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Timestamp: 2016-05-28 04:26:49+00:00

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PRODUCCION DE ENZIMAS
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Procedencia comercial de las enzimas:
microbianas, de plantas, de animales
Etapas en la obtención de enzimas industriales:
selección de la fuente  optimización de la producción  extracción, aislamiento y purificación ingeniería y diseño de enzimas
PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS ANIMALES PLANTAS MICROORGANISMOS
generalmente. abundantes) de
La tecnología a gran escala para su producción se encuentra hoy bien establecida. puesto que. La recuperación de las enzimas microbianas suele ser fácil. tienen velocidades crecimiento y de producción de enzimas muy alta (baratas. La producción de enzimas microbianas requiere materias primas fáciles de conseguir ya que crecen en medios de cultivo con escasos requerimientos. Los microorganismos son fáciles de cultivar. Los microorganismos pueden ser modificados genéticamente para producir mayor cantidad de enzima. Fácil escalado Las enzimas microbianas son más estables que sus homólogas de plantas y animales.
. Presentan numerosas ventajas
Los microorganismos son muy versátiles y teóricamente se puede encontrar un microorganismo que produzca un enzima concreto. son extracelulares.TEMA 2
Los microorganismos son la fuente principal de enzimas de aplicación industrial.
la separación de las células del medio de cultivo permite obtener preparados muy concentrados que facilitan la purificación
Actúan sobre sustratos de bajo peso molecular. glucosa oxidasa. Glucosa isomerasa.
Es necesaria la integridad de la célula para que se sintetice el enzima y preservar su estabilidad. penicilin acilasa. Para obtener el producto es necesario romper las células y separar el producto de los restos celulares. Operación difícil y costosa Las enzimas aparecen contaminadas con otras proteínas intracelulares.TEMA 2
ENZIMAS INTRACELULARES: permanecen en el interior de la célula. a-galactosidasa pullulanasa y lactasa.
ENZIMAS EXTRACELULARES: actúan sobre sustratos de alto
peso molecular.
Hidrolasas
Dado que la molécula es segregada fuera de la célula. Muy reguladas. Se sintetizan en grandes cantidades. El número de proteínas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fácil aislar una enzima concreta a partir de una mezcla Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura más compacta y menos susceptibles a la desnaturalización que las correspondientes intracelulares. no se requieren técnicas de ruptura celular que a veces son difíciles de aplicar a gran escala.
ETAPAS EN LA OBTENCIÓN DE ENZIMAS INDUSTRIALES
Selección de la fuente Producción de células con un alto nivel de la enzima Rotura celular y eliminación de los restos celulares (enzimas intracelulares) Concentración y enriquecimiento Purificación con alta resolución (dependiendo de su uso final)
Concentración y formulación del preparado
. • Constitutiva o inducible. • Mecanismos de control de su síntesis. • Intracelular o extracelular. de enzima y su
Experimentación previa en el laboratorio:
• Ciclo celular.TEMA 2
Maximizar la velocidad de síntesis concentración para reducir costos. • Requerimientos nutricionales.
 criterios de seguridad:
daños sobre el producto (propio organismo o por un metabolito)
contaminación con toxinas debe crecer en medios simples y baratos estable en sus propiedades genéticas producir alta cantidad de producto en poco tiempo fácil de separar
ORGANISMOS TERMÓFILOS
. a partir del medio natural o de colecciones de cultivo.TEMA 2
Selección de una cepa.
Mejora de estirpes
Incrementar la productividad de la enzima
Reducir o eliminar enzimas contaminantes
Conseguir su síntesis sin necesidad de inductores Permitir su síntesis en condiciones inadecuadas
1. Mutación y selección
2. Hibridación 3. Tecnología de ADN recombinante
O.TEMA 2
Formulación y preparación del medio de cultivo: baratos y fáciles de reproducir. N. Ca.S. Mg. Consideraciones:
Requerimientos nutricionales (C. P. etc) Propiedades de la enzima: Inducción Represión por catabolitos Inhibición por producto Mecanismos de liberación
ESTERILIZACIÓN EXTRACCIÓN DE LA BIOMASA Y RECUPERACIÓN DE ENZIMA
Tª. transferencia de oxígeno
La mayoría de los sustratos requieren un pretratamiento
Medios de cultivo muy simples No suele haber contaminación bacteriana.TEMA 2
Diseño del equipo y del proceso de fermentación
FERMENTACIÓN EN SUSTRATO SÓLIDO: sustrato insoluble sin fase líquida libre El proceso está limitado a hongos Difícil medida de los parámetros del proceso Difícil control del pH.ESTERILIZACIÓN Enzima se recoge muy concentrado No es necesario mantener inóculos FERMENTACIÓN SUMERGIDA
.TEMA 2
 Necesidad de purificación Pérdida del enzima: pérdida física inactivación
pH y temperatura formación de espuma Proteasas agentes quelantes.
FACTORES QUE INACTIVAN LAS ENZIMAS DURANTE SU AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
Factor inactivante Fuente de enzima frecuencia Modo de contrarrestarlo
Calor Frio Proteasa Productos oxidación de fenoles oxidación Dilución proteína Pérdida de estabilidad Inhibidores específicos Metales pesados Cambios de fase
cualquiera cualquiera mayoría Plantas y hongos
universal raro Común Bastante común
Enfriamiento Calentamiento Inhibidores de proteasas o frío Agentes reductores
cualquiera cualquiera cualquiera Plantas y bacterias cualquiera cualquiera
común Bastante común Bastante común Raro Raro común
Agentes reductores Concentración rápida Restauración de ese factor Separación del inhibidor Agentes quelantes Mínima agitación
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
MATERIAL DE PARTIDA
ROTURA CELULAR
Tratamiento con álcali
Tamización líquida
Agitación con abrasivos
Tratamiento enzimático
Choque osmótico
Tamización sólida
ELIMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
SEPARACIÓN SÓLIDO-LÍQUIDO
Centrifugación CONCENTRACIÓN
Liofilización PURIFICACIÓN
Sistemas en dos fases
EXTRACCIÓN.
CONSIDERACIONES PARTICULARES: SEGÚN LA NATURALEZA INTRACELULAR O EXTRACELULAR necesidad o no de rotura celular
SEGÚN LA FUENTE DE ENZIMA: Microorganismos Animales Vegetales
ELECCIÓN DEL MÉTODO DE ROTURA
 Susceptibilidad de la célula  Características de estabilidad del enzima  Velocidad del método
 Facilidad de separación de los restos celulares
 COSTE del proceso
1 álcali 1.TEMA 2
MÉTODOS DE ROTURA
1.1 sonicación 2.7 tamización líquida
.2 shock por enfriamiento 2. Métodos físicos de lisis celular:
2.2 lisozima y EDTA 1. Métodos químicos de lisis celular:
1.6 homogeneización con abrasivos 2.3 choque osmótico 2.4 congelación y descongelación 2.5 tamización sólida 2.3 detergentes: iónicos no iónicos
CONCENTRACIÓN Y ENRIQUECIMIENTO
1er paso: Eliminación de ácidos nucleicos: pH alto. nucleasas 2º paso: Eliminación de restos celulares: Centrifugación Filtración
3er paso: Concentración: Precipitación Adsorción Ultrafiltración Secado Liofilización
. fuerza iónica baja.
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: CENTRIFUGACIÓN • Centrífugas discontinuas
• Centrífugas de flujo continuo:
De disco De rotor tubular De cestillo
Fácil escalado
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: FILTRACIÓN
• Ultrafiltración:
– – – – Opera a temperatura y presión baja Suave y no destructiva No hay inactivación del enzima Económica
• Filtración de flujo tangencial.
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: CONCENTRACIÓN
Sulfato amónico Solventes orgánicos Polímeros de alto peso molecular
    polisacáridos aniónicos polisacáridos catiónicos Cromatografía de afinidad Otros
Ultrafiltración Secado
 Evaporación rotatoria  Secado en spray  liofilización
• Fácilmente escalable (aumento del diámetro de la columna) • Optimización previa en el laboratorio. • El objetivo principal es purificar grandes cantidades en el menor tiempo
posible (flujos elevados). Eliminación material particulado.
• Destino final del producto (posible presencia de contaminantes) • Selección del tipo de matriz. evitar la
adsorción inespecífica y contaminación bacteriana.
• Saltos de escala progresivos.TEMA 2
TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN: CROMATOGRAFÍA
Cromatografía a gran escala:
• Se pueden aplicar los mismos métodos que en cromatografía analítica.
Tipo de matriz
Dextrano con enlaces entrecruzados Poliacrilamida entrecruzados Agarosa Agarosa con enlaces entrecruzados Compuesto poliacrilamida/dextrano Compuesto poliacrilamida/agarosa Polímero acrílico hidroxilado Copolímero etilenglicol-metacrilato Celulosa Sílice porosa Polímero orgánico rígido con enlaces
Porosidad
Baja Baja Alta Alta Alta Media Media Baja/media Media/alta Baja/media Media/alta
Adsorción noespecífica
Baja Baja Baja Baja Media Baja Media Media Alta Alta Baja
Baja Baja Baja Media Media Media Media Media Baja Alta Alta
Buena Buena Deficiente Buena Buena Buena Buena Buena Buena Deficiente Buena
Facilidad de modificación
buena buena buena buena buena buena buena buena buena deficiente buena
Coste relativo
Bajo/medio Medio Medio Medio Medio Medio/alto Medio Medio Bajo Alto Alto
TÉCNICAS DE PURIFICACIÓN
Intercambio iónico Cromatoenfoque Afinidad Interacción hidrofóbica Filtración en gel HPLC
Sistemas acuosos en dos fases
Velocidad alta La resolución puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja.
La resolución puede ser alta. Capacidad limitada por el volumen de la muestra
Aplicación El fraccionamiento es mejor en las últimas etapas de la purificación. Velocidad alta.TEMA 2
Característica molecular aprovechada Tamaño
Tipo de cromatografía
Filtración en gel
Características Resolución moderada para el fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores. ya que las matrices son caras. La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz. En cualquier momento se pueden usar tampones intercambiadores y podrá existir una limitación respecto al volumen de muestra
La resolución puede ser alta. aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases
Interacción hidrofóbica
Afinidad biológica
. La capacidad puede ser alta. Puede ser utilizada en cualquier fase.
Es más efectiva en las primeras fases del fraccionamiento cuando se van a manipular grandes volúmenes.
Cromatoenfoque
Es mejor usarla en una purificación posterior. dependiendo del ligando y no limitada por el volumen de la muestra. pero es mejor aplicarla cuando la fuerza iónica es alta tras la precipitación con sales o después de un inter-cambio iónico Puede emplearse en cualquier etapa. La velocidad puede ser alta Resolución buena Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de muestra. Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra.
. 3:6 (139-144) 1985
Solución acuosa de dos polímeros
PEG y dextrano
Sistemas acuosos en dos fases:
Solución acuosa de un polímero y una sal
PEG y fosfato potásico Proteínas hidrofóbicas Proteínas hidrofílicas fase superior (rica en PEG) fase inferior
.separación
Protein recovery using two-phase systems.Mezcla y equilibrado .Aplicaciones: separación de restos celulares enriquecimiento para posteriores pasos de purificación concentración y purificación de proteínas en baja concentración . Trends in Biotechnology.
Diseño de enzimas:
 La fusión de un gen de interés a secuencias promotoras eficientes hace que una proteína se sobreexprese.  Dirigir la proteína sintetizada de novo al periplasma de la célula.  Adición de colas de afinidad.
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