Source: https://www.jove.com/video/57196/inclusin-en-parafina-y-finas-secciones-de-biofilms-microbianos?language=Spanish
Timestamp: 2018-10-19 06:52:17+00:00

Document:
Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis | Protocol (Translated to Spanish)
Inclusión en parafina y finas secciones de Biofilms microbianos Colonia para el análisis microscópico
Vibrio cholerae: organismo modelo para estudiar la patogénesis bacteriana - Entrevista…
Colonia de levaduras Método de anidamiento
El uso de un flujo de goteo y la rotación deldisco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm…
Describimos a fijación, inclusión en parafina y finas técnicas seccionamiento de biofilms microbianos de la Colonia. En muestras preparadas, patrones de expresión de subestructura y reportero de biofilm pueden visualizarse por microscopía.
Seccionamiento mediante inclusión en parafina es una técnica ampliamente establecida en sistemas eucarióticos. Aquí proporcionamos un método para la fijación, inclusión y secciones de biofilms intacto Colonia microbiana utilizando parafina perfundido. Para adaptar este método para el uso en Colonia biofilms, desarrollado técnicas para mantener cada muestra en su sustrato de crecimiento y laminar con un overlayer de agar y lisina ha añadido a la solución fijadora. Estas optimizaciones mejoran la retención de la muestra y la preservación de Características micromorfológicas. Muestras preparadas de esta manera son susceptibles de fino corte y proyección de imagen por microscopía de luz, fluorescencia y transmisión. Hemos aplicado esta técnica a biopelículas de la colonia de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisy Vibrio cholerae. El alto nivel de detalle visible en las muestras generadas por este método, combinado con cepa reportero ingeniería o el uso de colorantes específicos, puede proporcionar ideas interesantes sobre la fisiología y el desarrollo de las comunidades microbianas.
La mayoría de microbios tienen la capacidad para forma biofilms, comunidades de células ligan por matrices de producción propia. Biofilms se puede cultivar en muchos tipos de configuraciones físicas, con diversos regímenes de suministro de nutrientes y sustrato. Ensayos específicos para la formación del biofilm tienden a producir estructuras multicelulares reproducibles, y arquitecturas comunes se observan especies filogenéticamente diversas a nivel macroscópico o comunidad. Cuando microbios crecen como colonias en medio sólido bajo una atmósfera, morfología macroscópica transmite información sobre la capacidad de producción de la matriz y a menudo se correlaciona con otros rasgos 1,2,3. La arquitectura interna de las colonias microbianas también puede proporcionar pistas sobre biofilm específica química y fisiología, pero ha sido difícil de caracterizar. Recientes aplicaciones de las técnicas de crioinclusiones y cryosectioning a colonias bacterianas han permitido la proyección de imagen y visualización de características específicas en la resolución sin precedentes 4,5,6. Sin embargo, estudios con tejidos animales han demostrado que inclusión en parafina proporciona superior conservación de la morfología comparada con crioinclusiones 7 y se ha utilizado para visualizar las bacterias en los tejidos 8,9. Por lo tanto hemos desarrollado un protocolo para la fijación, inclusión en parafina y finas secciones de biofilms microbianos de la Colonia. Aquí, describimos la preparación de secciones delgadas 10,11de Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm, pero también con éxito hemos aplicado esta técnica a biofilms formados por las bacterias Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, y Vibrio cholerae12.
El proceso de inclusión en parafina y secciones delgadas de biopelículas sigue una simple lógica. En primer lugar, los biofilms están contenidos en una capa de agar para preservar la morfología durante el proceso. En segundo lugar, los biofilms encajonadas son sumergidos en un fijador para macromoléculas de la reticulación y preservar micromorfología. Estos son luego deshidratados con alcohol, limpiados con un solvente más polar y luego infiltrados con cera de parafina líquida. Una vez infiltrado, las muestras están incrustadas en bloques de cera para seccionamiento. Las secciones son corte montadas en portaobjetos y luego rehidratadas para volver a un estado más nativo. Desde este punto, pueden ser manchadas o cubiertas de medio de montaje para el análisis microscópico.
Este protocolo produce finas secciones de biofilms microbianos adecuados para análisis histológico. Subestructuras de biofilm de Colonia son accesibles cuando secciones delgadas preparadas utilizando este método son imágenes por microscopia ligera. Biofilms también puede ser crecidos en las manchas fluorescentes que contienen los medios de comunicación específicos para características individuales o manchados en la etapa de rehidratación, inmediatamente antes del montaje (pasos 9.5 9.6). Por último, microbios pueden ser diseñados para producir proteínas fluorescentes de manera constitutiva o regulada, lo que en situ informes de expresión de la distribución o gen de la célula dentro de estas comunidades. Hemos utilizado estos métodos para determinar la profundidad de biofilm de Colonia, distribución celular, distribución de la matriz, patrones de crecimiento y expresión génica espaciotemporal.
1. crecimiento de aeruginosa de los Pseudomonas Biofilms de Colonia
Preparación de placas de medio-bicapa
Preparar un 10 G/l triptona, agar 10 g/L solución (véase Tabla de materiales) en agua desionizada.
Autoclave durante 20 min enfriar a 50-60 ° C en un baño de agua.
45 mL de la solución de agar triptona vierta un plato cuadrado de 100 x 100 mm (véase Tabla de materiales) utilizando un tubo cónico de 50 mL. Permitir que el agar se solidifique (~ 20-30 min). Verter una segunda capa de 15 mL encima la primera capa. Dejar solidificar durante la noche, eliminación de condensación de tapas si es necesario frotándola con un paño libre de pelusas.
Avistamiento de Colonia Biofilms
Las cepas de interés de la raya de las existencias de congelador en LB agar placas13 e incubar en la oscuridad de 12-16 h a 37 ° C y 80-100% humedad relativa.
Para cada cepa o repetición, utilice una sola Colonia para inocular 2 mL de LB e incubar en la oscuridad de 12-16 h a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
El de la cultura mediante la dilución 1: 100 en fresco LB y de incubación en la oscuridad de 2.5-3 h a 37 ° C con agitación a 250 rpm.
Medir densidad óptica usando un espectrofotómetro y ajustar con LB estéril para lograr una suspensión con un OD500 nm de ~ 0,5.
Dependiendo de la Colonia deseada tamaño, pipeta 2.5-10 μl de la suspensión celular en un plato mediano-bicapa (preparado en el paso 1.1) y permitir que el terreno se seque por 20 minutos dejando la tapa de petri abierta cerca de una llama abierta puede facilitar el secado.
Incubar el punto colonias a 25 ° C y 80-100% humedad relativa, en la oscuridad hasta por 4 días.
2. preparación de la solución fijadora
Preparar la solución fijadora en el día de la recolección de la muestra. Diluir el 37% de formaldehído (FA) en PBS 1 x a una concentración final de 4% FA.
PRECAUCIÓN: FA es volátil y tóxico. Utilizar equipo de protección y trabajar en una campana bien ventilada.
Inmediatamente antes del uso, disolver clorhidrato de L-lisina en el 4% FA, (preparada en el paso 2.1) a temperatura ambiente a una concentración final de 50 mM L-Lisina HCl.
3. dirigir la aplicación de fijador a la biopelícula de Colonia [opcional]
Nota: Hemos encontrado que morfología de biofilm se conserva mejor cuando se añade el agar de recubrimiento antes de la fijación. Sin embargo, este paso constituye también un cambio en las condiciones ambientales que pueden afectar la expresión génica. Patrones de expresión de reportero fluorescente por lo tanto deben ser verificados mediante un protocolo separado en el que el paso de fijación se lleva a cabo antes de la adición de agar de recubrimiento, como se describe aquí.
En el día de la fijación y trabajar en una campana bien ventilada, pipetear el fijador preparado en el paso 2 directamente a la superficie del agar alrededor de la Colonia, lo que le permite llegar a la periferia de la Colonia sin sumergiéndola. Aplicar sólo como mucho fijador ya que para totalmente rodea la Colonia, aproximadamente 500 μl. permitir que el fijador difundir en la Colonia y el agar circundante.
Una vez que el fijador ha sido completamente absorbido por la Colonia y los medios circundantes, aproximadamente 20-30 min, y FA residual ya no es visible en la placa, repita el paso 3.1. Permiten este fijador difundir en la Colonia y el agar circundante.
Una vez que el fijador ha sido completamente absorbida por la Colonia y sus alrededores los medios repiten el paso 3.1, esta vez aplicando fijador a la superficie de la Colonia directamente. Permiten este fijador difundir en la Colonia y el agar circundante, proceder al paso 4 sólo después de todo fijador ha sido absorbida y ya no es visible en la placa.
4. superposición colonias con Agar
En el día de la fijación, preparar un 10 g/L solución de agar en agua desionizada y autoclave de 10-20 minutos disolver. Enfriar en un baño de agua a 50 ° c.
Suavemente verter 15 mL de la solución de agar al medio de cultivo y Colonia. Permitir que el agar para formar un gel a temperatura ambiente durante 5 minutos (figura 1B).
Utilice una cuchilla de afeitar para cortar un plato cuadrado, 3 capas con la Colonia laminada entre las dos capas superiores. Si de preparación de muestras múltiples, asegúrese de que cada tirada es cortado a un tamaño comparable.
Retire suavemente el exceso agar de la tirada que contiene la Colonia.
Para levantar las dos capas superiores de agar (contiene la Colonia) de la capa inferior del mandril (figura 1), mojar la cabeza plana de 1 x PBS o agua una espátula e inserte suavemente entre las capas superior e inferior. La Colonia laminada debe separarse de la capa inferior. Tenga cuidado de no torcer o doblar la Colonia laminada cuando se levante de su base.
Trabajar en una campana bien ventilada, transferir inmediatamente la Colonia laminada (es decir, mandril de 2 capas) en un cassette de inclusión (véase Tabla de materiales), marcado con un marcador resistente a productos químicos. Coloque el cassette de inclusión en un envío de diapositivas de vidrio (véase tabla de materiales) que contiene el fijador preparado en pasos 2.1-2.2. Asegúrese de que no hay burbujas de aire atrapadas en el interior del cassette de inclusión.
Incubar la muestra en el fijador durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente.
6. muestra proceso: Tampón de lavado, deshidratación, claro y la infiltración
Después de la fijación durante la noche, lave la muestra dos veces en PBS 1 x durante 1 hora. Para mejores resultados, automatizar la homogeneización de reactivo usando la función de un procesador de tejidos automático (véase tabla de materiales) establece en un ajuste bajo. Si no se dispone de ningún procesador, procesamiento se puede ejecutar manualmente.
Siga el lavado Tampón por deshidratación a través de una serie gradual de etanol (EtOH) diluciones en PBS 1 x (25%, 50%, 70%, 95%) durante 1 h a temperatura ambiente.
Deshidratar en tres lavados de 100% EtOH durante 1 h a temperatura ambiente.
Claro la muestra deshidratada en tres lavados de agente naranja claro a base de aceite de 100% (véase tabla de materiales) por 1 h a temperatura ambiente.
Infiltra la muestra limpia dos veces con parafina fundida la cera (véase Tabla de materiales), se calienta a 55˚C, por 2 h.
7. muestra incrustación
Llenar un molde de cera con cera de parafina fundida calentada a 55 ° c. Use una espátula caliente, plana para transferir rápidamente el mandril infiltrado del cassette de inclusión en el molde de cera, asegurando que el mandril apoya paralelo a la base del molde. Evite aplicar presión excesiva sobre el mandril. Moldes de cera pueden ser 3D personalizado impreso, o están disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales).
Permita que la cera solidifique durante la noche a 4 ° c. Muestras moldeadas en cera sólida pueden ser almacenadas indefinidamente a 4 ° c.
Una vez que la cera se ha solidificado, suprimir la muestra del molde y recorte el exceso cera de alrededor de la muestra con una cuchilla de afeitar. Deja la cera sobrante que se extiende desde un extremo de la muestra, paralelo al plano de corte, que puede utilizarse para fijar en el micrótomo (véase Tabla de materiales). También deja una envoltura de cera y aproximadamente 1 mm de espesor, alrededor de la muestra y lisa de sus caras.
8. seccionamiento
Un baño de agua a 42 ° c de calor. La muestra de la abrazadera en el micrótomo con la superficie de la Colonia orientada perpendicular al borde de la hoja (véase Tabla de materiales).
Cortar la muestra en intervalos de 50 μm hasta alcanzar el plano deseado de la Colonia, de la que se recogerán las secciones.
Corte una cinta del número de secciones de 10 μm espesor utilizando un micrótomo a un velocidad de seccionamiento de 75-80 rpm y un ángulo de separación de 6-10 °. Utilizar un pincel de punta fina para separar la cinta de la hoja.
Utilizando una gota de agua en la punta de una pipeta de Pasteur (preferido) o fórceps, transferir suavemente la cinta para el baño de agua. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire captura bajo la sección.
Inmediatamente insertar una diapositiva en el baño de agua y colocarlo debajo de la cinta en un ángulo de 45 °.
Toque el borde estrecho de la cinta a la corredera, justo debajo de la etiqueta del helado. La cinta debe adherirse.
Tire de la corredera en el baño de agua, ajustar el ángulo a ser perpendicular a la superficie del agua y permitir que la cinta en posición plana contra la corredera a lo largo de su longitud. Evite atrapar el exceso de agua debajo de la cinta.
Soporte suavemente el portaobjetos sobre un absorbente pelusa, absorbe exceso de agua de la sección.
Coloque el portaobjetos sobre una toalla de papel y deje que se seque a temperatura ambiente durante la noche en la oscuridad. Diapositivas pueden almacenarse indefinidamente a 4 ° c en la oscuridad.
9. fijación de calor, rehidratación y montaje
Una placa caliente nivelada a 45 ° c de calor. Caliente la diapositiva durante 30-60 minutos. La cera será convertido en semi fundida y aplanar contra la corredera.
Suavemente Levante la diapositiva de la placa y colóquela plana en una superficie lisa, nivelada, temperatura ambiente, usando cuidado para asegurar que la cera fundida no tira a ambos lados de la corredera, hasta que la cera solidifica (~ 1 min).
Mediante un envío de diapositivas de vidrio, cera de diapositivas en cuatro lavados de claro agente de 5 minutos cada uno, utilizando un aspirador de Büchner para eliminar la solución entre lavados.
Lavar los portaobjetos tres veces en el 100% EtOH durante 1 minuto.
Rehidratar las diapositivas de una serie gradual de etanol en el orden inverso de la transformación (95%, 70%, 50% y 25%) durante 1 minuto que cada uno seguido por dos lavados de 1 min en PBS 1 x.
Inmediatamente montar las secciones en un medio de montaje con tampón Tris (véase Tabla de materiales) y aplica un cubreobjetos, evitando la introducción de burbujas de aire. Permitir que el medio de montaje polimerizar durante la noche a temperatura ambiente.
Una vez polimerizado, sellar el cubreobjetos a la diapositiva usando esmalte de uñas claro. Diapositivas de sellado pueden conservarse indefinidamente en la oscuridad a 4 ° c.
Este método genera biofilm delgada-secciones en donde distintas características morfológicas y las zonas de la expresión génica pueden ser reflejadas por DIC, microscopía de fluorescencia y TEM. Mientras que la proyección de imagen DIC utilizando un 40 X objetivo de inmersión de aceite puede ser suficiente para mostrar algunos rasgos morfológicos (Figura 2E), hemos encontrado que la fluorescencia microscopía de variedades dirigido a proteína constitutivamente expresan fluorescente proporciona mayor visualización de la distribución de células dentro de la muestra (Figura 2D). Imágenes de secciones individuales pueden ser cosidos juntos para generar una muestra representativa de toda la Colonia (figura 2B) y proporcionan el contexto para la localización de características estructurales dentro de la morfología general en el nivel macroscópico (compare Figura 2A, B y C). Las características morfológicas y señales fluorescentes pueden medirse usando proyección de imagen de software14. Estructuras dentro de la biopelícula o transiciones entre zonas de la expresión génica luego pueden correlacionarse con la distribución de metabolitos o gradientes químicos11 .
Este protocolo puede ser modificado y adaptado de varias maneras. Uso de una tensión diseñada para proteína fluorescente expresa bajo el control de un promotor específico permite la visualización de la distribución de la expresión génica (Figura 3A). Colonias pueden crecer en medio que contiene tintes, o tintes pueden agregarse después de seccionamiento, para tinción de polisacáridos específicos (figuras 3B y C). Finalmente, las muestras preparadas en una versión modificada de este protocolo pueden ser examinadas por TEM (figura 3D) para permitir la visualización en una resolución más alta que el de DIC o microscopía de fluorescencia.
Figura 1: Esquema que representa la configuración para el crecimiento de la Colonia antes de la fijación.
(A) las colonias crecen en la parte superior dos capas de medio de cultivo agar solidificado (superior e inferior) y luego (B) son overlaid con una capa adicional (overlay), que conserva la morfología de las colonias. (C) la Colonia entre el recubrimiento y la capa superior se separa de la capa de fondo para la transformación posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Características micromorfológicas y fluorescencia de YFP en secciones de parafina-encajados de las colonias.
Datos representativos para Pseudomonas aeruginosa PA14 ΔFHZ Colonia15 expresan constitutivamente YFP y crecido durante 3 días en 1% triptona, agar al 1% con rojo Congo y Coomassie blue. (A) vista superior, imagen de fluorescencia que muestra la mitad de una colonia antes de la fijación. (B) sección transversal de toda la Colonia después de la inclusión en parafina. El área de caja fue fotografiado con un objetivo X 10 (C). El área de caja en (C) entonces era reflejado con un 40 X lente de objetivo de inmersión de aceite mediante fluorescencia (D) y CID (E). Barras de escala representan 2 mm (A), (B) de 500 μm y 100 μm (C-E). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Expresión de reportero, pre y post coloración características de la biopelícula y proyección de imagen de TEM de las muestras de biopelícula de parafina-encajado de la Colonia.
(A) mexGPr-GFP fluorescencia de reportero en una colonia de p. aeruginosa PA14 crecida durante 3 días en 1% triptona, agar al 1%. (B) fluorescencia de limite rojo de Congo en una colonia de p. synxantha crecida durante 5 días en un medio que contiene el tinte. (C) fluorescencia de la tinción de lectinas floribunda Wisteria para Pel polisacárido en p. aeruginosa PA14 ΔFHZ Colonia (crecida por 2 días en triptona 1%, 1% agar con rojo Congo y Coomassie azul), después de seccionar. (D) imagen TEM de una colonia deFHZ Δ de p. aeruginosa PA14 (crecida por 3 días en 1% triptona, agar al 1% con rojo Congo y Coomassie blue) y se procesan por seccionamiento mediante inclusión en parafina *. Barra de escala representa 40 μm (A-B), (C) de 20 μm y 5 μm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
* Esta muestra fue procesada para seccionamiento mediante inclusión en parafina hasta el paso 4 del protocolo anterior, omitiendo los pasos 4.1-4.3 y luego procesada por separado para el análisis TEM.
Muestras de inclusión en parafina y secciones delgadas del tejido es una técnica histológica clásica que permite proyección de imagen de estructuras morfológicas micro se usa comúnmente en los tejidos eucarióticos y se ha aplicado con cierto éxito a muestras microbianas8 ,9. Mientras que crioinclusiones permite la fuerte retención de señal endógena e inmunofluorescente, inclusión en parafina es generalmente preferible ya que proporciona mejor preservación de la morfología16. En la adaptación de este método para la aplicación de biopelículas microbianas, nos centramos en las características que son exclusivas de nuestro sistema. La matriz de los tejidos y las células son a menudo ligadas relativamente robusta, mientras que los biofilms tienden a ser más delicado; por lo tanto hemos optimizado cera incorporar protocolos para maximizar la retención de la muestra y fijación de rutina. Mantener la muestra en su sustrato de crecimiento y superposición de la Colonia con agar inmediatamente antes de la fijación se aseguran que la muestra no se pierde de la parte superior o la base. Sin embargo, superponiendo las colonias con agar demasiado caliente puede dañar las colonias, por lo que debe tener cuidado adicional durante este paso.
La fijación es un paso fundamental para conservar la estructura a través de la deshidratación áspera, claro, y pasos de infiltración requieren para inclusión en parafina. Encontramos que mejor de la fijación de la lisina-formaldehído preserva la integridad de la muestra. Soluble lisina, una diamina, puede reaccionar con aldehídos para formar polímeros reticulados y se ha propuesto reforzar la sustancia exopolymeric (EPS) contra degradación mecánica17,18.
Hemos observado que la fluorescencia del fondo disminuye con sucesivos lavados en el agente naranja claro a base de aceite, o a través de una exposición prolongada, durante la rehidratación de la muestra (paso 9.3). Sobre el tratamiento con el agente de claro, sin embargo, resulta en muestras frágiles que son difíciles de sección19. Puede ser necesario ajustar el volumen o el número de lavados para reflejar la cantidad de cera presente durante cada rehidratación. Fluorescencia del fondo creciente puede surgir además de la contaminación del tejido procesamiento reactivo, donde la cera, que es ligeramente autofluorescent, es total o parcialmente miscible en el solvente de limpieza o etanol utilizado en estos pasos (pasos 6.1-6.4). Además, hemos encontrado que etanol disminuye la señal del reportero, y es esencial para volver a constituir el fluoróforo en dos lavados de PBS antes de montar (paso 9.5 9.6).
Este método también permite la localización de fluorescencia constitutiva e impulsados por el promotor a la resolución de las células. Sin embargo, se aconseja precaución cuando utiliza este método para interpretar la expresión génica. El paso de la superposición en este protocolo (paso 4.2), aplicado antes de la fijación a 50 ° c, presenta un cambio ambiental considerable en relación con las condiciones de crecimiento inicial que puede influir en patrones de expresión génica. Puede ser útil verificar patrones de expresión mediante la aplicación de fijador a la Colonia directamente, inmediatamente antes de verter el recubrimiento, pero a un costo a la morfología (paso opcional 3.1-3.3).
Otro factor que influye en la interpretación de la fluorescencia es la topografía de la sección de sí mismo. Diferentes regiones de la biopelícula que exhiben diversos grados de integridad estructural y sean más o menos susceptibles de conservación por medio de fijación, dependiendo de que, si cualquier, grupos funcionales esos componentes son capaces de contribuir a la fijación del cross-linking 20. consecuentemente, las secciones pueden perder biomasa desproporcionadamente de la superficie de la sección cuando la transición de una zona morfológica o metabólica a otro a lo largo del eje z de la Colonia. Esto puede abordarse por un sector focal intacto de la sección de imágenes con un microscopio confocal.
Además de aplicar esta técnica a cepas dirigidas a proteínas fluorescentes express, hemos examinado Características micromorfológicas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el biofilm muestras teñidas con colorantes fluorescentes específicos (Figura 3A ). Jennings et al describió recientemente un tinte específico para Pel, el principal polisacárido producido por p. aeruginosa PA14 biofilms 21. Como se describe en el protocolo y representante anterior, aplicación de este tinte a las secciones permite la visualización de la distribución de Pel en PA14 Colonia biofilms en alta resolución (figura 3) 3. Por el contrario, tintes fluorescentes como el rojo Congo se pueden añadir al medio de crecimiento y reflejada posterior seccionamiento (figura 3B). La aplicación de un recubrimiento también mantiene Colonia biofilm estructura morfología y células en proceso de TEM (figura 3D).
El método optimizado que se describe aquí permite la preparación de Colonia biofilms para seccionamiento mediante inclusión en parafina, en donde pueden ser señal endógena y características o complejados tintes localizada en vivo con resolución superior reduciendo al mínimo muestra pérdida y preservación nativa Colonia macro - y micro-morfologías. Reconocemos que uso substancial de esfuerzo, tiempo y reactivos se requieren para este método. Sin embargo, consideramos que estos inconvenientes son contrarrestados por el grado de preservación morfológica, la resolución de en situ de la fluorescencia y la receptividad a la pre- y post-tinción procedimientos o estrategias de procesamiento (tales como la preparación para TEM) que brinda esta técnica.
Este trabajo fue apoyado por NSF carrera Premio 1553023 y Premio de NIH/NIAID R01AI103369.

References: resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución 
 resolución