de alteración macrovascular en paralelo a los cambios microvasculares. El infarto cerebral no es un hallazgo clave en ECM. En una enfermedad muy grave, sin embargo,La disminución del ADC puede ser identificada, indicando infartos cerebrales.
Figura 1: Perturbación de la barrera hematoencefálica. ( A ) Una imagen coronal 3D T1 ponderada representativa. Un aumento en la señal T1 es visible en la región central del bulbo olfatorio. ( B ) En la imagen de señal relativa T1 correspondiente (imagen de pre-contraste T1 restada de la imagen de post-contraste T1), la extravasación del agente de contraste es más fácil de delinear. La extravasación del agente de contraste es visible en las regiones corticales frontales (flechas blancas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: T2 RelaxOmetría. Los mapas T2 de la muestra a diferentes alturas de un ratón gravemente enfermo con una puntuación RMCBS de 5 ( A ) y de la exploración basal ( B ) se muestran en escala de color, en escala de grises y en escala de grises con ROI como superposiciones coloreadas. Azul oscuro = RMS, verde = corteza, turquesa = cápsula externa, amarillo = ganglios basales, azul claro = DMS, naranja = tálamo y rojo = tronco encefálico Por favor presione aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Mediciones del Volumen del Cerebro. El volumen cerebral aumenta significativamente en ratones moderadamente enfermos (RMCBS 15-10). Se muestran valores representativos de 10 ratones. Los datos se presentan como la desviación estándar media. Se usó una prueba t de Student pareada para analizar las diferencias en el sujetadorEn la hinchazón entre los grupos. En ratones moderadamente / gravemente enfermos, el volumen cerebral aumentó significativamente en comparación con la línea de base (p = 0,021 / 0,001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Microhemorragias. Se muestran imágenes representativas T2 * de un ratón antes del comienzo de la infección en etapa sanguínea ( A ) y el día 8 después de la infección con una puntuación RMCBS de 14 ( B y C ). En la primera imagen, no se observan microhemorragias ( A ), mientras que en la segunda y tercera imágenes se observan varias microhemorragias, con predominio en el bulbo olfatorio (B: imagen coronal plana, proyección C: 3D con microhemorragias segmentadas).
En este artículo, describimos un protocolo de resonancia magnética cerebral completo para delinear los cambios en la malaria cerebral experimental. Creemos que la RM ha sido subutilizada en la investigación de la malaria hasta la fecha y esperamos que nuestros protocolos ayuden a otros investigadores. Nos gustaría describir algunos puntos adicionales que pueden ser útiles.
Si los ratones gravemente enfermos son imágenes, el posicionamiento es crucial. Debido al aumento de la presión intracraneal, los ratones son susceptibles a la muerte, y por lo tanto, la columna cervical no debe ser estirado. La anestesia también debe mantenerse al mínimo. Si los ratones con enfermedad leve son imágenes, el mejor momento para la RM es de 12-24 h antes de la aparición esperada de los primeros síntomas clínicos. El edema vasogénico leve en el bulbo olfatorio es visible en ratones que no presentan signos clínicos de ECM (puntuación RMCBS de 20).
La longitud del protocolo de RM se puede adaptar de acuerdo con la pregunta de investigación específica. El proto mínimoCol debe incluir una secuencia ponderada en T2 o una relajometría T2 y una secuencia ponderada T2 * para juzgar la presencia de edema vasogénico y carga de microhemorragia / deterioro microvascular. Para obtener imágenes de buena calidad, los artefactos de movimiento deben mantenerse al mínimo. El movimiento se reducirá a través de la colocación apropiada del ratón y manteniendo la frecuencia respiratoria en aproximadamente 60-80 respiraciones por minuto.
Otros métodos de imagen in vivo , como la microscopía intravital, son prometedores en la visualización de alteraciones patológicas en ECM a nivel celular. 14 , 15 , 16 , 17 En comparación con la RM, la microscopía intravital puede ofrecer una alta resolución espacial a costa de cubrir solamente un área cortical limitada. En contraste, la RM es capaz de cubrir todo el cerebro con una resolución de hasta 80 μm. Por lo tanto, la RM puede guiar otras investigaciones celulares identificandoLos sitios de predilección -el comienzo de la enfermedad-, así como la etapa de la enfermedad, que luego puede ser evaluada usando metodologías adicionales. Los hallazgos de resonancia magnética en ECM pueden compararse con alteraciones patológicas detectadas con resonancia magnética en la malaria cerebral humana. Tanto la malaria cerebral humana como la experimental presentan edema vasogénico en áreas de neurogénesis, así como patología microvascular, como infartos cerebrales secundarios en áreas de cuenca. La materia blanca y gris se afecta de una manera similar, y la hinchazón del cerebro tanto en la malaria cerebral humana como experimental implica el tronco encefálico en una enfermedad grave, explicando el estado comatoso. 2 , 7
Esperamos que la imagen in vivo ayudará a desentrañar el mecanismo patológico subyacente de la malaria cerebral, que actualmente sigue siendo difícil de alcanzar. Como el edema y la inflamación cerebral son apenas visibles ex vivo, meThods para visualizar esta patología in vivo son clave y ayudará a mejorar la evaluación de nuevas terapias y vacunas.
Se agradece la asistencia técnica de expertos de Miriam Reinig. AH recibió fondos de una beca postdoctoral de la Facultad de Medicina de la Universidad de Heidelberg. MP es apoyado por un estipendio conmemorativo de la Fundación Else-Kröner-Fresenius. AKM es un beneficiario de una licencia de maternidad estipendio por la Academia DZIF del Centro Alemán de Investigación de Infecciones (DZIF). JP es el ganador de una Beca de Desarrollo Profesional de la Medicina Molecular (HRCMM) de Heidelberg. Además, agradecemos a Julia M. Sattler y Friedrich Frischknecht por brindar una película ejemplar de movimiento de esporozoitos.

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