Source: http://fisquiweb.es/PNob/PNobQ14.htm
Timestamp: 2020-02-19 04:53:48+00:00

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"Por el desarrollo de la microscopía de fluorescencia de alta resolución"
Eric Betzig (1960). USA
Stefan W. Hell (1962).Rumanía
William E. Moerner (1953). USA
Eric Betzig, Stefan W. Hell y William E. Moerner han obtenido el Premio Nobel de Química 2014 por haber superado la limitación que establecía que un microscopio óptico nunca puede tener una resolución mayor de 0,2 micrómetros. Utilizando la fluorescencia de las moléculas los científicos pueden ahora controlar la interacción entre moléculas individuales en el interior de las células, observar las proteínas relacionadas con determinadas enfermedades o rastrear la división celular a una escala de nanómetros.
Durante mucho tiempo la microscopía óptica estuvo limitada por una limitación física en cuanto al tamaño de las estructuras que era posible observar. En 1873 el microscopista Ernst Abbe demostró que la resolución de un microscopio está limitada por, entre otras cosas, la longitud de onda de la luz empleada. Durante la mayor parte del siglo XX esto llevó a creer que los microscopios ópticos nunca serían capaces de observar cosas más pequeñas que, aproximadamente, la mitad de la longitud de onda de la luz, es decir, 0,2 micrómetros (Figura 1). Podríamos observar los contornos de algunos orgánulos de las células, como las mitocondrias, pero sería imposible distinguir objetos más pequeños o, por ejemplo, seguir la interacción entre moléculas de proteínas en la célula. Es algo parecido a ser capaz de ver los edificios de una ciudad sin ser capaz de observar a sus ciudadanos ni saber cómo viven.
Stefan Hell trabajó en la llamada microscopía de fluorescencia, una técnica en la que se usan moléculas fluorescentes para obtener imágenes del interior de la célula. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos fluorescentes que se acoplan específicamente al ADN celular y que después se excitan mediante un breve pulso de luz, haciéndolos brillar durante unos instantes. Si los anticuerpos se acoplan al ADN emitirán luz desde el interior de la célula, ya que el ADN se localiza en su núcleo. De esta manera los científicos pueden ver donde se localizan ciertas moléculas. Pero sólo fueron capaces de localizar grupos de moléculas enredadas en los filamentos del ADN. La resolución es demasiado baja para discernir las cadenas de ADN individuales. Era como ver un rollo de hilo, pero no el hilo.
Cuando Stefan Hell descubrió el fenómeno de la emisión estimulada, se dio cuenta de que podía ser posible idear una especie de nanolinterna capaz de barrer la muestra, nanómetro a nanómetro, y usando la emisión estimulada apagar las moléculas fluorescentes. Al incidir el láser en las moléculas perderían su energía oscureciéndose. En el método propuesto, denominado disminución de la emisión estimulada (STED), un pulso de luz excita las moléculas fluorescentes, mientras que otro pulso de luz la anula, excepto en un volumen de tamaño nanómetrico, en el centro del haz. Sólo este volumen es visible. Barriendo la muestra y midiendo continuamente los niveles de luz, es posible obtener una imagen completa. Cuanto menor sea el volumen que emite fluorescencia en determinado momento, tanto mayor será la resolución de la imagen final. Por lo tanto, en principio, no existe límite a la resolución de los microscopios ópticos. El microscopio STED recoge la luz de una multitud de pequeños volúmenes para crear un conjunto
En contraste, el segundo trabajo premiado, la microscopía de un sola molécula, implica la superposición de varias imágenes. Eric Betzig y W. E. Moerner, independientemente, contribuyeron a su desarrollo.
En 1989 W. E. Moerner consiguió un logro fundamental al ser capaz de medir la absorción de la luz por una sola molécula por primera vez. El experimento abrió la puerta a un futuro nuevo e inspiró a muchos químicos a dirigir su atención hacia las moléculas individuales. Uno de ellos fue Eric Betzig
Ocho años más tarde Moerner dio el siguiente paso hacia la microscopía unimolecular, apoyándose en el descubrimiento de la proteína fluorescente GFP. Descubrió que la fluorescencia de una variante de la GFP podía encenderse y apagarse a voluntad. Cuando excitó la proteína con luz de longitud de onda de 488 nm la proteína comenzó a emitir fluorescencia, pero después de un rato se apagó. Luego, con independencia de la cantidad de luz que incidiera sobre la proteína, la fluorescencia no apareció. Resultó, sin embargo, que la luz de 405 nm podía hacer que la fluorescencia volviera a aparecer. Una vez reactivada volvía a emitir fluorescencia con luz de 488 nanómetros. Con este experimento Moerner demostró que era posible controlar ópticamente la fluorescencia de moléculas individuales.
El verdadero avance llegó en 2005, cuando Eric Betzig se tropezó con proteínas fluorescentes que podrían activarse a voluntad, similares a las moléculas que W. E. Moerner había detectado en 1997. Betzig se dio cuenta de que tal proteína era la herramienta necesaria para implementar la idea que había tenido diez años antes.
Un año más tarde, Eric Betzig demostró, en colaboración con los científicos que trabajan con proteínas fluorescentes, que su idea podía ser llevada a la práctica. Entre otras cosas, acoplaron la resplandeciente proteína a la membrana que envuelve el lisosoma, la estación de reciclaje de la célula. Usando un pulso de luz las proteínas fueron activadas para que emitieran fluorescencia, pero si el pulso era lo suficientemente débil sólo una fracción de ellas comenzaba a brillar. Debido a su reducido número, la distancia entre la mayoría de ellas era superior a los 0,2 micrómetros, el límite de difracción de Abbe.
Por lo tanto, la posición de cada proteína podía ser registrada con mucha precisión con el microscopio. Después de un tiempo, cuando la fluorescencia cesa, se activa un nuevo subgrupo de proteínas. Una vez más, el pulso era tan débil que sólo una fracción de las proteínas comienza a brillar, con lo cual se registra otra imagen. Este procedimiento se repite una y otra vez. Al superponer las imágenes, Betzig obtuvo una imagen de alta resolución de la membrana del lisosoma. Su resolución es mucho más alta que el límite de difracción de Abbe. El innovador método fue publicado en Science en 2006.
Los métodos desarrollados por Eric Betzig, Stefan Hell y W. E. Moerner han conducido a varias técnicas de nanoscopía y actualmente se utilizan en todo el mundo. Los tres galardonados son investigadores que siguen activos encabezando la innovación en el campo de la nanoscopía. Dirigiendo su poderoso nanoscopio hacia los componentes más pequeños de la vida, generan conocimiento de vanguardia. Stefan Hell se asoma al interior de las células nerviosas, vivas, con el fin de comprender mejor las sinapsis cerebrales. W el. E. Moerner ha estudiado las proteínas en relación con la enfermedad de Huntington. Eric Betzig ha rastreado la división celular dentro de los embriones. Estos son solo algunos ejemplos. Una cosa es cierta, el Premio Nobel de Química 2014 ha sentado las bases del desarrollo de un conocimiento de gran importancia para la humanidad.
La imagen del centro muestra las membranas del lisosoma y es una de las primeras tomadas por Betzig utilizando microscopía de una sola molécula. A la izquierda, la misma imagen tomada mediante microscopía convencional. A la derecha se ha ampliado la imagen de las membranas. Téngase en cuenta que la escala de 0,2 micrómetros equivale al límite de difracción de Abbe. La resolución es mucho mejor. Imagen de Science 313:1642 – 1645.

References: resolución 
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