Source: https://www.jove.com/video/54782/la-informacin-estructural-partir-de-una-sola-molcula-de-fret?language=Spanish
Timestamp: 2019-08-18 07:41:57+00:00

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Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System | Protocol (Translated to Spanish)
La información estructural a partir de una sola molécula de FRET experimentos utilizando el Nano-posicionamiento Sistema Rápido
La determinación de la estructura de una biomolécula es un requisito clave para la comprensión de su función. Dos métodos bien establecidos para la determinación de la estructura son crio-microscopía electrónica y cristalografía de rayos X 1, 2. Hoy en día, ambos métodos proporcionan información estructural de alta resolución con una resolución hasta el nivel de angstrom. Estos dos métodos se han utilizado ampliamente para elucidar la estructura de las grandes biomoléculas tales como los complejos de proteínas. Aunque los métodos existentes constantemente se han mejorado a lo largo de las últimas décadas, la complejidad de las estructuras biológicas sigue planteando un desafío importante para la biología estructural, en particular cuando grandes complejos, dinámicos y transitorios son investigados 3.
Con el fin de estudiar la dinámica de complejos macromoleculares y la relación estructura-función en particular, las metodologías de una sola molécula tienen provided información útil 4. Se desarrollaron varias nuevas estrategias para afrontar de manera ortogonal en la adquisición de información estructural y dinámica. Ejemplos son altos AFM velocidad 5, 6 manipulación mecánica, fluorescencia localización microscopía 7, así como de una sola molécula de transferencia de energía de resonancia de Förster (smFRET) 8, 9. Desde muy temprano en FRET que se ha denominado una regla molecular, debido a la dependencia de la distancia en la escala de longitud de biomacromoléculas 10.
Una aplicación particularmente interesante de smFRET es utilizar la información de distancia obtenida a partir de mediciones smFRET para inferir información estructural 11, 12, 13, 14, 15 >, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Debido a la alta resolución temporal de smFRET, la posición de las partes móviles de una estructura de proteína puede ser localizada. Sin embargo, con el fin de extraer información cuantitativa a partir de datos smFRET importantes parámetros de corrección sobre las moléculas de colorante que determinarse durante la medición 24. Con estos factores de corrección, la eficiencia de FRET FRET E se puede calcular utilizando la fórmula
en la que A y D I Figura 2). El β-factor de cuenta de la diafonía, la fuga de emisión del donante en el canal aceptor y se calcula
donde I 'A e I' d son las intensidades de fluorescencia del donador y la molécula aceptora después de la foto de blanqueo de la molécula aceptora.
El γ-factor de corrige la diferencia en las eficiencias de detección relativos en los dos canales, así como las diferencias en el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante y el colorante aceptor. Se calcula a partir de cada curva del tiempo individual
Nota, que esta descripción descuida excitación directa de la molécula aceptora, que a veces se vuelve importante y tendría que ser corregida para así. Para la determinación de estos factores de corrección es útil para excitar tanto para el donante, así como el aceptor en un esquema de alternancia 25 con el fin de diferenciar entre los cambios de foto-física y dinámica estructural.
Con el fin de no sólo lograr eficiencias smFRET cuantitativos, sino también información estructural cuantitativa, se introdujo el Sistema de Posicionamiento Nano-(NPS) en 2008 26. El nombre fue elegido en base a sus similitudes con el sistema de posicionamiento global por satélite (GPS). El NPS es una técnica híbrida que combina smFRET y datos de cristalografía de rayos X para la localización de las posiciones de tinte desconocidos en los complejos biomacromoleculares. La Cestructura rystal sirve como un marco de referencia y los resultados smFRET se utilizan para obtener información de la distancia entre una posición desconocida fluoróforo (antena) y una posición conocida de la estructura cristalina (satélite). En experimentos consecutivos de las distancias entre la antena y varios satélites se miden y la posición de la antena se determina por medio de un esquema de análisis estadísticamente rigurosa basada en la estimación de parámetros Bayesiano. Como resultado, no sólo la posición más probable de la antena se calcula, pero su distribución de la incertidumbre en 3D completa, la llamada posterior, visualizado por volúmenes creíbles. Por otra parte, fuentes de energía nuclear fue ampliado para permitir el análisis de redes completas smFRET 27.
El NPS se ha utilizado para resolver una serie de cuestiones importantes de la transcripción eucariótica, es decir, el curso de la DNA aguas arriba, el ADN no molde y el ARNm naciente dentro de la elongación co RNA polimerasa IImplex 12, 28, demuestra también el efecto de los factores de transcripción iniciación 26 y la arquitectura dinámica de un promotor-abierta compleja 29. Además, el NPS se utilizó para elucidar la estructura de la archaeal complejo abierto ARN polimerasa 30 y, en particular, la posición del factor de iniciación de la transcripción TFE, que se une competitivamente al mismo sitio como el factor de elongación de la transcripción SPT4 / 5 31.
Desde entonces, una serie de enfoques estructurales basados smFRET se han publicado 15, 18, 21, 23. Al comparar los diferentes métodos estructurales basados ​​smFRET, se hace evidente que la aparente precisión del método depende de la elección particular de los modelos de colorantes altamente. Hay que señalar quemoléculas de colorante pueden mostrar un comportamiento espacial y de orientación diferente en función de su entorno local.
Con este fin, Fast-NPS se introdujo 32. Fast-NPS usa un algoritmo de muestreo avanzado reducir los tiempos de cálculo drásticamente. Por otra parte, Fast-NPS permite a uno realizar un análisis estructural y para cada molécula de colorante que el usuario puede elegir entre una serie de cinco modelos distintos de colorantes que se describirá a continuación. El modelo más conservador, denominado clásico, asume que el colorante ocupa sólo una, pero desconocida, posición. En esta posición, el fluoróforo puede girar libremente dentro de un cono, cuyo tamaño está determinado a partir de su respectivo anisotropía de fluorescencia (dependiente del tiempo). La orientación del cono no es conocida, lo que conduce a grandes incertidumbres al convertir eficiencias smFRET medidos en distancias. A este respecto, el modelo es conservadora, ya que conducirá a la precisión más pequeño en comparación con el otro modo de colorantels. Sólo para distancias muy cortas caso de que las suposiciones hechas por el modelo clásico de plomo a una determinación de la posición notoriamente incorrecto. Para valores típicos smFRET, la posición correcta se entrega siempre en el volumen comparativamente grande creíble.
Sin embargo, desde una precisión más alta es deseable, es importante desarrollar y probar modelos alternativos de colorantes, que podrían ayudar a mejorar la precisión. Si el colorante gira mucho más rápido que su tiempo de vida de fluorescencia inherente, el llamado modelo ISO se puede aplicar. Aquí, el factor de orientación kappa 2 (necesaria para el cálculo del radio de Förster característica isotrópica ) Está ajustado a 2/3. Como resultado, los volúmenes creíbles calculadas son casi dos órdenes de magnitud más pequeña en comparación con aquellos en el modelo clásico de 32. En el caso de que el fluoróforo se encuentra en un entorno que permita no sólo reori rápidoentación, pero, además, el movimiento rápidamente en todo su volumen accesible, el modelo meanpos-iso debe ser utilizado. En este modelo, el tinte ocupa efectivamente sólo una posición media, en el que el promedio espacial se explica por una conversión distancia polinomio 15. Este modelo se aplica si, por ejemplo el colorante (comúnmente hidrófobo) se une a una región hidrófila, por ejemplo, el ADN. La aplicación del modelo meanpos-iso conduce a una reducción adicional en el tamaño de los volúmenes creíbles por un factor de aproximadamente dos. Sin embargo, un colorante unido a una proteína puede unirse de forma reversible a varios parches hidrófobos en su volumen estéricamente accesible (AV). Un fluoróforo que conmuta instantáneamente entre estas regiones, pero dentro de una región sufre una rotación libre y el movimiento localizada rápido es mejor descrita por el modelo VAR-meanpos-iso. Para una situación similar en la que el colorante no es libre de girar las var-meanpos aplica modelo. más d etails acerca de estos modelos se pueden encontrar en nuestra reciente publicación 32.
Estos modelos ofrecen un amplio repertorio para dar cuenta específicamente para los diferentes ambientes un tinte podría encontrar y aplicar de manera inteligente optimiza la precisión de localización. En Fast-NPS cada molécula de colorante unido a una posición específica se puede asignar a un modelo individual, de tal manera que FRET-socios se les permite tener diferentes modelos. Esto permite el modelado ilimitadas y cerca de la naturaleza. Sin embargo, es importante que uno realiza pruebas estadísticas rigurosas para asegurar que el resultado obtenido por la combinación final modelo es todavía de acuerdo con los datos experimentales. Estas pruebas están incluidas en el software Fast-NPS.
Para la aplicación de Fast-NPS a los datos experimentales se requiere la medición de (sólo) tres parámetros de entrada. En primer lugar, el tinte-par específico Förster isotrópica radios (/54782/54782eq5.jpg "/>) Se han determinado. Por lo tanto, el rendimiento cuántico (QY) del colorante donante, los espectros de emisión de fluorescencia del donante y el espectro de absorción del aceptor deben ser medidos. Estas mediciones pueden llevarse a cabo en granel, usando un espectrómetro estándar y un espectrómetro de fluorescencia estándar. Para cada par, la R 0 se calcula entonces utilizando la PhotochemCAD freeware y se puede utilizar en el análisis de NPS. Por otra parte, los (resuelta en el tiempo) anisotropías de fluorescencia de las moléculas de colorante necesitan ser obtenido usando una polarización (y tiempo) espectrómetro de fluorescencia sensible. Sin embargo, los parámetros de entrada más importantes para Fast-NPS son las eficiencias smFRET medidos en una configuración de microscopía de fluorescencia de una sola molécula, tales como un microscopio de fluorescencia de reflexión total interna (TIRFM) .
A continuación, presentamos un protocolo paso a paso para la obtención de datos y la aplicación de smFRET Fast-NPS (Figura 1).
1. Requisitos previos y material de laboratorio
NOTA: El conjunto de la cámara de medición se representa en la Figura 3. El sándwich de diseño de la cámara de medición consta de tres componentes principales: un portaobjetos de vidrio de cuarzo (sílice fundida), una película de sellado y un cubreobjetos que sella la cámara de flujo. La cámara de medida está montado sobre un soporte de muestras personalizado. Las dimensiones de la cámara de la muestra y el soporte de metal están orientadas para adaptarse a un portaobjetos de vidrio de cuarzo microscopía estándar (76 mm x 26 mm).
Corte de cuarzo portaobjetos de vidrio utilizando un taladro de diamante (0,75 mm) en las posiciones indicadas en la figura 4. El diseño de las placas de vidrio de cuarzo es asimétrica con el fin de diferenciar entre los dos lados de cada diapositiva.
NOTA: Los portaobjetos de cuarzo pueden ser reutilizados después de la medición hasta que la superficie se raya.
Para montar las cámaras, utilizar los soportes de muestra de metal personalizadas como se muestra en la Figura 5 </ Strong>. Los soportes de muestra contienen dos hilos (M4) con el fin de conectar una entrada y una tubería de salida para la cámara de flujo. Además, el uso hilos (M3) para montar la cámara de muestra en el soporte de metal, así como los hilos (M3) para fijar el soporte del prisma en la mitad inferior del soporte de metal.
Realizar las mediciones sobre un total smFRET microscopio de fluorescencia de reflexión interna tipo prismático (TIRFM) (Figura 6).
NOTA: El TIRFM cuenta con tres láseres: un verde (532 nm, láser Nd: YAG) y un láser rojo (643 nm, láser de diodo) para la excitación del donante y las moléculas de colorante aceptor, así como un láser azul (491 nm , láser de estado sólido bombeado por diodos) para blanquear las impurezas fluorescentes fondo de la cámara de la muestra antes de la medición smFRET. Los tres rayos láser son espacialmente combinado y pueden ser seleccionados a través de un filtro sintonizable óptico-acústico (AOTF). La luz de fluorescencia es recogida por un alto objetivo de apertura, dividido en un donante y un aceptaro canal mediante el uso de un espejo dicroico y proyectada en dos cámaras EM-CCD. La cámara de muestras se une a un micrómetro que permite el movimiento en x e y-dirección con dos motores paso a paso. Un tercer motor piezoeléctrico se usa junto con un IR-láser y un detector sensible a la posición para construir un sistema de enfoque automático para garantizar un enfoque óptimo durante todo el experimento.
Utilice la alternancia de excitación láser (ALEX) cuando la dinámica de las trayectorias de tiempo FRET se observan 25. Esta dinámica puede ser causada por cualquiera de los cambios conformacionales dentro de las moléculas o por las fluctuaciones en el brillo y el aceptador de parpadeo aceptor.
NOTA: ALEX permite la discriminación entre estas dos causas posibles y evita la mala interpretación de trayectorias FRET dinámicas. Sin embargo, por razones de simplicidad, la parte del protocolo se limita al análisis de las películas tomadas sin ALEX.
Precaución: el láser de clase 3B se utilizan en la configuración de la fluorescencia de una sola molécula. Asegurar que la adecuadaSer precauciones de seguridad, de acuerdo con las regulaciones gubernamentales locales, se han tomado antes de que el sistema es operado.
Realizar la medición de absorción se utiliza para la determinación del rendimiento cuántico en un espectrómetro de UV-VIS (véase Materiales y Métodos).
Realice la medición del espectro de emisión de fluorescencia del donante, el espectro de absorción del aceptor y la anisotropía de fluorescencia en un espectrómetro de fluorescencia (ver Materiales y Métodos).
Preparar cámaras de muestras de acuerdo con procedimientos publicados 33. Alternativamente, el procedimiento se describe en [34] se puede utilizar.
Etiqueta de las muestras investigadas con un par donador-aceptor molécula de colorante adecuado para smFRET y asegúrese de que hay un resto de biotina para la inmovilización en la superficie de la cámara de muestra.
NOTA: Con el fin de localizar una posición de tinte antena desconocido con el software Fast-NPS se necesitan diferentes construcciones de muestra. Cada constructo needs tengan una etiqueta en la posición de tinte antena desconocido y una etiqueta en una posición de satélite conocido a partir de la estructura cristalina. Se requieren al menos tres construcciones diferentes con colorantes unidos a la posición de la antena y tres posiciones de satélite diferentes para obtener resultados precisos. Medidas entre las antenas, así como entre los satélites también son útiles para mejorar la precisión, sin embargo, esto requiere el intercambio de moléculas de colorante que debe ser introducido correctamente en el análisis.
2. Montaje de cámaras de flujo en un soporte personalizado
Tire de tubo de silicona (0,8 mm ID, 2,4 mm OD) en los tornillos de la ficha huecos (M4) y cortar el tubo en ambos extremos dejando recta un saliente de 1 cm en ambos lados mediante el uso de una hoja de afeitar afilada. Ajustar el voladizo del tubo a alrededor de 2 mm en un lado del tornillo de pestaña.
Montar la cámara de flujo en el soporte de muestra de una manera que los orificios de la placa de vidrio de cuarzo coinciden con los hilos en el soporte de la muestra. Apretarde entrada y de salida de los tornillos suavemente para asegurar que la entrada y la salida de la cámara de muestra son todavía penetrable. Apriete suavemente los cuatro tornillos del soporte de vidrio acrílico para fijar la posición de la cámara de flujo.
Cortar el tubo de silicona (0,58 mm de diámetro, 0,96 mm de diámetro exterior) en 20 cm piezas largas. Inserte una de las piezas a la entrada y el tapón de salida de la cámara de medición. Cerrar el tubo de entrada y de salida mediante el uso de una abrazadera.
NOTA: Las cámaras de muestras montadas se pueden almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de dos semanas.
3. Medición smFRET en el microscopio TIRF
Utilice una jeringa para lavar la cámara de muestra con 500 l de PBS. Prevenir burbujas de aire en la cámara de muestra en todo momento mediante la creación de una gota en el extremo de la tubería de entrada antes de cambiar a una solución tampón diferente.
Enjuague la cámara de muestra con 100 l neutravidina solución (0,5 mg / ml en PBS) y se incuba 15 min a temperatura ambiente.
lavarla solución neutravidina con 500 l de PBS.
Atornillar el soporte de metal para el prisma sobre la cámara de muestra.
Montar la cámara de la muestra a la etapa micrómetro de la TIRF de microscopio. Asegúrese de montar la cámara de muestra horizontal lo más recto posible delante del objetivo para evitar el desenfoque durante el proceso de escaneado.
Iniciar el software que controla las cámaras EM-CCD y el software para el control de los motores piezoeléctricos de la etapa.
Ajuste el enfoque del objetivo del microscopio observando los reflejos del láser IR.
Coloque el prisma ($ 991, n = 1,52) en la parte superior del soporte del prisma de metal. Ajustar la posición lateral del prisma para asegurarse de que los rayos láser golpean el prisma a continuación, utilizar un adhesivo y se incuba con luz UV durante 5 minutos.
NOTA: prisma instalado puede ser reutilizada por la limpieza.
En el software de control de la cámara Haga clic en "Configuración de Adquisición" y definir los siguientes parámetros de adquisición: 100 ms integrattiempo de ionización, 401 fotogramas / película (cámara verde), 400 marcos / película (rojo de la cámara), multiplicadores de electrones ganar 225, pre-amplificador de ganancia y 5x lectura tasa de 3 MHz a 14 bits.
Crear una carpeta en el disco duro local para la medición. Elegir un nombre para los archivos de medición, por ejemplo, año-mes-día. En el software de configuración van al piloto "del almacenamiento automático", permite "salvar Auto" y elija el formato de archivo * .sif para la adquisición de películas. Seleccione la carpeta en el disco duro. Utilice el nombre de la carpeta como filestem.
Permitir que el (valor de arranque ajustado a 1) la función "AutoIncrement". Habilitar el archivo adjunto de un operador al nombre de archivo. Use "DON" y "ACC" para el donante y el canal aceptor, respectivamente. Elija "_" como separador.
En el software de control de la cámara, haga clic en "Video" para iniciar la imagen en directo de la cámara y el fondo del blanqueo de fluorescencia mediante el escaneo de la cámara de muestra usando la máxima intensidad de láser de los tres láseres (COMcombinado ≈3,000 W / cm2 durante 10 s por campo de visión).
Apagar el láser azul. Disminuir la intensidad del láser verde a alrededor de 200 W / cm 2 y alrededor de 40 mW / cm2 para el láser de color rojo si se utiliza excitación láser (ALEX) alterna.
Diluir la muestra fluorescente biotinilada a una concentración de 50 a 100 pM. Carga 100 l de la solución. La muestra se inmoviliza en la superficie de la cámara tras la unión.
NOTA: Asegúrese de no sobrecargar la cámara. moléculas vecinas deben estar separados el uno del otro.
Si es necesario, cargar un 100 l adicional de una muestra más concentrada 2x a la cámara.
Sellar el tubo de entrada y salida de la cámara de medición mediante abrazaderas vez completada la carga.
Desconectar todos los láseres y el uso de los motores piezoeléctricos para mover la cámara de flujo de dos campos de visión aún más.
En el software de control de la cámara, haga clic en "señal de Tomar" para iniciar la grabación de vídeo y el interruptoren el láser al mismo tiempo. Asegúrese de que más de 80% de las moléculas se blanquean por el final de la película mediante el ajuste de la potencia del láser.
Repita los pasos 3,17 y 3,18 para toda la zona de la cámara de muestra preblanqueados.
4. Adquisición de la correlación de transformación ( "beadmap")
Preparar una cámara de flujo como se describe en las Secciones 1.1, 1.2 y 2.
Utilice perlas multiespectrales fluorescentes recubiertas de avidina que muestran la emisión de fluorescencia en el donante y el canal aceptor. Vortex la acción para 1 min, luego se diluye 50 l de las acciones de 50 l ddH2O vórtice de nuevo durante 1 min, sonicar 1-2 min, luego Vortex otros 10 s.
Llevar a cabo los pasos descritos para las mediciones smFRET (Sección 3.5 a 3.10).
100 l de carga (1) volumen de la cámara de los 1: 2 perlas fluorescentes diluidos en la cámara de flujo. Esperar 10 min para las perlas fluorescentes se unan a la superficie.
Utilice los parámetros de adquisición en 3.9, pero Change duración de la película al 26 (cámara verde) y 25 (cámara roja) y la ganancia del multiplicador de electrones a 10.
Ajustar la intensidad del láser verde a un valor de 20 W / cm2.
Tomar una película en un campo de visión con aproximadamente 50-100 granos.
5. Procesamiento y Análisis de Datos smFRET
Utilice el encargo por escrito FRET SM software para el análisis de la beadmap (ver Materiales y Métodos) y las películas adquiridas. Iniciar el programa viewPlot1.m.
Haga clic en Análisis | Análisis de lotes, desactive la opción "ALEX" si no se ha utilizado. Para un mejor rendimiento elegir el umbral de pico hallazgo "alta". Presiona OK".
Seleccione "NO" cuando se le preguntó si un beadmap ya ha sido analizado. Explorar la carpeta que contiene el beadmap adquirida y seleccione el archivo .sif * (haciendo doble clic sobre él). En la siguiente ventana de diálogo pulse "OK".
NOTA: Si un beadmap ya se ha analizado en una medida anteriorción, elegir la opción "SI" aquí y seleccionar el beadmap salvado de la navegación a la carpeta correcta y haciendo doble clic en el archivo * .map beadmap. Continúe con el paso 5.8.
Elija dos perlas individuales posicionados en esquinas opuestas del campo de visión. Las intensidades de los píxeles están codificados por color desde el azul oscuro (baja intensidad) a rojo oscuro (alta intensidad).
Haga clic en el centro de la primera perla. Si el centro de la molécula puede estar situado claramente por el código de colores, seleccionar "SÍ" o de lo contrario haga clic en "NO" y elegir un par molécula diferente.
Coloque el punto de mira en el píxel que muestra la máxima intensidad y pulse "guardar". Repita el proceso con el segundo canal.
Haga clic en la molécula en la esquina opuesta y repita los pasos 5.5 y 5.6.
NOTA: El desplazamiento de píxeles relativa de los dos canales se visualiza en la ventana de comandos y la correlación de transformación se guarda automáticamente como archivo * .map en la carpeta que contiene el archivo de beadmap * .sif <./ Li>
Para cargar los donantes y aceptor de películas (* .sif) para el "análisis de lotes", vaya a la carpeta, seleccione todas las películas que ha de analizarse y haga clic en "OK". En la siguiente ventana de diálogo, pulse "OK".
NOTA: El análisis por lotes se termina cuando el último carril mostrado en la ventana de comandos comienza con "el análisis final ...". Las moléculas detectadas se muestran en una nueva ventana, que también indica el cambio relativo del donante y el canal aceptor determinado a partir de la correlación de transformación.
Para cargar los archivos de vídeo por lotes, haga clic en Archivo | Cargar. Desactive la opción "ALEX" si no se ha utilizado. Ajuste el smoothwidth a 10 y haga clic en "OK". Seleccione la carpeta que contiene los archivos * .ttr y hacer clic en "seleccionar todo" y "OK" en el siguiente menú contextual.
Si la traza mostrada cuenta las fases características smFRET (Figura 2) pulse sobre el botón de activación "No seleccionado" y la primeraseleccionar el punto de inicio del evento FRET hora moviendo la línea con el cursor del ratón y haciendo clic en el botón izquierdo del ratón. A continuación, seleccionar el punto del blanqueo de la molécula aceptora y, finalmente, el punto de la decoloración de la molécula donante tiempo tiempo.
En la siguiente ventana de la eficiencia de FRET se representa en azul. Para seleccionar la prensa traza el botón "Sí" en caso contrario seleccione "No". Para volver a acceder a una curva del tiempo, haga clic en el botón "Anterior".
Repetir el procedimiento hasta la última molécula de la película.
Después de analizar la última molécula en una película de guardar las trazas seleccionadas haciendo clic en "Archivo | Guardar". Guardar las trazas seleccionadas en la misma carpeta que los archivos * .sif.
Repita los pasos 5.10 a 5.13 para todas las películas adquiridas.
Ejecutar el programa combine_fret_results.m. Seleccione la carpeta que contiene los archivos * .res y todos los archivos * .FRETonly_trace. Guarde el traste y el marco a gota archivos FRET molécula-sabia como MW.dat yFRW.dat, respectivamente.
NOTA: Los archivos * .dat se guardan como archivos ASCII. El archivo FRW.dat contiene seis columnas y una fila para cada FRET-marco. La sexta columna contiene la eficiencia de FRET frame-sabia corregido. El archivo MW.dat contiene 21 columnas y una fila por cada molécula de FRET seleccionado. La tercera columna contiene la molécula de FRET eficiencia se refiere.
6. Viendo smFRET datos en histogramas
NOTA: Con el fin de extraer la eficiencia smFRET media de todos los datos grabados smFRET los datos de la trama a gota o los datos de moléculas en cuanto se representan en los histogramas y analizados mediante Gauss se ajusta a (múltiples) picos. En lo que sigue, el protocolo utiliza un software de análisis de datos comerciales (véase la Lista de Materiales). Sin embargo, cualquier otro software disponible se puede utilizar en su lugar.
Abrir un software de análisis de datos (véase la Lista de Materiales). Haga clic en Archivo | Importar | múltiples ASCII. Seleccione la carpeta que contiene el archivo FRW.dat. Seleccione el archivo y pulse el botón "OK & #34 ;. Aceptar la opción de entrada con "OK" sin un cambio.
Seleccione la tercera columna C (Y) que contiene las eficiencia de FRET corregidas, haga clic derecho en la columna y seleccione Plot | Estadística | histograma. En la ventana del histograma doble clic en las columnas y anular la selección de "binning automática" y seleccionar una bandeja de tamaño deseado, por ejemplo, 0,05. Además, puede seleccionar los valores de inicio y fin, por ejemplo, -0.025 y 1.025.
Seleccione las columnas del histograma haciendo clic izquierdo sobre ellos. A continuación, haga clic derecho y elegir la opción "ir a la papelera de la hoja de trabajo". Seleccione la opción "Cuenta" columna haciendo clic izquierdo en él y luego haga clic derecho y seleccione Plot | Columna / bar / Pie | Columna.
En el diagrama de barras ir a la columna Análisis | montaje | ajuste de curva no lineal | diálogo Abrir. Elija "Gauss" en virtud de la función y luego ir al jinete "Parámetros". Anular la selección de parámetros de inicialización automática. Fijar el valor de desplazamiento (y0) en 0. Haga clic en "Fit".
NOTA: La función de ajuste, así como el de montajecolas se muestran ahora en la trama de la columna. El valor "xc" da el centro de la función de ajuste, es decir, la media FRET eficiencia que sirve como parámetro de entrada para el software de NPS.
7. Medición de la Quantum Rendimiento
Realizar la determinación rendimiento cuántico con el método relativo similar al procedimiento descrito por Würth et al. 35, utilizando Rodamina 101 disuelto en etanol (QY = 91,5%) como un estándar.
Los espectros de absorción de registro en un espectrómetro UV-VIS utilizando un volumen de 80 l en una cubeta de absorción de 1 cm de espesor. La absorbancia a la longitud de onda que se utiliza para la excitación de fluorescencia tiene que ser ≤ 0,05.
espectros de emisión récord en un espectrómetro lámpara de calibrado que opere en modo de recuento de fotones. Llevar a cabo las mediciones con polarizadores Glan-Thompson en la excitación (0 °) y emisión (54,7 °) camino (condiciones de ángulo mágico) utilizando un SPECTR al ancho de banda de aproximadamente 5 nm y 2,5 nm para la excitación y emisión monocromador, respectivamente. Medir las muestras después de transferirlos a una cubeta de fluorescencia con 3 mm de paso teniendo cuidado de que la tasa de recuento no exceda de 10 6 s -1.
Calcular rendimiento cuántico según
donde n y n Std son los índices de refracción del disolvente de la muestra y del estándar, respectivamente. f (λ) y f_Std (λ) son las intensidades de fluorescencia de la muestra y el estándar de la longitud de onda λ. A (λ ex) y A std (λ ex) son la absorbancia de la muestra y de referencia en la longitud de onda de excitación y Φ std es el rendimiento cuántico de la norma.
Le "> 8. Cálculo de la Isótropo Förster Radio
Calcular el radio isotrópica Förster ( ) Desde el espectro de emisión de la molécula donante, el espectro de absorción de la molécula aceptora, el rendimiento cuántico del donante y el índice de refracción del medio. Utilice el software gratuito PhotochemCAD para el cálculo de . Sin embargo, cualquier otro software disponible puede utilizarse en lugar 36.
9. Medición de las anisotropías
Determinar las anisotropías de fluorescencia en estado estacionario a partir de las grabaciones de los espectros de fluorescencia con varios ajustes del polarizador de excitación / emisión (V / V, V / H, H / V, H / H) 36.
Calcular el G-factor, que corrige los artefactos de polarización del instrumento, para cada longitud de onda de laproporción
y utilizarlo para calcular el valor de anisotropía para cada longitud de onda:
donde XY indica la intensidad de excitación de polarización y la polarización de emisión x y.
La media de los valores en el rango espectral de emisión para calcular la anisotropía de fluorescencia en estado estacionario.
10. Instalación de Fast-NPS Software
Descargar UCSF Quimera de http://www.cgl.ucsf.edu/chimera y seguir la guía de instalación.
Ir a la página web del "Instituto de Biofísica"en Ulm Universidad: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Descargar la versión actual de Fast-NPS y extraerlo en una carpeta de su elección. Abra la subcarpeta "redistribuible" e instalar el Visual C ++ Redistributable que es apropiado para el sistema.
11. Centrar el archivo PDB
Abra el archivo PDB (s) de interés en la quimera. Seleccionar todos los átomos del complejo macromolecular y calcular las coordenadas del centroide (Herramientas | Análisis de la estructura | Ejes / Aviones / centroides | Definir centroide ... | Sí).
Abra la respuesta de registro (Favoritos | Responder Log) y la Herramienta de Transformación (Herramientas | Movimiento | transformar las coordenadas). Introduzca las coordenadas del centroide mostrado en la respuesta de registro en el cuadro de texto "Shift" de la ventana Transformación de coordenadas y de cambiar el signo de cada coordenada. Pulse el botón "Aplicar" y guardar el archivo con "Guardar AP" (Archivo | Guardar AP).
12. Marcolos Priores de posición
NOTA: Todos los valores se consideran en Angstrom.
Comience el lenguaje de cálculo técnico y cambiar la carpeta actual a la carpeta Fast-NPS local. Introduzca en la ventana de comandos: FastNPS.
Crear un nuevo archivo de trabajo en Project Manager (Proyecto | Nuevo).
Configurar la posición previa (Herramientas | tinte modelo anterior).
En el panel "fundamentos anteriores" definir la resolución espacial de la posición previa mediante la introducción de su valor (se recomienda 2).
Excluir el interior de la macromolécula mediante la activación de la casilla y hacer clic en el botón "AP carga". Seleccionar y cargar el archivo pdb centrada tal como se describe en la Sección 11.
Especificar el diámetro aproximado (se recomienda 13 Å, véase la discusión) del colorante mediante la introducción de su valor.
Introducir una distancia esqueletización, es decir, la distancia de la molécula de colorante puede penetrar en la macromolécula (se recomienda 2 Å).
En elPanel "tamaño máximo antes de" entrar en las coordenadas mínima y máxima de la posición anterior (recomendada: x en [-150,150], y en [-150,150] yz en [-150,150]).
Cuando se define un satélite, active la casilla de verificación "adjunto a través de conector flexible" en el panel "fundamentos anteriores" y entrar en el panel de "enlazador" las coordenadas del átomo (en el archivo PDB centrado) a la que se une la molécula de colorante. Además, especificar la longitud y el diámetro del ligador mediante la introducción de sus valores (se recomiendan 13 Å y 4,5 Å, véase la discusión). En el caso de una antena omitir este punto.
Presione el botón "calcular el volumen accesible".
Guardar la posición previa y opcionalmente exportarlo para fines de visualización utilizando un programa como Quimera.
13. La definición de la geometría de la red
Abrir la ventana Definir Medición (Modo | Editar geometría).
Crear una nueva molécula de colorante pulsando la culataen "Nuevo" en los "tintes" del panel.
Establecer su anisotropía de fluorescencia (Sección 9) mediante la introducción de un valor y seleccione un modelo de tinte en el menú desplegable "modelo de tinte".
Presione el botón "Load", seleccionar la posición correspondiente antes y marca la casilla de verificación Activar del colorante. Repita este procedimiento para todos los colorantes, es decir, para todas las antenas, así como para todos los satélites.
Después de la creación de todos los tintes, definir las mediciones. Crear una nueva medición haciendo clic en "Nuevo" en los "Mediciones" del panel.
Seleccione sus socios FRET en los menús desplegables "COLORANTE1" y "COLORANTE2" a continuación.
Introduzca la eficiencia smFRET con el error y el radio de Förster isotrópica de este par de colorantes.
Por último, seleccione la casilla de verificación Activar de la medición. Repita este procedimiento para todas las mediciones.
NOTA: A menudo la red se hace cada vez más complejo, por lo que el usuario podría confundirse. Con el fin de Prevent errores, comprobar visualmente la red pulsando el botón "Verificar red". La figura muestra los colorantes activados e indica las mediciones a través de líneas que interconectan los colorantes de FRET.
Abra la ventana de cálculo (Modo | Cálculo).
Si cada colorante en la red tiene un modelo específico asignado, seleccione "Definido por el usuario" e iniciar el cálculo presionando "Cálculo". Para tener todos los tintes en el mismo modelo, seleccione uno de los cinco modelos (clásico, iso, iso-meanpos, var-meanpos-iso-var y meanpos) y continuar.
NOTA: La ventana de comandos indicará el progreso del cálculo. Fast-NPS lo hará con un mensaje emergente, cuando el cálculo se ha completado.
15. La visualización de los resultados
Con el fin de exportar los volúmenes creíbles de los tintes, abra la ventana de resultados (modelo | Ver resultados).
densidades de tintes de exportación:
Exportarcolorantes individualmente o todos al mismo tiempo. Con el fin de exportar un solo colorante seleccionarlo en el panel "Los tintes mostrados" y pulse "Densidad de exportación". Introducir una resolución (se recomienda 2) y elija un tipo de archivo para la exportación. A la derecha se ve de antemano la densidad y algunas de sus características matemáticas se muestran.
Con el fin de exportar todos los tintes empujan simultáneamente "por lotes de exportación".
Abrir los archivos resultantes de densidad en la quimera.
16. Control de consistencia del modelo elegido Combinación
Abra la ventana de resultados (modelo | Ver resultados). Si en el panel "Cálculo Info" el cuadro de texto "consistencia" muestra un valor inferior al 90% el modelo actual no representa las eficiencias smFRET medidos suficiente y por lo tanto es inconsistente.
En caso de incoherencia presionar el botón de "La consistencia detallada". Búsqueda de las mediciones que tienen un valor por debajo de 90%. Si uno o más colorantes son en su mayoría involucrados en estas mediciones, sus modelos son susceptibles de causar la incompatibilidad. Considerar diferentes modelos de tinte para estos colorantes y vuelva a ejecutar el cálculo rápido de fuentes de energía nuclear.
La transcripción es el primer paso en la expresión génica en todos los organismos. En Archaea, la transcripción se lleva a cabo por un solo RNA polimerasa (RNAP). En comparación con los eucariotas, la RNAP arqueas tiene un parecido estructural sorprendente con sus homólogos eucariotas mientras que con un simple maquinaria transcripcional. Por lo tanto, Archaea se puede utilizar como un sistema modelo para estudiar la iniciación de la transcripción eucariótica por la ARN polimerasa II (Pol II). Recientemente, la arquitectura completa del complejo abierta arqueas ARN polimerasa se ha determinado a partir de una sola molécula FRET y NPS. Los datos del análisis de fuentes de energía nuclear se utilizó para construir un modelo del complejo promotor completa arqueas abierta, que proporciona información útil sobre el mecanismo de iniciación de la transcripción.
Para dilucidar esta estructura, se midieron las eficiencias smFRET entre moléculas de colorante de antena desconocidos ubicados dentro de la com promotor abiertocompleja y varias moléculas de colorante de satélites conocidos que fueron incorporados en cinco sitios de referencia en el RNAP, cuyas posiciones son conocidas a partir de estructuras cristalográficas (AP-ID: 2WAQ) 37. Los colorantes de antena se adjunta a una cualquiera de las diferentes posiciones en el ADN no plantilla, TFB, TBP o TFE. La red completa que se utiliza en este estudio consistía en más de 60 distancias medidas.
La figura 7 muestra el modelo del complejo promotor abierto archaeal completa construido a partir del análisis de NPS. Está formado por el promotor de doble hebra de ADN (azul claro y oscuro), la ARN polimerasa (gris) y el inicio de la transcripción factores de TBP (púrpura), TFB (verde) y TFE (amarillo). El modelo se superpone con los resultados del análisis de fuentes de energía nuclear, los volúmenes creíbles, que se calcula utilizando el modelo clásico (A), el modelo ISO (B), el modelo meanpos-iso (C), el modelo VAR-meanpos-iso (D) y las var-meanpos modelo (E).
Figura 1: Flujo de trabajo de la adquisición y el procesamiento de los parámetros necesarios para el cálculo rápido de fuentes de energía nuclear. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplar intensidad de fluorescencia tiempo rastro de un evento smFRET. Las intensidades de fluorescencia del donante (verde) y la molécula aceptora (rojo) que muestra las tres fases características, a saber, I: smFRET, II: fluorescencia del donante después de photobleaching aceptor, III: fluorescencia de fondo después de photobleaching donante.g2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ilustración esquemática de la cámara de flujo para los experimentos smFRET. La cámara de flujo se monta sobre un soporte de metal personalizado con los titulares de vidrio acrílico. El sándwich de diseño de la cámara de flujo comprende un cristal de cuarzo (sílice fundida) deslice con dos agujeros para la fijación de tubos de entrada y salida, una película de sellado y un cubreobjetos que cierra la cámara de flujo. El prisma de iluminación TIRF se monta sobre la mitad inferior de la cámara de flujo. tornillos pestaña huecas proporcionan la entrada y salidas de la cámara de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Preparación del portaobjetos de vidrio de cuarzo y la película de sellado. dibujo mecánico de la lámina de vidrio de cuarzo que indica las posiciones de los agujeros (en milímetros). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Dibujo mecánico de la cámara de flujo. Las medidas para el soporte del prisma de aluminio, acrílicos titulares de vidrio y marco de montaje de aluminio se dan en milímetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Representación esquemática de la configuración de TIRF de tipo prisma utilizado para los experimentos smFRET. Las abreviaturas de los componentes ópticos: A, de apertura; DM, espejo dicroico; F, filtro de emisión; L, la lente; M, espejo; O, objetiva; P, prisma; PSD, sensible a la posición de fotodiodos; S, muestra; PS, la etapa de posicionamiento; T, telescopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Resultados de la simulación de los diferentes supuestos del modelo. Todas las imágenes muestran el ARN archaeal polimerasa (AP-ID: 2WAQ, vista desde arriba) junto con el modelo de la promotora de ADN (tDNA y ntDNA en azul y cian, respectivamente), PDD (púrpura), TFB (verde) y TFE (amarillo)en el arqueas abrir compleja 30. Los volúmenes creíbles se superponen a los resultados de la simulación NPS de (A) el modelo clásico, (B) el modelo ISO, (C) el modelo meanpos-iso, (D) el modelo VAR-meanpos-iso y (E) de la var -meanpos modelo. Todos los volúmenes se muestran en el 68% de credibilidad. El las redes var-meanpos clásico y son consistentes con los datos smFRET. Por el contrario, las redes donde por todos los tintes se elige el iso, iso-meanpos o el modelo VAR-meanpos-iso son incompatibles con los datos medidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Presentamos la configuración y experimental procedimiento para determinar con precisión la eficiencia de FRET entre los colorantes unidos a través de enlazadores flexibles a biomacromoléculas, es decir, ácidos nucleicos y / o proteínas.
Con el fin de asegurar mediciones precisas smFRET (Sección 3), es crucial para excluir el aire de la cámara de flujo en cualquier momento durante la medición. Además, asegúrese de no sobrecargar la cámara de flujo con fluoróforos. Los fluoróforos deben estar claramente separados para asegurar el correcto análisis. Como pares smFRET, que no muestran la decoloración del donante tienen que ser excluidos del análisis, asegúrese de que> 80% de las moléculas en el campo de visión se blanquean al final de la película. Para dar cuenta de la falta de homogeneidad en la muestra de la β-factor y el γ-factor de, la corrección de los cross-talk y relativos eficiencias de detección del canal de donante y aceptor, respectivamente, se calculan para cada FRET emparejar individualmente.
Para las mediciones en el espectrómetro de fluorescencia (Secciones 7 a 9) un buen compromiso entre la intensidad de la señal y la resolución espectral de los datos registrados tiene que ser encontrado. Para este fin, las ranuras en la excitación y emisión vía del espectrómetro de fluorescencia tienen que ser adaptados depende del instrumento utilizado y de la concentración de la muestra.
Por otra parte, se presenta el método de análisis rápido de NPS para obtener información estructural de macrom transitoria o dinámicoMOLECULAR complejos. NPS se ha aplicado para revelar el camino de la cadena de ADN no plantilla y la posición de los factores de iniciación de la transcripción en el complejo abierto ARN polimerasa archaeal. El uso de la red de más de 60 diferentes medidas de distancia, puso de manifiesto que Fast-NPS, equipado con un motor de muestreo de reciente aplicación (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., y Michaelis, J. en preparación), reduce el tiempo necesario para el análisis de esta red smFRET complejo por ≈2 órdenes de magnitud, en comparación con el método de NPS mundial original de 27. La robustez del algoritmo se basa en un muestreador de Metropolis-dentro-Gibbs combinado con un esquema de templado paralelo. Fast-NPS muestra exacta reproducibilidad de los resultados de la red y es consistente con los resultados publicados anteriormente 30.
Existen varios métodos diferentes han sido publicados con el objetivo de inferir información estructural a partir de mediciones smFRET 11 arriba>, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Todos estos enfoques proporcionan sólo un modelo de tinte específico. Por lo tanto, colorantes, que no cumplen con las suposiciones hechas por el modelo respectivo, no se pueden utilizar o conducen a la información estructural falsa. Fast-NPS, por el contrario, permite seleccionar para cada molécula de colorante de un modelo diferente. Esto ayuda a explicar diferente comportamiento conformacional de ambos, la propia molécula de colorante, así como el enlazador utilizado para su fijación. El entorno molecular locales de la molécula de colorante, así como sus propiedades físicas se determinan qué modelo es el más adecuado.
Para la red smFRET analizado del complejo de iniciación archaeal, un supuesto isotrópica para todas las moléculas de colorante conduce a una disminución drástica in el tamaño de los volúmenes creíbles en comparación con el modelo clásico. En combinación con una posición dinámica promedio para todos tinte moléculas de la mediana de todos los tamaños de volúmenes creíbles (al 95%) se reduce a menos de 0,5 nm 3. Sin embargo, estos dientes posteriores molécula de colorante ya no responden con sus mediciones smFRET, lo que indica que los supuestos hechos de plomo a la información estructural falsa. En contraste, los posteriores determinados en el modelo clásico son consistentes con las eficiencias smFRET determinados.
A medida que la asunción de la posición isotrópico y / o dinámico con un promedio de todos los tintes presentar inconsistencias, Fast-NPS permite priores molécula de colorante en el que cada colorante se le puede asignar uno de los cinco modelos. Cada modelo utiliza el mismo volumen accesible. El algoritmo para el cálculo de las AV tinte hace varias suposiciones. Al principio, la forma espacial del fluoróforo se aproxima por una esfera. Por lo tanto, un diámetro teniendo en cuenta wid del fluoróforoTH, altura y grosor se deben utilizar (Sección 12). Además, la forma del enlazador se aproxima por una varilla flexible. Los valores presentados en la Sección 12 se calcularon para el colorante Alexa 647 unido a través de un enlazador 12-C. Hasta la fecha, no es posible determinar con precisión a priori qué modelo es el más adecuado, teniendo en cuenta una geometría experimental, y por lo tanto todos los modelos debe ser probado. En general, se elige el modelo que da el tamaño posterior más pequeña posible, sin dejar de ser consistente con los datos. Para probar si una selección de modelos es consistente con los datos smFRET, calculamos tanto la posterior y la probabilidad. La consistencia significa que más del 90% de las muestras recogidas de la posterior están dentro del intervalo de confianza del 95% de la probabilidad.
Si bien es cierto que cuanto más baja la anisotropía, menor será la incertidumbre distancia, en una red smFRET disposiciones geométricas de las moléculas de colorante también tienen que ser tomadas en cuenta. Así, mientras que rREPRESENTAN moléculas de colorante con una anisotropía baja fluorescencia con un modelo ISO es una primera opción típica, la prueba de consistencia proporciona un medio más directo para seleccionar el modelo de tinte correcto. La elección óptima de los modelos de colorante puede conducir a un aumento drástico en la precisión de localización y al mismo tiempo conservar la coherencia de la red con sus datos de FRET.
Para resumir, Fast-NPS permite obtener información estructural y dinámica de grandes complejos macromoleculares. En contraste con los métodos estructurales comunes tales como cristalografía de rayos x o microscopía electrónica de crio esto permite el seguimiento de los complejos altamente flexibles o transitorios, ampliando así en gran medida nuestra comprensión mecanicista de los procesos biológicos complejos.

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