Source: http://www.pardell.es/microscopia-electronica-de--stem-.html
Timestamp: 2018-07-23 10:03:01+00:00

Document:
Microscopía Electrónica de (STEM) - Apuntes de Electromedicina Xavier Pardell
Dado que el electrón es una partícula con una masa muy pequeña y cargada negativamente, es muy susceptible a ser desviada al pasar cerca de otros electrones o de núcleos cargados positivamente. Como ya se ha visto, esta dispersión de los electrones al pasar a través de una muestra es la que permite obtener imágenes de TEM.
Figura 1. Diferentes tipos de haces resultantes de la interacción de los electrones del haz incidente con una muestra fina.
La dispersión de los electrones puede producirse de dos formas:
Elástica: los electrones no pierden energía en la interacción. Esta interacción se suele producir para ángulos de entre 1º y 10º y para bajas energías. El conjunto de electrones resultantes suelen ser coherentes (respecto a su carácter ondulatorio, la coherencia indica la alineación de las longitudes de onda de un conjunto de ondas). La dispersión elástica pierde coherencia a medida que el ángulo sobrepasa los 10º. Los electrones dispersados elásticamente suponen la mayor fuente de contraste en el TEM, y también crean la mayor parte de la intensidad de los patrones de difracción (DPs).
Inelástica: los electrones pierden energía en la interacción. Se sueleproducir para ángulos pequeños, menores a 1º, y para electrones de alta energía. El paquete de electrones resultante suele ser incoherente. Este tipo de interacción es interesante en cuanto a la información que nos aporta sobre la composición química de la muestra, que no se puede obtener a partir de los electrones dispersados elásticamente.
Para referirnos a la probabilidad de que un electrón padezca una dispersión elástica o inelástica utilizamos el concepto de cross section o sección eficaz. Esto es un área imaginaria cuya fracción respecto al área total es igual a la probabilidad de que el fenómeno ocurra. Así, si la probabilidad de que un electrón interaccione inelásticamente con la muestra es de 0,1, la fracción de sección eficaz respecto al área será la misma, aunque ésta no representa ninguna área real. Por lo tanto, cada posible interacción tiene una cross section o sección eficaz (), que depende de la energía de la partícula (en nuestro caso, la energía del haz de electrones) y, como mayor sea, mayor será la probabilidad de que ocurra esta interacción.
Para un espécimen observado bajo el TEM, el número de eventos donde el electrón sufre desviaciones por unidad de área a lo largo de su trayectoria a través de la muestra es:
donde σ es la sección eficaz para la interacción del electrón con un átomo, es el número Nₒ de Avogadro, la masa atómica de la muestra, la densidad y el grosor. No obstante, debido a la cantidad de variables que afectan tanto la sección eficaz para un átomo como la total, se suele mostrar una estimación: para las energías del TEM (100-400 KeV), la elástica es casi siempre el componente dominante de la dispersión (del orden de ).
En vez de utilizar el área para describir la interacción también podemos utilizar una medida de longitud, ya que la distancia que recorre el electrón entre interacciones será importante para muestras finas (que son las utilizadas para microscopía electrónica). Este nuevo parámetro, llamado trayectoria libre media (mean free path) es la distancia media que el electrón recorre entre dos sucesos de dispersión. Esta distancia será importante en el sentido de que, conociendo este concepto, podremos saber cuán fino debe ser el espécimen para que la dispersión múltiple no sea significativa. De esta forma, se hace más sencillo interpretar los datos espectroscópicos e imágenes en términos de desviaciones únicas.
La relación entre y (trayectoria libre media) es:
Para TEM, los valores típicos de λ para dispersión son del orden de decenas de nm:esto implica que para obtener interacciones únicas de dispersión, necesitaríamos muestras de grosor del orden de decenas de nanómetros.
A pesar de toda la información anterior, los valores que podemos conocer de σ y λ siguen siendo imprecisos, especialmente para energías de 100-400 KeV utilizadas en TEM. Por lo tanto, lo que se hace es una simulación Monte Carlo para predecir la trayectoria del electrón a través de una capa fina: este método consiste básicamente en la utilización de números aleatorios en los programas computacionales, de manera que el resultado siempre estará regido por la estadística.
Figura 2. Simulación de Monte Carlo para la dispersión de electrones (haz de 1000 electrones de energía 100 KeV) a través de una capa fina de Cu (A) y Au (B). Se puede observar un aumento en el ángulo de dispersión para la muestra de mayor número atómico (oro).
Como ya hemos comentado, por la dualidad onda-partícula, los electrones en movimiento a altas velocidades también tienen propiedades ondulatorias. Por lo tanto, no sólo son susceptibles a interaccionar con la muestra como partículas, sino también como ondas. De esta forma, cuando los electrones atraviesan la muestra, también se produce el fenómeno de difracción, que ocurre cuando una onda interacciona con un objeto que se encuentra en el límite de su trayectoria.
Este fenómeno permite obtener patrones de difracción (DP, Diffraction Patterns), que también aportan información sobre la muestra. De forma simplificada, podemos decir que los patrones de difracción se obtienen por interferencias constructivas entre ondas (electrones) que se encuentran en el plano de difracción: la amplitud de las ondas se suma cuando su fase difiere en un múltiplo de 2, lo que requiere que la diferencia de caminos ópticos entre estas ondas sea un múltiplo de la longitud de onda, según la ley de Bragg (vista en apartados anteriores). Esta ley se formuló para rayos X, pero dado que no depende del mecanismo de difracción, sino de la geometría,es también aplicable a los electrones.
La difracción de rayos X se ha usado históricamente en la mayoría de estudios para obtener información sobre materiales. Hay ciertas analogías entre la difracción de rayos X y de electrones, pero en realidad los mecanismos implicados son distintos (más complejos en la difracción de electrones).
La difracción de rayos X se produce porque estos son desviados por los electrones presentes en el material, ya que la carga negativa de los electrones interacciona con el campo electromagnético de los rayos X. Los electrones responden al campo aplicado del flujo de rayos X oscilando con el período de este haz, y las partículas cargadas aceleradas resultantes emiten su propio campo electromagnético, de idéntica longitud de onda y fase que el de los rayos X incidentes. El campo resultante, que se propaga radialmente desde cada fuente de dispersión, se denomina la onda difractada.
Por su parte, los electrones se difractan tanto por los electrones como por los núcleos presentes en la muestra a estudiar, al interactuar las cargas negativas con los campos electromagnéticos locales del espécimen. De esta forma, los electrones del haz son dispersados de una forma directa por la muestra (no se trata de un intercambio de campo a campo como en el caso de los rayos X). Así, los electrones son más fuertemente dispersados que los rayos X.
Figura 3. El haz incidente de electrones en la muestra se convierte en un conjunto de de haces desviados por diferentes fenómenos.
Los patrones de difracción (DP) de electrones se corresponden estrechamente con la difracción de Fraunhofer observada en la luz visible (esta difracción se produce cuando un frente de onda plano interacciona con un objecto; dado que una onda emitida por una fuente puntual se vuelve plana a largas distancias, se conoce como difracción de campo lejano). Aunque, en realidad, lo que observamos en el patrón se corresponde con el efecto de la difracción de Fresnel para la luz visible (conocida como difracción de campo cercano).
El TEM tiene las características necesarias para poder obtener imágenes de la distribución de los electrones dispersados: patrones de difracción. Imaginemos que colocamos una placa fotográfica justo debajo de la muestra fina y que los electrones desviados de la figura 4 inciden directamente en la película imprimiendo el punto de su trayectoria. En estas circunstancias, contra mayor es el ángulo de desviación, más lejos del centro impactará el electrón: por tanto, las distancias en el film corresponden a los ángulos de dispersión de los electrones.
Figura 4. Ejemplos de patrones de difracción de electrones en un TEM convencional de 100 KeV. (A) Carbón amorfo (B) cristal simple de aluminio.
Qué factores afectan a la dispersión de los electrones en el TEM?
La σ total de dispersión disminuye contra mayor es la energía: por lo tanto, la dispersión de un haz de electrones a 300 KeV será menor que a 100 KeV. La densidad de la muestra también afecta a la dispersión: las regiones de alta densidad producen más eventos de dispersión que las de baja densidad y, contra mayor sea el número atómico Z de la muestra, más dominará la dispersión elástica.
Además, en general habrá menos dispersión a ángulos mayores (cuando seleccionamos electrones que se han desviado un cierto ángulo θde su trayectoria, estamos cambiando su sección eficaz efectiva, que disminuye contra mayor es el ángulo). Por esto, la dispersión que más nos interesará en el TEM convencional es la que se produce hacia delante (atravesando la muestra), ya que la mayoría de los electrones desviados se encuentran dentro de del haz directo (obtendremos más información).
La AEM (Analytical Electron Microscopy) conforma las técnicas de recopilación de datos espectroscópicos en el microscopio electrónico de transmisión. Estas señales se basan en diversos fenómenos generados durante las interacciones inelásticas de los electrones con la muestra (explicadas anteriormente).
Estas señales se pueden utilizar para identificar y cuantificar la concentración de elementos presentes en un área de la muestra, mapear su distribución en la muestra con una alta resolución espacial e incluso determinar su estado químico. Aunque hay diversas señales generadas por la interacción del haz incidente de electrones, las principales técnicas de la AEM se basan en la detección de rayos X y la medida de las pérdidas de energía de los electrones. En el primer caso, hablamos de EDXS o espectroscopia de dispersión de energía de rayos X (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy) y, en el segundo, de EELS o espectroscopía por pérdida de energía de los electrones (Electron Energy Loss Spectroscopy); estas técnicas se realizan en un TEM con los detectores correspondientes. Hay otras técnicas incluidas en la AEM, como la catodoluminiscencia o la especroscopia de Auger, pero no se suelen implementar en los TEMs comerciales.
Las condiciones inherentes a la microscopía STEM, como veremos, dan lugar a la realización de diversas técnicas de microscopía analítica, como la técnica de EELS, que también describiremos en este texto.
La microscopía STEM (Microscopía electrónica de transmisión de barrido) combina los principios de TEM y SEM.
Como en SEM, la técnica de STEM desliza un haz de electrones fino y focalizado a lo largo de la muestra. La interacción entre este haz y los átomos de la muestra generan un flujo de señales que se correlacionan con la posición del haz para construir una imagen virtual donde la intensidad de señal en cualquier localización de la muestra es representada por la intensidad en la escala de gris de la correspondiente localización en la imagen. La principal ventaja respecto al SEM convencional es la mejora en la resolución espacial.
Como en TEM, la técnica de STEM requiere muestras muy finas y detecta principalmente los electrones transmitidos a través del espécimen. Su principal ventaja respecto al TEM convencional es que permite el uso de otras señales que no puede ser espacialmente correlacionados en TEM, como los electrones secundarios, electrones dispersados, rayos X característicos y pérdidas de energía de los electrones.
Detectores en el STEM
Como se ha explicado en apartados anteriores, la obtención de contraste en el TEM se puede realizar de dos modos en función de los electrones seleccionados en el sistema de creación de la imagen: mediante campo claro (BF, Bright Field), donde se recogen los electrones del haz directo, o campo oscuro (DF, Dark Field), donde se seleccionan los electrones dispersados. En el STEM, también se seleccionan estos dos tipos de electrones, pero mediante detectores en lugar de aperturas.
Para seleccionar los electrones del haz directo, se utiliza un detector situado en el eje del haz (on-axis), mientras que para recoger los electrones dispersados, se utiliza un detector anular alrededor (off-axis).
En STEM, algunas de las técnicas que se pueden realizar en función de las señales detectadas son:
-	Electrones dispersados: En STEM, los electrones del haz que han sido dispersados en un ángulo relativamente grande son detectados utilizando un detector HAADF (High Angle Annular Dark Field, campo oscuro anular de grandes ángulos). Hablaremos de esto más adelante.
-	Microanálisis de rayos X: los rayos X emitidos por la muestra a causa del bombardeo de electrones, son característicos de la composición elemental de esta. Para contar y clasificar los rayos X en función de su energía, se utiliza un espectrómetro dispersivo de energía de rayos X (EDX, Energy Dispersive X-ray spectrometer).
Figura 6. Comparación del modo de obtención de imágenes en DF o BF para TEM convencional y STEM.
-	La espectrometría dispersiva de longitud de onda de rayos X (WDX, Wavelength Dispersive X-ray spectrometry) mide y cuenta los rayos X según su longitud de onda, como el nombre indica (la longitud de onda se puede correlacionar con la energía). Un espectrómetro de longitud de onda utiliza un cristal o una rejilla de espaciado conocido para difractar los rayos X característicos.
-	EELS: analiza los electrones transmitidos para determinar la cantidad de energía que han perdido en la interacción con la muestra. Se explicará con detalle más adelante.
Como veremos, en STEM se pueden detectar y medir prácticamente todas las señales generadas por una muestra fina bajo un haz de electrones. Por tanto, se podrían reproducir todas las técnicas convencionales utilizadas en TEM y otras menos convencionales, como el contraste Z y otras técnicas especializadas. No obstante, el modo de operación de STEM está enfocado a la obtención de información donde el TEM convencional tiene limitaciones, y de la misma forma, el modo STEM no será tan óptimo en técnicas en las que el TEM constituye el modo más especializado y adaptado, como veremos.
Un STEM permite una mayor flexibilidad en la selección de los electrones a detectar que el TEM, ya que es posible modificar el ángulo del detector, de manera que se obtiene el equivalente a una apertura de objetivo variable y se tiene un mayor control de los electrones que contribuirán a formar la imagen. Siempre podremos, por tanto, ajustar el contraste en una imagen de STEM modificando los controles de procesamiento de señal en el ordenador (ganancia del detector, brillo, etc.).
Aun así, las imágenes de STEM en campo claro suelen tener una baja resolución, ya que para un espécimen de pequeño grosor, el haz directo domina la resolución (por ello se necesita un mayor haz de electrones para obtener imágenes de intensidad aceptable). En general, en una imagen de STEM obtendremos un mayor contraste pero también más ruido que en la misma imagen para TEM.
En cambio, las imágenes de STEM en campo oscuro (en el que la mayoría de electrones dispersados son recogidos por el detector, a diferencia del campo oscuro en el TEM), contienen menor ruido que en TEM. Dado que no se utilizan lenes para la creación de la imagen, éstas no sufren las aberraciones típicas del TEM(mencionadas en apartados anteriores). A pesar de esto, la resolución en el STEM siempre será menor, excepto para muestras de mayor grosor, ya que la aberración cromática en este caso no afecta a la formación de las imágenes en STEM.
En definitiva, el uso de STEM está indicado en aquellos casos en los que la visualización de contraste sea más importante que la resolución: por ejemplo, en muestras de polímeros no teñidos, que no mostrarían contraste en un TEM convencional. El modo STEM también es muy útil en caso de que la muestra a estudiar sea sensible a la irradiación de los electrones: de esta forma se puede controlar el área irradiada de la muestra, convirtiéndolo en una forma de microscopía de baja dosis. También es adecuado utilizar STEM en caso de que la muestra sea tan gruesa que la aberración cromática limite la resolución en TEM, que tenga un contraste bajo de forma inherente o que se óptima para HRTEM (High Resolution TEM) por contraste de número atómico Z. Actualmente, el modo STEM en un TEM se ha convertido en una técnica rutinaria de alta resolución.
Figura 6. Comparación de imágenes de TEM de campo oscuro (A) y claro (C) y de STEM de campo oscuro con detector anular ADF (B) y campo claro (D) para el mismo polímero de doble fase. En ambos casos, la imagen en STEM muestra un mayor contraste a pesar de la menor resolución respecto al TEM convencional.
Contraste de grosor de masa (mass-thickness contrast) y contraste Z (Z-contrast)
El grosor de materia es la principal fuente de contraste en materiales amorfos. Este contraste está causado principalmente por la dispersión de Rutherford (desviación de los electrones a causa de la proximidad de su trayectoria a los núcleos de la muestra cargados positivamente; se trata de una interacción elástica). El contraste de un punto de la muestra vendrá dado por:
, donde y son la intensidad y el incremento de ésta, respectivamente, es la diferencia de grosor y es la sección eficaz total elástica, de la que ya hemos hablado anteriormente. Por tanto, si el contraste mínimo que podemos observar es de un 5%, la diferencia de grosor observable será:
, donde es la masa atómica de la muestra, el número de Avogadro, la sección eficaz para un átomo y la densidad del material.
El efecto del grosor en el contraste se deduce también del camino libre medio . es inversamente proporcional a , como ya hemos visto, por lo que los especímenes de mayor grosor son los que más dispersión producirán, hecho que es bastante intuitivo después de los conceptos que hemos tratado.
De forma global, si no tenemos en cuenta los electrones dispersados inelásticamente (lo cual no es razonable: a pesar de que la mayor parte de electrones que generan contraste son los dispersados elásticamente, no se pueden obviar la contribución de los inelásticos, pero lo haremos para simplificar la materia), podemos obtener la expresión para la reducción del número de electrones dispersados a medida que aumenta el grosor de la muestra:
, donde N=N/A y el resto de variables corresponden a las mismas que hemos descrito ya.
Se puede aplicar un razonamiento similar al anterior para . Utilizando el factor de dispersión atómico y otros parámetros en los que no haremos hincapié en este capítulo, podemos llegar a una expresión que nos indica que la sección eficaz , donde β queda definido por el ángulo de colección de la apertura de objetivo, depende de Z y de la energía en kV de los electrones: los especímenes con un mayor muestran más dispersión, mientras que para las energías de los electrones, son las Eo bajas las que aumentan la dispersión.
El contraste Z se refiere a la técnica de obtención de imágenes por contraste de masa de alta resolución (atómico). Se trata del límite del contraste por grosor de masa donde la dispersión detectable proviene de átomos aislados o columnas de átomos.
En los años 1970 ya se demostró la potencial capacidad del STEM para observar átomos aislados pesados en sustratos de bajo . Estas imágenes se formaban con el detector ADF recolectando únicamente los electrones dispersados elásticamente a pequeños ángulos. Pero a menudo había problemas debido a la recolección de electrones dispersados inelásticamente que se sumaban al señal de de ADF. Esto se solucionó separando estos electrones de la señal de ADF con el sistema de EELS (un inconveniente era que el contraste de difracción, proveniente por ejemplo de un sustrato cristalino, se preservaba en la señal de ángulos pequeños, hecho que dificulta la interpretación de la imagen).
Por tanto, de forma general podemos decir que en primera aproximación el contraste de una imagen en STEM dependerá de las variables locales de la muestra Z y t, y de las variables ajustables en el microscopio β y Eo
Figura 7. Contraste Z proveniente de átomos de platino individuales o en grupos de una imagen en ADF. Los átomos de Pt se encentran en una capa de Al2O3. Esta capa genera las amplias regiones claras por la difracción detectada en el ADF, dificultando la visualización de la dispersión por los átomos de Pt.
Por lo explicado en el apartado anterior, el primer intento de obtener contraste Z no fue adecuado para el estudio de materiales cristalinos. Como el detector ADF convencional siempre iba a recolectar algunos electrones provenientes de la difracción de Bragg, fue necesario diseñar otro detector con una apertura central mayor: se puede disminuir la longitud de la cámara con las lentes que se encuentran después de la muestra, para asegurar que los electrones de Bragg no llegan al detector. De esta forma, sólo los electrones dispersados en ángulos muy grandes contribuirán a la
Figura 8. Esquema del funcionamiento del detector HAADF en comparación con el ADF y el BF convencionales.
Los efectos de Bragg se pueden evitar si el detector HAADF (High Angle Annular Dark Field, campo oscuro anular de grandes ángulos) únicamente detecta electrones dispersados a ángulos mayores a 50mrad (). Por ejemplo, el detector Fischione HAADF mide 28mm, y su diámetro interior, 4mm. Por esto, las imágenes de contraste de Z también se llaman comúnmente imágenes de HAADF.
Figura 9. Imagen de alta resolución de TEM por contraste de fases (A) de Ge en Si con una capa superficial de SiO2 amorfo. El Si y el Ge son indistinguibles por contraste de fases. La misma muestra por contraste Z en STEM (B) permite observar las regiones del cristal con Ge (de mayor Z) y las regiones de SiO2 (de menor Z), que aparecen muy oscuras. Las estructuras cristalinas de Ge y Si son visibles en ambos casos, aunque en el segundo caso se observa más ruido. En (C) se observa un modelo cristalino superpuesto a una imagen de Z previamente procesada y refinada para reducir el ruido. En este caso se puede observar fácilmente el nivel atómico.
Una enorme ventaja de las imágenes por HAADF es que se pueden recolectar en el mismo momento y región de la muestra que los datos generados por EELS. Como veremos más adelante, esta es la única combinación de dos técnicas que permite obtener los dos tipos de información a la vez.
Contraste de difracción en STEM
Para obtener patrones de difracción en el STEM, análogamente al TEM, se deben detectar los haces difractados, asegurando que el detector ADF sólo recoja el haz fuertemente difractado (mediante la apertura de objetivo seleccionamos sólo un haz difractado). Esto se puede conseguir, alternativamente, desplazando el patrón para que la reflexión hkl caiga justo en el detector BF. De todas formas, el contraste de difracción observado en una imagen de STEM será en general de peor calidad que la observada en el de TEM: las condiciones normales de utilización del STEM no equivalen a las de TEM, en el que éstas aseguran un gran contraste de difracción. Estas condiciones son:
- El haz incidente debe ser coherente (el ángulo de convergencia debe ser muy pequeño).
- La muestra debe ser inclinada en la orientación adecuada para obtener los dos haces diferenciados
- Sólo el haz directo o el haz fuertemente difractado deben pasar por la apertura de objetivo.
Figura 10. Comparación de los ángulos de convergencia (2α) y divergencia (2β) del haz en TEM y STEM.
Dado que para los propósitos de STEM utilizamos un haz de electrones convergente en lugar de paralelo, podemos ver que no se podrá obtener la equivalencia con el TEM (el ángulo de convergencia siempre será mayor en STEM). No obstante, existe un principio llamado el Principio de reciprocidad, que en esencia afirma que siempre que los caminos de las ondas de los electrones contengan ángulos equivalentes (de convergencia y recolección) en algún punto del sistema óptico electrónico, la imagen de contraste será idéntica. De esta forma, dado que el ángulo de la apertura de objetivo en el TEM y el ángulo de convergencia en STEM son iguales, se puede tratar de satisfacer la igualdad recíproca disminuyendo la apertura de objetivo en STEM. No obstante, esto da como resultado un incremento del ruido a medida que obtenemos imágenes de mayor contraste. Por este motivo, por lo general el contraste de difracción sólo se utiliza en STEM con propósito analítico, pero las imágenes de difracción se siguen obteniendo con TEM, donde las condiciones son más adecuadas.
Nuevas técnicas de imagen
La mayor parte de las técnicas descritas hasta ahora se podrían incluir en lo que llamaríamos las imágenes TEM “clásicas”. Esto incluiría las técnicas BF y DF, que fueron las primeras técnicas y que pronto dieron lugar a modos de operación que utilizaban diferentes haces: contraste de difracción, contraste de fases, contraste de masa, etc. Estos mecanismos con los que caracterizamos nuestras muestras se basan en la selección de diferentes haces de electrones usando una variedad de detectores para obtener distintos contrastes en las imágenes. No obstante, actualmente hay variaciones de esta forma de trabajo que permiten obtener mucha más información de una imagen de TEM. En este texto presentaremos algunas de ellas, que constituyen una importante aplicación dentro de la Microscopía Electrónica Analítica.
Cualquier imagen de TEM o STEM consiste, en realidad, en una proyección bidimensional de una muestra tridimensional, lo cual constituye una limitación fundamental. Por ejemplo, si estudiamos un defecto en un material cristalino a través de imágenes de contraste de difracción, a veces es posible diferenciar si éste se encuentra en la parte superior o inferior de la capa, si se cuenta con experiencia en la observación; no obstante, en general se pierde la dimensión de profundidad.
Para recuperar la información de la profundidad habitualmente se usa la estereomicroscopía, aunque esta únicamente permite obtener información de características que muestren contraste de fase o de difracción (dado que esta técnica requiere la inclinación de la muestra a diferentes ángulos, no se puede utilizar el contraste de fases, ya que éste se vería modificado por en cambio de ángulo y se perdería el efecto estéreo). Esta técnica es muy útil, por ejemplo, cuando se quiere discernir si los precipitados en un espécimen se han formado en la superficie o en la base de éste.
La imagen en estéreo aporta información gracias al sistema de calibración de nuestro cerebro: la interpretación simultánea de imágenes recibidas en cada uno de los ojos (los cuales observan la imagen desde ángulos ligeramente distintos, con una separación aproximada de ) permite calibrar la profundidad de los elementos de la imagen gracias al cambio de paralaxis. Este es un mecanismo cerebral intrínseco que utilizamos de forma continuada y que nos permite observar el espacio tridimensional en el que nos movemos. Es fácil comprobar que, con un solo ojo, esto no es posible: si cerramos un ojo e intentamos unir nuestros dedos índices a unos 20 cm de la cara, es muy probable que no acertemos a la primera, ya que la falta de información proveniente del otro ojo impide obtener la profundidad de la imagen.
Figura 11. Pareja de imágenes de estéreo de precipitados en espinela en un espécimen de NiO-Cr2O3. Estas imágenes combinadas, con la separación adecuada, deberían mostrar la profundidad de los precipitados. Se puede observar también el pequeño cambio de paralaxis entre las dos imágenes.
Por lo tanto, si obtenemos dos imágenes de TEM de la misma área pero inclinadas con ángulos ligeramente distintos y se muestran de forma simultánea con un visualizador de estéreo, es posible observar una imagen única donde se aprecie la profundidad de las características observables gracias a este mecanismo cerebral. De hecho, algunas personas son capaces de diferenciar incluso el efecto estéreo sin ayuda del visualizador.
Para observar el efecto estéreo, las imágenes deberían estar separadas unos 60 mm, pero a la práctica es suficiente mover las imágenes hasta que la separación relativa entre éstas sea tal que los ojos y el cerebro sean capaces de captar y cuantificar el efecto. Además, es necesario que las dos imágenes tengas exactamente el mismo campo de visión, contraste y magnificación para poder observar este efecto, ya que de otra forma el cerebro interpretará el efecto de profundidad de forma incorrecta. Para ello, el procedimiento a seguir en la obtención de un par de imágenes de estéreo sería:
Seleccionar una región de interés y obtener una imagen (normalmente se utiliza campo claro)
Inclinar el espécimen alrededor de y asegurarse de que el campo de visión no se ha modificado en este paso, y corregirlo en caso de que haya cambiado
Asegurar que la imagen sigue enfocada (utilizando el control de altura de la muestra (z, specimen-height control).
Obtener la segunda imagen.
Una vez obtenidas ambas imágenes, se pueden simplemente observar con un visualizador de estéreo. Si las imágenes están correctamente espaciadas debería observarse el efecto de profundidad. Además, el visualizador permite calcular la profundidad relativa de una característica de interés en un par de imágenes, en base a la relación:
, donde Δp es el cambio de paralaxis del detalle en cuestión entre las imágenes, la inclinación relativa entre éstas y la magnificación (si la definición del ángulo de inclinación es , el será simplemente ).
Para una determinación de la profundidad real sería necesario marcar la superficie del espécimen con alguna característica reconocible, como partículas de oro, para tener una referencia. Esto no es importante, en general, en TEM, donde la profundidad relativa es suficiente para el fin de la imagen. Si se necesitan medidas cuantitativas en estéreo, es posible realizar más cálculos complejos, o utilizar la ET, que es una técnica emergente en TEM.
En biología, la necesidad de imágenes tridimensionales reales ha sido aparente durante las últimas décadas: las estructuras biológicas como virus o macromoléculas necesitan ser determinadas en las tres dimensiones, especialmente en las regiones donde la topología es importante para las propiedades físicas y químicas del complejo. En física de materiales, se comenzó a usar el APFIM (Atom Probe Field Ion Microscope), que permitía en contaje de átomos individuales en una estructura tridimensional. No obstante, esta sensibilidad era una limitación, ya que esta técnica es incapaz de analizar una muestra de unos centenares de nanómetros de grosor. Además, es necesario que la muestra sea conductora.
Ante la creciente necesidad de examinar nuevos materiales y dispositivos de forma integral a escala nanométrica, se desarrolló la tomografía electrónica (ET, Electron tomography), que es una técnica utilizada para la determinación de la estructura tridimensional de las muestras. Literalmente, la palabra tomografía significa la visualización de cortes o rebanadas. Aunque actualmente este término es más flexible, y se puede usar cuando se engloban geometrías arbitrarias, siempre que el espécimen sea inclinado activamente en diferentes ángulos. Para realizar esta técnica se pueden obtener los datos en un microscopio de TEM. El procedimiento experimental de obtención de datos consiste básicamente en dirigir el haz de electrones a través de la muestra, inclinando el ángulo de rotación respecto a un eje de ésta de forma diferencial en cada paso. Para esto es necesario un portamuestras específico que permite el cambio de orientación (es evidente que cambiar el ángulo de incidencia del haz de electrones sería inviable). El principio implicado en la obtención de reconstrucciones tomográficas es básicamente el mismo que el de las imágenes de estéreo, pero es esencial obtener al menos un centenar de imágenes y disponer de un ordenador que permita analizar los datos y visualizar los resultados obtenidos.
Una vez hemos recogido los datos para cada ángulo, es necesario realizar un procesamiento posterior para integrar toda la información y así obtener una imagen tridimensional de la muestra. Para este paso, obviamente, necesitamos herramientas computacionales que permitirán reconstruir la información proveniente del microscopio y observar la estructura interior de la muestra.
Esta técnica tiene especial interés para el estudio de nanomateriales y semiconductores: con el rápido avance de la nanotecnología, existe la necesidad de obtener información estructural de alta resolución para los nuevos dispositivos y materiales desarrollados. Inicialmente esta técnica se vio limitada por la necesidad de utilizar ordenadores rápidos y grandes memorias, así como portamuestras que permitan una inclinación relativa de prácticamente . Actualmente, la resolución de las tomografías electrónicas es del orden de 5 a 20 nm.
Como en la mayoría de técnicas microscópicas, existen diferentes modos de trabajo en la realización de tomografías electrónicas. La mayoría son combinaciones de técnicas que ya hemos visto.
La tomografía de campo claro (Bright-field TEM tomography) tiene el inconveniente de requerir que la intensidad de la imagen proyectada varíe monótonamente con el grosor del material. Esta condición es difícil de asegurar en estos casos, ya que la intensidad de la imagen está dominada por el contraste de fases, siendo por lo tanto difícil distinguir las inclusiones de alta densidad con los espacios vacíos. Además, el contraste del BF-TEM se basa esencialmente en un filtro de paso de frecuencias espaciales altas (la información para las bajas se suprime), por lo que las zonas afiladas o de cambios bruscos aparecen exageradas. La ventaja de la tomografía de campo claro es que permite obtener medidas fiables para materiales parcialmente cristalinos con dominios pequeños de cristal único. No obstante, no es una buena opción en ciencia de materiales, ya que no constituye una reconstrucción real debido a que el contraste de las imágenes no satisface las condiciones de proyección requeridas para la tomografía.
La tomografía HAADF-STEM (HAADF-STEM tomography) es más versátil y permite obtener imágenes tridimensionales de alta resolución para materiales altamente cristalinos como los dispositivos semiconductores. Los electrones recolectados por el detector HAADF corresponden principalmente a electrones que han interaccionado cerca del núcleo atómico y que son incoherentes, por lo que no muestras cambios de contraste según el grosor y orientación de la muestra asociados a la dispersión elástica. Por tanto, al contrario que los casos anteriores, se elimina el contraste de fase y difracción (las intensidades de la imagen varían con el grosor de la muestra proyectado en materiales de bajo Z), y de esta forma se suprimen los artefactos de realce de los bordes.
Como en todas las técnicas utilizadas para obtener imágenes tridimensionales, es importante prestar atención al cambio de foco según la profundidad: la profundidad de foco se puede maximizar usando una apertura de condensador pequeña que minimice el ángulo de convergencia, pero en última instancia el límite de difracción dominará resultando en un efecto difuminado residual. Esto limitaría la resolución de la tomografía obtenida, y lo que se suele hacer es reenfocar las imágenes en cada secuencia de cambio del ángulo de inclinación para asegurar que el enfoque sea óptimo en la mayoría de imágenes.
Figura 12. Imagen de STEM HAADF típica de un catalizador heterogéneo de nanopartículas de Pd6Ru6 de 1 nm de diámetro aproximadamente dentro de un soporte mesoporoso de sílice (MCM-41), en que los mesoporos son hexagonales. Es muy importante conocer la distribución tridimensional de las nanopartículas metálicas y su localización respecto a los poros internos, ya que esto es crucial para entender los factores que gobiernan la actividad y selectividad de los nanocatalizadores.
Figura 13. Montaje donde cada imagen corresponde a una proyección de la reconstrucción tridimensional del mismo catalizador MCM-41-Pd6Ru6 de la figura 13 vistas desde los ángulos que se muestran en cada caso. Las nanopartículas han sido posteriormente coloreadas en rojo para una mejor visualización.
Por lo tanto, la tomografía HAADF-STEM permite obtener una reconstrucción fiel de la muestra, siempre que las características de esta se puedan resolver.
La tomografía EFTEM (Energý-filtered TEM) permite a su vez realizar de forma rápida mapeados cuantitativos de determinados elementos con una resolución espacial de nm. Según el interés del estudio, se seleccionan diferentes rangos de electrones: en biología, se seleccionan rutinariamente el pico de electrones con pérdida nula de energía (zero-loss peak), donde los electrones que han sufrido una interacción inelástica mayor a 5 eV son suprimidos, permitiendo un mayor contraste; también en química analítica raramente se utilizan los electrones que han sufrido interacciones cerca del núcleo atómico, debido a la alta dosis de electrones necesaria para obtener la información; en física de materiales, en cambio, los especímenes suelen ser unos órdenes de magnitud más estables bajo el haz de electrones que en los campos anteriores, por lo que se puede reconstruir un mapa tridimensional de la distribución elemental de una muestra. Hablaremos de esta técnica más adelante.
Si en un microscopio que permite hacer STEM añadimos un espectrómetro de electrones, es posible realizar la técnica de medida de EELS (Espectrometría por pérdida de energía de los electrones).
La técnica de EELS se basa en el análisis de la distribución de energía de los electrones del haz que han atravesado la muestra de interés. La interacción de estos electrones con el espécimen nos aporta información sobre la composición y estructura química y la configuración electrónica de los átomos que conforman el material. Por tanto, podemos llegar a conocer el estado de valencia y el tipo de enlaces de los átomos presentes en el material, la densidad de electrones libres o la estructura atómica circundante, entre otros. Gracias al hecho de que el haz convergente en STEM nos proporciona información de forma local, podemos obtener medidas cuantitativas de las propiedades mencionadas, en correlación con la localización espacial en la muestra.
La técnica EELS está substituyendo a la XEDS gracias a su capacidad de obtener mayor información de la muestra (permite obtener más información que la simple identificación de los elementos). A pesar de que la XEDS nos proporciona una resolución de unos cuantos átomos y una alta sensibilidad, tiene la limitación de que es incapaz de detectar elementos por debajo del Litio en la tabla periódica. La EELS, además de ofrecer una mayor resolución espacial y sensibilidad analítica (ambas del nivel de un solo átomo), permite la detección de elementos ligeros.
La dificultad de esta técnica reside en su aplicación experimental: requiere muestras especialmente finas para obtener la información adecuada, y la interpretación de los resultados precisa unos conocimientos físicos más profundos que la XEDS.
Cuando un electrón de alta energía atraviesa una muestra fina, puede pasar inalterado o bien puede perder su energía (dispersión inelástica de los electrones). La técnica de EELS separa estos electrones dispersados inelásticamente en un espectro que podemos interpretar y cuantificar, que nos permite formar imágenes o DPs de electrones de una determinada energía, e incluso combinar los espectros y las imágenes.
El espectro de pérdidas de energía puede observarse en la figura 15. Se puede ver una separación del espectro en dos zonas: la de bajas pérdidas de energía y la de altas pérdidas (el punto que determina el límite entre estas zonas es más bien arbitrario, y en este caso se ha determinado del orden de ~50 eV. Cabe destacar las siguientes características:
El pico correspondiente a pérdidas nulas de energía es muy intenso
El rango de intensidades es enorme (el gráfico en realidad utiliza una escala logarítmica para la intensidad para poder mostrar todo el espectro).
La región de bajas pérdidas de energía que contiene el pico en plasmón es relativamente intensa.
La señal global de intensidad disminuye rápidamente con el aumento de las pérdidas de energía, alcanzando niveles que pueden ser omitidos por encima de los 2 KeV aproximadamente (que define el límite energético de la técnica).
Aunque no se pueda deducir fácilmente de la figura, en realidad, la región de bajas pérdidas de energía se corresponde con la información de los electrones del átomo enlazados más débilmente, mientras que la zona de altas pérdidas aporta información de los electrones que están más fuertemente ligados y de la distribución de los enlaces atómicos.
Figura 14. Ejemplo de espectro de EELS. El pico de pérdida nula de energía es un orden de magnitud más intenso que la porción de pérdida baja de energía, que a su vez es varios órdenes de magnitud más intensa que los picos identificados con el rango de altas pérdidas de energía.
Para examinar el espectro de energía de los electrones, utilizamos un espectrómetro con un prisma magnético. Este prisma magnético es la base del filtro de energía que permite conocer los valores para los electrones que atraviesan la muestra. Este detector de alta sensibilidad llega a una resolución menor a 1eV de energía (incluso cuando el haz de electrones tiene una energía mayor a 300KeV). Actualmente, sólo hay un tipo de espectrómetro disponible a nivel comercial, llamado EELS de recolección paralela o PEELS (manufacturado por Gatan, Inc.). A veces también se le denomina sector magnético, y consiste en un sistema de prismas magnéticos colocados en un TEM o STEM después de los detectores situados detrás de la muestra.
Hay dos tipos de filtros que dan lugar a dos instrumentos totalmente distintos a pesar de su función similar: el GIF (post-column Gatan Image Filter), que se basa en el sistema de prismas magnéticos PEELS, y el filtro in column, que es una variante magnética del prisma magnético de Castaing-Henry, ejemplificado por el filtro Omega (Ω), siendo los pioneros Zeiss, pero también usado en JEOL. Este último filtro, como indica su nombre, está integrado dentro del TEM entre la muestra y el detector; por lo tanto, no es un elemento añadido opcionalmente como en el primer caso.
En cualquiera de los filtros utilizados, el electrón pasa a través de uno o más prismas magnéticos, en un proceso análogo a la dispersión de la luz blanca por un prisma de vidrio. Los prismas magnéticos son preferibles a espectrómetros electrostáticos por diversas razones: son compactos y fácilmente integrables en el TEM, ofrecen suficiente resolución energética para distinguir el espectro de los elementos de la tabla periódica (lo cual hace posible el análisis) y los electrones en un rango de energía de 100-400 KeV (típico en AEMs) pueden ser dispersados suficientemente para detectar el espectro electrónicamente sin limitar así la resolución de energía.
La estructura básica de un PEELS-TEM se puede observar en la figura 16. Se puede observar que los electrones son seleccionados por una apertura de entrada variable (de 1, 2, 3 o 5 mm en el sistema Gatan). Estos viajan a través del espectrómetro hasta un “tubo de deriva” y son desviados por el campo magnético en ≥90°. Los electrones que han perdido energía son desviados un ángulo mayor que los que no han sufrido pérdidas. De esta forma, el espectro se forma en el plano de dispersión (figura 17), y consiste en una distribución de la intensidad de los electrones (I) en función de la pérdida de energía (‘E). A pesar de que las pérdidas de energía son un incremento y por tanto deberían expresarse en términos de ΔE, en la literatura de EELS se usa la convención de expresar tanto la energía como los cambios de energía con la letra E (en este caso, usamos 'E). El prisma magnético también actúa como una lente: se puede observar también en la figura 17 que los electrones con idénticas pérdidas energéticas que viajan en direcciones dentro y fuera del eje son reconducidos al foco en el plano de la imagen del espectrómetro.
Figura 16. Diagrama esquemático que muestra la situación de un PEELS (debajo de la pantalla de visualización de un TEM) y sus componentes.
Figura 15. Trayectorias seguidas por los electrones a través de un espectrómetro de prisma magnético. Se pueden observar la diferente dispersión y foco en el plano de la imagen (dispersion plane) de los electrones que pierden y no pierden energía. En la parte inferior podemos ver el efecto de lente magnética que ejerce el prisma en el plano normal al espectrómetro. En el cuadro superior derecho, la analogía con la dispersión de la luz blanca con un prisma de vidrio.
Técnica experimental: obtención de un espectro EELS
Para obtener un espectro por EELS, necesitamos un dispositivo que registre las medidas del plano de dispersión del espectrómetro. Históricamente, se utilizaba una película fotográfica o un semiconductor, pero en la actualidad se utiliza una cámara CCD tanto en GIFs como en filtros Ω. Una cámara CCD, charge-coupled device, es un dispositivo que permite el movimiento de cargas hacia un terminal donde estas son convertidas a valores digitales; las cargas generadas (electrones libres) en cada región de la CCD corresponderán a la señal recibida, y contribuirán al valor de la intensidad del píxel correspondiente. El uso de la CCD se ha extendido gracias a que muestra una mayor sensibilidad, mayor rango dinámico (ratio entre los valores máximo y mínimo de una magnitud; en este caso el mínimo correspondería al ruido de fondo) y mejor resolución energética en comparación con los métodos anteriores. Después del tiempo de integración necesario para obtener un espectro de calidad, éste se puede convertir a la señal requerida para el sistema visualizador de un ordenador.
Durante el uso del espectrómetro se puede trabajar en dos modos. Si utilizamos del TEM de forma que la imagen se presente por pantalla, el plano focal de la lente proyectora contiene un DP, que el espectrómetro después de la columna utiliza como objeto. Desde el punto de vista de un espectroscopista, esta forma de trabajo sería el modo de difracción, pero desde el punto de vista de un microscopista, es más natural llamarla modo imagen, ya que nosotros vemos una imagen por pantalla. En cambio, si ajustamos el microscopio de forma que el DP se proyecte en la pantalla (incluido el modo STEM), entonces el plano objeto del espectrómetro contiene una imagen, y la terminología es inversa. Esta terminología puede resultar confusa en función del punto de vista de la persona que la utiliza. En general, se utiliza el modo difracción o STEM.
El ángulo de recolección del espectrómetro β (que en realidad es un semiángulo) es una variable muy importante en EELS, por lo que hay que conocerla durante la obtención del espectro. Si no se controla el valor de este ángulo, no se pueden comparar directamente dos espectros, y esto introduce con frecuencia un error de cuantificación en las medidas.
Hay un ángulo para el cual un proceso específico de pérdida de energía del electrón es más probable: típicamente, debemos fijar el ángulo β como 2 o 3 veces aquél ángulo. En caso de duda, lo mejor es hacer β grande. No obstante, en general, ángulos de recolección grandes permitirán obtener altas intensidades pero también baja resolución. Un ángulo de recolección menor aportará una relación señal/ruido mayor en el espectro.
Figura 16. El valor de β (A) en TEM (modo imagen) o STEM/TEM (modo difracción). En (A), β depende principalment de las dimensiones de la apertura de objetivo, mientras que en (B), vendrá determinado por la apertura de entrada del espectrómetro (proyectada en el plano del DP).
Espectro de pérdida de energía
El término “pérdida de energía” de los electrones (EEL) implica que estamos interesados únicamente en las interacciones inelásticas. No obstante, el espectro también contendrá electrones que no han perdido energía distinguible, por lo tanto, deberemos considerar también la dispersión elástica.
Según el valor de la cantidad de energía perdida por el electrón, podemos hablar de diferentes regiones del espectro:
El pico de pérdida nula (zero-loss peak): contiene principalmente electrones dispersados elásticamente, pero también incluye electrones que han perdido cantidades de energía muy pequeñas. Se hace muy útil formar imágenes y DPs con los electrones de este pico, ya que ofrece ventajas respecto a imágenes no filtradas de muestras de un grosor considerable, que dan lugar a un mayor número de electrones desviados que no contribuyen al contraste, como ya hemos explicado (estas imágenes estarán libres de aberración cromática y efectos de dispersión difusa). Este pico será la señal de mayor intensidad del espectro.
Figura 17. Comparación de imágenes en TEM de una muestra biológica gruesa sin filtro (A) y con filtro (B), donde la señal de los electrones con pequeñas pérdidas de energía ha sido eliminada. Se puede observar un mayor contraste en (B).
La región de bajas pérdidas (low-loss region): contiene electrones que han perdido una energía de hasta 50 eV (este es un límite arbitrario). Estos electrones han interaccionado con los electrones débilmente ligados de las capas superiores de los átomos. Por ende, esta parte del espectro refleja la respuesta dieléctrica del espécimen a electrones de alta energía. También se pueden formar imágenes con estos electrones que muestran información sobre la estructura electrónica y otras características de la muestra. Una de estas características y probablemente la de mayor importancia es la de conocer la valencia con la que se encuentran los átomos de la muestra. También se puede calcular la constante dieléctrica local del espécimen, la densidad de electrones libres y el grosor, entre otros. La identificación de elementos y compuestos específicos se obtiene por comparación con espectros estándar de referencia que se pueden encontrar en las bases de datos.
Figura 18. Espectro de bajas pérdidas de energía de un espécimen de aluminio puro de grosor muy pequeño. El espectro muestra la intensidad de señal recibida según la energía de los electrones detectados. Se puede observar claramente el pico de pérdida nula (I_0) y un pequeño pico de plasmón (I_p) a los 15 eV.
Región de altas pérdidas: contiene electrones que han perdido una cantidad de energía mayor a 50 eV. Estos provienen principalmente de la ionización o de interacciones inelásticas con electrones fuertemente ligados más cercanos al núcleo atómica. En este caso también se puede obtener información sobre la composición elemental de la muestra. Esta información se suele utilizar para complementar los espectros obtenidos por XEDS, en los que falta información sobre elementos ligeros, como ya se ha comentado. Uno de los potenciales usos de los espectros de altas pérdidas es la obtención de mapas de los elementos presentes en la muestra, ya que la información obtenida permite una identificación elemental directa. Los márgenes correspondientes a ionizaciones permiten, además, obtener análisis e imágenes cuantitativos de todos los elementos de la tabla periódica. La principal limitación de esta última aplicación es que los especímenes deben ser mucho menores que la trayectoria libre media (típicamente menores a 50 nm), ya que de otro modo el procesamiento necesario de los resultados puede introducir artefactos.
Figura 19. Mapeado cualitativo de elementos de Si3N4 policristalino. En la primera imagen se puede observar la muestra bajo TEM convencional. Las subsecuentes imágenes muestran los puntos donde se ha encontrado presencia de diferentes elementos por la técnica de EELS: nitrógeno (verde), oxígeno (rojo) y silicio (azul).
Tomografía EELS (EELS tomography)
Es posible utilizar una serie de imágenes 2D filtradas por alguna región del espectro EELS de diferente inclinación para reconstruir una imagen 3D, como ya hemos visto en la sección de TE. Estas imágenes se denominan de tipo EFTEM (Energy-Filtered TEM). Con la reconstrucción tridimensional podemos apreciar características de superficie, ángulos y caras de crecimiento y otras propiedades que no se pueden obtener tan fácilmente a partir de las imágenes bidimensionales habituales. La tomografía EFTEM es un área aun en desarrollo, pero en la figura 21 se puede observar un ejemplo: la distribución del fósforo en una reconstrucción de una célula de mosca de la fruta (Drosophila melanogaster).
Figura 20. (A) Visión superior 2D y (B) reconstrucción tomográfica en 3D filtrada por energía que muestra la distribución de fósforo de una sección de larva de Drosophila. La región principal es parte de un núcleo celular y la zona superior derecha es una región del citoplasma que contiene ribosomas. Ambos contienen ácidos nucleicos (DNA y RNA, respectivamente), que son ricos en fósforo.
Las técnicas y modos de operación expuestos en este texto ponen de manifiesto que la microscopía electrónica de transmisión no constituye únicamente la solución a la falta de resolución proporcionada en su momento por los microscopios ópticos. En efecto, hemos visto que las posibilidades que ofrece un TEM van más allá de la extraordinaria resolución de las imágenes que permite obtener: la comprensión de la interacción entre los electrones del haz y la muestra a estudiar nos ha permitido desarrollar técnicas y acoplar detectores complementarios que permiten obtener una gran cantidad de información valiosa sobre la naturaleza del material de estudio.
El amplio espectro de datos de diferente categoría que permite obtener es la base de los estudios que se están llevando a cabo en la actualidad. Es por esto que la microscopía electrónica de transmisión se ha convertido uno de los recursos principales y fundamentales de investigación en el campo de la nanociencia y la nanotecnología.
Microscopía Electrónica de Transmisión de Barrido (STEM)
Williams, David B., Carter, C. Barry., Transmission Electron Microscopy: A Textbook for Materials Science, Springer, 2009.
Kimoto, K., Matsui, Y., Material characterization using Electron Energy Loss Spectroscopy in a Transmission Electron Microscope (TEM-EELS). Review of results. Octubre 2007.
Midgley, PA., Weyland, M., 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography, Ultramiscroscopy, 27, October, 2002.

References: resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución