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Timestamp: 2020-02-23 12:07:43+00:00

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Técnicas Microbiológicas Parte 1 | Tinción | Química
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Folleto 5 Metabolismo de Proteinas
v14n25a01.pdf
BqF Práctica II
6.-Tinción-gram.pdf
Procedemientos Lab Biologia.docx
Practica N° 2: COLORACIÓN GRAN: MUESTRA SARRO DENTARIO
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Guia Gram 11
MICROBIOLOGIA- INFORME 1
Coloración Bacteriana
El presente libro tiene la finalidad de dar apoyo a las asignaturas relacionadas con el cultivo, manejo, aislamiento, conservación e identificación de microorganismos para los estudiantes de educación media y superior del área biológica.
Se presentan algunas técnicas básicas microbiológicas el cual tiene como principal objetivo poner en práctica el método científico para despertar el interés y seguir estimulando en algunos casos al estudiante por esta rama de la ciencia.
Como una aportación a las estructuras didácticas de este libro, colocamos una serie de imágenes de lo que esperamos en el experimento y de lo que no esperamos para poderlos comparar.
Pasos a seguir para trabajo diario de un laboratorio de microbiología
Procedimiento para la realización de un medio de cultivo
Realización de una preparación en fresco y fija
Preparación de material utilizado en microbiología
Diluciones y diluyentes
Aislamiento por estría cruzada y vaciado en placa
Conservación de cepas
Determinación de OMA
Determinación de OCT
Aplicaciones de la temperatura (pasteurización de leche y control de calidad)
La calidad en nuestro trabajo en un laboratorio de Microbiología depende de una secuencia de pasos a seguir estrictamente por todo el personal que labora el, para ello sugerimos seguir los siguientes pasos para tratar de uniformar criterios.
1.- Preparación del área de trabajo
2.- Preparación de medios de cultivo
3.- Preparación de reactivos
4.- Preparación de material
5.- Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras para su análisis microbiológico
6.- Realización de la técnica
7.- Incubación de la muestra
8.- Recuento
9.- Realización de los cálculos
10.- Presentación del informe.
El personal de nuevo ingreso al laboratorio de Microbiología deberá de leer el manual de aseguramiento de la calidad y pondrá más interés en su área de trabajo.
Las características del área de trabajo son las siguientes:
1.- La mesa debe ser de acero inoxidable con instalaciones de agua, luz, drenaje y gas, cada una de estas instalaciones deberá de tener los siguientes códigos de colores según la NOM-026-STPS, Colores y señales de seguridad e higiene e identificación de riesgos por fluidos conducidos en tuberías.
IDENTIFICACIÓN DE TUBERÍAS CONTRA INCENDIO
IDENTIFICACIÓN DE FLUIDOS DE BAJO RIESGO
IDENTIFICACIÓN DE FLUIDOS PELIGROSOS
2.- El área de trabajo cuenta con luz natural principalmente y/o luz artificial.
3.- Una campana de flujo laminar para la realización del sembrado con instalaciones de luz.
4.- Siempre al inicio y al final de nuestras actividades la mesa se limpiará con una solución de benzal al 10 % para desinfectarla, para ello siempre se debe tener una esponja y un atomizador con benzal, además se debe de tener un frasco de con benzal para cuando se necesite, este reactivo hay que prepararlo frecuentemente para evitar que se contamine.
5.- La mesa debe tener dos mecheros con manguera en buen estado y una balanza granataria de 600 g de capacidad para el pesado de las muestras.
6.- En el cajón de la mesa se debe tener papel aluminio, cucharas de plástico nuevas, espátulas, frasco con torundas de algodón, hisopos, cuchillos, tijeras, pinzas, tenedores, ligas, (algunos estériles y otros no porque se pueden esterilizar con alcohol cuando se requieran)
7.- Debe existir un frasco de 2 litros de capacidad con 1 litro de benzal para colocar las puntas de las pipetas que se estén utilizando durante el análisis perfectamente etiquetado (PUNTAS DE PIPETAS SUCIAS).
8.- En la mesa procurar distribuir el material que se necesita de tal manera que contemos con el espacio suficiente para manipular las muestras tanto en el pesado de la muestra como el sembrado, de tal forma que sugerimos apilar las placas de Petri del lado izquierdo para irlas corriendo al lado derecho.
9.- Debajo de la mesa se tendrá un recipiente con una bolsa de plástico para desechar lo que no sirve, nunca las muestras, estas se guardan hasta que el análisis y reporte estén terminados.
10.- El área de trabajo estéril no debe tener corrientes de aire para evitar contaminaciones.
11.- El analista debe traer una bata de preferencia blanca, limpia y en buen estado, con el pelo recogido y cubierto con una cofia, además de utilizar un cubrebocas y guantes al manipular la muestra.
12.- Se debe de programar la fecha y hora de dar mantenimiento a las instalaciones así como la hora para la limpieza de este.
13.- El analista debe evitar en lo posible la entrada de personal ajeno al laboratorio o en zonas donde se preparen medios, reactivos, o área de sembrado de muestras.
14.- Al final de cada día de trabajo el analista indicará al personal de lavado de material cual es el que tendrá que lavar y esterilizar para ser utilizado nuevamente.
15.- Al desechar las muestras sobre todo las sólidas utilizar una coladera para evitar que las partículas sólidas de gran tamaño se vayan por el drenaje.
El personal encargado de la preparación de medios de cultivo debe conocer la NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo para poder clasificarlos, para ello mencionaremos lo siguiente:
Un Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad, proporcionándoles las condiciones ambientales adecuadas para su desarrollo, estos requieren elementos que se encuentran en su composición química. Los factores que se deben regular durante el crecimiento son los nutrientes, pH, temperatura, aireación, concentración de sales, y potencia iónica del medio.
Los componentes necesarios que debe contener un medio de cultivo deben ser:
a.- Fuente de carbono
Los microorganismos obtienen su energía a través de la fotosíntesis o de la oxidación de compuestos orgánicos, son capaces de utilizar el CO 2 como fuente principal de carbono. El carbono se suministra generalmente en forma de carbohidratos
b.- Fuente de nitrógeno
El nitrógeno es un componente de primer orden de las proteínas y ácidos nucleicos, las fuentes pueden ser los nitratos, nitritos, nitrógeno, amonio y aminoácidos.
c.- Fuentes de azufre
El azufre es uno de los constituyentes orgánicas de la célula, constituye parte de la estructura de diversas coenzimas y se encuentra formando parte de la metionina y cisteína, la mayoría de las bacterias toman el azufre del ión sulfato, otros más lo pueden obtener a partir del H 2 S.
d.- Fuente de fósforo
Se requiere fosfato como componente de ATP, ácidos nucleicos y coenzimas como el NAD, NADH y flavinas. El fosfato se asimila como fosfato inorgánico.
e.- Fuentes minerales
Algunos microorganismos requieren de iones Mg 2+ y ferroso Fe 2+ , el magnesio es un componente de la molécula de clorofila y el hierro es parte de las coenzimas de los citocromos y las peroxidasas. El potasio se requiere para la función de los ribosomas y el calcio es un constituyente de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas
f.- Factores de crecimiento
Se llama factor de crecimiento a la sustancia que favorece el crecimiento pero que el microorganismo es incapaz de sintetizar. Los factores de crecimiento pueden ser vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, biotina), algunas de estas sustancias se pueden obtener del suero, yema de huevo o sangre.
g.- Agar
El agar utilizado en bacteriología es un medio que esta libre de metales tóxicos, compuestos nitrogenados, sales
insolubles, azúcares libres, microorganismos muertos, bacterias termófilas y pigmentos.
El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas, particularmente de los géneros Gelidium, Gracilaria, Pteroclaida y Acanthopeltis, químicamente el agar es una mezcla de dos polisacáridos: agarosa y la agaropectina, cuyas estructuras se revelan como polímeros de la galactosa en sus distintas formas. La proporción de agarosa y agaropectina es variable, con valores extremos de 75 % de agarosa y 25 % de agaropectina, según la clase de algas utilizadas. El agar con agua destilada fría tiene un poder de hinchamiento superior a veces al 3000%, en agua hirviendo el agar se disuelve totalmente en pocos
minutos. La tendencia a la unión de sus partículas, que en frío se mantienen independientes producen un gel limpio
y transparente que al enfriarse, ya no cede el exceso de agua absorbida. La viscosidad del gel aumenta paulatinamente a medida que la solución disminuye en su temperatura, gelificando a los 35 –40 °C.
Los ácidos diluidos en frío, no alteran sensiblemente el agar, desde que se introdujo el agar a los medios de cultivo como agente gelificante ha resultado muy bueno debido a :
a.- Su estructura le confiere gran estabilidad frente a las enzimas microbianas, muy pocas bacterias marinas son capaces de hidrolizar como Pseudomonas carragenomora.
b.- Su estabilidad química, le permite mantener el medio al estado sólido prácticamente en cultivos de cualquier bacteria
c.- Su punto de fusión, superior a 80 °C, permite cultivar en medio sólido bacterias termófilas que se incuban hasta temperaturas de 65 °C.
d.- Su temperatura de gelificación, inferior a los 39 °C, permite mezclarlos en forma líquida.
e.- Su elevado poder gelificante permite su utilización a muy bajas concentraciones, generalmente del orden del 1 al 1,5 % (m/v) permitiendo obtener geles muy firmes, lo que permite sembrar microorganismos
f.- Su empleo en concentraciones muy bajas permite la obtención de medios semisólidos en los cuales se pueden realizar pruebas de movilidad
En algunas ocasiones un medio de cultivo posee algunas otras sustancias como colorantes o inhibidores para favorecer o inhibir el crecimiento de un microorganismo.
Los colorantes e indicadores son de importancia en la preparación de la mayor parte de los medios de cultivo diferenciales pues, pueden actuar de la siguiente manera:
a.- Como agentes bacteriostáticos
b.- Como indicadores de los cambios de acidez o alcalinidad
c.- Como indicadores redox en ciertos medios de cultivo.
Según la NOM los clasifica por:
A.- Su aspecto físico, los medios de cultivo preparados pueden ser:
a.- Líquidos,
b.- Semisólidos,
c.- Sólidos.
a.- Medios líquidos.
Se emplean fundamentalmente para:
- Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos.
- Estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen.
- Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas.
b.- Medios semisólidos.
- Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda.
c.- Medios sólidos.
- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios sólidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiología.
B.- Su uso, se clasifican en:
a.- Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
b.- Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios líquidos que estimulan la multiplicación de algún germen determinado e impiden o inhiben la reproducción de otros.
c.- Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de ácido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las características típicas de las colonias.
d.- Medios para cultivar gérmenes anaeróbicos.
Son medios de cultivo para aquellos gérmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.
e.- Medios de cultivo para medir la potencia de los antibióticos.
f.- Medios de transporte.
Sirven para transportar los especímenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporción original de la flora microbiana en los especímenes.
g.- Medios para filtración a través de membrana.
Pueden ser líquidos o sólidos. En el primer caso, se preparan a la concentración usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana.
Los medios sólidos tienen un contenido mínimo de agar para favorecer la difusión de nutrientes del medio de la membrana.
h.- Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
i.- Medios especiales para cultivo de protozoarios.
C.- Especificaciones
El fabricante debe especificar en cada medio:
a.- Contenido de humedad (medio deshidratado).
b.- Composición del medio.
c.- Método de preparación.
d.- Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado (en autoclave).
e.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.
f.- Características de desarrollo de los microorganismos en el medio.
g.- Advertencia sobre la conservación de los medios preparados.
h.- Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.
i.- Resultado de las pruebas de viabilidad del medio.
j.- pH del medio preparado.
k.- Fuerza de gel (si procede).
D.- Etiquetado
El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma español, con caracteres claros y legibles, de conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud, su Reglamento en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto, debiendo incluir además:
- Nombre comercial del producto.
- La leyenda "Agente de Diagnóstico".
- Datos de conservación y almacenaje.
- Número de Registro SSA.
- Nombre y domicilio del distribuidor.
- Método de preparación y pH final.
- Fórmula.
Por lo tanto haciendo uso de la reglamentación mexicana tenemos ejemplos de los medios de cultivo por su aspecto físico.
a) Medios líquidos.- Este medio no contiene agar y se emplea para obtener grandes cantidades de
microorganismos o bien para la producción de algún metabolito además de estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, se puede obtener el tubo o en matraz y en caso de cultivar a los mohos se puede hacer por agitación o sin agitación.
Figura 1: Cultivo en medio liquido (caldo nutritivo y caldo glucosa sales)
b) Medios semisólidos.-Se utiliza para determinar si un microorganismo tiene movilidad y su contenido de agar es de 13 g/l
Figura 2: Medio semisólido (medio SIM), para observar la movilidad de un microorganismos
c) Medios sólidos.- Se elaboran en una placa para obtener colonias aisladas de microorganismos y la
concentración de agar es de 15 g/l, también lo utilizamos en medios sólidos inclinados y cuando se trata de sembrar en tubo se colocan en ellos y después de la esterilización se inclinan sobre una varilla de vidrio para dejar una superficie de aproximadamente 3 cm.
Figura: 3 Medio sólido inclinado, sólido en placa y en matraz para vaciado en placa
B.- Por su uso se clasifican en:
a) Medios selectivos.- Son medios que contienen sustancias que inhiben el crecimiento de algunos
microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperación del germen o grupo de gérmenes de interés.
Figura 4: Medios selectivo agar eosina azul de metileno.
b) Medios selectivos de enriquecidos.- Son medios que estimulan la multiplicación de algún germen
determinado e impiden la reproducción de otros como por ejemplo el agar Baird Parker que sirve para el aislamiento de S. aureus, estos medios de cultivo le adicionamos una sustancias enriquecida de composición desconocida como suero, sangre, huevo, leche, extracto de hígado, etc.
Figura 5 Medio enriquecido
c) Medios diferenciales.- Son aquellos que contienen indicadores de ácido –base para detectar cambios en el medio o en las características típicas de la colonia.
Fig. 9 Medio de transporte para la realización de exudados faríngeos.
C.- También podemos clasificar a los medios de acuerdo a nuestras necesidades y lo podemos hacer de la siguiente forma.
A.- POR SU COMPOSICIÓN
a).- Medio sintético.- Si un medio se le conoce el 100 % de su composición química.
b).- Medio complejo.- Si un medio de cultivo no conocemos su composición química.
La calidad del trabajo microbiológico en el análisis de muestras se encuentra vinculada tanto con la idoneidad de los medios de cultivo y reactivos, como de la limpieza del material de vidrio y/o plástico que se utilizan durante su preparación y/o envase.
Las mejores instalaciones y equipo disponible y la habilidad del analista pierden todo su valor si la composición de los medios de cultivos no corresponde a la requerida y si durante la preparación de éstos no se respetan las indicaciones del fabricante.
-Leer siempre las instrucciones del fabricante, las cuales están en la etiqueta del frasco
-Realizar los cálculos para pesar exactamente lo solicitado.
-Se debe siempre de fundir el medio (agar), a la temperatura de ebullición y sobre un soporte con rejilla o sobre una parrilla de calentamiento.
-Utilizar un recipiente al doble de la capacidad que se vaya a preparar
-Verificar el pH con un potenciómetro
-Una vez preparado el medio de cultivo, si son placas y ya están solidificadas se colocan en bolsas de plástico nuevas y en posición invertida para evitar la deshidratación y se colocaran en el refrigerador hasta su uso.
-Si son tubos se tienen que inclinar, para ello se coloca una pipeta en una mesa plana y se sujeta con un masking, posteriormente se acomodan los tubos, de tal manera que al solidificarse quede un área de aproximadamente 3 cm de longitud. Una vez solidificados se colocan dentro de un bote de lámina y este se introduce en una bolsa de plástico, para ser guardados en el refrigerador
-Los medios que son líquidos se quedan en el interior del bote y una vez fríos se colocan en el refrigerador.
- No olvidar colocar en la incubadora, al menos una muestra de cada medio para testigo.
-Un medio contenido en un matraz puede ser esterilizado una segunda ocasión.
-El ácido tartárico se esteriliza por filtración con membrana.
Figura 10 Medio de cultivo donde podemos preparar el medio siguiendo las instrucciones del fabricante
Fig. 11 Medios de cultivo preparados.
Los cuales llevan un control de calidad y son probados con cepas ATCC, por ejemplo para el agar de sal y manitol es probado con:
Cepa de referencia
Crecimiento inhibido
Colonias con pigmento amarillo característico y halo de color amarillo (manitol positivo)
Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo)
ATCC 12453
Inhibición parcial
Tabla No. 1 cepas de referencia para control positivo y negativo del agar de sal y manitol.
La viabilidad de los medios se debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas en centros de referencia)
ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS
Los medios de cultivo deberán almacenarse en un lugar fresco y seco o en el refrigerador
PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO
1.- Asegurarse que el frasco que contiene el medio de cultivo esté bien cerrado, no presente grumos, no esté hidratado y se encuentre dentro de su vigencia.
2.- Leer cuidadosamente las especificaciones del fabricante, generalmente son las siguientes:
2.1 Contenido de humedad (medio deshidratado).
2.2 Composición del medio.
2.3 Método de preparación
2.4.- Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado
2.5.- Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso.
2.6.- Características de desarrollo de los microorganismos en el medio.
2.7.- Advertencia sobre la conservación del medio preparado.
2.8 Resultados de las pruebas de estabilidad del medio.
2.9 Resultado de las pruebas de viabilidad del medio.
2.10 pH del medio preparado.
3.- Calcular ÚNICAMENTE la cantidad de medio de cultivo que se necesita y anotar los cálculos en la bitácora.
4.- Abrir el frasco y auxiliándose de un espátula o cucharilla, pesar en balanza, previamente calibrada, la cantidad calculada.
5.- Colocar la pesada en un recipiente cuya capacidad sea por lo menos dos veces mayor a la del volumen de medio que se desea preparar.
6.- Adicionar el volumen de agua deseado, agitar vigorosamente y dejar reposar para iniciar su disolución. NOTA:
Antes de usar el agua, verificar el pH de la misma.
7.- Si para la disolución completa se requiere calentar, efectuar esta operación en platina caliente o sobre una rejilla de asbesto calentando con mechero. NO APLICAR CALOR DIRECTO AL MEDIO DE CULTIVO, porque puede sufrir alteración.
8.- Ajustar el pH a 25 ºC con potenciómetro ajustado. NO USAR PAPEL INDICADOR EN ESTA OPERACIÓN.
9.- Esterilizar los medios y/o soluciones preparadas, usando calor húmedo a temperaturas y tiempos establecidos por el fabricante, dicho valor lo obtenemos de la etiqueta del frasco de medio. Controlar el proceso de esterilización usando como bioindicadores al Geobacillus stearothermophilus y para calor seco utilizar al B. subtilis. Para sustancias termolábiles, esterilizar mediante el proceso de filtración y el bioindicador utilizado es Pseudomonas diminuta,
a.- Medios sólidos en placa
Cuando se necesite preparar placas de medios de cultivo, efectuar el proceso de vaciado en campana de flujo laminar o bien en la zona de trabajo bacteriológico del mechero, siguiendo las siguientes recomendaciones.
1.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una temperatura de 45 ± 2°C.
2.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y proceder a vaciar el medio
Fig. 12 Medio sólido a 45 °C y vaciado en placa del medio
3.- Dejar entreabiertas las placas un momento para que el agua se evapore y no se condense en la tapa, una vez desplazada el agua tapar rápidamente.
Fig.13 Diferentes placas con medio de cultivo
El medio sólido también es utilizado para realizar el recuento y aislamiento de microorganismos por la técnica de extensión con varilla, en esta técnica contamos con el medio ya solidificado y adicionamos 0,1 ml del inoculo en la superficie del medio, posteriormente esterilizamos la varilla y dejamos enfriar para extender la muestra.
Fig. 14 Técnica de extensión con varilla
Medio sólido en placa, dejar entreabierta la tapa de la caja de lo contrario se formará agua de condensación, tal y como se muestra en la figura. 14
4.- En caso de existir burbujas en el medio hay que flamear con la flama del mechero, procurando agarrar el collarín para que no se apague, tapar la placa y dejar solidificar.
Fig. 14 Cuando al vaciar nos queden burbujas, estas se pueden romper al hacer pasar la flama del mechero sobre ellas (Nunca hacer este procedimiento cuando ya se tenga el inoculo de la muestra)
5.- Los medios preparados se deben conservar de preferentemente en el refrigerador y protegidos con bolsas de plástico.
6.- Todos los medios de cultivo preparados deben llevar fecha de preparación.
7.- De cada lote preparado de medio de cultivo, incubar dos placas a 35 ºC durante 48 horas como prueba de esterilidad.
b.- Medios en matraz para vaciado en placa
Cuando se necesite preparar matraces con medios de cultivo, calcular lo que se necesite, colocarle un tapón de algodón con gasa y fundir el medio.
1.- Esterilizar el medio a las condiciones que indica el fabricante.
2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una temperatura de 45 ± 2°C.
3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio.
4.- Después de inocular las diluciones de las muestras preparadas, agregar de 12 a 15 ml del medio preparado, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporación del inóculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas y dejar solidificar.
Fig. 15Técnica de vaciado en placa
Fig. 16 Medios de cultivo a temperatura de 45°C para realizar la técnica de vaciado en placa
c.- Medios en matraz para vaciado en placa de mohos levaduras.
2.- Una vez que el medio sale de la autoclave, dejar enfriar a temperatura ambiente o en un baño María a una temperatura de 45 ± 2°C y adicionarle 1.4 ml de ácido tartárico al 10 % por 100 mL de medio.
3.- Preparar las placas en la mesa previamente etiquetadas y ya con el inoculo proceder a vaciar el medio
d.- Medios líquidos en tubo.
1.- Preparar el medio de cultivo (caldo) en un vaso de precipitados y colocarlo en un dosificador regulado a 9 mL y proceder a colocarlo en tubos de ensaye de 16 X 150 mm con tapón de rosca, previamente etiquetados y conteniendo una campana de Durham.
2.- Procurar no cerrar los tubos de ensaye hasta el tope para evitar que estos exploten.
3.- Colocar los tubos en un bote de lámina y colocarle papel Kraft a manera de gorro y proceder a esterilizar a las condiciones que indica el fabricante.
4.- Una vez esterilizados, dejar enfriar y colocarlos en un lugar fresco y seco o en el refrigerador para evitar la evaporación.
5.- Cuando se requiere tubos con otro tipo de caldo se le coloca a cada uno de los tubos 3 mililitros
Fig. 17 Preparación de medios de cultivo líquido en tubo
Las principales causas de error en la preparación de medios de cultivo son:
Diferencias en la medición o peso de los medios y /o ingredientes.
Falta de frescura del medio por estar bastante tiempo almacenado en el refrigerador el cual genera la deshidratación del medio
Presencia de residuos de detergente en el material utilizado.
Efecto germicida de algunas sustancias presentes en el material de vidrio por mal lavado y enjuagado.
Que la calidad del agua destilada utilizada no sea la indicada o que presente ciertas trazas de impurezas.
Diferencias en el ajuste del pH antes de la esterilización o disminución de este después de la esterilización por efecto del calentamiento o bien por parte del analista.
Aunque los medios sean de buena calidad podría en un momento dado tener sustancias que inhiban el crecimiento de los microorganismos.
Al vaciar los medios si no se hace a la temperatura sugerida puede tener agua de condensación y al sembrarlo puede generarnos colonias extendidas.
Una mala esterilización por parte del personal que lo realice ya sea un sobrecalentamiento del medio trayendo como consecuencia que se desnaturalicen algunas sustancias y en ocasiones pueden perder su poder diferencial o su consistencia.
Siempre que la técnica indique esterilizar por separado alguna sustancia se deberá de realizar nunca mezclarlos porque es una causa de error, que pudiera repercutir en el resultado de manera muy significativa.
El esterilizar los medios más de una vez corremos el riego de perdida de agua por lo que el medio estará más duro de lo que debe estar, por lo tanto se deben de pesar solo cantidades necesarias.
Revisar frecuentemente el funcionamiento del manómetro de la autoclave.
Los bioindicadores no deben presentar desarrollo alguno a las 48 horas de incubación en el baño María
Del lote elaborado el 5 % de las cajas d Petri o matraces preparados para el vaciado en placa no deben de presentar desarrollo alguno. Esta prueba se debe realizar siempre que se prepare material.
Elaboración de una preparación en fresco y una preparación fija
Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios ópticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las técnicas más comúnmente usadas para realizar preparaciones para microscopios ópticos.
A.- Preparación en fresco: para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no esté fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la muestra, sobre un portaobjetos y cubriéndola, sin formar burbujas de aire, con un portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases, pero antes debemos limpiar los portaobjetos de la siguiente manera.
Limpieza de los portaobjetos y cubreobjetos
Es preferible utilizar material nuevo, pero en ocasiones presentan algo de grasa por lo que debemos desengrasarlos con alcohol y secarlos con un paño fino que no deje pelusa, si no se utilizan en el momento se deben de envolver con papel higiénico, de esta manera quedan protegidos del polvo y únicamente se abre el paquete en el momento de hacerlos servir.
B.- Preparación de Frotis:
Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodón y que contenga alcohol.
a) Etiquetar la preparación, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta será preferentemente
pegada a la izquierda de la preparación, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta llevará el nombre del microorganismos, el nombre de la tinción, el equipo, el grupo y la fecha.
a) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ahí tomar con el asa una
pequeña gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos. (para este paso no se necesita
que el agua sea estéril y que se tenga que esterilizar el asa)
b) Encender el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de
ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre la
gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa extender el
cm 2 para obtener una película delgada de microorganismos. Flamear el asa para
inoculo aproximadamente un esterilizarla.
c) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.
d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rápidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de la
mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente. Realizar esta operación una vez más. El calor deseable es aquel en que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado en el dorso de la mano. Dejar
enfriar el portaobjetos antes de teñir.
Fig. 18 Preparación de un frotis para una preparación
Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inóculo de lo contrario quedará un frotis grueso, la luz no pasará y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis
a) Si se proporciona un tubo con una suspensión bacteriana, entonces encender el mechero.
b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inóculo de la suspensión.
c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d) Colocar el inóculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inóculo por lo menos 1 cm 2 , y flamear el
asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.
OBSERVACIÓN DE UNA PREPARACIÓN EN FRESCO DE UN MOHO
a) En un portaobjetos limpio coloca una gota pequeña de azul de algodón lactofenol
b) Con el asa coloca un poco del micelio del moho y colócale un cubreobjetos. Observa al microscopio a 40 X y
realiza un esquema de lo observado.
Fig. 19 Preparación de una muestra de mohos con azul de algodón lactofenol
Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos; el diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias por lo que para poder observar a los microorganismos es necesario teñir la célula el cual resulta de un conjunto de reacciones fisicoquímicos muy complejos, algunas reacciones pueden ser irreversibles y otras no, por ejemplo algunos colorantes que han teñido en exceso pueden eliminarse con disolventes adecuados.
La mayoría de los colorantes utilizados en microbiología son derivados de la anilina, los colorantes están formados por uno o más anillos bencénicos conectados por uniones químicas bien definidas (cromóforos) que están bien asociados con la producción de color, teóricamente ciertos radicales químicos poseen la propiedad de absorber la luz de diferentes longitudes de onda, además poseen un grupo funcional llamado auxocromo que permite su unión a componentes con carga contraria presentes en la célula.
Los colorantes se designan como ácidos o básicos, termino que no indican necesariamente sus reacciones de pH en solución, sino más bien si una parte significativa de la molécula es aniónica o catiónica. Desde el punto de vista práctico, los colorantes básicos tienen estructuras de naturaleza ácida.
En general, el proceso seguido en todas las tinciones conlleva las siguientes etapas: extensión, fijación, tratamiento con colorantes y observación.
Extensión: Se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y, si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de
Fijación: Tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero.
Tinción: Se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores. Puede ser de varios tipos:
TINCIÓN NEGATIVA:
Los colorantes no tiñen el microorganismo, sino el entorno, aumentando de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante (nigrosina).
Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la tinción negativa, sólo nos permite observar la forma, el tamaño y el tipo de agrupación de las células.
Tomar la preparación y colocarla en el recipiente dispuesto con el colorante que previamente les ha tocado
Tomar el tiempo por 1 minuto y con la pinza de disección sacarlo del recipiente.
Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
Dejar secar la preparación y observarla al microscopio.
Fig. 20 Pasos para la realización de una tinción simple, donde se pueden colocar varias preparaciones en un mismo portaobjetos
Fig. 21 Esquemas de las diferentes formas microscópicas
La pared celular es responsable de la tinción de Gram, el procedimiento de la tinción se inicia con una tinción de las células bacterianas fijadas mediante el colorante básico cristal violeta, posteriormente se trata con una disolución de yodo, el yodo forma un complejo con el cristal violeta que es insoluble en agua y sólo medianamente soluble en alcohol o acetona. Las células se tratan después con alcohol para diferenciarlas, las células Gram positivas retienen el complejo colorante-yodo por lo que las observamos de color morado-azules y las células Gram negativas son decoloradas por el alcohol por lo que se hacen visibles mediante la coloración de contraste que en este caso es la fucsina.
Procedimiento en la tinción de Gram
Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración según la tabla
Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
Lavar los frotis con agua de la llave.
Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante).
Lavar inmediatamente con agua de la llave.
Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersión y observarlos al microscopio con el objetivo de 100X. (Previamente realizar la técnica de iluminación de Köhler y enfocar a 10 y 40X)
Fig. 22 Pasos a seguir para realizar la tinción de Gram Resultados en una tinción de Gram
Fig. 23 Tinción de Gram
TINCIÓN DIFERENCIAL: Tinción de Ziehl – Neelsen
Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Acido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).
Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una
importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos (PPD).
El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis también causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios.
La tuberculosis es una enfermedad de distribución mundial pero con consecuencias devastadoras en los países en desarrollo. En el año 1993 la Organización Mundial de la Salud (OMS-WHO World Health Organization) declaró a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con el M. tuberculosis, y que en la próxima década serán infectadas más de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarán la enfermedad y 30 millones morirán por ella.
La Tinción de los microorganismos requiere una pared celular en buen estado, el interior de la célula, rico en lípidos conserva el colorante, pero la pared no. La función de ésta, y el fenómeno de resistencia a los ácidos, se debe a la insensibilidad de la pared frente a la acción del aclarador, en este casi el ácido.
A fin de que el colorante primario, la carbolfucsina, penetre a través de las cápsulas cerosas de los bacilos
acidorresistentes, se requiere de cierto tipo de tratamiento físico como el calor.
El calor favorece la fusión de las ceras por lo que el colorante puede penetrar, luego al dejar enfriar nuevamente
las ceras solidifican, de modo que el colorante ya no puede salir. Como el tratamiento es muy enérgico cualquier bacteria que no tenga un alto contenido de lípidos como Mycobacterium y Nocardia perderán el colorante primario durante la decoloración por lo que se teñirá con el colorante de contraste que es el azul de metileno. Las bacterias
que resisten a la decoloración por alcohol ácido se denominan bacterias ácido alcohol resistente (BAAR positivas) y los vemos al microscopio de color rojo y las BAAR negativas las vemos de color azul.
Procedimiento en la tinción de Ziehl-Neelsen.
Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloración
Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparación y esperar a que se enfríe.
Enjuagar con agua de la llave.
Cubrir los frotis con alcohol ácido por un minuto.
Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto
Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersión
Fig. 24 Pasos a seguir para la realización de la tinción de Zhiel-neelsen
TINCIÓN SELECTIVA DE ESPORAS: Tinción de Shaeffer y Fulton.
Una Tinción selectiva tiene por objetivo poner de manifiesto algunas estructuras de la célula bacteriana. Las endosporas son resistentes al calor y difíciles de destruir, las bacterias formadoras de endosporas son del género Bacillus y Clostridium. Las endosporas son impermeables a los colorantes, por lo que a veces se ven como regiones sin teñir dentro de las células que han sido teñidas
Procedimiento en la tinción selectiva de Shaeffer–Fulton
Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lámpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar calor periódicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparación.
Dejar que el frotis se enfríe.
Lavar con agua de la llave.
Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersión.
Diferentes tipos de esporas que podemos observar al microscopio
Fig. 25 Observación microscópica de la espora (verde)
Fig. 26 Diferentes tipos de posición de las esporas
En la realización de las tinciones podemos tener ciertos errores como son:
Edad del cultivo: Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismos, si sufre daño en la pared por alguna causa, se vuelve Gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante.
Tinción de Gram decolorada: Esto nos ocurre cuando dejamos actuar por más de 30 segundos el alcohol cetona, entonces la preparación nos va a resultar un Gram negativa.
Fig. 27 Formas bacterianas
El microscopio es un instrumento óptico que amplifica la imagen de un objeto pequeño. Es el instrumento que más se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminación se puede hacer visible un objeto microscópico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamaño original. Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos.
Fig. 27 Tamaños aproximados de células y moléculas
Para poder observar a la célula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas variedades, los cuales están diseñados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:
Un microscopio óptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la
observación de mayores detalles de los posibles a simple vista. El microscopio más simple es
lente de aumento o un par de anteojos. El poder de resolución del ojo humano es de 0,2
es decir que para ver dos objetos separados estos deben estar como mínimo a esa
distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la información. La resolución depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del
espécimen, la calidad de la fijación y la intensidad de la coloración. Teóricamente la máxima resolución que se puede alcanzar es de 0,2 µm dada por una luz con longitud de onda de 540
nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con objetos
condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no puede aumentar la resolución. Existen distintos microscopios ópticos generales y de investigación que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminación del espécimen, la alteración física de la luz que incide en la muestra y procesos analíticos que se aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminación; 2. Sistema óptico y 3. Sistema mecánico.
El sistema de iluminación corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la preparación y esta formado principalmente por la lámpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema óptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.
El sistema mecánico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y cambio de las lentes así como el enfoque de la preparación y esta formado por la base, estativo, tornillos macrométrico y micrométrico, platina, revolver y portarevolver.
2) Botón de encendido
3) Diafragma de campo
4) tornillo micrométrico
5) Tornillo macrométrico
6) Condensador
7) Diafragma de iris
8) Platina
9) Pinzas
10) Brazo o estativo
11) Objetivo de 4X
12) Objetivo de 10X
13) Objetivo de 40X
14) Revolver
15) Tubo del ocular
16) Ocular
Fig.28 Fotografía de un microscopio óptico con sus componentes:
Función básica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecánico
Base. Pieza metálica que sostiene a todo el aparato
Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparación, la cual es fijada por dos pequeñas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macrométrico y micrométrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numéricas que permiten ubicar fácilmente la posición de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparación en forma de cruz (ejes X y Y) para su localización.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macrométrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micrométrico. Permite el enfoque con precisión.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
Revolver. es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se envía por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separación entre sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro tiene un sistema mecánico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el tornillo micrométrico el tubo que tiene el ocular fijo y después se enfoca el que tiene el ocular móvil, pero en este caso sin mover el tornillo micrométrico, girando el ocular móvil hasta encontrar el foco.
b.- Sistema de iluminación
Lámpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes características: 6V, 5-15 W ó 12 V, 50-100 W
Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su función es la de regular el diámetro de la emisión de la luz a fin de que se ilumine solo el área de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparación.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz posible que inciden sobre él y los dirige hacia el plano focal del objeto.
Fig. 29 Esquema de un condensador. 1) Lente frontal, 2) lente auxiliar y 3) diafragma de iris
c. Sistema óptico
El ocular es la parte óptica final externa, situados en el tubo a través de los cuales se obtiene la imagen final, el ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.
Datos importantes grabados sobre la periferia de un ocular: 1) Corrección esférica (CPL); 2) Ocular de gran campo (W); 3) aumentos (10X); 4) distancia focal amplia (1,8) y 5) Para observación con gafas.
El tubo es la parte óptica – mecánica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o binocular, además esta adaptada para poderle colocar una cámara fotográfica ó una cámara de televisión. El tubo generalmente esta diseñado para trabajar a una distancia mecánica fija entre ellos y este valor puede ser de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para calcular el aumento total.
1.- Símbolo de lentes
2.- Dioptrías
3.- Aumento del tubo
4.- Oculares
5.- aumento del ocular
6.- Tubo del ocular
Fig. 30 Vista frontal de los oculares de un microscopio
Objetivos.- Son lentes que captan la imagen a observar, están construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio, apertura numérica y esta diseñada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de colores y números grabados sobre el tubo metálico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la disposición de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (tabla 2)
2.- El lado superior izquierdo indica el número de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numérica.
4.- El lado inferior la distancia mecánica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qué medio se hace la inmersión del objetivo (tabla 3)
Anillo de color superior
Aumento de 40 X
Aumento de 100 X
Espesor del cubreobjetos
Fig. 31 Información contenida en los objetivos:
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el número 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos ó
0,11 – 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 2. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores grabados
Color anillo superior
Tabla 3. Colores para el anillo inferior que indican en qué medio se debe hacer la inmersión del objetivo
Aumentos totales:
El número total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el número de aumentos que tiene el ocular por el número de aumentos que tiene el tubo y por el número de aumentos que tiene
el objetivo con el que se esta observando.
Distancia mecánica:
Se llama distancia mecánica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecánica se mide desde la superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es de 160 mm.
El poder de resolución de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy cercanos entre sí y que puedan verse separada.
El poder de resolución del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio óptico de 0,2 µ y el microscopio electrónico de 6 Ángstrom.
Apertura numérica:
Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del condensador o del objetivo.
Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas.
Este aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos ópticos del objetivo y del condensador, anula la amplitud de la porción fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste útil sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espécimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar células vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
La resolución de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partículas individuales más pequeñas en las imágenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es útil para observar autorradiografías, cristales en la orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sífilis.
Cada uno de los microscopios tiene una función determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, además en este tipo de microscopio también se realiza la técnica de iluminación de Köhler.
Figura 32 Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde
Son aparatos con poca capacidad de amplificación, pero muy útiles para observar especimenes más grandes que los que se pueden observar con un microscopio óptico
la muestra se tiñe con una sustancia fluorescente que absorbe la energía de las ondas cortas
de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas más largas (verde). Se utiliza en inmunofluorescencia, técnica en la cual una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo específico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.
La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolución de 0,1 µm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar la retina.
Este microscopio es una simple modificación del microscopio óptico, contiene un filtro polarizante llamado polarizador entre la fuente de luz y la muestra y se ubica un segundo polarizador, denominado analizador entre el objetivo y el observador.
Se puede rotar el polarizador y el analizador; la diferencia entre sus ángulos de rotación se usa para determinar el grado en que una estructura afecta el haz de luz polarizada. La capacidad que tiene un cristal o estructura cristalina de rotar el plano de la luz polarizada se denomina birrefringencia.
Exhiben birrefringencia el músculo estriado o esquelético y las inclusiones cristaloides de las células intersticiales testiculares.
Los microscopios electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo). Es posible con el microscopio electrónico resolver objetos separados por una distancia de 0,003 µm, comparado con los 0,25 µm de uno óptico. Los aumentos pueden llegar a ser de un millón de veces.
A causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados;
incluso una sola bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el microscopio electrónico se necesitan técnicas especiales de
cortes ultrafinos. Para seccionar las células primero deben ser fijadas y deshidratadas (etanol o acetona). Después de la deshidratación, la muestra se incluye en una resina y es aquí donde se realizan cortes finos con un ultramicrotomo, por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola célula bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas. Si sólo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias secciones finas por
lo que se montan células enteras que se recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El
haz de electrones es dirigido sobre la preparación y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de observación produciendo una imagen. A la primera técnica se la denomina Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y a la segunda Microscopía Electrónica de Barrido (MEB).
Se asemeja más que al microscopio electrónico de transmisión a los tubos de televisión de donde deriva la microscopia electrónica. Para analizar la mayoría de los tejidos se deja la muestra, se deshidrata por desecación de punto crítico, se cubre con una película evaporada de oro-carbón, se monta en un taco de aluminio y se coloca en la cámara de muestras del microscopio. En los tejidos mineralizados es posible eliminar todos los tejidos blandos con una lejía y analizar las características estructurales del mineral.
Se logra el barrido con el mismo tipo de rastreo que explora el haz de electrones a través de la superficie un tubo de televisión. Los electrones reflejados desde la superficie y los electrones forzados hacia el exterior de la superficie son captados por uno o más detectores y reprocesados para formar una imagen tridimensional en un televisión.
Se pueden tomar fotografías para registrar los datos o la imagen en una cinta de video. Muchos microscopios combinan las características de un microscopio electrónico de transmisión y de barrido, el cual permite microanálisis porrazos X con sonda electrónica. Se pueden adosar detectores al microscopio para reunir los rayos X emitidos cuando el haz de bombardea el corte histológico, y mediante analizadores apropiados se construye un mapa que muestra la distribución en los cortes de los elementos que tienen número atómico mayor de 12, en concentración suficiente para producir rayos X en cantidad tal que se pueda analizar
El microscopio es un instrumento óptico que se emplea para obtener imágenes amplificadas de pequeñas estructuras que no son posibles verlos a simple vista.
Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a.- Para limpiar la parte óptica, se elimina primero las partículas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire, un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y aún el cemento de las molduras y los objetivos compuestos, por lo no se deben usar.
c.- Las guías mecánicas deben mantenerse lubricadas.
Se enlistan algunos compuestos recomendados sólo para ciertas partes del microscopio.
a.- Espuma de jabón suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
b.- Agua destilada con algún detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la óptica.
c.- Solución para limpiar la óptica.- etanol al 40 %, éter al 20 %, para limpiar superficies de la óptica o remover residuos de aceite de inmersión.
TÉCNICA DE ILUMINACIÓN SEGÚN KÖHLER
A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lámparas de filamento espirilado, Köhler propone un método que actualmente es utilizado. Su iluminación comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de campo, situado generalmente a nivel de la lámpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado generalmente debajo del condensador.
Pasos a seguir para la iluminación de Köhler.
1.- Luz amarilla (bajo voltaje)
2.- Ajustar la distancia interpupilar
3.- Ajustar las dioptrías
4.- Abrir el diafragma de campo e iris
Tabla No. 4 Pasos a seguir para la iluminación de Köhler en un microscopio
5- Subir completamente el condensador
con la lente frontal introducida
7.- Observar y cerrar el diafragma
dispuesto en el pie del microscopio
9.- Centrar el diafragma de campo luminoso en
el campo visual, recurriendo a los dos tornillos
6.- Enfocar la preparación con el objetivo 4X o
8.- Bajar algo el condensador, hasta obtener máxima nitidez de la imagen del diafragma
10.- Abrir el diafragma de campo luminoso casi hasta el borde del campo visual, centrando con exactitud y abrirlo hasta que desaparezcas detrás del borde del campo visual.
11.- Regular el contraste de la imagen
12.- Insertar el filtro azul, regular la intensidad de la luz con el control del voltaje.
con ayuda del diafragma del condensador.
13.- A cada cambio de objetivo: enfocar con el micrométrico y contrastar con el diafragma del condensador.
14.- Al utilizar objetivos panorámicos de bajo aumento rebatir la lente frontal del condensador sin alterar su altura.
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA SER UTILIZADO EN MICROBIOLOGÍA
La esterilización se conoce como un proceso de destruir a todos los microorganismo de una superficie, existen varios métodos físicos y químicos de esterilización, para seleccionar el más adecuado es necesario conocer la naturaleza del material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilización.
La aplicación de calor es el método más simple para esterilizar un material, a condición de que no sufra daño en sí mismo. Una temperatura de 100 °C matará a todas las formas vegetativas, pero no las esporas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 °C, 15 minutos y 15 libras de presión. Generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren más rápidamente cuando se encuentran húmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del recipiente.
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos eléctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 –170 °C durante una h.
Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor actúa desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de la célula y fragmentando las membranas celulares.
Flameo:
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el más simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar el asa bacteriológica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que dicha asa lleve grandes cantidades de material biológico, pues éste podría “saltar” diseminándose partículas infectantes.
A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bisturí o pinzas, se puede esterilizar el material mojándolo con alcohol y encendiéndolo éste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilización completa. El método es rápido pero produce carbonización y pérdida del filo.
Fig. 33 Autoclave para esterilizar por calor húmedo, horno para esterilizar por calor seco y flama del mechero para incineración.
Fig. 34 Olla de presión con manómetro para verificar la presión de esterilización
Radiaciones ionizante y no ionizante:
La radiación ultravioleta provoca daño en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucleótidos, formando dímeros pirimidínicos, las radiaciones ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse también ondas supersónicas o ultrasónicas para romper o desintegrar a la célula.
Filtración a través de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor húmedo o seco pues son termolábiles, es decir que se desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtración de membranas para retener a los microorganismos. Aquí debemos de conocer las dimensiones del microorganismo a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (diámetro)
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o esteres de celulosa, para el caso de los filtros de la marca Millipore se utiliza como bioindicador a Pseudomonas diminuta para filtros con un diámetro de poro de 0,45 µm
Fig 35 Filtro (Millex) y Swinnex para filtración a través de membrana.
Fig. 36 Diferentes tipos de filtro
Gases (oxido de etileno) y líquidos (formaldehído y β propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógeno lábiles como los que tiene grupos carboxilos, amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilización gaseosa, generalmente en la industria farmacéutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plástico, equipos electrónicos, bombas cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y además cancerigeno, por lo que se suministra normalmente con una concentración entre el 10 y el 20 % de CO 2 . La concentración de óxido de etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilización. Un objeto limpio puede esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 °C o de 3 a 4 h a 54°C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el 40 y el 50 % y la concentración de oxido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario airear para eliminar el oxido de etileno residual porque es muy tóxico.
La β-propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva después de varias h y, por ello, no es tan difícil de eliminar. Destruye a los microorganismos más rápidamente que el oxido de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancerígena.
Métodos bacteriológicos para verificar las técnicas de esterilización.
En todo lugar en donde se realice esterilización se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten que la esterilización se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estéril, para ello existen en el mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio de color o turbidez de la ampolleta.
Método de la tira de papel
Existen en el mercado tiras impregnadas con esporas de Bacillus stearothermophylus se presentan en una envoltura con dos compartimientos. En el primero está la tira testigo, que se ha esterilizado (testigo negativo) y en el otro compartimiento se encuentran dos tiras, una de las tiras se saca (problema y testigo positivo) y se coloca en un recipiente que se va a esterilizar en la forma habitual. Luego las tiras se vuelven a su compartimiento correspondiente y se incuban por 7 días a 55 °C en caldo de soya y tripticaseína. Las esporas sobre las tiras testigos se desarrollan, pero si la esterilización no fue la correcta habrá desarrollo en la tira testigo.
Fig. 37 Muestra de una tira de esporas utilizada para diferentes tipo de esterilización
Método de la ampolleta:
Son ampolletas que contiene una suspensión de Bacillus stearothermophylus en medio de cultivo. La temperatura óptima para el desarrollo de este microorganismo se encuentra entre 50 y 65°C; dentro del medio líquido se encuentra un indicador que es el púrpura de bromocresol. Al utilizarla se debe colocar la ampolleta en el interior del compartimiento que va a esterilizar el material, después de terminar la esterilización, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre 55 y 65 °C durante 24 h, el enturbamiento y la aparición de un color amarillo indica una esterilización defectuosa, en cambio si el color permanece igual durante varios días de incubación el equipo esta funcionando bien. Debe llevarse el control constituido por una ampolleta que no se pone en el equipo, incubada en las mismas condiciones, debe mostrar desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.
Fig. 38 Diferentes formas de comprobar la esterilización
-Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
-El material (pipetas o cajas de Petri) utilizado con suspensiones microbianas o con medio de cultivo, nunca se esterilizan por calor seco
-Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, éste debe ser esterilizado en autoclave a 121 o C, 1,05 atm de presión durante 15 minutos
- Recolectar los desechos del material esterilizado en bolsas de plástico de alto punto de fusión para su posterior desecho
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN
Lavado de material de vidrio e instrumental
a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material plano y el instrumental metálico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando dextran.
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodón siguiendo las indicaciones del profesor
b) Colocar los tubos en un bote de lámina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha,
equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.
Fig. 39 Formas de preparación de tubos de ensaye para esterilización por calor seco y húmedo
a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, número de equipo de laboratorio y grupo.
Fig. 40 Pasos a realizar para preparar cajas de Petri para ser esterilizado por calor húmedo
a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado, utilizar para ello una aguja de disección o un clip
b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodón
c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con masking-
tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el número de equipo de laboratorio. Con
una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
Fig. 41 Pasos a realizar para la preparación de pipetas para ser esterilizadas por calor humedo.
a) Colocar en la boca de cada matraz un tapón compacto de algodón, envuelto con gasa, siguiendo las
b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente más grande que el tapón de algodón.
c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los
datos sobre el gorro de papel.
Fig. 42 Colocación del tapón de algodón al matraz y gorro de papel Kraf para matraz para ser esterilizado por calor húmedo
a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lápiz señalar con una flecha la punta.
b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.
Fig. 43 Preparación de pinzas o tijeras para ser esterilizado por calor húmedo
PREPARACIÓN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO
a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metálica.
b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posición invertida
perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MÉTODO MATERIAL CONTAMINADO)
b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el número de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha.
Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.
Fig. 44 Cilindro de acero inoxidable para esterilizar cajas de Petri
a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapón de algodón cuidando que no quede muy compactado.
b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodón, antes colocar en el interior
un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas.
c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre la
tapa del cilindro pipetero.
Fig. 45 Cilindro de acero inoxidable para esterilizar pipetas
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetándolo con
masking-tape o etiquetar
con un marcador indeleble.
Fig. 46 Formas de esterilizar matraces vacíos
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura
Fig. 47 Envoltura en papel aluminio de objetos metálicos sin filo
En la actualidad se utilizan pipetas automáticas para pipetear las suspensiones microbianas, soluciones y reactivos, por lo que se tienen que esterilizar solo las puntas.
Fig. 48 Utilización de pipetas automáticas.
La utilización de la norma en nuestro laboratorio es la de proporcionar las guías generales para la preparación de diluciones para el examen microbiológico de alimentos. En vista de la gran cantidad de productos en este campo de aplicación, estas guías pueden ser inapropiadas para todos ellos en forma detallada y para otros requerirse otros métodos diferentes. Sin embargo en todos los casos donde sea posible se recomienda apegarse a estas guías y modificarse únicamente cuando sea necesario.
La preparación de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el número de microorganismos por unidad de volumen, para permitir, después de la incubación, la observación de la prueba en el caso de tubos y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Para nuestro trabajo tenemos que:
1.- Dilución primaria, es la suspensión o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad del producto bajo examen y mezclarda con una cantidad de nueve veces en proporción de diluyente.
2.- Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la dilución primaria con un volumen de nueve veces
un diluyente y que por repetición de esta operación con cada dilución así preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculación de medios de cultivo.
1 Preparación de la dilución primaria.
1.1 A partir de muestras líquidas:
1.1.1 Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un
tiempo de 7 segundos. Tomar 1 ml de la muestra y diluir con 9 ml del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
1.1.2 Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alícuotas mayores, por ejemplo volúmenes de 10 u 11
ml, diluidos con 90 o 99 ml, de la misma forma que se describió anteriormente
1.2 A partir de muestras sólidas o semisólidas.
1.2.1 Pesar una cantidad de 10 u 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plástica estériles de
1.2.2 Adicionar un volumen de 90 a 99 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.
1.2.3 Operar la licuadora de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensión completa y homogénea para cada alimento. Aún en los equipos más lentos, este tiempo no debe exceder de 2 a 5 minutos, tambien podemos utilizar un Stomacher.
Figura 49 Stomacher para disgregar una muestra sólida
1.2.4 Permitir que las partículas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas
superiores de la suspensión.
Cuando la dilución primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar más diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para las operaciones subsecuentes o en la expresión de resultados.
2.2 Preparación de las diluciones decimales adicionales.
2.2.1 Transferir 1 ml o un múltiplo, por ejemplo, 10 u 11 ml de la dilución primaria 1 + 9 (10 -1 ), en otro recipiente
conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la
pipeta y el diluyente.
2.2.2 Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se menciono anteriormente.
2.2.3 La selección de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del
número esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de análisis previos y de la información que se obtenga del personal de inspección que la haya colectado. En ausencia total de información, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
2.2.4 Utilizar una pipetas para cada dilución inoculando simultáneamente las cajas que se hayan seleccionado. El
volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.
2.2.5 Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de líquido equivalente a su capacidad total, escurrir
aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una área de la caja Petri sin líquido.
2.2.6 Mientras se afora el líquido de la pipeta, la punta de ésta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y
mantenerla en posición vertical, para lo cual este último debe inclinarse lo necesario.
Para la técnica del número más probable utilizar tres tubos, donde sea posible demostrar el microorganismo en 10
ml de la dilución más alta.
2.3 Duración del procedimiento.
Fig. 50 Esquemas que muestras las diferentes formas de realizar las dilcuiones
La finalidad en la realización de diluciones es encontrar conteos en la placa para bacterias de 25 a 250 UFC/ml y para mohos y levaduras de 10 a 150 UFC/ml
Fig. 51 Placas que muestran la conveniencia de realizar diluciones
Fig. 52 Placa que muestra el intervalo de lectura para mohos que es de 10 a 150 UFC y para bacterias de 25 a 250 UFC
El aislamiento de un microorganismo para obtener un cultivo puro se realiza principalmente en un medio sólido. Se inicia por la separación de una sola célula a partir de una población y requiere también que la colonia que surja de esta célula se mantenga separada de otras células o colonias.
El aislamiento de un cultivo puro puede hacerse también en medios líquidos, siempre que el organismo predomine en el material de partida. Por una dilución en serie de la suspensión en un medio se consigue que en la última dilución se encuentren unas cuantas que al ser sembradas quedarán separadas.
En la naturaleza generalmente existen poblaciones mixtas de microorganismos, y entre ellas se establecen interrelaciones, estas se basan en la competencia por el sustrato común, la técnica utilizada y el tipo de medio seleccionado dependen de la naturaleza de la investigación, en general podemos tener: a) se puede necesitar tener una cosecha de células; b) puede ser necesario determinar el número y tipos de microorganismos presentes en una muestra o c) se puede aislar un tipo particular de microorganismos de una fuente natural.
La siembra en placas, con una serie de condiciones, de una muestra del material, permitirá producir colonias a un grupo seleccionado de formas, pero hará que muchos otros tipos pasen inadvertidos. Por esta razón es costumbre sembrar en placas muestras del material usando tantos medios y condiciones de incubación diferentes como sea posible.
El sembrado en placa en un medio sólido nos proporciona células inmóviles o dentro del medio, las cuales estarán separadas y de ahí los podremos tener en un tubo con agar inclinado para su conservación.
Se entiende por cultivo puro a la descendencia (clon) de una sola célula, generalmente lo realizamos para poder estudiar las siguientes propiedades.
a.- Aislamiento por estría simple para muestras con poca cantidad de microorganismos
Fig. 53 Placas con agar nutritivo y agar eosina azul de metileno (urocultivo)
b.- Aislamiento por estría cruzada
Inocular con el asa la placa y realizar las estrías tal y como se muestra en el siguiente esquema
Fig. 54 Siembra por estría cruzada en un medio selectivo y en un medio no selectivo. En ocasiones existen microorganismos que por poseer muchos flagelos invaden la capa y nos losp odemos asilaren ese medio, tal es el caso de Proteus en el medio agar sangre.
Fig.55 Placas de agar sangre sembrada por estría cruzada, en la segunda placa se puede observar el crecimiento invasivo de un microorganismo móvil.
c.- Aislamiento por extensión con varilla
Para el asilamiento de bacterias, mohos y levaduras podemos realizar la técnica de extensión con varilla, donde el inóculo sobre la placa con el medio es de 0,1 ml.
La técnica consiste en colocar el inóculo sobre el medio de cultivo, posteriormente se toma una varilla de vidrio o de acero inoxidable del que tenga la longitud del diámetro de la placa de Petri
Esta varilla se introduce en un frasco con alcohol y se flamea a la flama del mechero por lo menos tres veces para esterilizarla, se deja enfriar y se esparce el inoculo sobre la superficie del agar
Se deja en posición vertical derecha por 5 minutos, y se incuba
Fig. 56 Extensión con varilla
d.- Aislamiento por la técnica de vaciado en placa
Colocar 1 mL de la dilución que le indiquen en una caja de Petri y realizar el procedimiento por duplicado.
Agregar de 15 a 20 ml de agar cuenta estándar, mantenido a 45°C.
Homogenizar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6
en el sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporación del inoculo en el medio, cuidar que el medio no moje la cubierta de la caja.
4.- El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente
se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
Dejar solidificar el medio e incubar a 35 °C por 24 horas o si es necesario hasta las 48 horas, para el caso
de bacterias y para el caso de los mohos y levaduras de 3 a 5 días.
6.- Para el caso del Agar de papa y dextrosa se debe de acidificar el medio mediante la adición de 1,4 ml de
ácido tartárico al 210 % esterilizado por filtración a cada 100 ml de medio para que el pH sea de 3,5, este
procedimeitno se debe realizar cuando el medio este a 45°C y ahora si se puede utilizar.
Fig. 57 Vaciado en placa
Los movimientos rotatorios tienen por objetivo la distribución homogénea del inoculo, claro esta que con la ayuda de las diluciones de tal forma que el recuento para bacterias sea de 25 a 250 Unidades Formadoras de colonias (UFC)y para mohos y levaduras de 15 a 150 UFC
En algunos casos el aislamiento lo podemos hacer directamente en un medio selectivo, pues lo que deseamos es ver la producción de un metabolito, por ejemplo para el aislamiento de microorganismos productores de amilasas se utiliza el medio denominado agar almidón.
Fig. 58 Aislamiento de cepas silvestres mediante medios selectivos, por medio de halos de inhibición, producción de amilasas o producción de hidrólisis
El aislamiento nos sirve para obtener la morfología colonial, microscópica y observar alguna característica como hidrólisis o hemólisis.
A. MORFOLOGÍA COLONIAL
Morfología colonial en placa para bacterias
Una vez sembrada la placa la descripción de cada una de las colonias debe incluir:
1. TAMAÑO: Diámetro en mm, los límites de tamaño de las colonias varían desde fracciones de milímetros hasta 10 mm de diámetro. La mayoría de los microorganismos forman colonias de tamaño limitado al tiempo de incubación.
FORMA: Es la apreciación general de su figura la cual puede ser:
3.- ELEVACIÓN: Que puede ser:
Fig. 59 esquemas de diferentes formas y elevaciones en una colonia
4. BORDE O MARGEN: Se refiere al contorno de las colonias y puede ser: Entero, ondulado, Lobulado, crenado,
filamentoso o rizado.
Fig. 60 Esquema de algunos bordes que puede presentar una colonia.
5. COLOR: Blanco, amarillo, negro, marrón, anaranjado, etc.
Fig. 61 Colonias de diferentes colores
6. SUPERFICIE: Lisa o rugosa
7. ASPECTO: Húmedo, seco, algodonoso, pulverulento, aterciopelado, velloso, granuloso
8. CONSISTENCIA: Suave (butirosa), viscosa, membranosa o dura, esta prueba se tiene que realizar con la ayuda
de una asa.
9. LUZ REFLEJADA: Las colonias pueden ser brillantes o mate
10. LUZ TRANSMITIDA: Las colonias pueden ser translúcidas o transparentes
Fig. 62 Colonias con morfologias coloniales diferentes, durante el aislamiento
Tanto en los cultivos estáticos como continuos pueden establecerse condiciones definidas, y pueden determinarse sucesiones de distintos organismos y acumulaciones de productos metabólicos. A partir de aquí pueden extraerse los productos producidos por los microorganismos. Los cultivos mixtos pueden obtenerse también por la unión de cultivos puros, tal es el caso de las cepas que producen el Yogurt.
En ocasiones es muy difícil cultivar a los microorganismos sobre todo los parásitos y creciendo en un medio artificial, sin embargo se han ideado medios adecuados reproduciendo cuidadosamente las condiciones en el que el microorganismo se encuentra en su medio natural, estos parámetros son el pH, tensión de oxígeno, temperatura, los nutrientes, etc.
Para los requerimientos de sales minerales y factores de crecimiento al medio se le adiciona extractos de algún tejido, yema de huevo, sangre, plasma, etc.
Una vez recibida la muestra es necesario seleccionar el medio de cultivo primario adecuado para el tipo de muestra, determinarle la temperatura de incubación, condiciones de anaerobiosis o aerobiosis para su desarrollo. Actualmente se recomienda usar sólo medios enriquecidos y la realización de una coloración de Gram del aislamiento para la selección de otros medios para la identificación del microorganismo. La mayoría de los microorganismos crecen a 35 °C ± 2 °C, el crecimiento de la mayoría de los microorganismos se ve potenciado por una atmósfera de 5 – 10 % de CO 2 , pero si sólo se tiene una incubadora de aire ambiental se puede mantener los cultivos es jarra de anaerobiosis.
Cultivo en placa Petri
Se conoce como cultivo en medio sólido a la que se hace en una caja Petri o tubo de ensaye con medio sólido inclinado. Cuando es en placa puede ser por estría cruzada, por estría simple o estría masiva esto depende del objetivo del cultivo.
Cuando es por estría masiva se puede sembrar por medio de un hisopo, donde el inóculo se esparce minuciosamente en ángulos rectos respecto de la estría primaria, luego la placa se gira 90°, y el inóculo se esparce para cubrir toda la superficie. En ocasiones cuando se tienen muestras con poca carga microbiana y utilizando un medio selectivo se puede sembrar por estría simple, es más el método se puede volver cuantitativo si se utiliza una asa calibrada de 0,01 ml de volumen y la forma de sembrar es la siguiente.
Fig. 63 Esquema de la estría simple
Fig. 64 Placa A estría simple, Placa B y C estría masiva y Placa D estría cruzada.
Siembra en tubos de cultivo con medio sólido
Las siembras en tubos con medio sólido, por lo general se emplean para la conservación de un cultivo puro proveniente de una placa o para la siembra de pruebas bioquímicas como el medio OF, SIM y MIO. El pico de flauta del medio agarizado se inocula primero por punción (cuando es necesario), seguido por una estría en el pico de flauta desde el fondo a la parte superior con un movimiento en “S” a medida que se retira el asa.
Fig. 65 Cultivo en medio sólido vertical, esquema del cultivo por picadura y en estría simple en agar sólido inclinado
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
Por estrías
Se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia con el asa estéril y sobre la superficie del medio se desliza ésta en forma de estrías.
Se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado en forma inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picándolo longitudinalmente.
Cultivo por punto
Esta técnica de cultivo, generalmente se utiliza cuando necesitamos una gran cantidad del moho.
Fig. 66 Cultivo en medio sólido (placa) y en medio sólido (tubo).
CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO
Siembra en medios de cultivo líquidos.
La siembra en tubos de cultivo en medio líquido, el tubo debe inclinarse en un ángulo de 30 ° y el asa de inoculación debe tocar la superficie interna del vidrio, justo encima del punto donde la superficie del agar forma
un ángulo agudo. Cuando el tubo es vuelto a su posición vertical, el área de inoculación queda sumergida debajo de la superficie, se puede agitar suavemente el asa en el interior del medio líquido.
Fig. 67 Esquema del sembrado de un cultivo líquido.
El crecimiento de los mohos es diferente si este es agitado o no, debido a que la mayoría de los mohos son aerobios cuando no son agitados tienden a crecen como una nata sobre la superficie del medio, por lo tanto cuando necesitamos algún metabolito, es necesario la agitación y esta debe ser regulada para evitar la poca producción de pellets, pues eso disminuye la superficie de contacto. El medio de cultivo de mohos cuando esta bien sembrado se ve translucido, sin embargo cuando un medio de este tipo esta contaminado con bacterias se pone turbio.
Fig. 68 Cultivo en medio liquido en matraz para mohos en agitación y sin agitación
Fig. 69 Cultivo de mohos en agitación a diferentes revoluciones por minuto
Fig. 70 Pellet de un moho en donde el medio esta contaminado
Medio de cultivo con un moho en agitación el cual esta contaminado, en la fotografía se nota un pequeño crecimiento de un moho, además de que el medio esta turbio. Para la obtención de metabolitos o para la realización de una cinética es necesario utilizar una agitadora como se muestra en la figura siguiente.
Fig. 71 Agitadora
En la naturaleza existen microorganismos que llevan a cabo la respiración anaerobia en la cual no interviene el oxígeno, sino que se emplean otros aceptores finales de electrones, muy variados, generalmente minerales y, a
menudo, subproductos del metabolismo de otros organismos. Un ejemplo de aceptor es el SO 4 que en el proceso queda reducido a SH 2 :
Para cultivar a los microorganismos anaeróbicos se utilizan varios métodos debido a que hay microorganismos anaerobios estrictos y otros micoraerofilicos y los métodos ampliamente utilizado son el cultivo en estufa con atmósfera de CO 2 controlado o la jarra de anaerobiosis, en donde se introducen los tubos o placas y
(anión sulfato),
posteriormente se coloca un sobre al que previamente se le ha cortado una esquina y se le ha adicionado 10 ml de agua destilada con una pipeta y se cierra inmediatamente. -El sobre contiene una pastilla de borohidruro de sodio y otra de carbonato de sodio para generar H 2 y CO 2 - La jarra se puede meter a la incubadora sin riego de sufrir daño alguno, pues esta hecha de policarbonato -Se puede colocar un indicador para verificar si existen condiciones de anaerobiosis -El indicador utilizado para que se efectué la reacción es el paladio El bioindicador para verificar la las condiciones de anaerobiosis es:
Testigo de crecimiento aeróbico es: Micrococcus luteus ATCC 9341 Testigo de crecimiento anaeróbico es: Clostridium novii ATCC 9690
Fig. 71 Jarra de anaerobiosis y sobre Gas Pak
CULTIVO DE BACTERIAS EN MEDIO SEMISÓLIDO
Fig. 68 Cultivo en medio semisólido en SIM y OF
Interpretación de los cultivos:
La interpretación de los cultivos primarios luego de la incubación requiere de habilidad y experiencia, esta valoración es realizada anotando las características y el número relativo de cada tipo de colonia recuperada en el medio de cultivo, por la determinación de la pureza, la coloración de Gram, la morfología de la colonia y la observación de los cambios en el medio que rodea la colonia, el cual refleja la actividad metabólica del organismo. La inspección se lleva a cabo sosteniendo la placa en una mano y observando la superficie del agar para detectar el crecimiento, durante el examen las placas deben ser viradas en distintas direcciones bajo una iluminación brillante y directa, de modo que la luz se refleje en distintos ángulos, se puede utilizar un contador de colonias para tener mejor iluminación.
Los olores producidos por la acción de ciertas bacterias sen el medio pueden ser útiles para la identificación tentativa de los microorganismos por ejemplo. Pseudomonas: zumo de uva, Algunas especies de Proteus. Chocolate quemado, especies de Corynebacterium, aroma frutal, Nocardia y Streptomyces: sótano mohoso, y especies de Clostridium. Fecal, pútrido.
Algunas de las características a observar son las siguientes:
Mediante la evaluación de las características de las colonias descritas y la acción en el medio, se puede hacer una identificación preliminar de las diferentes bacterias aisladas en un cultivo primario. Estas características son útiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificación de los microorganismos.
-Para cultivar a los microorganismos anaeróbicos se utiliza una jarra de anaerobiosis, en donde se introducen los tubos o placas y posteriormente se coloca un sobre al que previamente se le ha cortado una esquina y se le ha adicionado 10 ml de agua destilada con una pipeta y se cierra inmediatamente.
-El sobre contiene una pastilla de borohidruro de sodio y otra de carbonato de sodio para generar H 2 y CO 2
- La jarra se puede meter a la incubadora sin riego de sufrir daño alguno, pues esta hecha de policarbonato
-Se puede colocar un indicador para verificar si existen condiciones de anaerobiosis
-El indicador utilizado para que se efectué la reacción es el paladio
El bioindicador para verificar la las condiciones de anaerobiosis es:
Testigo de crecimiento aeróbico es: Micrococcus luteus ATCC 9341
Testigo de crecimiento anaeróbico es: Clostridium novii ATCC 9690
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