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BOE.es - Documento BOE-A-1994-20802
Documento BOE-A-1994-20802
«BOE» núm. 227, de 22 de septiembre de 1994, páginas 29062 a 29074 (13 págs.)
BOE-A-1994-20802
https://www.boe.es/eli/es/rd/1994/07/01/1488
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, mediante el presente Real Decreto, que se dicta al amparo de la competencia atribuida al Estado en materia de bases y coordinación general de la sanidad por el artículo 149.1.16. de la Constitución, se transpone al ordenamiento jurídico interno la Directiva 93/53/CEE del Consejo, que establece las medidas mínimas de lucha contra determinadas enfermedades de los peces y se incorpora la Decisión de la Comisión 92/532/CEE que establece los planes de muestreo y los métodos de diagnóstico para la detección y confirmación de determinadas enfermedades de los peces.
En su virtud, a propuesta del Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentación, de acuerdo con el Consejo de Estado y previa deliberación del Consejo de Ministros, en su sesión del día 1 de julio de 1994,
A efectos del presente Real Decreto, se aplicarán las definiciones siguientes:
3) Productos de los peces de acuicultura: Los productos derivados de los peces de acuicultura, tanto si están destinados a la cría como los huevos y gametos, como si están destinados al consumo humano.
10) Peces presuntamente infectados: Peces que presenten signos clínicos o lesiones <post mortem> o reacciones dudosas en las pruebas de laboratorio que permitan suponer con motivo la existencia de alguna enfermedad de la lista I o de la lista II.
11) Peces infectados: Peces en los que se confirme oficialmente la presencia de alguna enfermedad de la lista I o de la lista II como consecuencia de los exámenes de laboratorio, o, en el caso de la anemia infecciosa del salmón, tras un examen clínico y un examen <post mortem>.
13) Explotación infectada: Explotación que contenga peces infectados, así como las explotaciones que se han vaciado y todavía no se han desinfectado.
a) De las entradas en la explotación de peces vivos, huevos y gametos, con todos los datos sobre la entrega, el número o peso, el origen, la fuente de suministro y la talla de los peces.
f) Las entradas o salidas de vehículos de la explotación queden sujetas a la autorización del servicio oficial, que establecerá las condiciones necesarias para evitar la propagación del agente patógeno.
1. Deberán retirarse inmediatamente todos los animales.
2. En el caso de explotaciones terrestres deberá evacuarse el agua de todos los estanques para limpiarlos y desinfectarlos.
3. Todos los huevos y gametos, los peces muertos y los peces que presenten signos clínicos de enfermedad serán considerados materiales de alto riesgo y deberán destruirse bajo control del servicio oficial, con arreglo a las disposiciones del Real Decreto 2224/1993, de 17 de diciembre, sobre normas sanitarias de eliminación y transformación de animales muertos y desperdicios de origen animal y protección frente a agentes patógenos en piensos de origen animal.
4. Se matarán y destruirán todos los peces vivos, bajo control del servicio oficial y con arreglo a las disposiciones del Real Decreto 2224/1993, de 17 de diciembre, o bien, aquellos peces que hayan alcanzado la talla comercial y no presenten signo clínico alguno de enfermedad, serán sacrificados bajo control del servicio oficial para su comercialización o transformación con vistas a la alimentación humana.
5. Tras la retirada de los peces, huevos y gametos, se procederá a limpiar y desinfectar lo antes posible los estanques, equipos y todo el material que pueda haberse contaminado, de conformidad con las instrucciones establecidas por el servicio oficial, de modo que se elimine cualquier riesgo de propagación o de supervivencia del agente causante de la enfermedad. Los procedimientos de limpieza y desinfección de una explotación infectada se determinarán de conformidad con el procedimiento comunitario.
6. Todas las sustancias mencionadas en el párrafo d) del apartado 2, del artículo 5 que puedan estar contaminadas serán destruidas o tratadas de tal forma que se elimine todo agente patógeno presente.
7. Se efectuará una investigación epizootiológica con arreglo a lo dispuesto en el apartado 1 del artículo 8 y se aplicarán las disposiciones del apartado 4 del mismo artículo. Tal investigación incluirá la toma de muestras para su análisis en laboratorio.
Cuando peces de origen salvaje que no pertenezcan a una explotación, así como los peces de lagos, estanques u otras instalaciones destinadas a practicar la pesca de recreo o en las que hubiera peces de ornamentación, estén infectados o presuntamente infectados, las Comunidades Autónomas velarán por que se apliquen medidas adecuadas. El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación informará a la Comisión Europea a través del cauce correspondiente y a los demás Estados miembros, de las medidas que hayan adoptado.
2. En caso de que la investigación epizootiológica indique que la enfermedad puede haber sido introducida desde otra cuenca hidrográfica u otra zona costera o haber sido propagada a otra cuenca u otra zona costera como consecuencia del contacto producido por desplazamientos de peces, huevos o gametos, de animales, de vehículos o de personas o por cualquier otro medio, las explotaciones situadas en esas cuencas y zonas costeras se considerarán sospechosas y se aplicarán las medidas que se establecen en el artículo 5. En caso de confirmarse la existencia de la enfermedad, se aplicarán las medidas contempladas en el artículo 6.
Medidas para combatir las enfermedades
de la lista II
c) Ponga o mande poner las explotaciones afectadas bajo control oficial para asegurarse de que únicamente se autoricen los desplazamientos de huevos, gametos o de peces vivos procedentes de las explotaciones infectadas, destinados a otras explotaciones infectadas por la misma enfermedad o a su sacrificio para el consumo humano.
2. Durante un período determinado, las Comunidades Autónomas podrán crear bajo el control del servicio oficial, un programa facultativo u obligatorio de erradicación de las enfermedades de la lista II en explotaciones no autorizadas o en zonas no autorizadas. Durante ese período, estará prohibido introducir peces vivos, huevos o gametos procedentes de explotaciones infectadas o de explotaciones cuyo estatuto sanitario se desconozca, en una zona o una explotación sujeta a dicho programa.
Tras el período contemplado en el párrafo primero, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación informará a la Comisión y a los demás Estados miembros, de los resultados obtenidos.
2 Sin perjuicio de lo dispuesto en la Decisión del Consejo 90/424/CEE, de 26 de junio, relativa a gastos en el sector veterinario, y, en particular, en su artículo 28, las competencias y funciones del laboratorio contemplado en el apartado 1 del presente artículo serán las que figuran en el anexo D.
La presente disposición se dicta al amparo del artículo 149.1.16. de la Constitución, en materia de bases y coordinación general de la sanidad.
Anemia infecciosa del salmón (AIS).
Septicemia hemorrágica viral (SHV).
Institut National de Recherches Vétérinaires.
Bundesforschungsanstalt.
(DIRECCION OMITIDA)
Laboratorio de Sanidad y Producción Animal.
Centre National d'Etudes Véterinaires et Alimentaires.
Laboratoire Central de Recherches Véterinaires.
Fisheries Research Centre.
Instituto Zooprofilattico Sperimentalle delle Venezie.
Centraal Diergeneeskundign Instituut.
Laboratorio Nacional de Investigacao Veterinaria.
Fish Disease Laboratory.
8) Para los laboratorios de diagnóstico, en caso necesario, un servicio de examen <post mortem>, la capacidad necesaria para los exámenes serológicos, histológicos, etc., y la actualización de las técnicas de diagnóstico rápido (a estos efectos procede establecer disposiciones relativas al transporte rápido de muestras).
Las explotaciones se someterán a inspecciones clínicas al menos dos veces al año durante el período comprendido entre octubre y junio, o siempre que la temperatura del agua sea inferior a 14 Grad. C. Los intervalos entre inspecciones deberán ser de cuatro meses como mínimo. Se inspeccionarán todas las unidades de producción (estanques, tanques, acuarios, jaulas de red, etc.) para comprobar si hay peces muertos, de poco peso o que actúen de manera anormal. Deberá prestarse especial atención a la zona de desagüe (si es posible), donde los peces de poco peso tienden a acumularse debido a la corriente de agua.
Para realizar los análisis que requieran las inspecciones, se recogerán entre 30 y 150 peces y/o muestras de fluido ovárico, tal como figura en el cuadro 1 A. Si hubiese truchas arco iris, toda la muestra estará compuesta de peces de esa especie; en caso contrario, la muestra deberá incluir peces de todas las especies presentes siempre que sean propensas a la SHV o a la NHI, de conformidad con el anexo A. Las especies estarán representadas en la muestra por igual. Durante los cuatro años de control inicial previos a la obtención de la autorización, la muestra debe componerse de 150 ejemplares para garantizar que la detección de los portadores del virus se realiza con un margen de aproximación del 95 por 100, estando afectados un 2 por 100 de los animales. En años posteriores (mantenimiento de la autorización), el tamaño de la muestra puede reducirse a 30 a fin de asegurar la detección de los virus con un margen de aproximación del 95 por 100, estando afectados un 10 por 100 de los animales (cuadro 1B).
Antes de su envío o traslado al laboratorio, se extraerán de los peces partes de los órganos que deban examinarse, con tijeras y pinzas estériles, y se introducirán en tubos de plástico que contengan medio de transporte, es decir, medio de cultivo celular con un 10 por 100 de suero de ternera y antibióticos. Puede recomendarse la combinación de 200 UI de penicilina, 200 microg. de estreptomicina y 200 microg.
de kanamicina por ml. aunque podrán utilizarse asimismo otros antibióticos de eficacia probada. Los tejidos que se examinarán serán el bazo, la parte anterior del riñón, el encéfalo y en algunas ocasiones fluido ovárico (cuadros 1A y 1B).
Los tubos se colocarán en recipientes aislados (por ejemplo, cajas de poliestireno de paredes gruesas) con una cantidad suficiente de hielo o de bloques congelados para garantizar la refrigeración de las muestras a una temperatura comprendida entre 0 y 5 Grad. C durante su traslado al laboratorio. Se evitará la congelación.
El examen virológico se iniciará lo antes posible y nunca después de que hayan transcurrido cuarenta y ocho horas desde la recogida de las muestras. Si la longitud de los peces que deban examinarse fuere inferior a 6 cm. podrán enviarse peces enteros al laboratorio en bolsas de plástico refrigeradas como se ha indicado anteriormente.
Una vez en el laboratorio, se homogeneizará completamente el tejido de los tubos (con un triturador, mezclador o mortero) y a continuación se suspenderá el homogeneizado en el medio de transporte original. Si la muestra está formada por peces enteros, es decir, peces de menos de 6 cm. de longitud, éstos se desmenuzarán con tijeras estériles tras haber eliminado la parte del cuerpo posterior a la cloaca, se homogeneizarán según el procedimiento descrito y se suspenderán en el medio de transporte en la proporción 1:10.
El homogeneizado se centrifugará a una aceleración de entre 2.000 y 4.000 xg durante quince minutos en una centrífuga refrigerada a una temperatura comprendida entre 2 y 5 Grad. C, y el sobrenadante se recogerá para su examen.
Si la muestra estaba formada por peces enteros, después de la centrifugación el homogeneizado será expuesto a los antibióticos en el medio de transporte utilizado para la resuspensión, bien durante cuatro horas a temperatura ambiente o durante una noche a 4 Grad. C.
Inmediatamente después de la centrifugación un volumen del sobrenadante se mezclará a partes iguales con un antisuero divalente anti-virus de NPI (cepas de referencia Sp y Ab), diluido en la proporción adecuada, y se incubará conjuntamente durante una hora como mínimo a una temperatura de 15 Grad. C y dieciocho horas como máximo a una temperatura de 4 Grad. C. El título del antisuero deberá ser como mínimo 1:2.000 en una prueba de neutralización en placa del 50 por 100.
Se cultivarán las células BF-2 y EPC o FHM a una temperatura comprendida entre 20 y 25 Grad. C en el medio mínimo fundamental (MEM) de Eagle (o sus modificaciones) co n adición de un 10 por 100 de suero vacuno fetal y antibióticos en concentraciones normales.
Si las células se cultivan en frascos cerrados, el medio se amortiguará con bicarbonato. El medio utilizado para el cultivo de células en unidades abiertas deberá amortiguarse con Tris-HCI (23 mM) y bicarbonato sódico (6 mM) con un pH lo más próximo posible a 7,6, el más idóneo para la multiplicación de virus.
Para cada dilución y cada línea celular se empleará al menos un área celular de 2 cm2 aproximadamente, correspondiente a un pocillo de una placa de cultivo celul ar de 24 pocillos. Se recomienda el uso de placas de cultivo celular, aunque también son aceptables otras unidades con áreas de cultivo similares o mayores.
Los cultivos celulares inoculados se incubarán durante siete días a una temperatura de 15 Grad. C. Si el color del medio de cultivo pasa de rojo a amarillo, lo que in dica la acidificación del medio, se llevará a cabo el ajuste del pH con una solución estéril de bicarbonato, o con una sustancia equivalente, para garantizar la propensión celular a la infección vital.
Los cultivos inoculados se incubarán durante siete días a una temperatura de 15 Grad. C, según se indica en el punto III.4.
Se mezclarán alícuotas de las diluciones con partes iguales de los siguientes reactivos, por separado, y se incubarán durante sesenta minutos a una temperatura de 15 Grad. C:
d) Medio 1:1.
o del modo indicado por el laboratorio de referencia en lo que respecta a la posible citotoxicidad de los antisueros.
De cada mezcla de suero y virus, se inocularán al menos dos cultivos celulares con 50 Ul cada uno, y se incubarán a 15 Grad. C. Se comprobará la aparición de ECP, seg ún se indica en el apartado III.4.
Tras aclarar los pocillos con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se incorporará a los pocillos el virus que se desee identificar en fases de dilución dobles o cuádruples y se dejará reaccionar con el anticuerpo de recubrimiento durante sesenta minutos a 37 Grad. C. Tras el aclarado con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se añadirán anticuerpos con biotinil de la especificidad correspondiente a la de los anticuerpos de recubrimiento y se dejará reaccionar durante sesenta minutos a 20 Grad. C. Después de efectuar otro aclarado como el anterior, se añadirá extrepta vidina conjugada con peroxidasa de rábano (HRP) y se dejará reaccionar durante una hora a 20 Grad. C. Tras efectuar un último aclarado, se visualizará la enzimaligad a utilizando sustratos ELISA adecuados (OPD, TMB u otros).
Número de inspecciones clínicas anuales / Número de peces utilizados para el análisis de órganos / Número de peces utilizados para el análisis de fluido ovárico
a) Explotaciones con reproductores. / 2 / 120 (primera serie). / 30 (primera serie).
/ 150 (segunda serie). / 0
b) Explotaciones con reproductores únicamente. / 2 / 0 / 150 (primera y segunda serie).
c) Explotaciones sin reproductores. / 2 / 150 (primera y segunda serie). / 0
a) Explotaciones sin reproductores. / 2 / 30 (primera y segunda serie). / 0
b) Explotaciones con reproductores. / 2 / 120 (primera serie). / 30 (primera serie).
Número máximo de peces por muestra conjunta: 5.
Mantenimiento de la autorización
a) Explotaciones con reproductores. / 2 / 15 (primera o segunda serie). / 15 (primera o segunda serie).
b) Explotaciones con reproductores únicamente. / 2 / 0 / 30 (primera o segunda serie).
c) Explotaciones sin reproductores. / 2 / 30 (primera y segunda serie). / 0
a) Explotaciones sin reproductores. / 1 / 30 (1) (primera o segunda serie). / 0
b) Explotaciones con reproductores. / 2 / 0 / 30 (primera o segunda serie).
(1) Las muestras deberán haberse recogido entre dos y seis meses después de haber trasladado los peces de agua dulce a agua salada.
Procedimientos de diagnóstico para la confirmación de la necrosis hematopoyética infecciosa (NHI) y de la septicemia hemorrágica viral (SHV), en caso de brotes sospechosos
El diagnóstico de la NHI y de la SHV se podrá realizar mediante alguna de las siguientes técnicas:
A.I.1 Selección de muestras. Para el análisis se seleccionarán como mínimo diez peces que muestren los síntomas típicos de la NHI o de la SHV.
de kanamicina por ml, aunque podrán utilizarse asimismo, otros antibióticos d e eficacia probada. Los órganos que deberán examinarse son el bazo, la parte anterior del riñón y en encéfalo.
Los tubos se colocarán en recipientes aislados (por ejemplo, cajas de paredes gruesas) con una cantidad suficiente de hielo en <bloques congelados> para garantizar la refrigeración de las muestras a una temperatura comprendida entre 0 y 5 Grad. C. durante su traslado al laboratorio. Se evitará la congelación.
Una vez en el laboratorio, se homogeneizará completamente el tejido de los tubos (con un triturador, mezclador o mortero) y a continuación se suspenderá el homogeneizado en el medio de transporte original. Si la muestra está formada por peces enteros, es decir, peces de menos de 6 cm. de longitud, se desmenuzarán con tijeras estériles, tras haber eliminado la parte del cuerpo posterior a la cloaca, se homogeneizarán según el procedimiento descrito y se suspenderán en el medio de transporte en la proporción de 1:10.
Si la muestra ha sido enviada en un medio de transporte (es decir, con exposición a antibióticos), no es necesario aplicar otro tratamiento de antibióticos al sobrenadantes.
El tratamiento con antibióticos tiene por fin controlar la contaminación bacteriana de las muestras y hace innecesaria la filtración con filtros de membrana. Inmediatamente después de la centrifugación, se mezclará un volumen del sobrenadante a partes iguales con un antisuero divalente anti-virus de NPI (cepas de referencia Sp y Ab), diluido en la proporción adecuada, y se incubará conjuntamente durante una hora como mínimo a una temperatura de 15 Grad. C o dieciocho horas como máx imo a una temperatura de 4 Grad. C. El título del antisuero deberá ser como mínimo 1:2.000 en una prueba de neutralización en placa del 50 por 100.
Para cada dilución y cada línea celular se empleará al menos un área celular de 2 cm2 aproximadamente, correspondiente a un pocillo de una placa de cultivo celular, aunque también son aceptables otras unidades con áreas de cultivo similares o mayores.
A.III.3 Incubación de los cultivos celulares.
Los cultivos celulares inoculados se incubarán durante siete días a una temperatura de 15 Grad. C. Si el color del medio de cultivo celular pasa de rojo a amarillo, l o que indica la acidificación del medio, se llevará a cabo el ajuste del Ph con una solución estéril de bicarbonato o con una sustancia equivalente, para garantizar la propensión celular a la infección viral.
La suspensión de la autorización se mantendrá hasta que las pruebas de laboratorio hayan demostrado que el virus en cuestión no es el de la SHV ni el de la NHI.
Se concederá un plazo máximo de cuatro semanas para la identificación del virus, incluido el tiempo necesario para la realización de análisis de los laboratorios de referencia.
Se reunirán, según la línea celular, alícuotas del medio de todos los cultivos/pocillos pertenecientes al cultivo inicial, a continuación de un ciclo de congelación y descongelación de cultivos, y se mezclarán 0,5 ml de medio a partes iguales con el antisuero anti-NPI descrito en el apartado A.II.2; la mezcla se incubará durante sesenta minutos a una temperatura de 15 Grad. C. A continuación, se inocula rá en cultivos celulares en diluciones de 1:1 y 1:100, como se describe en el apartado A.II.2. La inoculación podrá ir precedida de la preincubación de las diluciones con el antisuero divalente antivirus de NPI, con una dilución adecuada.
Los cultivos inoculados se incubarán durante siete días a una temperatura de 15 Grad. C, según se indica en el apartado A.III.4.
Si se observase la existencia de ECP en un cultivo celular se eliminarán las células mediante centrifugación a baja velocidad o por filtración con membrana (0,45 microm.) y se diluirá en medio a 1:100 y 1:10.000 en un medio de cultivo celular.
De cada mezcla de suero y virus, se inocularán al menos dos cultivos celulares con 50 ul cada uno, y se incubarán a 15 Grad. C. Se comprobará la aparición de ECP, seg ún se indica en el apartado A.III.4.
Los cultivos teñidos se prepararán utilizando solución salina de gliceros y se examinarán con luz ultravioleta incidente, utilizando oculares de 10 x o 12 x y objetivos de 25 x o 40 x con aperturas númericas >0,7 y >1,3, respectivamente. Las diluciones del antisuero inicial y de inmunoglobulina conjugada con isotiacianato de fluoresceína dependerán de la disposición del microscopio elegido o disponible.
Tras aclarar los pocillos con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se incorporará a los pocillos el virus que se desee identificar en fases de dilución dobles o cuádruples y se dejará reaccionar con el anticuerpo de recubrimiento durante sesenta minutos a 37 Grad. C. Tras el aclarado con solución amortiguadora PBS-Tween-20, se añadirán anticuerpos con biotinil de la especificidad correspondiente a la de los anticuerpos de recubrimiento y se dejará reaccionar durante sesenta minutos a 20 Grad. C. Después de efectuar otro aclarado com el anterior, se añadirá estreptav idina conjugada con perioxidasa de rábano (HRP) y se dejará reaccionar durante una hora a 20 Grad. C. Tras efectuar un último aclarado, se visualizará la enzima ligada utilizando sustratos ELISA adecuados (OPD, TMB u otros).
La suspensión del órgano tratada con antibióticos y antisuero antivirus de NPI se diluirá a 1:10 y 1:10.000 en un medio de cultivo celular; las alícuotas se mezclarán a partes iguales con los reactivos enumerados en el apartado A.IV.1 y se incubarán durante sesenta minutos a 15 Grad. C.
Si no se han observado ECP después de siete días, se realizarán subcultivos a partir de los cultivos inoculados con sobrenadante y medio (B.II.3). C. Técnicas rápidas de diagnóstico (IFAT, ELISA)
Entrada en vigor: 23 de septiembre de 1994.
Fecha de derogación: 08/10/2008
SE DEROGA, por Real Decreto 1614/2008, de 3 de octubre (Ref. BOE-A-2008-16090).
el anexo F, por Orden de 19 de septiembre de 2001 (Ref. BOE-A-2001-18134).
los arts. 6.1.a) y 14.1 y se añade el anexo G, por Real Decreto 3481/2000, de 29 de diciembre (Ref. BOE-A-2001-1435).
SE SUSTITUYE el Anexo F) y se modifica la disposición final primera, por Real Decreto 138/1997, de 31 de enero (Ref. BOE-A-1997-3979).
TRANSPONE la Directiva 93/53/CEE, de 24 de junio (Ref. DOUE-L-1993-81152).
DE CONFORMIDAD con la Decisión 92/532/CEE, de 19 de noviembre (Ref. DOUE-L-1992-81874).
Real Decreto 2224/1993, de 17 de diciembre (Ref. BOE-A-1994-1181).
Directiva 91/67/CEE, de 28 de enero (Ref. DOUE-L-1991-80142).
Decisión 90/424/CEE, de 26 de junio (Ref. DOUE-L-1990-81102).

References: artículo 149
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 artículo 5
 artículo 8
 artículo 5
 artículo 6
 artículo 28
 artículo 149
 Real Decreto 
 Real Decreto 
 Real Decreto 

Real Decreto