Source: https://www.jove.com/author/Daniel+M._Suter?language=Spanish
Timestamp: 2018-03-24 12:14:18+00:00

Document:
Protocols and Video Articles Authored by Daniel M. Suter (Translated to Spanish)
Las culturas de las células nerviosas de Aplysia para imágenes de alta resolución de los Conos de Crecimiento Aih Cheun Lee1, Boris Decourt1, Daniel M. Suter1 1Department of Biological Sciences, Purdue University Aplysia californica neuronas desarrollan un gran crecimiento en los conos de la cultura que son excelentes para imágenes de alta resolución de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y de las planchas de las neuronas de células Aplysia bolsa, así como para la creación de una cámara de imágenes de células vivas.
Dinámica De Los Microtúbulos Son Condición Necesaria Para La Familia Dependiente De La Quinasa Src Directivo Crecimiento Cono Current Biology : CB. Jul, 2004 | Pubmed ID: 15242617	Microtúbulos dinámicos explorar el periférico (P) de dominio cono de crecimiento utilizando haces de actina F como guías de polimerización. Dinámica de los microtúbulos son necesarios para la orientación del crecimiento del cono, sin embargo, los mecanismos de reorganización de los microtúbulos durante el giro cono de crecimiento no son bien entendidos. En este sentido, abordar estos problemas mediante el análisis de crecimiento de los eventos de dirección de cono in vitro, evocadas por perlas derivatizadas con la superfamilia de las Ig APCAM proteínas de adhesión celular. La inhibición farmacológica de ensamblaje de los microtúbulos con bajas dosis de taxol o vinblastina dado lugar a la rápida eliminación de los microtúbulos del dominio de P, con poco efecto en la central (C) los microtúbulos axonales o la motilidad basado en actina. Temprano durante las interacciones de destino, se detectó F-actina de montaje y Src activado, pero pocos los microtúbulos, en APCAM sitios de unión de cuentas. La mayoría de los microtúbulos extendidos hacia los objetivos de cuentas después de la atenuación flujo F actina ocurrido. Extensión de los microtúbulos durante las respuestas de crecimiento de dirección del cono fue reprimida fuertemente por amortiguación dinámica de los microtúbulos con bajas dosis de taxol o vinblastina. Estos tratamientos también inhibe las respuestas de crecimiento de cono de giro, así como de montaje actina focal y la acumulación de Src activa en los sitios de unión de talón. Estos resultados sugieren que los microtúbulos dinámicos transportar señales implicadas en la regulación de Src dependientes de complejos de adhesión APCAM implicados en la dirección del crecimiento del cono.
Análisis De Alta Resolución De La Morfología Neuronal Cono De Crecimiento Por La Fuerza Comparativa Atómica Y Microscopía Óptica Journal of Neurobiology. Dec, 2006 | Pubmed ID: 17058186	Conos de crecimiento neuronales son móviles estructuras sensoriales en la punta de los axones, transducir información de guía en movimientos direccionales hacia las células diana. La morfología y la dinámica de los conos de crecimiento neuronal han sido bien caracterizadas con técnicas ópticas, sin embargo, muy poca información cuantitativa está disponible en la estructura tridimensional y las propiedades mecánicas de las subregiones distintas. En el presente estudio, hemos fotografiado los conos Aplysia un gran crecimiento después de la fijación química con el microscopio de fuerza atómica (AFM) y comparar directamente los datos con imágenes obtenidas por métodos de microscopía de luz. Imagen de fuerza constante en el modo de contacto, en combinación con la fuerza distantes mediciones revelaron una altura promedio de 200 nm para el periférico (P) de dominio, a 800 nm para la transición (T), y zona de 1200 nm para la central (C) de dominio, respectivamente . Las imágenes de AFM muestran que los filopodial F-actina paquetes son más rígidos que rodea la F-actina redes. Agrandamiento de consejos filopodios son de 60 nm más altos que los ejes correspondientes. Las mediciones de las propiedades mecánicas de las regiones específicas del cono de crecimiento con el AFM reveló que la zona T es más rígido que el P y el dominio C. La comparación directa de la AFM y los datos ópticos adquiridos por contraste de interferencia diferencial y microscopía de fluorescencia reveló una buena correlación entre estos métodos de imagen. Sin embargo, el AFM proporciona información sobre la altura y el volumen en una resolución más alta que los métodos de fluorescencia con frecuencia utilizados para estimar el volumen de los compartimentos celulares. Estos hallazgos sugieren que las mediciones de AFM en los conos de crecimiento en directo proporcionará una comprensión cuantitativa de cómo las proteínas se pueden mover entre las diferentes regiones del cono de crecimiento.
Análisis Cuantitativo De La Dinámica De Los Microtúbulos Durante La Guía De Adherencia Mediada Por El Crecimiento Del Cono Developmental Neurobiology. Oct, 2008 | Pubmed ID: 18698606	Durante la adhesión mediada neuronales crecimiento microtúbulos orientación de cono experimentar reordenamientos importantes. Sin embargo, se desconoce si los microtúbulos se extienden a sitios de adhesión debido a cambios en más de fin de polimerización y / o la dinámica de la translocación, debido a los cambios en las interacciones de los microtúbulos-actina, o porque siguen la reorganización del citoesqueleto de actina. En este caso, se utilizó la microscopía fluorescente de speckle para cuantificar directamente la dinámica de los microtúbulos y la actina en los conos de crecimiento Aplysia que se vuelven hacia perlas recubiertas con el APCAM molécula de adhesión celular. Durante la fase inicial de la formación de adherencias, los microtúbulos dinámicos en el dominio periférica preferentemente explorar APCAM-bolas antes de cambios en la morfología de crecimiento cono y el flujo retrógrado de actina. Curiosamente, estos microtúbulos primeros tienen las tasas sin cambios de polimerización, pero que pasan menos tiempo en la translocación retrógrada debido a la disociación del flujo de actina. Por otra parte, los microtúbulos explorar el sitio de adherencia pasar menos tiempo en la despolimerización. Durante la fase posterior de generación de fuerza de tracción, los avances de dominio centrales y más microtúbulos en el ámbito periférico se extienden debido a la atenuación del flujo de la actina y la limpieza de las estructuras de F-actina. Los microtúbulos en la zona de transición y el dominio central, sin embargo, trasladar hacia el sitio de adherencia en concierto con arcos y haces de actina, respectivamente. Llegamos a la conclusión de que las moléculas de adhesión guiar a los conos de crecimiento neuronal y reorganización de microtúbulos subyacentes en gran parte por la regulación diferencial de actina microtúbulos movimientos de acoplamiento de la actina y la función de la región cono de crecimiento y no por el control de más de gama velocidades de polimerización.
Microtúbulos Mediada Por Src Trata De La Tirosina Quinasa De Los Conos De Crecimiento Neuronal Molecular Biology of the Cell. Nov, 2008 | Pubmed ID: 18716055	Src tirosina quinasas de la familia son importantes enzimas de señalización en el cono de crecimiento neuronal, y que han sido implicados en el direccionamiento del axón, sin embargo, la localización detallada, el tráfico y las funciones celulares de las quinasas Src en los conos de crecimiento en vivo no son claras. En este caso, hemos clonado dos nuevos Aplysia quinasas Src, denominado SRC1 y Src2, y nos muestran su asociación tanto con la membrana plasmática y los microtúbulos del citoesqueleto en el cono de crecimiento por imágenes de células vivas, inmunocitoquímica y fraccionamiento de la célula. Activado Src2 se enriquece en las puntas de filopodios. Curiosamente, Src2 mejorados con vesículas verdes fluorescentes de la proteína-positivo endocítica y estructuras tubulovesicular someterse a los microtúbulos mediada por los movimientos que son bidireccionales en el ámbito central y sobre todo retroceso en el ámbito periférico. Para probar aún más el papel de los microtúbulos en el tráfico de Src en el cono de crecimiento, los microtúbulos se agotaron, ya sea con o tratamiento nocodazole vinblastina, resultando en un aumento en los niveles de Src2 la membrana plasmática en todos los ámbitos de crecimiento del cono. Nuestros datos sugieren que los microtúbulos regular el nivel de estado estacionario de Src activa en la membrana plasmática por mediación de reciclaje retrógrado de endocitosis Src. Expresión de constitutivamente activos SRC2 resultados en ya filopodios que sobresalen de los conos de crecimiento más pequeñas, que implican a Src2 en el control del tamaño de filopodios y lamellipodia.
Cortactin Colocalizes Con La Actina Filopodial Y Se Acumula En Sitios De Adhesión IgCAM En Los Conos De Crecimiento Aplysia Journal of Neuroscience Research. Apr, 2009 | Pubmed ID: 19021290	Ambos IgCAMs y el citoesqueleto de actina desempeñan un papel crítico en la motilidad cono de crecimiento neuronal y la orientación. Sin embargo, no está claro cómo los receptores IgCAM transducción de señales desde la membrana plasmática para inducir la remodelación de la actina. Estudios anteriores han demostrado que la agrupación local y la inmovilización de APCAM, el homólogo de NCAM Aplysia, induce la actividad de quinasa Src y polimerización F-actina en el dominio periférica de conos cultivadas bolsa Aplysia crecimiento de las células. Por lo tanto, quisimos comprobar si el sustrato de quinasa Src y cortactin regulador de la actina podría ser un vínculo molecular entre la actividad de Src y montaje de actina durante APCAM mediada por la orientación cono de crecimiento. En este caso, hemos clonado Aplysia cortactin y demostró que es abundante en el sistema nervioso. La inmunotinción de los conos de crecimiento mostró una fuerte colocalización de cortactin con F-actina en haces filopodial y en el borde de ataque de lamellipodia. La perturbación del citoesqueleto indica que la distribución de cortactin depende en gran medida los filamentos de actina. Además, activa Src colocalized con cortactin en las regiones de reunión, incluyendo la actina borde de ataque y consejos filopodios. Por último, se observó que cortactin, al igual que la F-actina, se localiza en APCAM sitios de adhesión que median orientación cono de crecimiento. En conjunto, estos datos sugieren que cortactin es un mediador de IgCAM activada por la Asamblea de actina participan en la motilidad cono de crecimiento y orientación.
Especies Reactivas De Oxígeno Regular F-actina De La Dinámica En Los Conos De Crecimiento Neuronal Y El Crecimiento Neurítico Journal of Neurochemistry. Feb, 2009 | Pubmed ID: 19054285	Las especies reactivas del oxígeno son bien conocidos por sus efectos nocivos debido a la oxidación de los lípidos, las proteínas y el ADN que en última instancia resultará en la muerte celular. La acumulación de pruebas indica que las especies reactivas del oxígeno también tienen importantes funciones de señalización en la proliferación celular, la diferenciación, la motilidad celular y la apoptosis. En este caso, probamos la hipótesis de si las especies reactivas de oxígeno juegan un papel fisiológico en la regulación de la F-actina estructura y la dinámica de los conos de crecimiento neuronal. La reducción de los niveles citoplasmáticos de las especies de oxígeno reactivas con un eliminador de radicales libres, N-terc-butil-alfa-phenylnitrone, o mediante la inhibición de fuentes específicas de especies de oxígeno reactivas, tales como NADPH oxidasas o lipoxigenasas, redujo el contenido de la F-actina en el dominio periférica de los conos de crecimiento. Fluorescente speckle microscopio reveló que estos tratamientos causado actina inhibición de montaje, la reducción del flujo retrógrado de actina y el aumento de la contractilidad de las estructuras de actina en la zona de transición conocida como arcos, posiblemente mediante la activación de la vía Rho. Reducción de los niveles de especies reactivas de oxígeno en última instancia, dio lugar en el desmontaje del citoesqueleto de actina. Cuando las neuronas se cultivaron durante la noche en condiciones de reducción de radicales libres, la formación de cono de crecimiento y desarrollo de neuritas fueron gravemente dañados. Por lo tanto, se concluye que los niveles fisiológicos de las especies reactivas de oxígeno son fundamentales para mantener una dinámica de F-actina del citoesqueleto y el control de crecimiento de las neuritas.
La Topografía Y La Nanomecánica De Los Conos De Crecimiento Neuronal En Vivo Analizada Por Microscopía De Fuerza Atómica Biophysical Journal. Jun, 2009 | Pubmed ID: 19527666	Los conos de crecimiento neuronales son estructuras móviles situadas en el extremo de los axones que se traducen en información de guía extracelular en los movimientos direccionales. A pesar de la importante función de los conos de crecimiento en el desarrollo neuronal y la regeneración, se sabe relativamente poco sobre la topografía y las propiedades mecánicas de las distintas regiones subcelulares cono de crecimiento en estado activo. En este estudio, hemos utilizado el AFM para estudiar el dominio de P, la zona T, y el dominio C de los conos de crecimiento vivo Aplysia. La altura media de estas regiones se calculó a partir de contacto de modo imágenes de AFM a ser 183 + / - 33, 690 + / - 274, y 1322 + / - 164 nm, respectivamente. Estos hallazgos son consistentes con los datos derivados de las imágenes en modo dinámico de vivir y ponerse en contacto con las imágenes en modo de los conos de crecimiento fijos. Indentación nano-mediciones indican que los módulos de elasticidad del dominio C y T región zona fruncido varió entre 3-7 y 7-23 kPa, respectivamente. La gama de los módulo medido elásticas del dominio P fue 10-40 kPa. Imágenes de alta resolución del dominio P sugieren que sus resultados elástico relativamente alto módulo de una densa malla de filamentos de actina en lamellipodia y de haces de actina en la filopodios. El aumento de la rigidez mecánica de los dominios de P y T es probable importante para apoyar y transducción de la tensión que se desarrolla durante la dirección del crecimiento del cono.
Rescate De Partículas Infecciosas De Alfavirus Premontado Nucleocápside Núcleos Journal of Virology. Jun, 2011 | Pubmed ID: 21471237	Alfavirus son pequeños, esféricos, envuelto, de sentido positivo, de una sola hebra de ARN, los virus responsables de la humana considerable y enfermedades de los animales. Uso de la microinyección de núcleos prefabricados como una herramienta, el sistema ha sido creado para estudiar el montaje y proceso de gemación del virus Sindbis, el miembro del tipo de los alfavirus. Se demuestra la liberación de virus infecciosos como partículas de células que expresan Sindbis glicoproteínas de la envoltura del virus después de la microinyección de nucleocápsidas virus de Sindbis purificados desde el citoplasma de las células infectadas. Además, se muestra que nucleocápsidas ensamblados in vitro son similares a los aislados en el citoplasma de las células infectadas con respecto a su capacidad para ser incorporados en viriones envueltos después de microinyección. Este sistema permite el estudio del proceso en ciernes alfavirus independiente de una infección auténtica y proporciona una plataforma para estudiar las necesidades virales y del huésped para ciernes.
El Rol Emergente De Las Fuerzas De Elongación Axonal Progress in Neurobiology. Jul, 2011 | Pubmed ID: 21527310	Una comprensión de cómo los axones alargada que se necesita para desarrollar estrategias racionales para el tratamiento de enfermedades neurológicas y lesiones nerviosas. Cono de crecimiento mediada por el alargamiento neuronal se considera actualmente como ocurre a través de la dinámica del citoesqueleto que implican la polimerización de la actina y la subunidades de tubulina en el extremo del axón. Sin embargo, trabajos recientes sugieren que los axones y conos de crecimiento también generan fuerzas (a través de la dinámica del citoesqueleto, quinesina, dineína, y miosina), las fuerzas de inducir la elongación axonal, y los axones alargan por el estiramiento. Esto se destacan los resultados de revisión de sistemas de modelos diferentes (Drosophila, Aplysia, Xenopus, pollo, ratón, rata y las células PC12), apoyando el papel de las fuerzas, los movimientos a granel de los microtúbulos, y la adición de masa intercaladas en el proceso de elongación axonal. Creemos que una respuesta satisfactoria a la pregunta: &quot;¿Cómo los axones crecen?&quot; vendrá por la integración de los mejores aspectos de la biofísica, la genética y la biología celular.
Imágenes De Células Vivas De La Motilidad Neuronal Cono De Crecimiento Y Orientación in Vitro Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 2011 | Pubmed ID: 21748670	El cono de crecimiento neuronal, una estructura muy móviles en la punta de los procesos neuronales, es un excelente sistema modelo para estudiar los movimientos direccionales celulares. Si bien los métodos bioquímicos y genéticos dio a conocer las interacciones moleculares entre el ligando, el receptor, de señalización, y el citoesqueleto asociados a proteínas que controlan el crecimiento axonal y la orientación, la formación de imágenes in vitro de células vivas se ha convertido en un enfoque fundamental para la disección de los mecanismos celulares de la motilidad cono de crecimiento y orientación. Importantes conocimientos sobre estos mecanismos han sido obtenidos de los estudios que utilizan los grandes conos de crecimiento elaboradas por Aplysia californica las neuronas, un modelo de sistema excepcional para imágenes de células vivas de una serie de razones. Neuronas identificadas se pueden aislar y fotografiada a temperatura ambiente. Aplysia conos de crecimiento son de cinco a diez veces más grande que los conos de crecimiento de otras especies, haciéndolas adecuadas para cuantitativa de alta resolución de imagen de la dinámica de las proteínas del citoesqueleto y enfoques biofísicos. Por último, la proteína, el ARN, las sondas fluorescentes, y pequeñas moléculas pueden ser microinyectados en el cuerpo celular neuronal para la localización y estudios funcionales. Este capítulo describe el cultivo de las neuronas celulares Aplysia bolsa, formación de imágenes de células vivas de los conos de crecimiento neuronal utilizando contraste de interferencia diferencial y fluorescentes speckle microscopía así como el ensayo contenida interacción talón para inducir la adhesión mediada por la orientación del cono de crecimiento in vitro.
Cómo Seguir El Camino Correcto Nature Neuroscience. Jan, 2012 | Pubmed ID: 22193250

References: resolución 
 resolución 
 Resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución