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Deber Nº 1 de Medicamentos II - Hplc
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE INGENIERIA ESCUELA DE INGENIERIA QUIMICA LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL
Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
Josué Sánchez CI. 20077499 Yelibeth Ochoa CI. 20520989 RESUMEN
La cromatografía líquida de alta eficacia se utiliza para la separación y análisis cuantitativo de una amplia variedad de mezclas, especialmente aquellas en las cuales sus componentes no son volátiles o son térmicamente inestables. Esta técnica se empleó con el propósito de separar y determinar cuantitativamente el fenol, tolueno y cafeína presentes en una muestra problema, se empleó una columna C18, una fase móvil compuesta por metanol:agua y un detector de absorción UV/Visible. La identificación de los compuestos presentes en la muestra problema se realizó mediante una comparación con los cromatogramas obtenidos para una solución estándar con los mismos componentes. Se optimizó el sistema cromatográfico a fin obtener la mejor separación. Bajo estas condiciones se obtuvo el cromatograma de la muestra problema, por el método de normalización de áreas, se calculó la composición de la misma obteniéndose que la muestra problema presentó la siguiente composición en los compuestos estudiados: 0.1193 g/l de fenol, 0.0248 g/l de cafeína y 1.0042 g/l de tolueno.
En las cromatografías clásicas, en las que la fase móvil es un líquido que fluye a través de un sólido por el efecto de la gravedad para alcanzar alta resolución sería necesario emplear columnas excesivamente largas, lo que se traduciría en un desarrollo muy lento de los cromatógramas. Estos inconvenientes se han resuelto con la cromatografía de alta resolución, en la que se trabaja con pequeñas columnas, muy empaquetadas y forzando el paso de la fase móvil mediante elevadas presiones, con lo que se consiguen separaciones muy efectivas en un plazo muy corto de tiempo. [2]
En la cromatografía líquida los componentes de una mezcla son llevados a través de una fase estacionaria fijada dentro de una columna mediante el flujo de una fase móvil líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias de la velocidad de migración entre los componentes de la muestra, que vienen condicionadas por la naturaleza de los analitos y su interacción con las fases.[4]
Un término importante en la cromatografía liquida es la elución de los componentes de una muestra, la cual comprende el lavado de una parte de la muestra disuelta en la fase móvil a través de una columna de fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. [1]
La cromatografía líquida de alta eficacia o HPLC (High Performance Liquid
Chromatografy) es el método más sofisticado y moderno de la cromatografía líquida, que utiliza partículas de fase estacionaria para el interior de la columna con diámetros muy pequeños entorno a 3-10 µm, para aumentar la eficiencia, maximizando el tiempo y el área
de contacto entre el analito y las fases minimizando así la altura del plato, el diámetro. De
manera se ha conseguido reducir el tamaño de la columna a 10-30 cm de largo y 4-10
de diámetro en la HPLC, y el tiempo necesario para la separación de minutos a 1h. [4]
Esta técnica es utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna cromatógrafica. Además, la alta presión permite usar relleno de tamaño de partícula reducido para lograr la separación de componentes a flujos razonables. [5]
El proceso cromatográfico puede ser considerado como un conjunto de fuerzas que compiten de manera selectiva por un compuesto (analito o soluto) para, por una parte, fijarlo al relleno de la columna o fase estacionaria, o llevarlo disuelto en los líquidos que fluyen a través de la columna o fase móvil. Los distintos tipos de fuerzas entre fase estacionaria y solutos definen los distintos tipos de cromatografía. [3]
Tabla 1. Tipos de cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). [3]
Dependiendo de la fase estacionaria, el mecanismo de separación puede ser reparto, adsorción, tamaño molecular (geles) e incluso cambio iónico, aunque los métodos más utilizados están basados en reparto y adsorción. [2]
En la cromatografía HPLC, se deben cumplir cuatro reglas básica: Fase móvil y estacionaria han de ser de polaridad opuesta, todos los solutos han de ser solubles en la fase móvil (es decir, polaridad similar), todo soluto que entra en la columna ha de salir de ella (propagación) y, a ser posible, con los distintos solutos separados (migración
diferencial).[1]
El esquema fundamental de un cromatógrafo de alta resolución está constituido por un deposito y un dispositivo de bombeo de la fase móvil que opera a elevada presión (hasta 500 atm.), un sistema de inyección de la muestra, columnas resistentes, generalmente e
acero inoxidable, rellenas de fase estacionaria, un detector y un sistema de registro gráfico. La columna y los detectores van introducidos en termostatos. Los detectores más utilizados en esta técnica están basados en absorciometría UV y en medida de índices de refracción, siendo los cromatógramas obtenidos semejantes a los de cromatografía gaseosa con
detector diferencial. En la figura se muestra el instrumental de la cromatografía
Chromatografy). [4]
El detector se coloca en el extremo final de la columna, y la señal se transforma en una gráfica en función del tiempo, un cromatógramas, que consta de una serie de picos simétricos. Los picos sobre el eje de los tiempos se emplean para identificar tanto cualitativa (posición en el eje) como cuantitativamente (área bajo los picos) los componentes de la muestra. [3]
La cromatografía cuantitativa se basa en una comparación de la altura o del área del pico de un analito con el de uno o más estándares. Ambos parámetros varían linealmente con la concentración. La cromatografía cualitativa se basa en la comparación de la posición de los picos (tiempos determinados de retención) con cromatogramas estándares. [3]
La efectividad de la columna cromatográfica para la separación de solutos depende de las velocidades relativas a las cuales las especies son eluidas. La eficiencia máxima para la cromatografía líquida ocurre a muy bajas velocidades de flujo. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamaño de la partícula del empaque de la columna, se reduce la viscosidad de la fase móvil o se incrementa la temperatura.[3]
Los experimentos de optimización tienen como objetivo reducir el ensanchamiento de banda o bien modificar las velocidades relativas de migración de los componentes. Las variables cinéticas incrementan la altura de plato de una columna producen un ensanchamiento de banda. Por otra parte, las velocidades de migración son modificadas por aquellas variables que afectan a los factores de capacidad y selectividad de la solución. [5]
Se dice que la operación es optima si tiene tiempo de análisis corto, alta resolución, alto número de etapas y caída de presión mínima, para lograr estas condiciones se aplican ciertos cambios como el de la polaridad de la fase móvil, de flujos, de pH, salinidad, temperatura y viscosidad y por ultimo cuando nada de esto funciona se recurre al remplazo de la columna. [1]
Se debe tener cuidados al aplicar cambios, por ejemplo no se puede disminuir y aumentar el caudal de forma brusca porque se generan cambios de presión importantes. Al disminuir el caudal se desplazan los picos en el tiempo. Una forma de mejorar la resolución es aumentar el número de platos teóricos de la columna, este recurso es costoso en términos de tiempo, a no ser que se aumente mediante una reducción de la atura de plato, lo cual se puede conseguir variando el caudal, disminuyendo el tamaño de partícula y reduciendo la viscosidad del disolvente. [1]
La cromatografía HPLC, es especialmente adecuada para compuestos poco volátiles , termolábiles e iónicos. Algunas aplicaciones incluyen sustancias tan diversas como aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenos, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometálicas y una gran variedad de sustancias inorgánicas. [3]
Entre algunos de los ejemplos de la gran aplicación de HPLC en la industria de alimentos se tiene la detección y cuantificación de cafeína y teobromina que son alcaloides muy importantes en el café, té y el cacao, especialmente por su acción estimulante, en la determinación de azúcares y determinación cuantitativa de polisacáridos como el almidón, las dextrinas, los dextranos, el glucógeno, la inulina, la celulosa, las hemicelulosas, las pectinas, así como sustancias mucilaginosas de algas marinas y las gomas vegetales. A demás es usada en la separación de triglicéridos, para el estudio de aceites y grasas adulteradas, y en la determinación de contenido de Vitaminas A y sus precursores (β caroteno) en margarina y aceites de hígado por fase inversa, y del contenido en Vitamina D en leche en polvo y cereales por fase normal. [3]
En la industria petrolera, es un método importante, para analizar las composiciones de casi todos los productos que van saliendo, del cracking, los tipos de gasolinas y separación de impurezas presentes en estas, los compuestos orgánicos destinados a síntesis, entre otras tantas aplicaciones, por lo que se puede decir que es una técnica muy versátil. [4]
Con la práctica de laboratorio se pretende conocer la aplicabilidad de la cromatografía HPLC en la determinación de una serie de compuestos aromáticos especialmente la cafeína presente en una muestra problema, estudiar las diferencias moleculares y en propiedades fisicoquímicas que se aprovechan para la separación, así como también aprender a seleccionar las condiciones de flujo y composición de la fase móvil a usar de manera de optimizar la separación de los analitos en la columna cromatográfica.
METODOLOJIA EXPERIMENTAL
El equipo fue manipulado por técnico del laboratorio, el cual ya por adelantado había preparado el equipo y las soluciones a emplear con el fin de agilizar la práctica y dado la complejidad que tiene el uso del cromatógrafo, el técnico es el único encargado de su manipulación.
1. Determinación del tiempo muerto por inyección de K 2 Cr 2 O 7 .
El K 2 Cr 2 O 7 es una especie que no es retenida por la columna, por lo tanto a partir de la inyección de una pequeña muestra de esta especie es posible determinar el tiempo muerto, a partir del cromatograma 1, se tiene que:
Donde Tm es el tiempo muerto.
Figura.1 Cromatograma de inyección de K2Cr2O7
2. Determinación de tiempo de retención ajustado, factor de retención, factor de retención relativa, número de platos teóricos y resolución.
Estos parámetros se determinan para el cromatograma 2, el cual se muestra en la Figura.2
Figura.2 Cromatograma 2 Inyección de Mezcla Isocrática.
De este cromatograma se extrae la siguiente información:
Tabla 1. Datos Extraídos del Cromatograma para cada componente.
 Tiempo de retención ajustado.
Por lo tanto para la Cafeína
De igual manera se obtienen para los demás componentes.
Tabla 2. Tiempos de retención ajustado.
Tiempo de retención ajustado (min)
B Fenol
C Tolueno
 Factor de Retención.
Para la Cafeína:
Tabla 3. Factor de retención para cada unos de los componentes.
Factor de retención K’
 Factor de Retención relativa.
Donde B es el soluto que eluye de último entre dos solutos.
Para Cafeína y Fenol:
De igual manera se obtienen para los demás componentes:
Tabla 4. Factor de retención relativa para cada pareja de solutos adyacentes.
Cafeína-Fenol
Fenol- Tolueno
 Número de Platos teóricos.
Tabla 5. Número de platos teóricos para cada componente.
 Resolución.
Tabla 6. Resolución para cada pareja de solutos adyacentes.
Resumen de Resultados para el cromatograma 2.
Tabla 7. Resultados para el cromatograma 2.
El mismo procedimiento fue aplicado para el cromatograma 3,4 y 5, obteniéndose los siguientes resultados.
Cromatograma 3.
(70:30)(80:20)
Resumen de Resultados para el cromatograma 3.
Tabla 8. Resultados para el cromatograma 3.
Factor de retención relativa
Cromatograma 4.
Figura.4 Cromatograma 4 Inyección de Mezcla Gradiente. FM MeOH:H2O (70:30)
Resumen de Resultados para el cromatograma 4.
Tabla 9. Resultados para el cromatograma 4.
Cromatograma 5.
Figura. 5 Cromatograma 5.Inyección de muestra problema.
Resumen de Resultados para el cromatograma 5.
Tabla 10. Resultados para el cromatograma 5.
3. Determinación de la concentración de la muestra problema.
Siguiendo el procedimiento que se describe a continuación para determinar la concentración de los estándares.
Para la preparación de estándares debe pesar aproximadamente 0,6500 g de Tolueno, 0,156 g de Fenol y 0,0625 g de Cafeína, y disolver con Etanol en un balón aforado de 50 mL y diluir a volumen. Tendrá solo tres estándares para la elaboración de la curva de calibración. Para el primer estándar, tomar un volumen de 2 mL de la solución anterior en un balón aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase móvil. Para el segundo estándar debe tomar un volumen de 1 mL de la solución inicial, trasvasar a un balón aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase móvil. Tendrá solo tres estándares para la elaboración de la curva de calibración.
Para el tercer estándar debe tomar un volumen de 0,5 mL de la solución inicial, trasvasar a un balón aforado de 25 mL y diluir a volumen con fase móvil.
Siguiendo las reglas de dilución y toma de alícuotas se determina la concentración de patrón.
Para el Tolueno:
Del balón de 50ml se toman 2ml y se diluye en un balón aforado de 25ml.
Para el Fenol:
Del balón de 50ml se toman 1ml y se diluye en un balón aforado de 25ml.
Del balón de 50ml se toman 0,5 ml y se diluye en un balón aforado de 25ml.
partir del cromatografo 4,
con los valores de área correspondiente al pico para cada
componente se calcula el factor de respuesta.
Tabla 11. Datos del Cromatograma 4
3320,33374
359,51184
1466,08813
A partir del cromatografo 5,
componente se calcula la cantidad inyectada de cada componente.
Tabla 12. Datos del Cromatograma 5
3295,03125
343,83981
1415,76111
El análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) aplicada a una muestra de Fenol, Cafeína y Tolueno, se realizó en una columna C18 (químicamente enlazada) y una fase móvil compuesta por una mezcla de metanol-agua; por lo que se está en presencia de una cromatografía en fase reversa. Así que, el primer compuesto en eluir es el que presenta mayor afinidad a la fase móvil esto es, el más polar, cafeína luego el fenol y por último el tolueno.
Figura 1 . Estructura del fenol, tolueno y cafeína respectivamente.
En los cromatogramas obtenidos se empleó como sistema de detección, luz UV/Visible, porque los tres compuestos estudiados absorben a longitudes de onda cercanas a 254nm.
La identificación de los compuestos presentes en la muestra problema se realizó mediante una comparación con los cromatogramas obtenidos para una solución estándar con los mismos componentes, encontrándose que los factores de retención de cada componente estudiado son: para el fenol 2880.7 l/g, la cafeína 132813.35 l/g y el tolueno 1409.70 l/g.
El sistema cromatográfico se optimizó a partir de un sistema de elución por gradiente, en el cual la composición de la fase móvil cambia en el tiempo. Así que para optimizar el sistema En primer lugar, se aumentó el flujo de fase móvil desde 0,8 a 1,5ml/min (Figura 5 Anexa), resultando que el componente más afín a la fase estacionaria (tolueno) eluye en un menor tiempo, mejorando el sistema cromatográfico al disminuir el tiempo de análisis. En segundo lugar, se modificó la composición de la fase móvil, de una relación metanol:agua de 70:30 a 80:20, por lo que aumenta el poder eluyente de la fase móvil, disminuyendo una vez más el tiempo al cual eluye la muestra menos polar (Figura 3). Bajo estas condiciones se obtuvo un nuevo cromatograma a partir del cual, por el método de normalización de áreas, se calculó la composición de la muestra problema. Es importante destacar la eficiencia del método y su importancia a nivel industrial ya que este tipo de cromatografía es muy utilizada para análisis en control de calidad en diferentes áreas como alimentos, fármacos, contaminantes y otros.
 Es posible separar compuestos aromáticos, tales como tolueno, fenol y cafeína, de una muestra por medio de cromatografía liquida de alta precisión (HPLC).
 La separación de los analitos por cromatografía HPLC puede optimizarse mediante el uso de una elución en gradiente, variando el flujo y la composición de la fase móvil.
 Para el sistema estudiado se alcanzó una mejor separación en un menor tiempo, con un mayor número de etapas y con menor altura de la etapa utilizando una mezcla metanol: agua 80:20 y un flujo de 1,5ml/min.
 La diferencia en la polaridad de las moléculas de fenol, tolueno y cafeína debido a grupos sustituyentes en su estructura aromática, permite que puedan ser separados mediante una cromatografía liquida HPLC.
 En la separación de aromáticos como fenol, tolueno y cafeína por cromatografía liquida es posible utilizar un detector de absorción de UV/visible, ya que dichas moléculas absorben a longitudes de onda cercana a 259nm gracias a los grupos insaturados que contienen dichas moléculas.
 La cromatografía liquida de alta precisión (HPLC) tiene múltiples aplicaciones en la industria química, farmacéutica, en medicina para control de calidad de los productos, para caracterización de efluentes, para la determinación de gran cantidad de compuestos presentes en la sangre, entre muchas más.
[1] Skoog y Holler. (2001) Principios de Análisis Instrumental. McGraw-Hill Interamenricana de España, S.A.U. Madrid, España. Capitulo 26.
[2] http://elac.uca.edu.ni/pd/karlschen/files/745/2416/Cromatografia.pdf
[3]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_teo_y_apli
caciones.pdf
[4]http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_principios
_y_aplicaciones.pdf
[5] http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/manchi/alim/trabajos09-10/trabajo4.pdf
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