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título Lección 1: Introducción histórica a la microbiología. Diversidad del mundo microbiano
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Lección 1: Introducción histórica a la microbiología. Diversidad del mundo microbiano.
1. Concepto de microbiología y microorganismo.
La palabra microbiología proviene de tres palabras. Se trata de la ciencia que estudia los microorganismos.
Hablamos de microorganismos como el organismo que debido a su pequeño tamaño escapa a la vista del ser humano, teniendo que utilizar el microscopio para observarlos..
Poseen tres características que determinan el término:
Falta de organización tisular, no forma tejidos.
Para su estudio vamos a utilizar siempre la técnica del cultivo puro.
Son objeto de material de estudio de la Microbiología todas aquellas entidades biológicas acelulares y organismos unicelulares, pluricelulares o cenocíticos, carentes de organización tisular, para cuyo estudio se requiere la metodología del estudio del cultivo puro y que por su tamaño escapan a la perfección del ojo humano.
Estudia la estructura, función, desarrollo, metabolismo, genética, comportamiento, ordenación taxonómica y evolución de los microorganismos, así como el estudio de las actividades de los microorganismos para su explotación y control.
2. Descubrimiento del mundo microbiano.
El descubrimiento del mundo microbiano estuvo condicionado por el descubrimiento del microscopio. Con los microscopios de la época no se podían ver los microorganismos, pero Leeuwenhoke con un microscopio simple tallado por él pudo ver los microorganismos, que los denominó animáculos, eran estructuras en forma de bastón que en realidad de trataban de bacterias.
Fue el primero en ver los microorganismos.
A partir de ese momento tuvieron que pasar casi dos siglos para que sucedieran los siguientes avances en la fabricación de microscopios compuestos y consigo los siguientes avances microbianos, la tinción de gram, la tinción de flagelos.
3. Controversia sobre la generación espontánea.
Otro problema que existía era el de la generación espontánea, en la que se decía que la vida surgía de manera espontánea, también es llamada abiogénesis.
· Francesco Redi abolió la teoría de la generación espontánea en animales.
· Lázaro Spallanzani, era un naturista que vio que la vida surgía de otra vida, refiriéndose ya a los microorganismos. Se le ocurrió hervor unos caldos y cerrarlos, y como no se contaminaban pensó que en el aire había algo, y cuando no los tapaba si que se contaminaban.
· Needham, pensaba que al cerrar los caldos no había oxígeno, por lo que no podía surgir vida.
· Louis Pasteur, fue el encargado en abolir la teoría de la generación espontánea en el mundo microbiano. Pensó que en el aire había gérmenes, por lo que filtro grandes cantidades de aire y lo miró en un microscopio (compuestos), donde pudo ver que había bacterias. ¿Pero como podía demostrar que a partir de ahí surgía la vida?, ideo un experimento en el que tenia una infusión de carne que calentaba (para matar lo que hubiese) y pudo ver que si lo dejaba sin tapar se contaminaba. Lo que hizo después fue calentar esa infusión en unos matraces con cuello de cisne y pudo ver que pasado el tiempo seguía transparente, pudiendo pasar el oxígeno pero no los microorganismos. Cuando inclinaba el matraz se volvía a contaminar la infusión.
· John Tyndall, se dio cuenta que en algunas infusiones estando en el matraz seguían contaminándose y pensó que esos microorganismos se encontraban en dos formas: vegetativas y en forma de resistencia(esporas).
· Esto lo corroboró Ferdinand Cohn que descubrió las endoesporas.
· A Nicolas Appert que intentó conservar alimentos herméticamente cerrados y calentarlos se le conoce con el nombre de appertización.
4. Descubrimiento del papel de los microorganismos en las transformaciones de la materia orgánica, inorgánica y en la producción de enfermedades.
Pasteur estudió las transformaciones químicas que llevaban a cabo los microorganismos, observó que cuando los caldos se contaminaban cambiaban sus características. Aparecía olores pútridos (que venían dados por la utilización de las proteínas), olores ácidos (por la utilización de los azúcares).
Descubrió que los microorganismos estaban fermentando, donde los azúcares se transformaban en ácidos (o alcohol). La Sacchaiomycer cerevisial produce la fermentación alcohólica. Vio que había otros organismos, bacterias lácticas, que transformaban los azúcares en ácidos. También descubrió la fermentación butírica, realizada por microorganismos anaerobios.
A partir de aquí se empezaron a realizar los cultivos puros: que son aquellos cultivos que solo tienen un tipo de microorganismos.
· Emil Hansen y Jeseph Listen, por disoluciones.
· Robert Koch, ideó un método para obtener cultivos puros pero en medios sólidos. Se dio cuenta que si dejada una rodaja de patata se formaban unas agrupaciones (colonias) que procedían de un solo microorganismo. Esa colonia está formada por individuos iguales, formando un cultivo sólido.
Al líquido se añadía gelatina, para solidificar pero no lo hacia por las proteasas que tenía y por que a altas temperaturas se volvía líquida. Pero gracias a Walter Hesse y Fannie Hesse lo logró, utilizando el agar en los medios sólidos.
Microorganismos como agentes biogeoquímicos.
Se pudo ver que había una implicación de los microorganismos en el medio ambiente. A Martinus Beijerinck y a Sergei Winograndsky se les conoce como los padres de la ecología microbiana.
· Beijerinck: realizó cultivos de enriquecimiento (métodos de cultivo que tiene unas sustancias para que crezcan los microorganismos).
También realizó el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno en asociación con leguminosas, como es el caso de Rhizobium. Y también de bacterias libres como las Azotobacter.
· Winograndsky: descubrió las bacterias quimioautótrofas, capaces de fijar el CO2 atmosférico para sintetizar la materia orgánica. También eran quimiolitótrofos, que obtienen la energía de compuestos inorgánicos (Fe2+, amonio, ...).
Microorganismos como agentes productores de enfermedades.
Primero vieron los microorganismos como agentes de enfermedades en plantas e incluso en animales, pero la enfermedad en seres humanos no se había demostrado.
· Semmelweis, trabajaba en un hospital y se dio cuenta que había muchas más muertes de mujeres cuando daban a luz en el hospital que cuando lo hacía en sus propias casas. Se producía la fiebre puerperal y recomendó a los médicos que se lavasen las manos antes de cada intervención.
· Listen, se dio cuenta que las heridas se infectaban y recomendó una disolución de fenol diluido.
· El primero que relacionó un microorganismo con una enfermedad fue Koch. Estudió mucho Bacillus anthracis, que causaba el carbunco. Los granjeros le consultaron porqué se morían muchos de sus animales a causa de una enfermedad. Lo que hizo fue determinar que los animales morían a causa de este microorganismo.
1º Extrajo la sangre de los animales muertos y la miró al microscopio, donde vio unos microorganismos..
2º Cultivó esos microorganismos y vio que crecían.
3º Se los implantó a un animal sano y vio que enfermaba.
4º Observó la sangre y vio los mismos microorganismos del principio.
Después de este experimento redacto unos postulados. Los POSTULADOS DE KOCH.
1º. El patógeno a de estar siempre presente en el enfermo pero no en el sano.
2º. El patógeno se tiene que poder separar en cultivo puro.
3º. El patógeno obtenido de ese cultivo puro ha de producir la enfermedad en un animal sano cuando lo inoculamos.
4º. Hemos de poder reaislar el patógeno del animal que hemos inoculado y ha de ser igual que el inicial.
Después de demostrar la anterior siguió investigando. Esos postulados los volvió a utilizar para demostrar a Mycobacterium tuberculosis o tisis.
No sólo investigó Koch sino que también lo hicieron Pasteur y su grupo. Se crearon dos escuelas:
La alemana donde se encontraba Koch, y la francesa donde estaba Pasteur.
Había enfermedades que no se daban a causa de bacterias sino que eran causadas por virus.
· Chamberland era de la escuela de Pasteur. Construyó unos filtros de porcelana que eran capaces de retener las bacterias para esterilizar materiales líquidos.
· Otros investigadores (Ivanovsky y Beijerinck, por separado) se dieron que usando los filtros de Chamberland que cuando hacían una maceración en plantas y le añadían el líquido filtrado se infectaban, por lo que los agentes infecciosos tenían que ser más pequeños que las bacterias.
· Loeffter y Frosch descubrieron la fiebre aptosa, se trataba de un agente filtrante que causaban enfermedades en animales.
También había virus que infectaban a bacterias, como el bacteriófago T4.
· Wendell Stanley fue el primero en cristalizar un virus, se dieron cuenta que están formados por proteínas y ácidos nucleicos y necesitaban una célula para reproducirse.
· Howard Temin estudió el virus del Sarcoma de Rous, se dieron cuenta que el material del virus era ARN que mediante la transcriptasa inversa daba ADN.
· Montagnier y Galla descubrieron el Virus de la inmunodeficiencia humana.
Desarrollo de la Quimioterapia.
Utilización de compuestos químicos para curar enfermedades.
· Paul Erlich descubrió el Salvarsán 606 que se utilizó para el utilizamiento de la sífilis.
· Gerhard Domagk, encontró el Prontosil rubrum que era efectivo frente a estafilococos y estretococos.
· Alexander Fleming descubrió la penicilina.
· La producción del compuesto la hicieron Florey y Chain.
· Waksman descubrió otros medicamentos,
Desarrollo de la inmunología.
Prevención mediante vacunas.
· Edward Jenner. La viruela está erradicada, pero es un arma biológica. Fue se fijó que las mujeres que cuidaban a las vacas (las vaqueras) no tenían viruela, sufrían una viruela leve, era un tipo que sufrían las vacas llamado virus vacunal. Lo que hizo fue extraer linfa y se lo inoculaba a un niño y ya no presentaba la enfermedad.
Descubrió las vacunas atenuadas.
· Pasteur descubrió una vacuna del cólera aviar.
· Jaime Ferrar Cluá. Descubrió unas vacunas para la tuberculosis, cólera, rabia y tifus.
· Beadle y Tatum establecieron que en los genes estaba la información genética que daban luegar a proteínas.
· Delbrück y Luria, mutaciones.
· Watson y Crick, descubrieron la estructura de ADN.
· Kary Mullis, descubrió una enzima Taq polimerasa. Contribuía en la replicación de la información genética- esta enzima es importante porque amplifica una región de ADN durante largo tiempo. Esto se podía hacer con la replicación, pero para que se abran las cadenas hay que ponerlo a 90º C. Por lo que esta enzima se ponía desde el principio porque es extremófila.
5. La microbiología como ciencia básica y aplicada.
Podemos ver la microbiología como una ciencia básica que se puede estudiar desde distintos puntos de vista como la taxonomía, citología, fisiología, ecología y genética.
También se distinguen distintas ramas cuando es una ciencia aplicada, como la microbiología médica, de alimentos, sanitaria, de la salud, ambiental o industrial.
Los microorganismos son los seres vivos mejor conocidos. Debido a su simplicidad estructural tienen una elevada velocidad de crecimiento. Tienen una gran facilidad de manipulación genética y una gran capacidad de llevar a cabo transformaciones químicas.
6. La microbiología en la actualidad: perspectivas futuras.
Se sigue investigando en la lucha contra las enfermedades infecciosas, se han encontrado nuevos métodos de diagnóstico, nuevas tecnologías de vacunas y se experimenta en la búsqueda de nuevos fármacos.
En la agricultura y la ganadería son importantes como insecticidas biológicos, hay una búsqueda de nuevas cepas fijadoras de nitrógeno, y los microorganismos se utilizan como suplemento en la alimentación animal.
También son importantes en la industria alimenticia y biotecnológica, ya que se utilizan en los controles de calidad, se produce la obtención de enzimas, vitaminas, ácidos orgánicos y se produce una mejora de la producción de un determinado producto.
En el medioambiente también toman un papel importante ya que participan en los ciclos de los elementos, se utilizan en el reciclado de basuras y depuración de aguas, en la eliminación de contaminantes del suelo y, en la decoloración y detoxificación de efluentas textiles, papeleros, ...
“ Es extraordinario como, en todo el mundo, los microbiólogos participan en actividades tan diferentes como el estudio de la estructura de los genes, control de las enfermedades y los procesos industriales basados en la extraordinaria capacidad de los microorganismos para degradar y sintetizar moléculas complejas. La Microbiología es una de las profesiones más satisfactorias porque ofrece a sus facultativos la oportunidad de estar en contacto con el resto de las ciencias naturales y, por ello, contribuir de muchas maneras a mejorar la vida humana” RENE DUBOS
7. Diversidad microbiana: microorganismos con estructura celular procariota y microorganismos con estructura celular eucariota y entidades acelulares.
- Entidades acelulares: virus, viroides, virusoides, ARNs satélites y priones.
Dentro de las entidades acelulares se estudian los virus que son partículas infectivas con organización simple, son considerados parásitos intracelulares obligados, existen en dos formas: una forma extracelular llamada virión y otra intracelular llamada virus.
El virión es metabólicamente inerte, están constituidos por una parte proteica formado por una cápside dentro de la cual se encuentra el ácido nucleico, pudiendo ser ADN o ARN. Al conjunto se le denomina núcleo cápside. Los que solo poseen núcleo cápside se les denomina virus desnudos y los que poseen una envuelta lipídica se llaman virus envueltos. Cuando el virus penetra dentro de la célula el virus se apodera de la maquinaria de la célula para reproducirse. Algunas veces dentro del núcleo cápside hay algunas enzimas como la lisozima que ataca a bacterias, que le permite al virus hacer un poro en la pared de la célula y penetrar.
Virus satélite: está formado por una cápside y ácidos nucleicos. Necesitan infectar al mismo tiempo que otro virus para que se pueda reproducir. Es el caso del virus de la hepatitis D.
Viroide: son partículas infectivas que causan malformaciones en plantas, tienen un gran poder infeccioso. Están formados exclusivamente por ARN circular y simplexo. Posee una serie de plegamientos porque posee regiones homólogas entre sí y se unen, pareciendo una cadena duplexa.
Ácidos nucleicos satélite: son también partículas infecciosas que se encuentran dentro de virus, dentro encontramos los virusoides, son también cadenas simplezas de ARN que se encuentra dentro de la cápside de ARN de otro virus. Se consideran como parásitos de virus, hay casos que se produce una relación muy fuerte entre el virusoide y el virus para que se reproduzcan.
Priones: los descubrió Prusiner, y están formados exclusivamente por proteínas. Son variantes conformacionales de proteínas normales. Lo que hacen es modificar la conformación de PrP haciéndolas patógenas.
- Organismos procariotas: bacterias y arqueas.
Estas células no poseen ningún tipo de membrana unitaria a excepción de la membrana plasmática. No tienen RE, mitocondrias, ... Lo que si tienen son ribosomas de tamaño 70s. Poseen un sistema de membrana que va a ser diferente en bacterias (poseen unos lípidos de membrana diferentes a los que están en arqueas, al glicerol se le unen ácidos grasos mediante enlaces ester) y en arqueas (el glicerol está unido a cadenas isoprenoides mediante enlaces eter).
Disponen también de pared celular que se sitúa por fuera de la membrana plasmática que es la que les confiere la forma, también son diferentes en bacterias y en arqueas.
No hay ningún tipo de reproducción, pero existe intercambio genético que hace que la diversidad aumente, se lleva a cabo mediante: la transformación, la transducción y la conjugación.
Existe otra diferencia entre arqueas o bacterias, el aminoácido por el que empiezan las proteínas también es diferente en ambas, el ARNt es diferente. En bacterias es formil-metionina y en arqueas metionina.
Pueden ser móviles(presentando flagelos y nunca cilios), inmóviles.
- Organismos eucariotas: protozoos y algunos hongos y algas.
Dentro de los hongos lo que nosotros estudiamos son los microscópicos, siendo unicelulares llamados levaduras (viven en lugares con gran cantidad de azúcar) y pluricelulares (que sus células forman filamentos, denominándolos así hongos filamentosos, los filamentos se unen entre sí formando el micelio). Son importantes por:
· Que son agentes productores de enzimas y antibióticos.
· También los hay patógenos.
· son oportunistas.
En general no son fotosintéticos, no tienen cloroplastos. Tiene pared celular diferente a la de los procariotas.
En hongos si se puede dar reproducción asexual, hay unos hongos denominados mucosos que son unos híbridos entre los hongos y los protozoos. Se alimentan de bacterias.
Las algas no son móviles, las hay unicelulares y pluricelulares, disponen de pared celular.
Los protozoos son organismos eucariotas móviles, son muy importantes como patógenos, como es el caso de Plasmodium (malaria).
8. Propuestas de clasificación de los seres vivos.
Los virus y derivados no están encuadrados en cuadrados dentro de los seres vivos.
Vamos a tener que encuadrar los procariotas (bacterias y arqueas) y los eucariotas.
Antes estaban divididos en dos reinos: plantae y animalia. Cuando se descubrieron los microorganismos incluyeron las algas y los hongos en el reino plantae y, bacterias y protozoos en el reino animalia, pero se vieron algunos errores.
Después se descubrió que había unas algas verdeazuladas (cianobacterias) que tenían una estructura muy similar a las bacterias, y metieron este tipo de algas en el reino plantae.
Ernst Haeckel propuso la formación de otro reino que lo llamó protista y donde incluyó algas, bacterias, hongos y protozoos. Se dio cuenta que las algas y las cianobacterias eran diferentes y formaron el grupo monera.
Chatton se dio cuenta que había dos tipos de estructura celular, procariotas y eucariotas. Atendiendo a todo esto Whittaker los separó en cinco reinos, basado en la estructura celular y la alimentación. Los reinos eran los siguientes:
Monera: donde estaban las bacterias.
Protista: donde se encontraban protozoos y algas.
Funji: donde se encuentran los hongos.
Animalia: están todos los animales.
Plantae: plantas.
Whittaker junto con Margulir al reino protista le llaman protoctista.
Hay otros autores que defienden la clasificación en seis reinos, dividiendo el reino monera en Eubacterias y arqueobacterias.
Cavalier-Smith los clasifica en ocho reinos, con dos imperios teniendo en cuenta la estructura celular:
Bacteria dividiéndolos en dos reinos (Eubacterias y arqueobacterias).
Euraria dividiéndolo en cinco reinos (plantae, chromista, fungi, animalia, protozoo, arqueozoo).
Nosotros vamos a utilizarel modelo de Carl Woese, está basado en la filogenia (relaciones evolutivas), es el más natural, basado en las similitudes que tienen unas macromoléculas denominadas cronómetros moleculares que son algunas proteínas y algunos ácidos nucleicos. Es que más se utiliza es el ARNribosómico, forma parte de los ribosomas, está universalmente distribuida, tiene siempre la misma función, permite establecer comparaciones entre organismos. El que se utiliza para realizar estas relaciones es en el caso de los eucariotas el ARNr 18s, y en el caso de los procariotas el ARNr 16s.
En base a las similitudes del ARN, propone un sistema de clasificación, los seres vivos se dividen en tres taxones llamados dominios: bacterias, arquea y eukarya.
En bacterias estarían incluidos todas las bacterias. En arqueas estarían incluidos todas las arqueas. En eukarya estaría incluidos todas los demás seres vivos.
Establece que todos los seres vivos salieron de un ancestro universal, del que se bifurcan en dos líneas que llegan al dominio bacteria y otra en eukarya y arquea.
Dentro de estos tres dominios en bacterias están incluidos unos 15 reinos.
En arqueas hay tres reinos (“ korarchaeota”, crenarchaeota, euryarchaeota).
Y en eukarya encontramos varios reinos.
Dentro del dominio bacteria es el que más reino hay y los que vamos a estudiar.
A partir del ancestro universal (procariota) , una línea arquea, bacteria y otra la de los eucariotas, esta empezó a crecer, el material genético se organizó dando lugar a una célula eucariota con núcleo, en simbiosis con una bacteria es cuando se forma el origen de las mitocondrias. Cuando una célula con mitocondrias se une con una bacteria da lugar a los cloroplastos (fotofrofas).
Lección 2. Observación de los microorganismos.
1. Microscopio óptico.
El ojo humano es capaz de ver organismos de hasta medio milímetro, los microorganismos son del tamaño entre m = 10-6m, nm = 10-9m.
El microscopio que más utiliza es el microscopio óptico de campo claro.
El campo visual aparece totalmente iluminado y la muestra con un tono más oscuro, esto es debido al contraste entre el campo y la muestra. Hay veces que el contraste es tan pequeño que se van a tener que utilizar técnicas de tinción para poderlas ver.
La fuente de luz llega al primer sistema de lente que es el condensador, que dirige los rayos de luz hacia el lugar donde se encuentra la muestra, en la platina. La luz penetra en el segundo sistema de lente llamado objetivos que se sitúan en un rotor o revolver donde se sufre una ampliación, luego la luz a va a los oculares donde sufren otra ampliación.
Los oculares tiene un aumento de 10 y los objetivos de 5, 10, 40 y 100.
El poder de resolución hace referencia a la capacidad que tiene el microorganismo para que dos puntos que están muy juntos, se puedan diferenciar separados. Está en función de una ecuación:
d = 0,5 
n sen
El denominador se conoce con el nombre de apertura numérica. Cuanto más pequeña sea d, más resolución tendrá el microscopio.
d = la distancia mínima de separación de dos puntos para que esos dos puntos se perciban como separados.
 es la longitud de onda de la fuente de iluminación, como en este caso es visible estará entre 400-700 nm, lo normal es 530nm.
n es el índice de refracción del medio existente entre la muestra y el objetivo, hay aire que es 1.
 hace referencia a la mitad del ángulo del cono de luz que sale de la muestra y llega al objetivo. Como mucho es 90º, y el sen90 = 1.
La apertura numérica es característica del microscopio.
Cuanto mayor sea”d”, mayor poder de resolución tendrá del microscopio.
¿Cómo podemos hacer que un microscopio tenga menor “d”?
· Haciendo que  sea pequeño.
· Otra manera es aumentar la apertura numérica, aumentando el ángulo.
· Otra manera es cambiando el índice de refracción, aumentándolo, poniendo aceite de inversión, oscilando entre 1,2 y 1,4, lo normal sería de 1,25.
· El máximo de resolución de un microscopio de campo claro es 0,2m.
· El índice de refracción del aceite es similar al del vidrio, el aceite lo que hace es que los rayos no se refracten.
Se utiliza a nivel de prácticas, no sirve para ver estructuras internas. La imagen que nos muestra es bidimensional. Se tiene que teñir la muestra y lo primero que hay que hacer es fijarla al vidrio.
Hay otros microscopios en los que no hace falta teñir la muestra para poderla observar.
2. Microscopio de campo oscuro.
El campo visual va a ser completamente oscuro y los organismos van a aparecer más claros y brillantes.
Poseen un condensador opaco, de tal manera que a la muestra solo le llega la radiación procedente de los laterales, por lo que el campo visual es negro.
Presenta unas ventajas:
· Su poder de resolución es mayor.
· No es necesario teñir las muestras.
· Son capaces de observar algunas estructuras internas.
· Se pueden visualizar los flagelos.
· se utiliza para aquellos microorganismos que son lábiles, cuando se tiñen se estropean.
3. Microscopio de contraste de fases.
Se ideó para aumentar el contraste con el campo visual y la muestra y nos evitásemos teñir las muestras.
El campo visual también aparece claro, pero un poco más oscuro que en el microscopio de campo claro, y los microorganismos van a aparecer más brillantes.
Se pueden visualizar estructuras internas.
Posee un sistema de lentes modificados. Tiene un condensador con un diafragma anular y el objetivo con una placa de difracción, con esto se quiere aumentar las diferencias entre los diferentes índices de refracción que tienen las distintas partes de la muestra. Todo esto se traduce en las diferencias de contraste entre las diferentes partes de la muestra y, entre la muestra y el exterior.
Las imágenes que se ven son bidimensionales.
4. Microscopios de fluorescencia.
También se trata de un microscopio óptico y nos va a dar imágenes bidimensionales.
Se basa en la propiedad de que tiene alguna sustancia que absorbe una luz de onda corta y emite luz de onda larga en el espectro visible. Estas sustancias se denominan fluorocromos. Por lo tanto este miscroscopio poseerá una fuente de iluminación ultravioletra, mientras que la miestra emite luz visible para que nosotros la podamos ver.
Se utiliza mucho en ecología mibrobiana.
El fluorocromo que más se utiliza es el DAPI, se une a los ácidos nucleicos y después emite una luz en el espectro de color azul.
Este tipo de microscopio tiene que tener unas características.
· El condensador tiene que ser de cuarzo, porque el vidrio es opaco a la luz ultravioleta.
· Cuando la muestra se ve verde está presente el fluorocromo isotiocionato de fluoresceína.
5. Microscopio de interferencia.
En este microscopio ya podemos ver imágenes tridimensionales.
Utiliza una fuente de luz polarizada que se hace incidir en un prisma que se separa en dos rayos perpendiculares entre sí. Cuando los dos rayos inciden en la muestra al no estar en la misma fase se producen unas interferencias y lo vamos a ver como diferencias en el contraste y también en las dimensiones de la muestra.
No es necesario teñir las muestras y se van a visualizar muy bien las estructuras internas.
6. Microscopio de fuerza atómica.
Es mucho más sofisticado.
Posee una especie de sonda que recorre toda la muestra, lo que hace es reproducir la muestra (detecta cualquier tipo de anomalía en la muestra).
Son imágenes tridimensionales y no hace falta teñirlas. Dentro del poder de resolución son mucho más reales que cuando hay que teñir la muestra.
7. Microscopio confocal de rayo láser.
Este rayo se dirige hacia una zona en vertical de la muestra. Vamos a poder ver los distintos planos de la muestra en profundidad.
Este tipo de microorganismos suele ser con muestras teñidas, con fluorescencia, para ver los microorganismos vivos y muertos.
8. Tratamiento de la muestra en el microscopio óptico de campo abierto.
Antes de empezar a teñir una muestra es necesario fijarla al porta, que se realiza mediante la aplicación de calor. Cuando la muestra es sólida lo que hay que hacer es resuspenderla en una gota de agua, después mediante un asa de siembra se extiende por todo el porta. Una vez resuspendida, o bien se deja secar al aire o utilizamos la llama del mechero, de esta manera conseguimos que las proteínas de los microorganismos se adhieran al vidrio. Hay que hacer esto, para que cuando se le eche un líquido no se pierdan los microorganismos, a este proceso se le denomina FROTIS.
Cuando ya está fijada la muestra es cuando empezamos a teñir. Se realiza mediante la utilización de colorantes que pueden ser ácidos, con carga negativa, o básicos, con carga positiva.
Nuestra muestra va a ser negativa, así que cuando la teñimos con un colorante básico, éste penetrará en los tejidos de la muestra, pero si es ácida no penetrará y lo que se teñirá será es campo visual.
Podemos utilizar distintas tinciones:
· Simples: únicamente se utiliza un contaminante. Si es básico el contaminante tiene que ser Azul de metileno, Safranina (rojo- rosado) o Cristal violeta.
En el caso de que el contaminante sea ácido tiene que ser o Migiosina, Tinta china o Eosina.
Para hacer la tinción primero hay que hacer un Frotis, luego le añadimos el colorante que se deja actuar dos minutos, se lava y se deja secar al aire, cuando esté seco ya lo podemos observar al microscopio pero siempre con el de inmersión.
En el caso de que el colorante sea ácido, el Frotis se realiza en el mismo colorante, no se resuspende en agua, se deja secar al aire y no hay que lavarlo. Este tipo de tinción da información a cerca de la forma de los microorganismos, vamos a ver organismos pequeños y también vamos a poder determinar si se agrupan o no.
· Diferenciales: ya se utilizan dos colorantes, de tal manera que los microorganismos responden de diferente manera dependiendo del colorante.
Gram: utiliza dos colorantes y los dos don básicos, unos se denomina primario que es el Cristal violeta y el otro secundario o de contraste y es la safranina. A los que se tiñen con el cristal violeta se les denomina Gram positivos y se tiñen de violeta, los que se tiñen de Safranina son los Gram negativo que se tiñen de un color rojo- rosado. Se tiñen de diferente color debido a los peptidoglucanos.
Primero se hace un Frotis, luego se añade el Cristal violeta, se deja actuar, lo retiramos y se añade un mordiente (lugol, que se une al Cristal violeta, formando un complejo de mayor tamaño) durante un minuto. A continuación se añade el alcohol, en algunos microorganismos va a arrastrar el colorante y en otros no. Se añade la Safranina y los microorganismos que se han quedado sin tinte se tiñen de color rojo- rosado.
Ácido alcohol resistente o también denominada tinción de Zielh- Nielsen: se utiliza en microbiología cínica para diferenciar dos especies: la Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae. Todos los del género Mycobacteriun y Nocardia poseen pared de Gram positiva y poseen ácidos, micólicos y ceras por lo que la tinción de gram no es muy efectiva y se utiliza esta.
Primero se hace el Frotis, luego se añade la Fucsina fenicada y se espera cinco minutos, dándole calor para que el colorante penetre en el microorganismo. Luego se le añade un colorante ácido que es el etanol clorhídrico y se deja un minuto, se añade azul de metileno. Los organismos que sean ácido- alcoholes resistentes se verán de color fucsia y serán positivos, y los que no sean resistentes serán negativos y se verán de color azul.
· Esporas o endosporas: son muy resistentes al tinte, se utiliza el Verde malaquita.
Primero se hace un Frotis, luego añadimos el colorante, se tiene ocho minutos aproximadamente dándole calor, luego se lava. Se añade la Safranina, si las células tienen esporas ésta se quedará teñida de verde y los demás de rojo- rosado.
· Capsula: es una estructura que poseen algunos microorganismos, de naturaleza polisacárida y son solubles en agua. Se usa un colorante ácido, Tienta china. Colocamos una gota en el porta, resuspendemos la muestra y extendemos. Dejamos secar al aire y cuando está seca se añade un colorante básico, normalmente la Safranina. La tinte china no penetra, la Safranina sí y se va a ver rojo- rosado, se tiñe la pared y el citoplasma pero no la cápsula.
· Flagelos: es muy laboriosa. Se utiliza un mordiente para aumentar el tamaño del flagelo, puede ser el alumbre de potasio o el ácido tánico. Luego se tiñe con fucsina.
9. Microscopios electrónicos.
· Su fuente de luz son los electrones, a diferencia de la luz visible del óptico.
· Las lentes son electromagnéticas y tienen que estar siempre situadas en un tubo al vacío, porque si hay aire, los electrones se dispersan..
· El poder de resolución es mayor, porque la longitud de onda de los electrones es de 0,005nm.
· Hay dos tipos de microscopios:
De transición (MET = TEM) las imágenes que nos dan son bidimensionales y se utiliza para estudiar la ultra estructura celular.
Se consiguen valores de d = 0,5 nm, los aumentos que se consiguen también son mayores, oscilan entere 100000 y otros llegan hasta un millón de aumentos.
Se utilizan para estudiar los orgánulos celulares. En este microscopio los electrones proceden de un filamento de tungteno que se calienta y emite una serie de electrones que se dirigen a la muestra mediante un condensador, los electrones chocan con la muestra. Algunos quedan absorbidos y otros la atraviesan (producidos por lente del objetivo) sufren amplificación, son captados esos electrones en una pantalla sensible a los electrones.
La imagen es bidimensional y como no se utiliza luz , son en blanco y negro. Lo que vamos a ver son zonas más oscuras en la que han llegado menos electrones, y una zona más clara en la que han llegado más electrones.
Con este microscopio no se pueden ver las muestras en vivo porque los electrones tienen poco poder de penetración, hay que cortar la muestra en láminas con un grosor de 20-100 nm, pero lo normal es de 60 nm.
Para preparar una muestra lo primero que hay que hacer es fijar la muestra, utilizando para ello un Glutaraldehido, en el que precipitan proteínas. Una vez fijada hay que deshidratarlas, sometiéndolas a concentraciones ascendentes de etanol o acetona. Una vez deshidratada la muestra se mete en una resina que ha temperatura ambiente es sólida. Vamos a tener un bloque de resina y dentro la muestra. Cuando está solidificada se corta la muestra, mediante un ultramicrotomo. Cada uno de esos cortes lo colocamos sobre una rejilla de cobre que luego se pone en el microscopio.
Para que haya más contraste la muestra se puede teñir.
Todo este proceso hace que algunas veces se produzcan estructuras que no se encuentran en vivo.
De barrido: las imágenes que nos dan son tridimensionales y se utilizan para estudiar el exterior de las células.
Tiene menor resolución, una d = 7 nm y también tiene menos aumentos. La diferencia está que lo que observamos en la superficie celular, nunca el interior.
Partimos de un filamento ............. que se denomina haz primario, cuando choca con la muestra la superficie de la membrana emite otro haz secundario, éste a través del objetivo incide en la pantalla y se ve la imagen.
Es necesario hacer un tratamiento de la muestra. La introducimos y la deshidratamos en concentraciones ascendentes de etanol o acetona. Una vez deshidratada se coloca sobre un disco o plataforma y se cubre con una capa de oro/ paladio y ya podemos verla al microscopio.
Lección I. Una introducción al estudio de la apologética

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