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Timestamp: 2020-07-07 00:36:53+00:00

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Grupo 2 Principios Para El Diagnostico de Enfermedades Infecciosas | Bacterias Gram Positivas | Anticuerpo
Grupo 2 Principios Para El Diagnostico de Enfermedades Infecciosas
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microbiologia09.05-2013
laboratorio frotis
Gua Laboratorio 3
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PRINCIPIOS GENERALES DEL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
2.1. MICROSCOPÍA Y CULTIVO IN VITRO
2.1.1. MICROSCOPÌA
Es el conjunto de técnicas para producir imágenes visibles de estructuras demasiado pequeñas para ser percibido a simple vista; el estudio detallado de los componentes de células y tejidos animales o vegetales, por el tamaño que poseen, requiere el uso de instrumentos (microscopio).
En microbiología se utiliza para dos fines básicos: 1) detección inicial de microorganismos e 2) identificación preliminar o definitiva de los mismos.
El microscopio fue empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula y los tejidos. El nombre deriva etimológicamente de dos raíces griegas: mikrós, que significa pequeño y skopéoo, que significa observar. Es decir el microscopio es un instrumento que sirve para observar objetos o estructuras pequeñas.
Existen dos tipos de microscopios que emplean la luz como fuente de energía para formar imágenes aumentadas y detalladas de objetos que a simple vista no es posible observar:
b) Microscopio fotónico compuesto.
COMPONENTES DEL MICROSCOPIO FOTÓNICO
El microscopio fotónico compuesto está integrado por tres tipos de componentes:
a) COMPONENTES MECÁNICOS: Son aquellos que sirven de sostén, movimiento y sujeción de los sistemas ópticos y de iluminación así como de los objetos que se van a observar.
 Base o pié: Es una pieza metálica, amplia y sólida que proporciona estabilidad y sirve de soporte para los otros componentes del microscopio.
 Brazo, estativo o columna: Permite la sujeción y traslado del microscopio. Soporta al tubo óptico, a la platina y el revólver.
 Platina:
perforación circular central, por la que pasara la luz del sistema de iluminación. En ella se apoya la preparación (lámina portaobjetos que contiene a la muestra que se va a examinar) a observar, que es sujetada por un par de pinzas que tiene un sistema mecánico, denominado carro, que permite el movimiento de derecha a izquierda y de adelante hacia atrás.
 Tubo óptico: Consiste en un cilindro metálico que suele medir 160mm o 170 mm de longitud (dependiendo del fabricante del microscopio) el cual en el extremo inferior, está conectado al revolver o portaobjetivos y en el otro superior se relaciona con el (los) ocular(es).
 Revolver o portaobjetivo: Es una pieza sobre la que se montan los objetivos y es capaz de girar para permitir el cambio de dichos objetivos con el fin de que coincidan de manera perpendicular con la perforación central de la platina.
 Tornillos macrométrico y micrométrico: Generalmente están situados en la parte inferior del brazo o columna. Pueden estar separados (en los 2 microscopios antiguos) o el tornillo micrométrico está incorporado en la circunferencia del tornillo macrométrico (microscopios actuales). Ambos tornillos permiten el movimiento de la platina hacia arriba y hacia abajo con la diferencia de que el Tornillo macrométrico mueve la platina de forma brusca y poco precisa; en cambio, el tornillo micrométrico mueve la platina hacia arriba y hacia abajo de forma lenta y muy precisa para efectuar el enfoque fino y definitivo de la imagen. La finalidad es de acercar o alejar la preparación hacia los objetivos y así conseguir un enfoque óptimo de la imagen.
b) COMPONENTES ÓPTICOS: comprende un conjunto de lentes dispuestas de tal manera que produce el aumento de las imágenes que se observan a través de ellas.
 Objetivos: son unos pequeños cilindros incrustados en el revólver, situados cerca de la preparación y obtienen la imagen real aumentada e invertida. Considerados los elementos más importantes en la formación de la imagen microscópica, ya que establecen la calidad de la imagen en cuanto a su nitidez, la capacidad que tiene para captar los detalles de la misma (poder de resolución) y determinan la cantidad total de aumento. Cada objetivo tiene grabadas en su superficie unas cifras que indican: el aumento propio, la apertura numérica, la longitud del tubo ocular y el grosor de los cubreobjetos que debe utilizarse en la preparación para una correcta observación. Suelen llevar dibujado un anillo de color que indica su aumento y suelen ser de x4 (rojo), x10 (amarillo), x40 (azul) y x100 (blanco). Por ejemplo, las siguientes cifras grabadas: 40x/0.70; 160/0.17, indican: 40x el aumento del objetivo; 0.70 la abertura numérica, es decir, la medida del tamaño del cono de luz que el objetivo puede admitir; 160 la longitud (en mm) del tubo del ocular que debe ser utilizados con ese objetivo y 0.17 el espesor del cubreobjetos (en mm) que debe usarse con ese objetivo.
 OCULAR: Es otro componente óptico del microscopio, debe su nombre porque la imagen final se observa a través de él acercando el ojo del observador a la lente “ocular” del componente. Es el encargado de formar una segunda imagen a partir de la imagen primaria que forma el objetivo. La imagen del ocular es de mayor tamaño, virtual y derecho. Esta imagen únicamente amplía un número determinado de veces (5x, 8x, 10x, 12x) a la imagen formada por el objetivo. No añade, por más aumentos propios que posea, ningún detalle a los generados por el objetivo. Ojo humano: de 100 metros a 0,1 milímetro microscopio óptico: de 0,1 mm a 0,25m (micras) microscopio electrónico: de10 m a 0,1 nm (manómetro).
b) COMPONENTES DE ILUMINACION: Se consideran dentro de este grupo a las partes del microscopio que reflejan, transmiten, y regulan la cantidad de luz necesaria para efectuar la observación a través del microscopio.
 FUENTE DE LUZ: Para observar la muestra microscópica es necesario que esta se ilumine con algún tipo de luz y nuestros microscopios cuenta con un foco que da energía eléctrica que dirige sus rayos luminosos hacia el sistema condensador
 CONDENSADOR: Es una lente de gran abertura que Es el componente óptico que tiene como función principal dirigir y concentrar los rayos luminosos que provienen de la fuente luminosa. Está formado por una o dos lentes convergentes que reúnen los rayos luminosos y los orientan hacia la abertura central de la platina en la preparación. Se encuentra debajo de la platina y tiene un diafragma unido en la parte inferior.
 DIAFRAGMA: Está en el interior del condensador y sirve para limitar el haz de rayos que atraviesa el sistema de lentes eliminando los rayos demasiado desviados (regula la luz y ajusta la apertura numérica). Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
TIPOS DE MICROSCOPIOS FOTÓNICOS.
MICROSCOPIO DE TRANSPARENCIA O DE CAMPO CLARO (OPTICA):
Los componentes básicos de los microscopios ópticos son una fuente de luz que se utiliza para iluminar la muestra colocada en una platina, un condensador para enfocar la luz en la muestra y dos sistemas de lentes (lente del objetivo y lente del ocular) que se utilizan para ampliar la imagen de la muestra. En la microscopia de campo claro la muestra se ve mediante transiluminación, de manera que la luz procedente del condensador atraviesa la muestra. Después se amplía la imagen, primero por la lente del objetivo y después por la lente del ocular. La ampliación total de la imagen es el producto de las ampliaciones de las lentes del objetivo y del ocular. Habitualmente se utilizan tres lentes del objetivo diferentes: bajo aumento (aumento de 10 veces), que se puede utilizar para explorar una muestra; alto aumento en seco (40 veces), que se utiliza para buscar microorganismos grandes como parásitos y hongos filamentosos; e inmersión en aceite (100 veces), que se utiliza para observar bacterias, levaduras (fase unicelular de los hongos) y los detalles morfológicos de los microorganismos y las células de mayor tamaño. Las lentes del ocular pueden ampliar aún más la imagen (generalmente de 10 a 15 veces).
La limitación de la microscopia de campo claro es la resolución de la imagen (es decir, la capacidad de distinguir que dos objetos están separados y que no son uno solo). La capacidad de resolución de un microscopio está determinada por la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar el objeto y el ángulo de la luz que entra en la lente del objetivo (el que se denomina abertura numérica). La capacidad de resolución es máxima cuando se interpone aceite entre la lente del objetivo (habitualmente la lente de 100x) y la muestra, porque el aceite reduce la dispersión de la luz. Los mejores microscopios de campo claro tienen una capacidad de resolución de aproximadamente 0,2 um, lo que permite ver la mayoría de las bacterias pero no los virus. Aunque la mayoría de las bacterias y los microorganismos de mayor tamaño se pueden ver mediante microscopia de campo claro, los índices de refracción de los microorganismos y el fondo son similares. Por tanto, los microorganismos se deben teñir con un colorante para poder observarlos, o se debe utilizar un método microscópico alternativa
MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO:
En los microscopios de campo oscuro se utilizan las mismas lentes del objetivo y del ocular que en los microscopios de campo claro; sin embargo, se utiliza un condensador especial que impide que la luz transmitida ilumine directamente la muestra. Solo la luz oblicua y dispersa llega a la muestra y atraviesa los sistemas de las lentes, lo que hace que la muestra esté muy iluminada sobre el fondo negro. La ventaja de este método es que la capacidad de resolución de la microscopia de campo oscuro es significativamente mayor que la de la microscopia de campo claro (es decir, 0,02 um en comparación con 0,2 um), lo que posibilita la detección de bacterias muy delgadas, como treponema pallidum (microorganismo causal de la sífilis) y el género leptospira (leptospirosis). La desventaja de este método es que la luz pasa alrededor de los microorganismos y no la atraviesa, lo que dificulta el estudio de su estructura interna.
La microscopia de contraste de fases permite examinar los detalles internos de los microorganismos. En esta forma de microscopia, como se hacen pasar haces de luz paralelos a través de objetos de densidades diferentes, la longitud de onda de un haz se “desfasa” en relación con el otro haz de luz (es decir, el haz que atraviesa el material más denso se retrasa más que el otro). Mediante el uso de anillos anulares en el condensador y en las lentes del objetivo se amplifican las diferencias de fases, de modo que la luz en fase parece más brillante que la luz fuera de fase. Esto crea una imagen tridimensional del microorganismo o de la muestra y permite un análisis más detallado de las estructuras internas.
MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA O DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA:
Algunos compuestos, denominados fluorocromos, pueden absorber la luz ultravioleta o ultraazul de la longitud de onda corta y emitir energía con una longitud de onda visible y mayor. Aunque algunos microorganismos tienen fluorescencia natural (autofluorescencia), la microscopia fluorescente habitualmente se supone la tinción de microorganismos con colorantes fluorescentes, y después de su estudio con un microscopio fluorescente de diseño especial. El microscopio utiliza una lámpara de vapor de mercurio, de un halógeno o de xenón a presión elevada que emite una longitud de onda de luz más corta que la que emiten los microscopio de campo claro tradicionales, se utiliza una serie de filtros para bloquear el calor que genera la lámpara, eliminar la luz infrarroja y seleccionar la longitud de onda adecuada para excitar el fluorocromo. Posteriormente la luz que emite el fluorocromo se amplifica con las lentes del objetivo y del ocular tradicionales. Los microorganismos y las muestras teñidas con fluorocromos aparecen brillantes sobre un fondo oscuro, aunque los colores varían dependiendo del fluorocromo seleccionado. El contraste entre el microorganismo y el fondo es suficientemente grande para que se pueda realizar una búsqueda rápida del microorganismo con bajo aumento y después el material se explora con mayor aumento una vez que se ha detectado con fluorescencia.
Al contrario de otros formas de microscopio, en los microscopios electrónicos se utilizan bobinas magnéticas (y no lentes) para dirigir un haz de electrones desde un filamento de tungsteno a través de una muestra y hacia una pantalla. Dado que la longitud de onda en este caso es mucho más corta que la de la luz, la resolución y la ampliación mejoran drásticamente. Con microscopio electrónico se pueden ver partículas víricas individuales (en contra posición con los cuerpos de inclusión víricos). Las muestras habitualmente se tiñen o se cubren con iones metálicos para crear contraste.
Hay 2 tipos de microscopios electrónicos:
Microscopios electrónicos de transmisión, en los cuales los electrones, igual que la luz en los microscopios ópticos, atraviesan directamente la muestra.
Se requieren técnicas de precipitado de metales pesados en lugar de colorantes hidrosolubles.
Microscopios electrónicos de barrido, en los que los electrones rebotan en la superficie de la muestra con un determinado ángulo y se generan una imagen tridimensional.
A diferencia de la microscopia de transmisión, se usa para observar la superficie de un espécimen sólido. Por lo general el objeto que se observa se prepara en una forma especial que permite depositar en la superficie del espécimen una capa muy delgada de un metal pesado, como oro o paladio.
2.1.2 MÉTODOS DE ESTUDIO EN EL DIAGNOSTICO MICROBIOLICO.
Existen 2 tipos de estudio: Método Directo( in vivo) y Método Indirecto (in vitro)
específico que está causando el daño o la patología. A.I Tradicionales.
- Observación microscópica.
A.II Moleculares.
- Hibridizacion
- P.C.R.
A.III Detección de antígenos:
- Inmunofluorescencia directo
- Elisa directo
B. Métodos indirectos:
- Inmunofluorescencia Indirecto
- Elisa Indirecto
A) Observación Microscopica:
Podemos distinguir dos tipos diferentes de muestras biológicas:
A) Preparaciones en fresco o in vivo.
Las preparaciones al fresco son muy fáciles de preparar; se prepara una disolución acuosa donde se introduce el microorganismo, se pone una gota en un porta, se tapa con un cubre y se observa. Se emplean para observar la morfología de bacterias, especialmente de espiroquetas. Sirve también para observar la movilidad de las bacterias y para observar
cambios citológicos; mitosis, esporulación, etc. También sirve para observar inclusiones (grasas, etc.)
- Suero fisiológico: demostrar la presencia de Tricomonas y Treponemas.
- Solución de KOH (10%): Permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.
- Tinta china: El frotis se hace con la nigrosina; no hay que fijarla (por eso no se considera a la tinta china como tinción). Nos sirve para observar la cápsula de bacterias, indicadora de virulencia. Esta técnica se utiliza principalmente para identificación del Cryotococcus Neoformans.
B) Preparaciones fijadas y teñidas
Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.
Las preparaciones fijadas y teñidas son las más utilizadas en Microbiología por dos razones:
- La tinción facilita la visualización de la bacteria
- Con varios colorantes clasificamos la bacteria en distintos grupos.
Estas tinciones utilizan los colorantes
diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea. En algunas técnicas de coloración, las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de
La mayor desventaja es que la bacteria ya está muerta
Gram y la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para obtener información acerca de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas
Otras tinciones como Las tinciones de hematoxilina férrica y tricromica son sumamente útiles para la identificación de parásitos protozoarios, y La tinción de Wright-Giemsa se utiliza para identificar parásitos sanguíneos
LA TINCIÓN GRAM
Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias).
se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram, La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas
de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglucano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram.
Las Bacterias Gram-Negativas son aquellas que presentan dos membranas lipídicas y entre ellas se localiza un fina pared celular compuesta fundamentalmente por peptidoglucano ( al ser fina esta pared, no se tiñe de violeta o azul en la tinción ).Estas bacterias se tiñen de Rosa.
Bacterias Escherichia coli (Gram negativas)
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano.
2) La decoloración debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tinción las células
grampositivas. EI proceso de decoloración debe ser corto y es esencial un cálculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
El carácter de grampositivo no es siempre un fenómeno del todo o nada. Algunos organismos son
más grampositivos que otros y algunos son gram-variables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos.
Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-
negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-
positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativa; el contenido graso es mucho más
elevado en las gram-negativa que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram.
Tinción Hematoxilina Férrica
Se utiliza para la detección e identificación de protozoos fecales. Los huevos y las larvas de helmintos retienen demasiado colorante, por lo que se identifican con mas facilidad en preparaciones en fresco.
Tinción Tricròmica
Alternativa a la hematoxilina férrica para teñir protozoos. Esta tinción se usa para la visualización de protozoos, permite examinar la morfología y las estructuras internas, lo que facilita su identificación.
La tinción de Giemsa (pr. guímsa), ideada por el alemán Gustav Giemsa, es un método habitual para el examen de frotis sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas dentro de las células huéspedes. La coloración de Giemsa se emplea también para teñir frotis de sangre en el examen para protozoos.
Esto permite distinguir perfectamente en microscopio óptico el núcleo celular, los cromosomas durante la mitosis, y en algunos casos, incluso el ADN mitocondrial (kinetoplasto de algunos protozoos, como Trypanosoma).
B. TINCIÓN ACIDORRESISTENTE
Se utilizan al menos tres tinciones, cada una de las cuales aprovecha el hecho de que algunos
microorganismos conservan una tinción principal incluso después de exponerlos a agentes decolorantes potentes.
Tinción De Ziehl-Neelsen (Baar)
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.
Tinción Rodamina-Auramina
Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.
Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica
Tinción De Kinyoun
Tinción acidorresistente en frio, tiene los mismos principios que la tinción de ZIEHL-NEELSEN.
Tinción Naranja De Acridina
El uso de naranja de acridina para detectar la presencia de bacterias en los hemocultivos ha sido ampliamente aceptado. De hecho, una gran cantidad de estudios han demostrado que la tinción de
hemocultivos con naranja de acridina es tan sensible como el subcultivo ciego para la detección inicial de hemocultivos positivos.
Tinción De Blanco De Calcoflúor
Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones. Los organismos fluorescentes con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice.
2.1.3 CULTIVO IN VITRO
Se utilizan medios de cultivo para la recuperación de los microorganismos a partir del hábitat natural donde se encuentran y hacer que proliferen en medios artificiales que les proporcionan sus requerimientos nutricionales, las cuales permiten el su crecimiento en el laboratorio, in vitro.
La base de la microbiología se creó en 1676 cuando Anton van Leeuwenhoek observo bacterias en
el agua utilizando uno de los primeros microscopios. No fue hasta casi 200 años después cuando
Pasteur consiguió cultivar bacterias en laboratorio en un medio de cultivo compuesto de extractos de levaduras, azúcar y sales de amoniaco. En 1881 Hesse utilizo agar que consiguió en la cocina de su mujer para solidificar este medio, lo que permitió cultivar colonias macroscópicas de bacterias. A lo largo de los años los microbiólogos y los cocineros han vuelto a la cocina para crear cientos de medios de cultivo que actualmente se emplean en los laboratorios de microbiología clínica.
El éxito de los métodos de cultivo depende de la biología del microorganismo, del lugar de la infección, de la respuesta inmunitaria del paciente frente a la misma y de la calidad del medio de cultivo. La bacteria Legionella es un patógeno respiratorio importante; sin embargo, nunca se consiguió cultivar hasta que se reconoció que su recuperación dependía de disponer de un medio enriquecido con hierro y L-cisteína. Campylobacter, un importante patógeno entérico, no se consiguió recuperar de las muestras de heces hasta que se incubaron medios altamente selectivos
a 42 °C en una atmosfera microaerófila. Chlamydia, una importante bacteria responsable de
enfermedades de transmisión sexual, es un patógeno intracelular obligado que debe ser cultivado en células vivas. Staphylococcus aureus, que es la causa del síndrome del shock toxico
estafilocócico, produce la enfermedad mediante la liberación de una toxina hacia el sistema circulatorio.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro grupos generales:
 medios enriquecidos no selectivos
 medios selectivos
 medios diferenciales
 medios especializados
Medios de cultivo no selectivos enriquecidos
Estos medios están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de los gérmenes que no necesitan unas condiciones exigentes. Algunos de los más empleados son:
a) Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis (α, ß o gamma). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar dos componentes el agar nutritivo, enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticasa de soja, y el agregado de 5 % de sangre (ovina, caballo, conejo, también puede usarse sangre humana) para cultivos en una placa de Agar. El agar sangre aporta muchos factores de enriquecimiento. Se usa también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos (que es un factor de virulencia).
b) Agar chocolate: es un medio de cultivo enriquecido y no selectivo. Es un agar modificado. Cuando se añade sangre
o hemoglobina al medio de base calentado, se vuelve marrón de ahí viene su nombre. Contiene glóbulos rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 °C. Este medio permite el crecimiento de la mayor parte de las bacterias, incluidas algunas que no crecen en el agar sangre (es decir, Haemophilus, algunas cepas de Neisseria patógenas).Estas bacterias necesitan factores de crecimiento, como el NAD y hematina, componentes que podemos encontrar dentro de los glóbulos rojos; por lo tanto, un prerrequisito lógico para el crecimiento es la lisis de los glóbulos rojos. El agar se llama así debido a su parecido con el chocolate, pero no contiene nada de este.
c) Agar Mueller-Hinton: es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aeróbicos por el método de Bauer-Kirby. Utilizando un solo disco impregnado con una alta concentración de un antimicrobiano. Este medio es el seleccionado para realizar las pruebas de susceptibilidad por su alta reproducibilidad, su bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que presentan la mayoría de los patógenos. Su composición está bien definida e incluyen extractos de ternera y caseína, sales, cationes divalentes y almidón.
d) Caldo tioglicolato: Fue descripto originalmente por Brewer. Favorece el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, incluidos los nutricionalmente exigentes. Las sustancias reductoras como tioglicolato de sodio, el sulfito de sodio y cisteína disminuyen el potencial de óxido reducción y proporcionan una
de estos compuestos, se neutralizan los efectos bacteriostáticos de los derivados mercuriales, arsenicales y de otros metales pesados que pudieran estar presentes en la muestra en estudio. El bajo contenido de agar le otorga la propiedad de ser un medio fluido y retarda la dispersión de CO2 y O2. Debido a todas estas características desarrollan microorganismos aerobios, anaerobios facultativos y estrictos.
e) Agar dextrosa de Sabouraud: Se trata de un medio de cultivo enriquecido que contiene caseína y tejido animal digeridos suplementados con glucosa; es utilizado para cultivo de mohos y levaduras patógenas y no patógenas. El bajo pH del medio resulta favorable para el crecimiento de los hongos y ligeramente inhibitorio para las bacterias.
anaerobiosis suficiente y debido a los grupos -
Medios de cultivos selectivos y diferenciales
 Los medios de cultivo selectivos se diseñan para poder recuperar gérmenes específicos
que pueden estar presentes en una mezcla de otros gérmenes (p. ej., un patógeno entérico en las heces).
 Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los gérmenes no deseados.
 Estos medios se hacen diferenciales añadiendo ingredientes específicos que permiten la identificación del germen en una mezcla (p. ej., añadiendo lactosa y un indicador de pH para identificar los gérmenes que fermentan la lactosa).
Ejemplos de medios de cultivos selectivos y diferenciales:
Agar MacConkey: es un medio de cultivo específico para bacterias gramnegativas y diferencial cepas que fermenten la lactosa. Sirve como un indicador visual de pH,
distinguiendo así las bacterias gramnegativas que pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-). Al utilizar la lactosa en el medio, bacterias Lac+ como Escherichia coli, enterobacter y Klebsiella producen acidez, lo cual baja el pH bajo 6,8 lo que tiene como consecuencia la aparición de colonias de color rosadas o rojas. Algunas bacterias en cambio fermentan la lactosa de manera lenta, estas siguen siendo Lac+ por ejemplo: Serratia y Citrobacter. Bacterias que no fermenten la lactosa como Salmonella, Proteus y Shigella utilizaran peptona en su lugar, formando amoniaco, lo cual incrementa el pH del agar, formando colonias blancas o incoloras.
b) Agar sal Manitol: es un medio de cultivo selectivo que se utiliza en el aislamiento de estafilococos. Permite el crecimiento de bacterias Grampositivas mientras inhibe el crecimiento de Gram negativas. Este medio es importante en el laboratorio clínico debido a que es capaz de distinguir los microorganismos patogénicos en un corto periodo de tiempo. Contiene una alta concentración de sal (NaCl), haciéndolo selectivo para Staphylococcus debido su alta concentración de NaCl es inhibitorio para la mayoría de las bacterias Gram negativas. Además contiene manitol otro inhibidor de bacterias Gramnegativas y un indicador de pH indicador de fermentación; rojo de fenol. Coagulasa-positivo Staphylococcus producen colonias amarillas con zonas amarillas, mientras que coagulasa-negativo Staphylococcus producen colonias rojas o ligeramente rosadas sin cambio alguno al medio. Si un organismo es capaz de fermentar el manitol, un subproducto ácido es creado que hace que el rojo de fenol cambie a amarillo. Se usa para el aislamiento selectivo de colonias de Staphylococcus sospechosas de ser patógenas.
c) Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD): es un medio selectivo diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de patógenos entéricos Gramnegativos, especialmente del género Shigella. La degradación de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa, lactosa y sacarosa) genera la producción de ácido haciendo virar el indicador (rojo fenol) de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es prácticamente fermentada por todas las enterobacterias con excepción de los microorganismos pertenecientes al género Shigella. La salmonella fermenta la xilosa, pero también descarboxila la lisisna y genera el producto alcalino diamino cadaverina. Este producto neutraliza los productos de fermentación de los ácidos, de manera que las colonias serán rojo.
d) Medio de Lowenstein-Jensen (L J): Originalmente la fórmula de Lowenstein de 1931 contenía los indicadores rojo congo y verde de malaquita. En 1932 Jensen modificó el medio eliminando el rojo congo e incrementando la concentración de verde de malaquita.
Este medio se utiliza para aislar micobacterias, contiene glicerol, harina de patatas, sales y huevos coagulados. Se añade verde malaquita para inhibir las bacterias grampositivas
e) Agar Middlebrook: Este medio de cultivo de agar se emplea también para aislar micobacterias. Contiene nutrientes necesarios para el crecimiento de las micobacterias y verde malaquita para la inhibición de bacterias grampositivas. A diferencia del medio L J se solidifica con agar
f) CHROMagar: Es un medio selectivo y de diferenciación para el aislamiento de hongos. Es usado para aislar e identificar algunas especies distintas de la levadura Candida.
Con la inclusión de sustratos cromógenos en el medio, las colonias de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei producen colores diferentes, lo que permite la detección directa de estas especies de levaduras en la placa de aislamiento.
 Las colonias de C. albicans presentan un color de verde claro a mediano
 Las colonias de C. tropicalis, moradas (de azul verdoso a azul metálico)
 Las colonias de C. krusei, rosado claro con borde blancuzco.
Es posible que otras especies de levaduras produzcan su color natural (crema) o presenten un color rosado o malva de claro a oscuro (por ejemplo, Candida [Torulopsis] glabrata y otras especies). Una ventaja adicional del medio es la fácil detección de cultivos mixtos de levaduras, debido a los diferentes colores que presentan sus colonias. Peptonas especialmente seleccionadas suministran los nutrientes en CHROMagar. La mezcla cromógena está formada por sustratos artificiales (cromógenos), que liberan compuestos de colores diferentes al ser degradados por enzimas específicas. De esta manera es posible diferenciar determinadas especies o detectar ciertos grupos de organismos con sólo un mínimo de pruebas de confirmación. El cloranfenicol inhibe la mayoría de los
contaminantes bacterianos.
g) Agar de levaduras inhibidor: Este medio de cultivo es un compuesto selectivo enriquecido que se emplea para aislamiento de hongos patógenos distintos de los dermatofitos. Se añade cloranfenicol para suprimir el crecimiento de las bacterias contaminantes.
Se han creado muchos medios de cultivo especializados distintos para detectar gérmenes específicos, que pueden ser exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros.
 Algunas bacterias y todos los virus son gérmenes intracelulares estrictos, de forma que solo se pueden cultivar en células vivas.
 En 1949 John franklin Enders describió una técnica para cultivar células de mamífero y aislar el virus de la poliomielitis. Esta técnica se ha ampliado para poder cultivar la mayor parte de los gérmenes intracelulares estrictos.
 Los cultivos celulares pueden ser células que crecen y se dividen sobre una superficie (es decir, una monocapa de células) o células suspendidas en un medio de cultivo. Algunos cultivos celulares están bien establecidos y se pueden mantener de forma indefinida. Estos medios se comercializan en general.
 Otros cultivos celulares se deben preparar inmediatamente antes de infectarlos con bacterias o virus y no se pueden mantener en el laboratorio más de unos pocos ciclos de división (cultivos celulares primarios). La entrada a las células se suele regular por la existencia de receptores específicos, de forma que se puede emplear la capacidad diferencial de infectar líneas celulares específicas para predecir la identidad de una bacteria o virus.
2.2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
El ADN y el ARN o las proteínas de un agente infeccioso de una muestra clínica se puede utilizar para ayudar a identificarlo Las ventajas de las técnicas moleculares radican en su sensibilidad, su especificidad y su seguridad. Desde el punto de vista de seguridad, estas técnicas no requieren aislamiento del agente infeccioso y se pueden llevar a cabo en muestras o extractos fijados químicamente. Debido a su sensibilidad, permite detectar muestras diluidas de ADN microbiano en un tejido, aunque el agente no se esté replicando ni produciendo otros indicios de infección.
2.2.1 DETECCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO MICROBIANO
ELECTROFORETICO DEL ADN Y POLIMORFISMO DE LONGUITUD DE
FRAGMENTOS DE RESTRICCION
a) enzimas de restricción
Son endonucleasas capaces de reconocer secuencias específicas de bases en el DNA bicatenario y cortarlo en ese punto. Su papel biológico consiste en la degradación de cualquier DNA extraño. El DNA propio no es escindido gracias a un sistema de protección conocido como modificación mediante el cual las bases nitrogenadas están metiladas en los puntos susceptibles de ser cortados por la enzima.
Existen casos en los que no se conoce la secuencia del gen implicado en una enfermedad genética y, por lo tanto, no se dispone de una sonda específica.
Mediante el estudio de un árbol familiar se puede relacionar la presencia de una determinada enfermedad con la presencia de un polimorfismo concreto.
Los polimorfismos, variaciones al azar en la secuencia del DNA, pueden producir variaciones de los sitios de corte para una enzima de restricción, dando lugar a fragmentos de restricción de distinta longitud a los obtenidos en otro sujeto.
Estos polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (PLRF) se heredan según las leyes de Mendel.
Si el polimorfismo se encuentra en el mismo cromosoma que el gen en cuestión, se dice que están ligados y la distancia entre ellos se mide por la frecuencia con la que ocurre recombinación durante la meiosis gamética.
Cuanto menor sea esta distancia, mayor será la probabilidad de que ambos rasgos (enfermedad y polimorfismo) se transmitan unidos a la descendencia.
Si ambos genes se encuentran muy separados en el mismo cromosoma se heredan como si se
encontraran en cromosomas distintos, debido a la alta probabilidad de que se produzcan
entrecruzamientos entre dos distantes.
c) analisis electroforético
La estructura del genoma y la secuencia genética constituyen dos características fundamentales para la distinción de la familia tipo y la cepa del microorganismo. Se pueden distinguir cepas específicas de los microorganismos a partir de su ADN o ARN,
o por los fragmentos de ADN obtenidos
cuando esta molécula es atacada por endonucleasas de restricción específica (enzimas de restricción). Las enzimas reconocen secuencias concretas de ADN
que tiene una estructura polindrómica.
Las regiones de ADN reconocidas por las distintas endonucleasas de restricción difieren en su secuencia, longitud y frecuencia de aparición. Como resultado de ello, las diferentes endonucleasas inciden del ADN de una muestra en diferentes sitios y dan lugar fragmentos de diferentes longitudes. La escisión de diferentes muestras de ADN con una endonucleasa de restricción también puede generar fragmentos de longitudes diferentes. La diferencia en la longitud de fragmentos de ADN entre las diferentes cepas de un microorganismo específico producido por las endonucleasa de restricción
se denomina polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PLFR).
B.- DETECCION, AMPLIFICACION Y SECUENCIIADO DE ACIDOS NUCLEICOS
a) sondas génicas
Una sonda es
de ADN (o
raramente ARN)
1000 bases)
de pequeño tamaño (normalmente
en biología molecular como herramienta para detectar la
presencia de ADN o ARN de secuencia complementaria parecida o igual. En su uso, la sonda se une a la secuencia diana monocatenaria (ADN/ARN) mediante un mecanismo de hibridación que forma una estructura bicatenaria, una de las hebras pertenece a la sonda, y la otra a la secuencia diana. Esta unión se establece porque tanto la sonda como la diana tienen secuencias en parte o totalmente complementarias, formándose pares de bases complementarias
Bioquímicamente una sonda es una molécula de ADN o ARN homologa a una secuencia de ARN o ADN diana, con la que híbrida de forma estable y especifica (por asociación de bases complementarias). La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN
o ADN y se unirá exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama
especificidad de la sonda. Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La detección solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo
detectable. Dependiendo del número de estos grupos incorporados y de la señal que emitan la sonda puede tener diferente sensibilidad.
b) Tipos de sondas
Distintos tipos de sondas de ácidos nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridación in situ:
Sondas de DNA de doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando técnicas como “nick translation, random priming o PCR”, en las cuales el nucleótido marcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buena actividad específica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estas son menos sensibles debido a que la concentración de la sonda marcada es reducida.
Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas utilizando “primer extensión” en templados de cadena simple o por PCR con un nucleótido marcado. Éste último es el más usado porque es más fácil de llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material.
El PCR permite una gran flexibilidad en la elección de las secuencias marcadas por el uso de primeras. Estas marcas han sido ampliamente usadas.
oligonucleótidos modificados durante la síntesis química o adicionando una cola
marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucleótidos marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.
5. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la sonda es clonada en un vector que flanqueará dos sitios distintos de iniciación.
6. La cadena de RNA anti sentido (sonda) es sintetizada en dirección opuesta al gen endógeno. Se recomienda linealizar la sonda de RNA con enzimas que dejen el extremo 5’ cohesivo, porque se ha reportado, que el extremo 3’ romo promueve la síntesis de transcritos anormales.
c) Preparación de la sonda
Para sondas de cadena sencilla, se debe usar la secuencia reversa complementaria. Cuando las sondas son sintetizadas por transcripción, involucra generar mRNA del gen endógeno. Cuando se diseñan los oligos marcados, es importante recordar que la secuencia antisentido es la hebra complementaria reversa de la cadena líder y debe ser leída de 5’ a 3’.
En general es preferible usar sondas específicas, ya que esto garantiza una buena hibridación. Existen situaciones en las cuales esto no puede llevarse a cabo, por ejemplo, si los genes todavía no están clonados de las especies usadas para la hibridación o si la secuencia génica es muy similar entre especies.
d) Elección de la sonda:
Las sondas largas de cadena simple (RNA o DNA) proporcionan una alta sensibilidad en la detección de cadena sencilla. Los oligonucleótidos son muy sensibles y la señal puede ser incrementada por el uso de un cocktail de sondas que flanquearán en regiones distintas.
e) Tamaño de la sonda:
Las sondas largas pueden emitir una señal más fuerte debido a que incorporan mayor número de nucleótidos marcados dentro de ella. Sin embargo, las sondas que son tan largas dan señales débiles, debido a que la sonda penetra menos eficientemente en el tejido. La mejor estrategia es usar una secuencia larga como templado para la síntesis de la sonda pero asegurar que la sonda generada es lo suficientemente pequeña para poder penetrar. Muchos
procedimientos están basados en que la sonda de 50-150 bases porque emiten señales óptimas para la hibridación en secciones de ciertos tejidos. Se ha encontrado que las sondas de RNA que miden por arriba de 1 kb proveen señales óptimas para la hibridación in situ, en embriones fijados en para formaldheído. La penetración está influenciada por el tamaño de la sonda aunque también depende de la naturaleza del tejido, de la forma de fijación y si el pre tratamiento ha sido realizado para remover las proteínas celulares.
2.2.2 TECNICAS MOLECULARES
Son Procedimientos basados en la caracterización física de moléculas de acidos nucleicos.
Permiten llegar al diagnóstico rápido de las enfermedades infecciosas en aquellos casos
donde el dispositivo convencional no pueda ser utilizado
2.2.3DETECCIÓN DE PROTEÍNAS
En algunos casos lo virus y otros agentes infecciosos se pueden detectar a través de
hallazgos de ciertas enzimas características o proteínas específicas. Por ejemplo, la detección de
una actividad enzimática de transcriptasa inversa en suero y cultivo celular indica la presencia de
un retrovirus. El patrón proteico de un virus u otros agentes formados tras la electroforesis con
dodecil sulfato sódico en gel poliacrilamida también se puede utilizar para identificar y distinguir
diferentes cepas víricas o bacterianas.
2.3. DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Las técnicas inmunológicas se utilizan para detectar, identificar y cuantificar antígenos en muestras clínicas, así como para evaluar la respuesta humoral frente a la infección y los antecedentes de exposición a agentes infecciosos de un individuo. En la mayoría de los casos se puede adaptar la misma técnica para evaluar el antígeno y el anticuerpo. Esta unión antígeno- anticuerpo se ha venido usando desde hace mucho tiempo y se han desarrollado métodos diferentes para evaluarlos y cuantificarlos.
2.3.1 ANTICUERPOS
Como ya se sabe (exposiciones anteriores) que un antígeno es la sustancia extraña ( exotoxinas y endotoxinas de bacterias, proteínas víricas,etc) que al entrar a nuestro cuerpo el sistema inmunológico lo reconocerá como una amenaza y desencadenara una respuesta inmunitaria y la consiguiente formación de anticuerpos.
Son proteínas circulantes que se producen en respuesta a una exposición a agentes extraños (antígenos). Son increíblemente diversos y específicos; son los mediadores de la inmunidad humoral contra toda clase de microbios. En un comienzo como se les descubrió que ofrecían protección contra la toxina diftérica se les llamo antitoxinas.
Los anticuerpos solo son sintetizados por células de la estirpe de los linfocitos B y existen en dos formas: los anticuerpos unidos a la membrana en la superficie de los linfocitos B actúan como receptores para el antígeno y los anticuerpos secretados neutralizan las toxinas, impiden la entrada y propagación de los microorganismos patógenos y eliminan los microbios. El reconocimiento del antígeno por los anticuerpos unidos a la membrana de los linfocitos B vírgenes activa a estos linfocitos e inicia una respuesta inmunitaria humoral. Los linfocitos B activados se diferencian en células plasmáticas que secretan anticuerpos de la misma especificidad que el receptor para el antígeno.
Entre las funciones efectoras mediadas por los anticuerpos están la neutralización de microbios o productos microbianos tóxicos; la activación del sistema del complemento; la opsonización de microorganismos patógenos para potenciar su fagocitosis; la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, por la que los anticuerpos hacen que el sistema inmunitario innato
provoque la Iisis de las células infectadas; y la activación del mastocito mediada por anticuerpos para expulsar a parásitos helmintos.
ANTICUERPOS POLICLONALES: Son preparaciones heterogéneas de anticuerpos que pueden reconocer numerosos epítopos en un único antígeno. Se pueden obtener del suero de pacientes convalecientes o se pueden preparar en animales.
individuales en un antígeno.
Ventajas de los anticuerpos monoclonales: Radican en la posibilidad de restringir su especificidad a un único epítopo antigénico y de la preparación en cultivos tisulares a escala industrial.
Desventaja de los anticuerpos monoclonales: Es que muchas veces son demasiado específicos, de manera que es posible que un anticuerpo monoclonal específico para un epítopo de un antígeno vírico de una cepa no sea capaz de detectar cepas diferentes de ese mismo virus.
MONOCLONALES:
2.3.2 MÉTODOS DE DETECCIÓN
Los complejos antígeno-anticuerpo se pueden detectar directamente por técnicas de precipitación o marcando el anticuerpo con una sonda radiactiva, fluorescente o enzimática, o indirectamente por la medición de una reacción dirigida por el anticuerpo, como la fijación del complemento.
2.3.3 INMUNOANÁLISIS PARA ANTÍGENOS ASOCIADOS A CÉLULAS
Se pueden distinguir los complejos antígeno-anticuerpo específicos y las reacciones cruzadas mediante técnicas de inmunoprecipitación. Dentro de un intervalo limitado de concentración tanto de antígenos como de anticuerpos, denominado zona de equivalencia, el anticuerpo reticula el antígeno para formar un complejo que es excesivamente grande para permanecer en solución y termina por precipitar. Esta técnica se basa en la naturaleza multivalente de las moléculas de anticuerpo.
Los complejos antígeno-anticuerpo son solubles a unas relaciones de concentración de antígeno con respecto a anticuerpo situadas por encima y por debajo de la concentración de equivalencia.
La inmunodifusión radial simple:
Se puede utilizar para detectar y cuantificar un antígeno. En esta técnica, el antígeno se coloca en un pocillo y se permite que difunda en un agar que contenga anticuerpo. Cuanto mayor sea la concentración del antígeno, más lejos difundirá hasta alcanzar la equivalencia con el anticuerpo en el agar y precipitará en forma de anillo alrededor del pocillo.
La inmunodifusión doble de Ouchterlony:
Se aplica para determinar las relaciones existentes entre diferentes antígenos. Esta técnica también se emplea para determinar si las muestras son idénticas, si comparten algún epítopo, pero no todos (identidad parcial), o bien si se trata de muestras diferentes. Se usa para detectar anticuerpos de antígenos micóticos.
Inmunoelectroforesis: Se coloca en antígeno en un posillo y se separa por electroforesis. Después se coloca anticuerpo en un surco y se forma líneas de precipitación a medida que el antígeno y el anticuerpo difunden el uno hacia el otro.
Contrainmunoelectroforesis: Esta técnica es similar al método de Ouchterlony, pero el movimiento del antígeno es facilitado por electroforesis. El antígeno y el anticuerpo se pueden colocar en pocillos separados y permitir que se desplacen electroforéticamente el uno hacia el otro.
Electroforesis en cohete: Los antígenos se separan por electroforesis en un gel de agar que contiene anticuerpos. La longitud del cohete indica la concentración del antígeno.
Los antígenos existentes en la superficie o en el interior de la célula se pueden detectar por inmunofluorescencia o enzimoinmunoanálisis.
INMUNOFLUORECENCIA DIRECTA: Una molécula fluorescente se une de forma covalente al anticuerpo.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Se utiliza un segundo anticuerpo fluorescente específico para el anticuerpo primario con el fin de detectar el anticuerpo antivírico primario y localizar el antígeno.
ENZIMOINMUNOANÁLISIS: En esta técnica, una enzima como la peroxidasa del rábano picante o la fosfatasa alcalina, se conjuga con el anticuerpo y convierte un sustrato en un cromóforo si hay unión con el antígeno.
CITÓMETRO DE FLUJO:
Se utiliza para analizar la inmunofluorescencia de células en suspensión y es especialmente útil para identificar y cuantificar linfocitos (inmunofenotipificación). La citometría de flujo emplea un láser para excitar el anticuerpo fluorescente unido a la célula y determinar el tamaño se esta por medio de determinaciones de la dispersión de luz.
SEPARADOR DE CELULAS ACTIVADAS DE FLUORESCENCIA: Es un citómetro de flujo que también puede aislar subpoblaciones específicas de células para su crecimiento en cultivo tisular basándose en su tamaño e inmunofluorescencia
El citómetro de flujo puede efectuar un análisis diferencial de los leucocitos y comparar poblaciones de linfocitos T CD4 y CD8 de manera simultánea.
La citometría de flujo también es útil para analizar el crecimiento celular con posterioridad al marcado fluorescente del ácido desoxirribonucleico y otras aplicaciones de la fluorescencia.
2.3.4 INMUNOANÁLISIS PARA ANTICUERPOS Y ANTÍGENOS SOLUBLES
 Enzimoinmunoanálisis por adsorción (ELISA)
Los enzimoinmunoanálisis (EIA) o ELISA (“Enzyme-Linked Iramuno Sorbent A ssay”), descritos hace 25 años, se basan en dos fenómenos biológicos importantes:
1. la elevada especificidad de los anticuerpos (Ac);
2. la alta actividad de algunas enzimas usadas en este tipo de ensayos, lo que permite la
amplificación de la señal generada por la muestra.
Independientemente de los esquemas experimentales empleados, los EIA comprenden dos etapas generales;
la reacción de un inmunorreactante con un antígeno (Ag) o anticuerpo (Ac);
inmunorreactante
La sencillez de los ELISA, sumada a la potencialidad de los anticuerpos monoclonales (AcMo), hace que día a día se vayan imponiendo sobre métodos tales como aquellos basados en la utilización de un trazador radiactivo (radioinmunoanálisis-RIA-), un trazador emisor de luz (quimioluminiscencia) o un trazador fluorescente (fluorografía). La gran ventaja del ELISA sobre los-otros métodos reside en que no requiere un equipamiento demasiado sofisticado para su implementación en el laboratorio. Además, los reactivos empleados son de una vida media muy alta (en el caso del RIA, un trazador radiactivo marcado con iodo tiene una vida media de 60 días, mientras que un conjugado enzimático usado en ELISA suele conservarse en buen estado durante años) y no se corre el riesgo de contaminación producida por el manipuleo de isótopos radiactivos.
Clasificación de los enzimoinmunoanálisis:
Los enzimoinmunoanálisis pueden clasificarse en:
a. EIA homogéneos;
b. EIA heterogéneos.
Los primeros se realizan exclusivamente en fase líquida, mientras que en los segundos se emplea un soporte sólido para inmovilizar a uno de los inmunorreactantes. Por cuestiones de sencillez y aplicabilidad general, sólo nos dedicaremos al estudio de los EIA heterogéneos. Los ElA heterogéneos pueden clasificarse en dos tipos:
1. enzimoinmunoanálisis de amplificación de actividad; y
2. enzimoinmunoanálisis de modulación de actividad.
o En los enzimoinmunoanálisis de amplificación de actividad o no competitivos, se em plea un gran exceso del inmunorreactante con el objeto de obtener una señal máxima debida a la presencia del compuesto a ser dosado. De acuerdo a la ley de acción de masas, un exceso de inmunorreactante permite detectar niveles muy bajos del analito que se quiere determinar. Estos ELISA se subdividen de acuerdo a la molécula inmovilizada en la fase sólida. La inmovilización del Ag para detectar Ac es un sistema que tiene una alta detectabilidad debido a que varias moléculas del conjugado enzimático, que en este caso son Ac anti-Ig marcados con la enzima, pueden unirse a cada molécula de Ac que reaccionó con el Ag inmovilizado. Este efecto se traduce en una gran amplificación de la señal. Mediante la utilización de métodos de “puenteo” inmunológico (con Ac anti-Ig) o no inmunológico (con el sistema avidina-biotína o proteína A) es posible aumentar aún más la detectabilidad. En general, estos sistemas se denominan ELISA de amplificación. Otro sistema de amplificación de actividad es el ELISA de captura, en el que se inmoviliza un Ac (“Ac de captura”), se captura Ag y se revela su presencia con un conjugado enzimático anti-Ag. Este sistema se emplea para la cuantificación de Ag o para la detección de Ac contra el Ag capturado. En general, es deseable que el conjugado enzimático y el Ac inmovilizado provengan de la misma especie para evitar interferencias en el sistema originadas por reacción cruzada del conjugado con el Ac de captura.
o En enzimoinmunoanálisis de modulación de actividad o competitivos se modula la actividad del conjugado enzimático por competición con el analito. Menores cantidades del conjugado enzimático permiten obtener una detectabilidad mayor, ya que pequeñas cantidades del competidor tienen un gran impacto sobre la actividad enzimática detectada en la fase sólida. Existen dos diseños generales de ensayos de modulación de actividad: en uno de ellos, el ligando marcado con enzima y el ligando sin marcar que se quiere dosarse- incuban simultáneamente en el sistema; en el otro diseño, el ligando no marcado a ser dosado se incuba en una primera etapa y en una segunda etapa se incuba con el ligando marcado enzimáticamente, el que reaccionará con los sitios no ocupados por el ligando que reaccionó en la primera etapa.
Independientemente de estos dos diseños generales, en ELISA de modulación de actividad se puede inmovilizar el Ag en la fase sólida y agregar el Ag marcado con la enzima. Una tercera variante es usar el sistema descrito en el párrafo anterior con la diferencia de que se emplea un Ac anti-Ag sin marca enzimática y en una etapa siguiente agregar un conjugado anti-Ig marcado con la enzima. Este ensayo es de modulación y amplificación de actividad y tiene la ventaja de que permite aumentar la detectabilidad del sistema.
En todos los ensayos inmunoenzimáticos en fase sólida, independiente de las numerosas estrategias existentes, se pueden distinguir 3 etapas:
1. inmovilización del inmunorreactante (Ac o Ag)
2. incubación con la muestra de modo que ésta
reaccione con el inmunorreactante inmovilizado:
3. amplificación o modulación por medio de la
utilización de un conjugado enzimático (esta etapa puede en realidad ser de más de un paso).
 Western blot es una variante del análisis ELISA. Esta técnica transfiere proteínas víricas separadas por electroforesis según su peso molecular o su carga a un papel de filtro (p. ej., nitrocelulosa, nailon). Cuando se exponen al suero del paciente, las proteínas inmovilizadas capturan los anticuerpos antivíricos específicos y se visualizan mediante anticuerpos antihumanos conjugados con enzimas. El Western blot se usa para confirmar los resultados del análisis de ELISA en sujetos con sospecha de infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
 Radioinmunoanálisis (RIA) se emplean anticuerpos o antígenos marcados con sondas radioactivas, para cuantificar complejos antígeno-anticuerpo. El radioinmunoanálisis se puede efectuar como una análisis de captura (como se describió para el análisis de ELISA), o también como un análisis de competencia, donde los anticuerpos presentes en el suero de un paciente se cuantifican es su función de su capacidad de competir con un anticuerpo marcado radioactivamente en el laboratorio y reemplazarlo en los complejos antígeno-anticuerpo. El desarrollo del radioinmunoensayo {radioimmunoassay,RIA) comienza en 1956 de forma un tanto desapercibida, con los trabajos de Yalow y Berson sobre el metabolismo de la insulina. Esos autores hallaron que la cantidad de insulina marcada con átomos de iodo radiactivo que se unía a una fracción de globulinas de individuos diabéticos (luego reconocida como anticuerpos), se relacionaba con la concentración de insulina fría existente. Tal observación constituyó la base de la detección de esa hormona plasmática y del posterior desarrollo de todos los métodos radioinmunológicos de saturación y desplazamiento. A partir de las primeras publicaciones en 1959 y 1960 que describieron explícitamente la determinación de insulina plasmática sin previa extracción, resultó ampliamente reconocido que el RIA era un método ventajoso. Entre sus cualidades se hallan la alta sensibilidad, su comparativa sencillez respecto de los métodos biológicos usados en endocrinología, y su versatiUdad para aplicarlo a muestras de pequeños volúmenes y en grandes series. Esas propiedades lo convierten en uno de los métodos analíticos de base inmunológica de mayor importancia, con proyecciones en medicina, veterinaria y en áreas no médicas interesadas en la detección de muy bajas concentraciones de compuestos orgánicos. Las variantes metodológicas acumuladas últimamente hacen que no exista un RIA en particular, sino un conjunto de procedimientos basados en un principio general. El fundamento es muy sencillo:
 Se mezcla una cantidad constante de antígeno marcado radioactivamente y una cantidad constante de un anticuerpo para ese antígeno
 Se produce la reacción entre antígeno (Ag) y anticuerpo (Ac)
 Se separa la fracción de antígeno que se ha unido de la que permanece libre (hay varias formas de hacerlo. En la figura inferior se utiliza un 2º anticuerpo dirigido contra el primero)
 Se determina la radioactividad
 Si la muestra contiene además antígeno frío (no marcado), éste competirá con el marcado para unirse al anticuerpo, y se observará un descenso en la medida de la radioactividad
 Este descenso es proporcional a la concentración de antígeno frío en la muestra.
 Fijación del complemento representa una prueba serológica estándar, aunque entraña diversas dificultades a nivel técnico. En esta prueba, la muestra de suero del paciente reacciona con el antígeno del laboratorio y el complemento adicional. Los complejos antígeno-anticuerpo se unen, activan y fijan el complemento (consumen). A continuación se analiza el complemento residual por medio de la lisis de eritrocitos recubiertos de anticuerpos.
En los análisis de inhibición de anticuerpos se aprovecha la especificidad de un anticuerpo para evitar una infección (neutralización) u otra actividad (inhibición de la hemaglutinación) para identificar la cepa del agente responsable de la infección, habitualmente un virus, o bien para cuantificar las respuestas de anticuerpos a una cepa específica de un virus.
 Aglutinación con látex es una prueba rápida y técnicamente simple para la detección de un anticuerpo o un antígeno soluble. Los anticuerpos específicos de un virus hacen que las partículas de látex recubiertas de antígenos víricos se agrupen. A la inversa, las partículas de látex recubiertas de anticuerpos se emplean para detectar antígenos víricos solubles. Cuando un anticuerpo es puesto en contacto con su antígeno específico, si éste se encuentra al estado particulado (hematíes, bacterias, células), las partículas se agruman y aglutinan. Los principios que regulan esta reacción son los mismos que para la precipitación. La ocurrencia de uno u otro fenómeno depende de si el antígeno es particulado (suspensión) o está en solución. En un comienzo se creyó que el hecho estaba regido por el anticuerpo al que se denominaba aglutinina. Hoy sabemos que un mismo anticuerpo puede dar aglutinación con una suspensión bacteriana y precipitación con un lisado obtenido a partir del mismo microorganismo. La aglutinación se lleva a cabo en medio salino. La concentración óptima de electrólitos es 0,15 M. Concentraciones mayores pueden neutralizar las cargas superficiales negativas que las bacterias y otros antígenos particulados poseen a pH neutro y provocar aglutinación espontánea no específica. Concentraciones de NaCl inferiores a 0,001 M son inefectivas. El mecanismo de la aglutinación ha sido explicado de diferentes maneras. Bordet y Eagle consideraron que inespecíficamente el electrólito era el responsable de la aglutinación, sobre la base del siguiente mecanismo: durante la reacción el antígeno se rodearía de una capa monomolecular de globulina anticuerpo; si en el medio no hay electrólitos, la ionización de la proteína sería suficiente como para mantener la dispersión, pero la presencia de electrólitos impediría esa ionización, y al disminuir las cargas por debajo de ciertos límites se originaría el fenómeno de aglutinación. Si la interpretación de Eagle fuera la correcta, los grumos microscópicos de la experiencia.
2.3.5 SEROLOGÍA
La serología de emplea con el fin de identificar el agente responsable de la infección, evaluar la evolución de una infección o determinar la naturaleza de la infección: infección primaria frente a reinfección, aguda frente a crónica.
 Infección primaria: primera infección que sufre un organismo por un agente patógeno.
 Reinfección: Segunda o posterior infección en un organismo ocasionada por un mismo tipo de agente patógeno.
 Infección aguda: es aquella que se presente bruscamente, y resuelve en el corto plazo.
 Infección crónica: es aquella que de presentación paulatina, y resuelve a largo plazo.
Los datos serológicos de una infección se obtienen a partir del tipo y el título de los anticuerpos y
la identidad de las dianas antigénicas.
2. Aparición algo más tardía de anticuerpo específico de clase IgG. La concentración de este anticuerpo va creciendo hasta alcanzar, en 3-6 semanas, una meseta que muy lentamente desciende. Su persistencia suele ser muy prolongada, mucho más allá de la curación del enfermo y en ocasiones es detectable durante toda la vida. Este hecho de mantenerse positiva después de la curación limita su interpretación cuando se detecta aisladamente. Estos dos datos relativos a la
respuesta inmune nos permiten un uso más apropiado para el diagnóstico. Efectivamente, la detección de IgM específica a unas concentraciones determinadas y dada la brevedad de su duración nos faculta para realizar un probable diagnóstico de la infección aguda. Por otra parte, la observación de un incremento en la concentración de IgG específica en dos muestras separadas en el tiempo - una en fase aguda y otra convaleciente (habitualmente dos semanas) - nos indica la presencia de un estímulo antigénico en ese momento, o lo que es lo mismo, la existencia de una infección aguda. Este incremento en la concentración de anticuerpos específicos cuando comparamos dos muestras de suero en un paciente recibe el nombre de seroconversión, y para buscarla, el estudio se realiza; con dos muestras de suero del mismo enfermo con objeto de comprobar el aumento de la concentración de anticuerpos.
Elección de una prueba serológica. Sensibilidad, especificidad
La incorporación de una técnica nueva a un laboratorio clínico debe de estar precedida de estudios de evaluación. Una prueba serológica se evalúa, fundamentalmente, por los parámetros de sensibilidad, especificidad y valor predictivo. Del conocimiento de estos tres valores intrínsecos de la misma se deducirá su aplicación o no en determinadas circunstancias y como deberá interpretarse su resultado ya sea positivo o negativo.
La medida de la sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que están en la situación que queremos diagnosticar. Cuantos más resultados positivos produzca en este grupo de enfermos más sensibilidad tendrá la prueba y menos resultados falsos negativos (FN) obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos positivos (VP) que son detectados en individuos con esa enfermedad y esa técnica. En serología es difícil tener pruebas con el 100% de sensibilidad y casi todas producen algún resultado negativo falso.
La especificidad se mide, por el contrario, realizando la prueba en colectivos de personas que no padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La especificidad por tanto se define como el porcentaje de verdaderos negativos que serán detectados en pacientes sanos con esa prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de resultados negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serológicas con especificidades casi del 100%. Estos dos parámetros son propiedades intrínsecas del test y no varían nunca con relación a la población estudiada.
Perfiles serológicos
En la práctica diaria el diagnóstico indirecto se ha decantado, en los últimos años, por el estudio de las muestras mediante perfiles serológicos. La lógica de estas agrupaciones, similar a lo que realiza en el diagnóstico directo, descansa en que generalmente el problema clínico requiere investigar varios patógenos como posibles agentes etiológicos, como responsables de la patología del paciente. Las alternativas son pues explorarlos uno a uno o simultáneamente. Obviamente la primera fórmula es más lenta y, probablemente, más económica. La segunda es lo contrario y probablemente más eficaz desde el punto de vista clínico. En ocasiones el perfil se divide en dos o tres niveles que se ejecutan progresivamente según los resultados obtenidos en el nivel anterior. Este método de perfiles no es nuevo, pero en la actualidad la disponibilidad comercial de muchos antígenos y la automatización ha impulsado su utilización y a nosotros nos parece un sistema bueno y eficaz para el diagnóstico dada la excelente relación entre coste, eficacia y tiempo de respuesta diagnóstica. Esta filosofía de trabajo supone una organización especial del laboratorio de tal suerte que la mayoría de las técnicas se realicen con una frecuencia mayor a la requerida si se buscan patógenos de manera independiente.
Utilización clínica de los perfiles serológicos
Dependiendo de la clase de anticuerpos que ponga en evidencia la técnica empleada (IgG, IgM o ambos) será necesario, como ya se citó en otra parte, el estudio de una o dos muestras de suero realizadas, en este último supuesto, simultáneamente. En el caso de detección de IgM una muestra extraída en la fase aguda será suficiente. En el supuesto de que midan IgG o ambas clases es mandatorio el estudio seriado
III. DIAGNOSTICO DE LABORATORIO PARA ENFERMEDADES BACTERIANAS
El propósito fundamental del diagnóstico microbiológico clínico es optimizar la asistencia que se presta al paciente. Para alcanzar este objetivo es esencial obtener y comunicar, lo antes posible, al médico responsable del mismo resultados útiles para su manejo y tratamiento, usando eficientemente los recursos disponibles. Conjugar estos objetivos, con el máximo rigor científico y una creciente demanda asistencial, es lo que se persigue en los Servicios de Microbiología Clínica.
El diagnóstico etiológico directo de las enfermedades infecciosas pretende demostrar la presencia del microorganismo causal en productos patológicos adecuados obtenidos del paciente e incluye, entre otros procedimientos, el cultivo, el cual persigue el aislamiento del microorganismo causante de la infección. Cuando es factible, el cultivo se considera el método diagnóstico de elección, porque permite la identificación del microorganismo implicado, el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos apropiados y facilita la aplicación de marcadores epidemiológicos. Una vez aislado el microorganismo de la muestra, se procede a su identificación, es decir, a clasificarlo dentro de un grupo o taxón ya establecido, con el que tenga la mayor semejanza. La complejidad de este proceso depende del nivel de precisión o discriminación que se pretende conseguir.
Aunque en los últimos años se ha asistido a un crecimiento importante en la oferta de métodos genotípicos aplicados al diagnóstico microbiológico, en la mayor parte de los procesos de identificación se siguen utilizando métodos fenotípicos, puesto que su realización, lectura y coste los hacen más asequibles. En este capítulo se revisan las técnicas de identificación de las bacterias patógenas. Los métodos clásicos para la tipificación de las bacterias se basan en sus características morfológicas y metabólicas. Las pruebas diagnósticas se seleccionan en una base empírica, con el fin de proporcionar información suficiente para hacer posible la discriminación entre los géneros y especies. Además, hoy en día, las técnicas de biología molecular (basadas en la caracterización de genes específicos o segmentos de ellos) son cada vez más comunes y utilizadas en Microbiología Clínica.
ESTRATEGIA EN LA ELECCIÓN DE LOS MÉTODOS
El laboratorio de microbiología deberá tener a disposición del clínico todas las pruebas ne- cesarios para el diagnóstico y la atención de los pacientes a servir. Pero no todas las pruebas pueden ser realizadas en el laboratorio, por lo tanto éste deberá decidir cuáles se realizarán allí, cuáles se enviarán a un laboratorio de referencia y cuál será ese laboratorio. Las necesidades de los pacientes dictarán el número y la variedad de métodos que el laboratorio ofrecerá. Basado en estudios numéricos históricos y predictivos de las pruebas solicitados, el laboratorio puede discontinuar pruebas poco usadas que resultan costosas y de baja calidad.
El cultivo y la identificación de los patógenos específicos a partir de los materiales recogidos de los
pacientes en los que se sospecha una infección es la mejor herramienta diagnóstica disponible, aunque no la más rápida. En algunas situaciones dicho estudio resulta difícil o incluso imposible, por ejemplo en rickettsiosis y en la sífilis.
En algunos casos puede ser necesaria la serología u otros métodos, ya sea porque no se conocen las condiciones necesarias para su cultivo in vitro o por los riesgos que implica la manipulación de estos microorganismos.
Hoy se dispone de técnicas para detectar y cuantificar muchos marcadores específicos de enfermedades infecciosas. Por un lado, se usan técnicas inmunológicas para cuantificar las inmunoglobulinas específicas o detección de antígenos en los tejidos; por otro, la introducción de la genética molecular en el laboratorio clínico, ha sido un gran avance al respecto.
Son aquellos que detectan: al microorganismo por microscopia, al microorganismo por cultivo, a los antígenos del microbio y los ácidos nucleicos (reacción en cadena de la polimerasa). Para la detección de antígenos se usan técnicas inmunológicas como la inmunofluorescencia (IF), el enzimoinmunoanálisis (EIA) y los test de aglutinación.
Métodos indirectos Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) que desarrolla el hués- ped. Se basan en la detección de anticuerpos específicos mediante técnicas inmunológicas (EIA, IF, western blot, etc.).
DIAGNÓSTICO MICROSCÓPICO DE LAS ENFERMEDADES INFECCIOSAS
El microscopio de luz es una de las herramientas más útiles en el diagnóstico bacteriológico. Aún hoy con el desarrollo de métodos más rápidos (muchos requieren instrumentos sofisticados o caros), la simple visualización microscópica de muestras clínicas es todavía la forma más rápida y específica de orientar el diagnóstico clínico. Basta recordar la utilidad del examen en fresco para la visualización de algunas bacterias, por ejemplo el examen en fresco con campo oscuro para Treponema y las muestras fijadas y teñidas con coloraciones simples o diferenciales, como la coloración de Gram o de Ziehl Neelsen. Existen distintos tipos de microscopios ópticos o de luz. El más usado en el laboratorio de bacteriología es el microscopio de campo claro (de luz transmitida), el resto (de campo oscuro, de contraste de fases, de luz ultravioleta) tienen uso más restringido. El microscopio de luz consta de dos sistemas de lentes convergentes: el objetivo (próximo al objeto de estudio) y el ocular (próximo al ojo del observador). Posee un objetivo de bajo aumento (10X), uno de mediano aumento (40X) y uno de alto aumento (100X o lente de inmersión). Este último es el más usado en bacteriología, porque al sumergir el lente en el aceite que recubre el preparado aumenta el poder de resolución a 0,2 micras, siendo posible observar la mayoría de los tipos bacterianos. El microscopio posee además una fuente de luz (incluida o externa al instrumento), un condensador móvil, un espejo que refleja la luz y un diafragma que permiten regular el paso de la luz concentrando los rayos luminosos sobre el objeto. Por último, tiene una platina para colocar la lámina de estudio y un mecanismo de ajuste para enfocar el sistema de lentes sobre el objeto. Dicho mecanismo consta de un macrométrico (de ajuste grosero) que coloca al objeto próximo al foco y un micrométrico (de enfoque fino) que permite el enfoque del objeto. La microscopia óptica es un método sencillo y rápido que muchas veces orienta al diag- nóstico etiológico. Nos informa la cantidad y morfología bacteriana, además de la presencia de determinados tipos celulares presentes en el preparado que validan o no la muestra para el análisis microbiológico; por ejemplo: las células epiteliales en muestra de secreciones respiratorias.
El examen microscópico puede realizarse en fresco u obteniendo un frotis fijado y colorea- do. El examen en fresco permite apreciar la existencia de bacterias y la presencia de movilidad de las mismas y características de esta. Esto último muchas veces orienta a la identificación de una cepa bacteriana o al diagnóstico etiológico. Algunas bacterias como las espiroquetas tienen un diámetro muy pequeño como para ser observadas en un microscopio de luz transmitida, por lo cual se usa el microscopio de campo oscuro que permite distinguir sus propiedades morfológicas y de movilidad. En este microscopio, la luz pasa a través de un condensador que proyecta luz transversalmente sobre la muestra, de modo que el haz de luz incide oblicuamente sobre la superficie del microorganismo siendo reflejado. Los rayos desviados son los que penetran en el objetivo y hacen que los cuerpos bacterianos se observen rodeados de un halo brillante.
La microscopia de fluorescencia tiene los mismos principios de óptica, las diferencias están relacionadas con la generación y transmisión de la luz útil para la excitación de colorantes fluorocromos o de fluorescencia natural de los microorganismos. Algunos producen luz después de absorber luz ultravioleta; otros lo hacen luego de haber tomado un fluorocromo, por ejemplo las bacterias ácido alcohol resistente. Por último, otros producen luz luego de la unión del antígeno a un anticuerpo conjugado previamente con un colorante fluorescente, este método es muy usado en virología y será expuesto con las técnicas Inmunológicas; también es muyusado en el diagnóstico de algunas enfermedades bacterianas, poe ejemplo Chlamydia spp. y virus sincicial respiratorio. La microscopia electrónica usa electrones en lugar de luz. Dicho método de estudio es útil por ejemplo para el diagnóstico de virus causantes de gastroenteritis. Con el microscopio electrónico se puede observar la morfología de los viriones presentes en las muestras clínicas. La limitación de este método, además del costo del microscopio, es que necesita una concen- tración elevada de viriones (aproximadamente 109 partículas virales por ml, dependiendo del virus) en la muestra, por lo tanto decimos que es poco sensible. Por esto es una técnica poco usada, más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de similar utilidad. El microscopio electrónico nos permite, por ejemplo, obtener resultados positivos rápidos de muestras de materia fecal de pacientes con diarrea. Rotavirus, Adenovirus, Coronavirus y Calcivirus pueden ser visualizados e identificados como causantes de esta enfermedad. Por ejemplo, Rotavirus posee una forma característica en doble rueda y un tamaño distintivo (70 nm de diámetro) y se los encuentra en concentraciones de hasta 10 11 partículas virales por gramo de heces. También en otras muestras, como líquido vesicular, biopsia de tejidos, verrugas, orina o suero es posible obtener resultados positivos mediante coloración negativa. Si la concentración de virus en la muestra clínica es baja y por tanto no son visibles directamente por el microscopio electrónico, se pueden usar técnicas que aumentan la visualización, por ejemplo la inmunoelectromicroscopia. Ésta consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales y la formación de agregados de partículas que son visibles con mayor facilidad que las partículas solas.
Objetivos Y ut ilidad de Las t écnicas de Ident ificación
La identificación de una bacteria sospechosa de ser la causa de una infección es uno de los instrumentos principales del diagnóstico y tratamiento de las enfermedades infecciosas. Diferenciar un microorganismo patógeno per se, potencialmente patógeno o contaminante, y deducir sus posibles mecanismos de resistencia, facilita el tratamiento de la enfermedad infecciosa con la mayor eficiencia posible. También permite realizar un seguimiento y control de las infecciones hospitalarias, detectar un posible brote infeccioso y establecer una política de antibióticos coherente y apropiada en concordancia con el centro hospitalario o el área asistencial, lo que traerá consigo una disminución de las infecciones nosocomiales y/o comunitarias, y una menor generación de resistencias en los microorganismos. Para poder ser clínicamente útil, la identificación de un microorganismo debe ser lo más rápida posible. La economía y la práctica dictan el uso de un número mínimo de pruebas diagnósticas. Por necesidad, la identificación en Microbiología Clínica representará siempre un compromiso entre la exactitud y precisión, por una parte, y la rapidez y la economía por otra. Cómo se logra este compromiso es lo que determina la calidad
diagnóstica en Microbiología.
La taxonomía bacteriana tiene como objetivo la construcción de sistemas que permitan clasificar a las bacterias. Dentro de la clasificación taxonómica, las categorías y definiciones más utilizadas son familia (un grupo de géneros relacionados entre sí), género (un grupo de especies relacionadas entre sí), especie (un grupo de cepas relacionadas entre sí), tipo (grupos de cepas interrelacionados dentro de las especies; por ejemplo, biotipo, serotipo) y cepa (aislamiento concreto de una especie en particular).
Uno de los factores clave para identificar a las bacterias como agentes patógenos depende de su aislamiento en cultivo puro. Una colonia en cultivo puro está compuesta por un solo tipo de microorganismo
y procede de una sola célula original. Las pruebas de identificación se deben hacer siempre con colonias
únicas procedentes de cultivos puros. La taxonomía bacteriana convencional permite la identificación de géneros y especies mediante la aplicación de diversos criterios, como los que se resumen a modo de ejemplo en la tabla.
Observación directa (Microscopia)
Métodos rápidos de identificación bacteriana
El término de “método rápido” en microbiología engloba una amplia variedad de procedimientos y técnicas que permiten obtener resultados en menos tiempo que las pruebas diagnósticas convencionales. Existen métodos rápidos aplicables a la microscopía, técnicas de identificación bioquímicas, pruebas de detección de antígenos y de anticuerpos. Incluso en las técnicas de diagnóstico molecular existe una gradación de celeridad, siendo algunas de estas pruebas tan “rápidas” como la PCR “a tiempo real”.
Los procedimientos microscópicos que utilizan tinciones estándar y/o anticuerpos fluorescentes para detectar microorganismos específicos se consideran métodos rápidos y se utilizan para la diferenciación inicial
o la identificación presuntiva de ciertos grupos de microorganismos. La identificación rápida de los cultivos clínicos también incluye equipos de identificación comerciales e instrumentos o sistemas robóticos e informáticos completamente automatizados. Los equipos comercializados son habitualmente sistemas de pruebas miniaturizadas que utilizan sustratos cromogénicos o fluorogénicos para estudiar las enzimas preformadas. Las reacciones buscadas pueden ser obtenidas en un tiempo de 2 a 6 horas de incubación, aunque algunas de ellas pudieran requerir una incubación ampliada hasta el día siguiente.
o bservación e inspección
de colonias:
disposición, tamaños, textura, formas, pigmentos,
tinciones: formas, agrupación,
baterías bioquímicas: uso
de sustratos
(oxidación/fermentación), producción de metabolitos
resistencia a antibióticos: antibiograma y antibiotipos, ribotipos, fagotipos, estudio de las concentraciones mínimas inhibitorias, estudio de
Las capacidades y prestaciones de estos equipos y sistemas son muy variables y suelen incorporar sistemas de lectura mecanizada y automatizada mediante espectrofotómetros, códigos numéricos y bases de datos computarizadas, realizando de forma secuencial la incubación,
lectura e interpretación de los resultados de las pruebas.
Tinciones rápidas
El examen de las muestras debe iniciarse con la inspección visual ordinaria y proceder al nivel de magnificación necesario para visualizar el patógeno o de- terminar la ausencia del mismo. En la mayoría de los Servicios de Microbiología se realiza un examen macroscópico de la muestra mediante la inspección visual en el momento de realizar la extensión sobre el portaobjetos, la preparación de los cultivos y, posteriormente, un examen microscópico mediante las tinciones elegidas (Tabla 2); por lo tanto, el microscopio es el instrumento más necesario para un microbiólogo, dado que permite la observación de microorganismos que no pueden ser apreciados con detalle a simple vista. Las muestras pueden prepararse de diferentes formas para hacer a los microorganismos más fácilmente visibles y mostrar sus características estruc- turales. Las suspensiones en fresco permiten valorar algunos elementos, como motilidad bacteriana, recuento de leucocitos, detección de parásitos o protozoos o visualización de estructuras fúngicas; por otra parte, las tinciones microbioló- gicas permiten observar a los microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener, o no, determinados colorantes (Tabla 3) Las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos, siendo las más usadas las tinciones diferenciales, que permiten distinguir a los microorganis- mos por alguna de sus características tintoriales peculiares:
• Tinción de Gram: es de gran importancia en Microbiología, ya que permite hacer diferenciaciones
taxonómicas, separando dos grandes grupos de bac- terias (gram-positivas, de color violeta azulado, y gram-
negativas, de color granate o rojo-rosado), según se comporten ante esta tinción.
• Tinción ácido-alcohol resistente: se basa en que ciertos microorganismos no pierden la coloración por
una mezcla de ácido y alcohol si han sido pre- viamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos ácido-alcohol resistente.
• Otras: hematoxilina férrica, tricrómica, May Grunwald-Giemsa, Wright-Giemsa.
Sistemas de observación de los microorganismos
Magnificación (x)
Examen visual ordinario
Lupa o gafa-lupa
precisa y detallada
– De campo claro
Células teñidas
– De campo oscuro
Células no fácilmente teñidas para
visua- lización en campo claro
– Contraste de fases
Células vivas y/o no teñidas
Preparaciones usando tinciones con fluo- rocromos, los cuales pueden teñir direc- tamente las células o pueden acoplarse a
Determina la ultraestructura de los
– De transmisión
orgá- nulos celulares
– De barrido
20-10.000
Determina las formas y estructuras
de la superficie celular
La tinción más utilizada en microbiología es, sin lugar a dudas, la tinción de Gram, que proporciona información sobre los siguientes aspectos:
• Taxonómico: permite la clasificación inicial de las bacterias usando crite- rios morfológicos (tamaño, forma, agrupación, carácter tintorial).
• Clínico: permite un diagnóstico presuntivo de bacteriuria significativa, también un diagnóstico
etiológico orientativo del líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente con sospecha de meningitis, etcétera.
• Control de calidad y validez de la muestra remitida para cultivo, como sucede con los esputos y otras muestras del tracto respiratorio.
• Guía para el procesamiento de la muestra: orienta sobre la elección de los medios de cultivo,
incubación, requerimientos nutricionales adicionales, etc. más
apropiados según los microorganismos observados en la tinción.
y atmósferas
t inciones y métodos microscópicos para la detección rápida de microorganismos en muestras y
materiales infectados
LBA, preparaciones de Tzanck, muestras
Permite visualizar bacterias, levaduras, parásitos e inclusiones
metacromáticos
Morfología general y seleccionada
corinebac-
Permite hacer diagnóstico presuntivo, sobre todo, en neumonía y meningitis bacteriana
Detección de leucocitos, reconocimiento de la morfología de bacterias comunes
Requiere experiencia para valoración adecuada; no incluye otros agentes in- fecciosos, pero puede diferenciar leva- duras
Tinciones de muestras Los microorganismos
Las micobacterias son bacilos rectos, cortos o largos y las nocardias, bacilos arboriformes y ramificados
(esputos,
LBA, LCR, orina,
etc.) muestran un color rojo granate,
ácido- contrastado
alcohol resistentes (AAR) y para azulado; permite
diferenciación de micobacterias
arásitos
Examen directo de lesiones con sospecha de sífilis primaria
Se ven espiroquetas móviles
Examen directo de la extensión
Los criptococos poseen una cápsula de polisacáridos que aparece como un halo sobre un
Tinción inversa, la cápsula no se
tiñe;
diferenciar leucocitos de levaduras
Examen directo de las extensiones
Visualiza elementos fúngicos
de piel, pelos
muestras y facilita la visualización
eficaz para diferenciar
Tinción de fluorocromo fijada a los núcleos de las bacterias, que muestran fluorescencia naranja sobre un fondo oscuro; fluorescen tanto bacterias viables
Requiere el uso de microscopio de fluo- rescencia
verdaderos mi- croorganismos de
artefactos, especialmen- te en hemocultivos
Examen directo de LCR, LBA y otros líquidos corporales para detectar estruc- turas fúngicas y algunos quistes parasi- tarios
Tinción fluorescente que se fija a la pared
blanquecina suave
celular de hongos y levaduras, pero no a bacterias o células inflamatorias; se prefiere a la tinta
y a preparaciones de KOH
Es útil para búsqueda de AAR en una variedad de muestras clínicas, especial- mente, las más contaminadas con flora normal
sedimentos de micobacterias
microorganismos AAR, por su rendimiento en el cribado de gran número de muestras Requiere el uso de microscopio de
• Puede indicar la conveniencia de aplicar otras técnicas de diagnóstico rápido (detección de antígenos o de anticuerpos, técnicas de biología molecular).
• Guía la calidad del proceso que exige concordancia entre los micro organismos que se
observan en la visión directa y los que se obtienen, recuperan o aíslan por cultivo.
• Puede proporcionar ayuda para orientar la asistencia, tanto en pautas terapéuticas empíricas de antimicrobianos, como en la adopción precoz de medidas preventivas y de control epidemiológico
El aspecto de las bacterias en el microscopio permite plantear las siguientes cuestiones
• ¿Qué características tintoriales presentan las imágenes o elementos vi- sualizados en las
preparaciones?: ¿se trata de bacterias gram-positivas o gram-negativas?, ¿son bacilos ácido-
alcohol resistentes (BAAR), o no, o sólo parcialmente?
• ¿Cuál es la morfología de las células bacterianas visualizadas?: bastones o bacilos, cocos,
cocobacilos, difteromorfos o corinebacteriformes, espirales o helicoidales, pleomórficas (forma variable),
• ¿Cuál es su disposición y estructura individual o integrada?, ¿aparecen las células en forma separada o configurando cadenas, parejas, tétradas, racimos, agrupamientos ordenados o desordenados, etc.? y…
• ¿De qué tamaño son las células?: ¿grandes, pequeñas, de dimensiones bac- terianas o de aspecto fúngico (levaduriforme o filamentoso micelial)?
Un cultivo celular es obtenido de explantes de órganos o de embriones de animales. Estas células obtenidas asépticamente se disocian por acción de una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspención de células libres así obtenidas, se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o de plástico, donde se adhieren y multiplican formando una capa fina de células que se llama monocapa celular. Ésta crece en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminación bacteriana agregando antibióticos adecuados al medio de cultivo. Los cultivos celulares en monocapa son los más usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc.). Los cultivos celulares se dividen en primarios, diploides y líneas celulares continuas. Los primeros se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces. Las líneas celulares diploides, crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y conservan, por lo menos en un 75%, el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. Las líneas celulares conti- nuas, permiten un número finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una línea continua, esta debe haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Estas líneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas: disponibilidad para todos los investigadores de stocks de células idénticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa en botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios. Libre de contamina- ción con agentes extraños. Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que
existe una relación específica entre el huésped y el virus, que está en relación con los datos clínicos y el tipo de muestra para inocular. Así por ejemplo la línea celular HEp- 2, son células heteroploides humanas derivadas del carcinoma laríngeo y se recomiendan para virus sincicial respiratorio y Adenovirus.
La MRC5, es una línea diploide fibroblástica de pulmón embrionario humano, que se usa para el aislamiento del Citomegalovirus, el virus sincicial respiratorio, herpesvirus , Echo virus, etc. La MDCK, es una línea celular diploide de riñón canino que se recomienda para el aislamiento del virus Influenza. Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37º C por un período de hasta 14 días en promedio, esperando la aparición del efecto citopático, la toxicidad o la degeneración celular. El cultivo se observa al microscopio a las 24, 48, 72 horas y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparación con cualquier cambio morfológico observado en los cultivos inoculados. El efecto citopático es la visualización de cambios morfológicos más o menos característicos en las células inoculadas producidas por la acción del virus en el cultivo celular. Así, por ejemplo, el virus sincicial respiratorio forma sincicios o células gigantes en HEp- 2.
Los Adenovirus, forman células redondeadas con forma de racimo en HEp-2, dejando áreas libres de células. Cuando los virus no producen efecto citopático, se puede recurrir a técnicas que ponen en evidencia la presencia de este en el cultivo. Las más usadas son: hemadsorción, hemaglu- tinación y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver figura 2). Hay virus que durante su multiplicación intracelular expresan en la membrana de la célula huésped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoproteínas capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de glóbulos rojos de diferentes especies animales. Por lo tanto, si se agregan glóbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede evidenciar la infección de esas células a través de la unión de los glóbulos rojos a la superficie celular. Dicho fenómeno se conoce como hemadsorción. En la hemaglutinación, las hemaglutininas pueden evidenciarse en el sobrenadante de los cultivos usando el mismo fundamento que para la hemadsorción
Gracias al cultivo microbiológico se obtiene información adicional que es muy valiosa para aislar e identificar a los microorganismos. Los medios de cultivo sólidos pueden clasificarse en:
1. “Medios no selectivos” (agar sangre y agar chocolate): posibilitan el cre- cimiento de muchas especies
diferentes de bacterias, pero no permiten el aislamiento de una sola especie bacteriana a partir de muestras propensas a la contaminación con un gran número de microorganismos comensales.
2. “Medios selectivos”: ayudan en el aislamiento de especies de importan- cia médica en presencia de
especies comensales, mediante la adición de sustancias inhibidoras, sistemas indicadores y tampones que ayudan a la detección diferencial (agar MacConkey, agar CLED, agar XLD, agar VCAT o VCN). Se utilizan para sembrar diferentes tipos de muestras contaminadas (intraabdominales, heces, orina o exudados genitourinarios).
Características macroscópicas de las colonias
Después de un examen visual del desarrollo en la superficie de las placas de agar, se deben apreciar las principales características de las colonias: tamaño (en general, las bacterias gram-positivas producen colonias algo más pequeñas que las gram-negativas), forma, grado de elevación, borde, color, superficie, densidad, consistencia y olor.
Reacciones en el medio de agar usadas para la identificación de bacterias
1. Tipo de hemólisis en el medio de agar sangre. La hemólisis es una reacción observada en el medio
circundante o subyacente a la colonia; sirve de ayuda para la identificación presuntiva, particularmente, de los
y debe valorarse frontalmente y por transiluminación.
• a-hemólisis: eliminación parcial de la sangre en torno a la colonia, ori- ginando una decoloración verduzca en el medio (ej.: S. pneumoniae, estreptococos del grupo viridans).
• b-hemólisis: eliminación completa de la sangre circundante o subyacente a las colonias por lisis completa de los hematíes (ej.: Streptococcus pyo- genes, Streptococcus agalactiae, Listeria monocytogenes).
2. Producción de pigmentos en medio de agar: es una de las características inherentes de cada
microorganismo específico y pueden estar confinados a la propia colonia o colorear el medio: verde, a veces, con brillo metálico (P. aeruginosa), rojo-rosado (Serratia marcescens), azul (Kluyvera spp.), púr- pura
(Chromobacterium violaceum) o marrón negruzco (Prevotella melanino- genica).
Cambios en medios diferenciales: en los medios de cultivo diferenciales se incluyen diversos colorantes, indicadores de pH y otros componentes meta- bólicos, que actúan como indicadores de las actividades enzimáticas y ayudan a identificar a las bacterias aisladas, muy útiles en determinados tipos de muestras, como los coprocultivos y urocultivos.
Crecimiento en medios líquidos: hay claves importantes para la identi- ficación de los microorganismos que pueden ser detectadas observando el crecimiento en los medios líquidos, especialmente, en el caldo de tioglicolato o en otros como el Brain-Heart-Infusion (BHI).
La capacidad de la morfología colonial para hacer una identificación presuntiva permite:
 Realizar un diagnóstico presuntivo rápido en un momento de necesidad crítica basado en el juicio razonado del microbiólogo.
 Incrementar la calidad de los cuidados del paciente a través de la comunicación rápida de los resultados, aumentando el coste-efectividad de las pruebas microbiológicas (diferenciación de patógenos potenciales de la flora normal).
 Tener un papel significativo en el control de calidad, especialmente, de los procedimientos automatizados y de otros sistemas de identificación comercial disponibles (evitar interpretaciones erróneas, debidas a inóculos mixtos que alterarían la identificación), valorando la correlación de los resultados generados con la identificación esperada
IDENTIFICACION POR PRUEBAS BIOQUIMICAS
Pruebas bioquímicas rápidas
Existen varias pruebas bioquímicas de realización fácil y rápida sobre colonias aisladas a partir de medios de cultivo que permiten la diferenciación presuntiva rápida entre grupos de microorganismos o entre especies bacterianas. Además, estas pruebas pueden orientar sobre las técnicas adicionales necesarias para hacer una identificación definitiva. En la tabla 4 se resumen los principios, los modos de acción y las aplicaciones de algunos de estos procedimientos.
Bacterias y pruebas adicionales
En la práctica, la identificación bacteriana se puede realizar con métodos convencionales o con métodos semi o totalmente automatizados. Los métodos convencionales se suelen llevar a cabo en forma de cascada decisoria, con un algoritmo de identificación consensuada o estandarizada que permite simplificar la batería a un mínimo de pruebas necesarias y apropiadas.
Principios, modos de acción y aplicaciones de algunas
pruebas Tabla 4. bioquímicas rápidas
Reacción positiva (color rojo) identifica a E. coli, Proteus vulgaris
Determina la fermentación de lactosa (color amarillo) en fermentadores lentos de la lactosa. Diferencia, por ej., Neisseria lactamica de especies patógenas de
Diferenciación entre
oxi- dasa
fermentadores (reacción +, color azul- morado); también ayuda a la
de Neisseria, Aeromonas,
burbujeo)
estreptococos (reacción -) y de Listeria de
Identificación presuntiva
Streptococcus pneumoniae (colonias lisadas) en cultivos de esputo, sangre o
(L-pirrolidoni l-
Identificación de estreptococos del
pirroglutamil-
grupo A de Lancefield. Diferencia Enterococcus de los es- treptococos del grupo D (reacción +, color rojo brillante)
naftilamida)
amino-peptidasa
Ureasa (rápida)
Prueba de cribado (positiva, color rojo) para Cryptococcus, Proteus, Klebsiella y Yersinia ente- rocolitica
Hipurato (rápido)
de Streptococcus agalactiae,
Campy- lobacter jejuni y Listeria
Plasmocoagulasa
aureus de
Ejemplo de identificación por algoritmo en cascada. ECN: estafilococos negativos para la coagulasa
Para la identificación de los bacilos gramnegativos (BGN) aerobios, del tipo de las enterobacterias, se realiza una batería de pruebas bioquímicas con la que se identifica a los que se aíslan más frecuentemente en nuestro medio. Además, conocer el fenotipo de sensibilidad antibiótica de una determinada especie ayuda de forma determinante a la identificación final.
En la identificación de los cocos
es muy importante diferenciar a
Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de los estafilococos coagulasa negativos (ECN).
catalasa positivos
Por otra parte, para la identificación de los cocos Gram positivos catalasa negativos, la identificación preliminar es esencial, ya que existe una gran varie- dad de géneros. Por ello, se aconseja una identificación en cascada con unas pocas pruebas convencionales, que permitan identificar el género, y en algún caso, la especie (patrón hemolítico, crecimiento en forma de satélite con una cepa de S. aureus hemolítica, piracinamidasa, hidrólisis del hipurato, prueba del CAMP, solubilidad en bilis y optocina). Si interesa la
identificación de la especie, lo más habitual es utilizar galerías comerciales (API rapid ID 32 STREP ® , Vitek2 ® ,
MicroScan Walk-Away ® , Phoenix ® o Wider ® ).
Bacillus, la
diferenciación preliminar debe
Para la identificación de los bacilos gram-positivos de los géneros
Coryne- bacterium
por la morfología de la colonia, color, hemólisis, características
utilizar también un sistema de galerías para los bacilos corineformes (API Coryne) ® , o el API 50 CHB ® para el
género Bacillus o mediante métodos automáticos, como el sistema Phoenix ® .
microscopio, presencia de espo- ras, etc. Aunque para una mayor seguridad en la identificación
Para la identificación de bacterias anaerobias es importante
permite, en algunos casos, conocer el género, en función de la morfología, tinción de Gram, disposición y patrón de hemólisis. Una identificación definitiva se puede realizar con galería de pruebas como el API rapid
realizar una identificación preliminar, que
ID 32 A ® .
Estos ensayos se basan en la detección de anticuerpos (Ac) específicos que permiten señalar a determinado microorganismo presente en una infección. La otra posibilidad es la detección de antígenos (Ag) solubles en los materiales a estudiar. Son todas reacciones de tipo antígeno anticuerpo (Ag- Ac).
La especificidad de los antisueros de uso corriente en el laboratorio suele ser muy variada. Generalmente, los microorganismos son un mosaico de antígenos expuestos. Según su espe- cificidad podemos encontrar tres tipos de inmunoglobulinas: policlonales, monoespecíficas y monoclonales. Por ejemplo supongamos que dos bacterias A y B son diferentes; que la bac- teria A presenta en su superficie tres Ag diferentes y que la bacteria B posee un Ag idéntico al de la bacteria A, un Ag propio y único y, un Ag que reacciona en forma cruzada con A. Un antisuero policlonal contra la bacteria A, la reconocerá en todos sus Ag, pero también reconocerá a B por el Ag idéntico al de A y por aquel que tiene reacción cruzada con A. Si pensamos en un antisuero monoespecífico contra el Ag en que B tiene reacción cruzada con A, también reconocerá las dos bacterias, tanto por reconocimiento específico, como por reacción cruzada. Por último, un Ac monoclonal solo reconocerá a la bacteria A, dado que no hay posibilidades de reacción cruzada.
Es importante destacar que generalmente, todas las pruebas mejoran la especificidad y sensibilidad con los Ac monoclonales, pero su uso debe ser valorado junto a las necesidades, los costos, etc.
Aunque existen técnicas diferentes para la detección de Ag o de Ac, todas se basan en diferentes formas de evidenciar una reacción Ag- Ac. La contrainmunoelectroforesis (CIE) fue una de las primeras técnicas en usarse. Ésta se basa en la carga negativa que presentan los Ag bacterianos en medio alcalino, cuando son sometidos a una corriente eléctrica; en cambio, los Ac permanecen neutros. Esta técnica es poco usada en la actualidad porque es menos sensibles que otras que se desarrollaron posteriormente y de mayor costo económico.
Técnicas muy usadas y de fácil realización son las que se basan en aglutinación de partí- culas, por ejemplo la aglutinación de látex o la coaglutinación que usa S. aureus y su proteína A fijadora de inmunoglobulinas. La prueba de aglutinación es un método sencillo, de un solo paso. Además es una técnica rápida y barata. Los ensayos de aglutinación dependen de la fijación inicial de Ac o de los Ag específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica, en la que se investiga el Ag o los Ac y las partículas se aglutinan si el Ag o Ac adecuado se encuentra presente. La prueba de aglutinación ha sido usada para detectar el Ag (el más importante) de Rotavirus en heces, mostrando buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. También se ha usado para detectar Ag de Adenovirus.
Las técnicas de análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) que usan Ac unidos a enzimas que catalizan reacciones colorimétricas, son de uso corriente. Los ELISA para la detección de Ag se basan en la “captura” del Ag por Ac específicos unidos a una fase sólida, generalmente el pocillo de una microplaca o una esfera de plástico pequeña. El Ag viral presente en la muestra clínica se combina con el Ac fijado a la fase sólida y el Ag viral se detecta mediante la adición de otro Ac específico conjugado a una enzima. La enzima con- jugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. En la reacción con peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro, que en su forma oxidada tiene un color característico. Si la enzima es fosfatasa, la desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color.
En los últimos años los EIA indirectos se han aplicado al diagnóstico de Ac virales. En esta técnica los Ag virales se inmovilizan en una fase sólida (esferita, policubetas para microtitula- ción u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para ésta. Con esta técnica se pueden procesar muchas muestras en forma rápida y automatizada, sin requerir de un observador experimen- tado para leer los resultados, dado que estos se leen con espectrofotómetros especialmente diseñados. Por lo tanto, dicha técnica se considera más objetiva (ver figura 3).
Las técnicas inmunomicroscópicas que usan la fluorescencia (IF), también son usadas para la detección de Ag o Ac. Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. El principio básico de la IF directa se ilustra en la figura 4. Las muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas en un portaobjetosdonde se dejan secar
y se fijan. Luego se agregan Ac específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que
difunden a través de la membrana celular y se combinan con los Ag virales expresados en las células. La reacción Ag-Ac se observa con el microscopio de fluorescencia por la apari- ción de fluorescencia de color verde manzana. Esta técnica se puede usar para identificar rápidamente el virus directamente en la muestra (por ejemplo en las células del lavado nasal o de un hisopado nasofaríngeo) o para confirmar el efecto citopático observado en cultivos celulares. Esta técnica se llama IF directa.
Además con el uso de Ac monoclonales específicos para los Ag inmediatos de Citomegalo- virus, es posible determinar la presencia de dicho virus en cultivos celulares algunos días antes de que se pueda reconocer el efecto citopático. Sin embargo, la eficacia de la técnica depende mucho de la calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero; además de la recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, la técnica realizada en manos expertas resulta útil para identificar algunos virus como los respiratorios, dado que proporciona un diagnóstico etiológico en una jornada de trabajo. También pueden estudiarse muchas muestras simultáneamente.
El advenimiento de los Ac monoclonales ha incrementado la especificidad y en algunos casos la
sensibilidad de estos ensayos. Los Ac monoclonales conjugados con isotiocianato de fluoresceína pueden usarse para identificar el virus sincicial respiratorio, Influenza A y B, Parainfluenza 1y se fijan. Luego se agregan Ac específicos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los Ag virales expresados en las células. La reacción Ag-Ac se observa con el microscopio de fluorescencia por la apari- ción de fluorescencia de color verde manzana. Esta técnica se puede usar para identificar rápidamente el virus
directamente en la muestra (por ejemplo en las células del lavado nasal o de un hisopado nasofaríngeo) o para confirmar el efecto citopático observado en cultivos celulares. Esta técnica se llama IF directa. Además con el uso de Ac monoclonales específicos para los Ag inmediatos de
Citomegalo- virus, es posible determinar la presencia de dicho virus en cultivos celulares algunos
días antes de que se pueda reconocer el efecto citopático. Sin embargo, la eficacia de la técnica depende mucho de la calidad de los reactivos, del microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero; además de la recolección y preparación de la muestra adecuada. Aun así, la técnica realizada en manos expertas resulta útil para identificar algunos virus como los respiratorios, dado que proporciona un diagnóstico etiológico en una jornada de trabajo. También pueden estudiarse muchas muestras simultáneamente.
La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de IF y es la técnica de elección en algunos laboratorios. El procedimiento requiere algunos pasos adicionales, dado que en este caso el Ac monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adición de un substrato, para evidenciar la reacción por un cambio de color visible micro y macroscópicamente.
La IF indirecta es un método rápido y confiable para la determinación de Ac en el suero del paciente. El principio de la técnica se ilustra en la figura 4. Se basa en la unión del Ac presente en el suero del paciente, con los Ag expresados en la superficie y el citoplasma de las células infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan células no infectadas. Primero se incuba el suero del paciente con las células infectadas y no infectadas; luego se realiza un lavado con solución amortiguadora y se agregan Ac contra la inmunoglobulina G humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. Éste último es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz de color verde característica. El conjugado se unirá a los Ac del paciente si la reacción es positiva, leyéndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparición de fluorescencia en el citoplasma y la superficie de las células infectadas, mientras que las células control no fluorescen, generalmente se ven de color rojo. (Ver figura 4).
El radioinmunoensayo (RIA) fue originalmente aplicado para identificar el Ag de super- ficie de la hepatitis B (HBsAg) y el Ac anti-HBsAg. Estos ensayos tienen buena sensibilidad y especificidad, pero la aparición del EIA con mayor tiempo de conservación de los reactivos, costo más bajo y ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las técnicas de RIA en la mayoría de las situaciones en las que se requiere la detección de Ag viral.
La técnica de western blot (WB) tiene muchas aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son particularmente útiles para el diagnóstico del virus de la inmunodeficiencia humana
Figura 5. Esquema de Western blott para la detección de anticuerpos
(VIH). Dicha técnica se basa en la separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa, con el objeto de determinar la pre- sencia de Ac específicos contra cada una de esas proteínas. Se realiza esquemáticamente en tres pasos. En el primero se realizan cultivos celulares de grandes cantidades de virus que luego son tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los Ag resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida. A continuación se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. Por último se coloca el suero del paciente en la membrana de nitrocelulosa y se agregan Ac anti- inmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina); finalmente se agrega el substrato enzimático para la visualización de las bandas reactivas con un producto final coloreado. Esta técnica es similar a un EIA, aunque menos sensible pero más específica. En la práctica, solamente el tercer paso se realiza en los labo- ratorios de diagnóstico, dado que los equipos comerciales proveen tirillas con los Ag; esto facilita la estandarización de las
determinaciones. (Ver figura 5 La interpretación de las pruebas serológicas que detectan Ac tienen como concepto central, el aumento del título. El título de Ac es la recíproca de la mayor dilución del suero del paciente, en que los Ac son aún detectables. Los pacientes con muchos Ac tienen títulos altos, ya que los Ac serán detectables aún en diluciones altas del suero. Los pacientes con respuesta humoral íntegra, aumentarán el título de Ac durante la enfermedad. Por lo tanto, se deben realizar dos extracciones de suero con un intervalo de dos semanas para poder detectar las modificaciones en el título, la cual tiene que ser cuatro veces (dos diluciones) mayor para considerarse significativa. En algunas infecciones serán necesarios períodos de tiempo mayores para evidenciar dichos cambios. Una forma alternativa es la detección de inmunoglobulina M (IgM) específica. Como método directo, la detección de Ag es de uso corriente en el laboratorio para el diagnóstico de agentes de meningitis, para la detección de Ag de S. pyogenes en la faringe y para muchos virus (sicicial respiratorio, Rotavirus, virus de la hepatitis). Como método indirecto para la detección de Ac contra el microorganismo se usa en: brucelosis, fiebre tifoidea, infecciones por Chlamydia o Mycoplasma, infecciones virales como hepatitis, VIH, virus herpes y enfermedades eruptivas como sarampión, rubéola, paperas y dengue.
DETERMIBACIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
(Técnicas moleculares)
En los últimos años, ha ganado aceptación en el laboratorio clínico el uso de técnicas basadas en la detección de ácidos nucleicos. La combinación del reconocimiento de fragmentos de ácidos nucleicos por medio de sondas y la amplificación previa continúan en desarrollo.
Actualmente es posible extraer secuencias específicas de un fragmento de ácido desoxi- rribonucleico (ADN) por medio de endonucleasas de restricción. Luego estas secuencias extraídas se pueden desnaturalizar y marcar con una enzima o con un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas, que tienen una secuencia de ADN conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos. Hoy se están produciendo sondas de ácidos nucleicos sintéticas, y así se obtienen sondas de oligonucleótidos de alta especificidad que están disponibles en.
La amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es otra técnica alternativa a los cultivos. Primero se realiza la amplificación de los
Figura 6. Hibridación de AND con una sonda marc ada
Fragmentos de ADN a hibridar, con la reacción en cadena de la polimerasa que aumenta notablemente la sensibilidad de las técnicas de detección de ADN. Aunque todavía son costosos, estos métodos de microbiología molecular, ya tienen su espacio en el laboratorio clínico. Son útiles en la investigación de algunas bacterias como Mycobacterium tuberculosis, Rickettsia sp., Mycoplasma. También se usan para la detección de genes que le confieren a la bacteria resistencia a algunos antibióticos, por ejemplo la meticilino resistencia de S. aureus y las betalactamasas de N. gonorrhoeae. En virología han introducido importantes cambios en el diagnóstico de enfermedades, tales como la encefalitis herpética y otras enfermedades neurológicas virales, la infección por VIH del recién nacido y la infección por Papilomavirus humano.
La PCR fue desarrollada por Saiki et al., para aumentar el número de moléculas de ADN blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molé- cula de ADN y una sola copia de genes puede ser extraída de mezclas complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. Esta técnica consiste, en una amplificación de secuencias específicas del ADN. Se basa en el uso de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se hibridan específicamente con cada una de las cadenas de ADN previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reacción se produzca se usa una enzima llamada Taq pol (ADN polimerasa ter- moestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La función natural de la ADN polimerasa consiste en reparar y replicar el ADN. Los deoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se una la polimerasa será complementario al de la base en la posición correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple de ADN, complementaria y alineada a cada cebador. Se realiza una serie repetida de ciclos, cada uno compuesto por tres pasos básicos: desnaturalización a altas temperaturas (95ºC) del ADN de doble cadena; acoplamiento de los cebadores, la temperatura se desciende a 55 - 72ºC y elongación del cebador, aquí se eleva la temperatura a 72ºC permitiendo la incorporación de los deoxinucleótidos. Mientras tanto se van deplecionando los cebadores y los deoxinucleótidos y se van sintetizando nuevas cadenas de ADN. Al final se consiguen miles de copias de ADN del fragmento de ADN limitado por los cebadores. Los fragmentos de ADN obtenidos se pueden identificar por varias técnicas: visualización en geles de agarosa o poliacrilamida con tinción con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta o hibridación con una sonda marcada. La combinación de la PCR y las sondas de ácidos nucleicos marcadas promete ser el método más sensible para la detección e identificación de los virus.
En conclusión decimos que para elegir un método diagnóstico, además de la sensibilidad y la especificidad, hay que considerar aspectos operativos de las técnicas a usar tales como el costo, la complejidad técnica del ensayo, el volumen necesario y preparación de la muestra, el tiempo que requiere el proceso y la disponibilidad comercial de los reactivos de calidad reconocida. Además, se debe considerar el nivel de complejidad del laboratorio y la disponi- bilidad tecnológica y de recursos que requiere cada técnica.
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES MICÓTICAS
1.- CONSIDERACIONES CLÍNICAS
Las infecciones fúngicas pueden causar un gran número de entidades clínicas, con manifestaciones variadas que dependen del lugar de infección y del tipo de paciente. En general, podrían clasificarse según un criterio de profundidad, en superficiales, cutáneo-mucosas, subcutáneas y profundas (endémicas y oportunistas). Son las micosis profundas oportunistas las que han adquirido un protagonismo especial en los últimos tiempos debido, entre otros motivos, al aumento de incidencia, gravedad y trascendencia del diagnóstico precoz, a lo que habría que añadir la dificultad para diferenciar la colonización de la infección invasora. El aumento significativo de las infecciones fúngicas sistémicas oportunistas es debido, entre otras causas, a las medidas de soporte vital, al aumento del uso de antibióticos de amplio espectro, a la implantación de material protésico, a la terapia con corticoides y, en general, cualquier tipo de inmunosupresión (terapéutica o adquirida). Sin el tratamiento adecuado, la mortalidad de las infecciones fúngicas sistémicas es muy alta, lo que unido a los costes de hospitalización que este tipo de infecciones genera, las convierten en entidades de gran trascendencia en la práctica diaria en el medio hospitalario. El diagnóstico micológico tradicional, basado en el cultivo, se caracteriza por su lentitud y, en el caso de las micosis sistémicas, por su baja sensibilidad y por la necesidad de obtener muestras por métodos invasores. El hemocultivo, por ejemplo, es, sin lugar a duda, un buen método diagnóstico de las micosis sistémicas; pero requiere incubación prolongada y posee una sensibilidad global de alrededor del 50% en el caso de la infección producida por levaduras, que en el caso de la aspergilosis invasora no llega al 10%. Sigue siendo, sin embargo, el método de elección para el diagnóstico de las micosis superficiales y mucocutáneas. En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas diagnósticas independientes del cultivo con la intención de mejorar la sensibilidad y reducir el tiempo necesario para realizar el diagnóstico. El papel del laboratorio de microbiología es de gran importancia, siendo fundamental para la elección de un tratamiento adecuado la identificación del agente causal de la infección.
1.1. MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTANEAS Estas micosis incluyen infecciones muy frecuentes que afectan al estrato córneo de la piel, a la epidermis y a los anejos cutáneos: pelo y uñas. Son infecciones que constituyen una parte importante de las consultas dermatológicas y cuyo diagnóstico de elección sigue siendo el examen directo y el cultivo de las muestras de piel y anejos cutáneos.
1.2. MICOSIS SUBCUTÁNEAS Están causadas por hongos ambientales inoculados directamente en el tejido celular subcutáneo mediante un traumatismo. Presentan una agresividad local variable. Característicamente no se diseminan a distancia. Entre ellas se incluyen la cromoblastomicosis, esporotricosis, micetomas y una serie de cuadros raros: rinosporidiosis, entomophtoramicosis y lobomicosis. El diagnóstico de estas infecciones suele realizarse por examen microscópico directo y cultivo. En algunas de ellas, como la lobomicosis, el hongo causal no ha podido cultivarse y el diagnóstico es histológico.
1.3. MICOSIS TROPICALES ENDÉMICAS Conforman un grupo de infecciones cuyos agentes causales acumulan una serie de características curiosas: 1) presentan dimorfismo de temperatura, 2) son patógenos primarios, 3) causan patología diseminada, incluso en pacientes no inmunocomprometidos, 4) tienen una distribución geográfica característica. Aunque pueden afectar a individuos inmunocompetentes, las infecciones en pacientes inmunodeprimidos son más frecuentes y graves. El diagnóstico se realiza por una combinación de métodos convencionales:
histología, cultivos y serología; y no convencionales, como la detección de antígenos específicos en sangre y orina (histoplasmosis).
1.4. OTRAS MICOSIS OPORTUNISTAS Constituyen un grupo muy heterogéneo de enfermedades que tienen en común la situación del paciente, la gravedad y la relativa dificultad de diagnóstico. Por otra parte, el diagnóstico etiológico es muy importante, pues la respuesta a los distintos antifúngicos varía con las especies implicadas. En este grupo se incluyen: pneumocistosis, fusariosis, penicilinosis, zigomicosis, pseudalescheriasis, pitosis, infecciones por Dipodascus capitatus, trichosporonosis, infecciones por Scedosporium prolificans y otras. Algunas de estas infecciones se diagnostican con mas facilidad, porque los hongos crecen en abundancia de muestras accesibles, como ocurre en la infección por Penicillium marneffei, mientras que otras requieren procedimientos muy invasores y cierta dosis de fortuna.
2. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO CONVENCIONAL
 Recogida de la muestra:
Consejos generales para optimizar la recogida de las muestras:
1. Debe disponerse de un protocolo de recogida de muestras que será actualizado periódicamente.
2. Es responsabilidad del médico asegurar una correcta recogida y envío en condiciones adecuadas
de las muestras, funciones que no deben ser delegadas en personal no cualificado.
3. Es necesario recoger las muestras asépticamente, utilizando contenedores estériles, remitirlas
al laboratorio antes de 2 horas y sembrarlas lo antes posible.
4. La muestra debe recogerse antes de instaurar el tratamiento y siempre de la parte activa de la
lesión (cuando se sospecha una micosis pulmonar es preferible una muestra respiratoria que un
hemocultivo).
5. Se debe evitar la utilización de hisopos siempre que el tipo de lesión lo permita, pues están
contaminados frecuentemente con microbiota bacteriana. Sin embargo, algunas muestras
(conducto auditivo, faringe, vagina, cérvix) no pueden ser recogidas de otra forma.
6. Las muestras de lesiones cerradas y abscesos suelen presentar un gran rendimiento. Deben
aspirarse con jeringa y transferirse a un contenedor estéril con solución salina, prestando atención
la recogida de gránulos, si los hubiese.
El raspado de lesiones de piel y faneras puede realizarse con distintos materiales; los más
utilizados son bisturí, moqueta o cepillo.
8. En situaciones que requieran un estudio epidemiológico, debe establecerse la necesidad de una
recogida de muestras ambientales, familiares o animales.
9. El recipiente de recogida se identificará con los datos del enfermo (nombre y localización), y
debe protegerse para que no se rompa en su transporte al laboratorio.
10. Las muestras deben ir acompañadas obligatoriamente del volante de petición para Microbiología. En el cual, al menos, debe hacerse constar la siguiente información: datos del paciente (nombre y apellidos, número de 5 historia clínica, fecha de nacimiento y sexo); datos clínicos (orientación diagnóstica, tratamiento antimicrobiano, enfermedad de base y antecedentes de interés); datos del médico solicitante.
11. Al laboratorio se le debe informar de la sospecha de presencia de hongos peligrosos. También
si se sospecha la presencia de hongos con requerimientos especiales, Malassezia sp, por ejemplo,
así como de viajes u origen de paciente.
Procedimiento de la toma y siembra de muestra. a- Toma de muestra con pinza (método convencional). b- Toma de muestra con cepillo dental. c- Siembra de pelos en la mitad de una placa de agar Sabouraud. d- Siembra de escamas en la otra mitad de la placa agar Sabouraud.
 Procesamiento de la muestra:
Para realizar un buen diagnóstico micológico es importante que la muestra se recoja y se transporte en condiciones idóneas y que no se demore su cultivo. Aunque hay pocos estudios sobre la disminución de la viabilidad de los hongos a temperatura ambiente o por la acción del hielo seco, es conocida la dificultad de recuperar Rhizopus arrhizus en muestras en las que se demora el cultivo, y también, la pérdida de viabilidad de algunos hongos por la desecación, temperatura elevada (>37 ºC) o baja (<10 ºC), sobrecrecimiento bacteriano, presencia leucocitos, etc. La refrigeración puede comprometer el aislamiento de hongos dermatofitos, Malassezia sp. H. capsulatum. Las muestras que están potencialmente contaminadas con microbiota bacteriana (muestras de piel, aspirados transtraqueales, aspirados de oído interno, muestras de conjuntiva) deben enviarse a temperatura ambiente. En términos generales, los procedimientos utilizados en el laboratorio de bacteriología son adecuados para el cultivo de hongos, pero hay que tener en cuenta que, habitualmente, la carga microbiana es inferior en el caso de los hongos con respecto a las bacterias. Esto obliga a recoger mayor cantidad de muestra para obtener un rendimiento óptimo. Las muestras inaceptables no deben procesarse y el facultativo debe ser informado inmediatamente. Todo laboratorio debe distribuir por escrito las normas de rechazo de muestras.
 Tinciones y exploración por microscopia directa:
Las tinciones en microbiología son las primeras herramientas que se utilizan en el laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace más de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiología microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos
 Tinción de blanco de calcofluor: Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor aumentando su visibilidad en los tejidos y otras muestras. Este colorante se emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según la fuente luminosa que se utilice Las especies del género Malassezia integran la flora habitual del ser humano, pero en ocasiones, causan diversas afecciones. Durante mucho tiempo, el diagnóstico temprano se vio demorado por la dificultad de obtener los cultivos de estos hongos. El objetivo de este trabajo es evaluar las ventajas del empleo de la microscopía de fluorescencia con blanco de calcoflúor para la observación de especies de Malassezia, tanto de material extraído de los pacientes, como de los cultivos. La técnica de fluorescencia ofrece, en comparación con la coloración
tradicional de azul de lactofenol, la ventaja de facilitar además de la observación de los elementos fúngicos, observar el patrón de brotación de estos organismos, útil para la identificación. El análisis de materiales clínicos con la coloración de blanco de calcoflúor y posterior observación con microscopio de fluorescencia, resulta entonces un método sencillo y rápido para la identificación presuntiva y contribuye, por lo tanto, al diagnóstico temprano.
 Tinción de Giemsa: Detecta formas intracelulares de Histoplasma capsulatum. No tiñe la pared quística del genero Pneumocystis. Tiñe otros microorganismos además de los pertenecientes a los géneros Histoplasma y Pneumocystis. Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas
estructuras se tiñan de púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y
 Tinción Gram: es un tipo de tinción diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias gram negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella. Tiñe la mayor parte de las levaduras y las hifas presentes en las mismas. Casi todos los hongos son grampositivos aunque muestran un patrón moteado o aparecen como gramnegativos, como el Cryptococcus neoformans
 Metenamima argéntica de Gomori: Tinción más adecuada para detectar todos os hongos. Tiñe las hifas y las levaduras de negro sobre un fondo verde. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico, los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos, a su vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina (o metenamina) produciendo una coloración de café a negra, debido al depósito de plata reducida en los lugares de localización de los aldehídos.
 Tinción de Mucicarmín: Se trata de un kit que contiene soluciones de:
Mucicarmín Concentrada Biopur Acética de Tartrazina Biopur Colorante Histológico.
Usado en la identificación de sitios de tumores primarios, ayudando a la distinción de células escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucina- positivos.
cápsula de los criptococos (hongos) se tiñe de rosa oscuro.
tartrazina tiñe el citoplasma de amarillo. Es una tinción anatomopatológica para
detectar mucina. Resulta útil para mostrar material capsular de Cryptococccus neoformans, también puede teñir las paredes celulares de Blastomyces dermatitidis y
Rhinosporidium seeberi.
 Cultivo:
 Agar Czapek Dox: se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. y Penicillium sp. Es el medio de referencia para la identificación de Aspergillus sp.
 Agar de papa dextrosa: es un medio utilizado para la estimulación de la formación de conidias, en la preparación de inóculos de hongos miceliales y en la estimulación de producción de pigmentos: rojo en Trichosporum rubrum, rosa salmón en Microsporum audouinii y amarillo en Microsporum canis. Se utiliza con frecuencia en microcultivos para observar las características morfológicas.
 Agar Dixon modificado: utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse añadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida. 21 22
 Agar Sabouraud + Glucosa modificado por Emmons: es el medio estándar para el aislamiento, esporulación y conservación de muchos hongos. Su pH y la concentración de glucosa favorecen la esporulación.
 Agar infusión de cerebro corazón: puede utilizarse como medio enriquecido para facilitar el crecimiento de C. neoformans a partir de muestras estériles como el LCR y el mantenimiento de la fase levaduriforme de algunas micosis sistémicas, ya sea con sangre
o sin ella. En general, está indicado para el aislamiento de una gran variedad de
patógenos, incluyendo levaduras, mohos y bacterias como Nocardia. Enriquecido con sangre de carnero al 10%, se utiliza para el aislamiento de todos los hongos, incluyendo los hongos dimórficos. Pueden añadirse antibacterianos (cloranfenicol y/o gentamicina) para convertirlo en selectivo. En algunas ocasiones también puede completarse con
cicloheximida (facilita el aislamiento de Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis).
 Agar inhibidor de mohos: es un medio enriquecido que contiene cloranfenicol o gentamicina, pero no actidiona. Se utiliza en el aislamiento de hongos sensibles a la cicloheximida (Cryptococcus, zigomicetos, etc.) a partir de muestras contaminadas. Permite el desarrollo de la mayoría de los mohos y de las levaduras.
 Agar Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol: es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patógenos a partir de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimórficos. Inhibe algunas especies de hongos de interés médico (Candida no albicans, Aspergillus, zigomicetos, C. neoformans, etc.).
 Agar urea de Christensen: se utiliza en la identificación de algunos dermatofitos, especialmente Trichophyton rubrum de Trichophyton mentagrophytes y de algunas levaduras (C. neoformans).
 Medios cromogénicos para levaduras: Cromocandida contienen diversos sustratos enzimáticos que están unidos a compuestos cromogénicos. Muy útil para el estudio de levaduras.
 Dermatophyte test medium: medio utilizado para el aislamiento de dermatofitos en muestras muy contaminadas, proporcionando una identificación presuntiva. Los dermatofitos producen alcalinización, virando el medio de amarillo a rojo. Algunas bacterias y algunos hongos también pueden producir alcalinización. Debido a que se trata de un medio coloreado, no es un medio útil para la caracterización de los pigmentos producidos por los dermatofitos. La cicloheximida inhibe muchos de los hongos saprofitos.
 Agar harina de maíz con/sin Tween 80: se utiliza en el cultivo y diferenciación de especies de Candida basándose en las características miceliales. El Tween 80 se incorpora para demostrar la formación de clamidoconidias. Si se le añaden 10 g de glucosa puede utilizarse en la diferenciación de T. rubrum y T. mentagrophytes basándose en la producción de pigmento.
 Agar Lactrimel: Medio conteniendo leche, harina de trigo, y miel. Además contiene inhibidores lo que impide el desarrollo de Bacterias :(E.Coli y cocáceas: S.aureus) 3. DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO NO CONVENCIONAL
 Basados en métodos inmunológicos
Aunque los anticuerpos que se forman durante las infecciones fúngicas no son el principal mecanismo de defensa, se han utilizado en algunas infecciones para ayudar a su diagnóstico. Se puede realizar determinación de anticuerpos en suero y LCR frente a Coccidioides immitis e Histoplasma capsulatum, la detección en suero y LCR del antígeno del criptococo o la detección del
antígeno en orina y suero del Histoplasma.
 Basados en la detección de componentes fúngicos
• Identificación del galactomanano para el Aspergillus. Muestra elevada sensibilidad cuando se
realizan determinaciones seriadas, por lo que puede contribuir al diagnóstico precoz de la aspergillosis invasiva.
• La prueba del Beta-glucano para la Candida. Este es un antígeno de pared, pero se encuentra también en Aspergillus y Pneumocystis, y no es específico de Candida. Hay varios sistemas comerciales con alta sensibilidad y especificidad, con 90% y 100%, respectivamente, pero el valor predictivo positivo es muy bajo (54%); el valor predictivo negativo es alto y la eficacia global, según algunos estudios, llega a 85%. Puede haber falsos positivos en pacientes en hemodiálisis que utilizan sistemas con membranas de celulosa y en pacientes en tratamiento con albúmina, inmunoglobulinas, sulfamidas y anticancerígenos.
 Identificación de las características de distintos hongos:
La determinación de la identidad del agente etiológico causante de una micosis puede influir directamente en el pronóstico y las consideraciones terapéuticas. La identificación de los patógenos fúngicos puede tener también otras implicaciones diagnósticas y epidemiológicas. Conocer el género y la especie del agente infeccioso permite también acceder a los datos contenidos en los registros fúngicos y las publicaciones especializadas, en especial en las micosis
oportunistas más infrecuentes.
El primer paso de la identificación de una cepa fúngica consiste en la diferenciación de un hongo levaduriforme de una forma micelial. La morfología macroscópica de las colonias suele orientar el proceso, ya que los hongos levaduriformes crean colonias opacas pálidas, mientras que las formas miceliales dan lugar a grandes colonias filamentosas de textura, color y topografía variables. El estudio microscópico delimita en mayor medida el proceso y, a menudo, es suficiente para identificar numerosos especies de hongos. La identificación del género y la especie requiere estudios microscópicos más detallados para determinar las estructuras características. La identificación de las esporas suele implicar análisis fisiológicos y bioquímicos adicionales; la identificación tanto de esporas como de formas miceliales mejora mediante procedimientos específicos de caracterización molecular e inmunológica.
TOMA DE MUESTRAS Y CULTIVOS
La toma apropiada de una muestra para cultivo es posiblemente el paso más importante en la confirmación final de que un microorganismo es el responsable de un proceso de enfermedad infecciosa.
Una muestra mal tomada no solo puede resultar en la recolección fallida de microorganismos importante , sino también conducir a una terapia equivocada y aun dañina si el tratamiento es dirigido hacia un comensal o contaminante.
La muestra debe ser de material del sitio real de infección y tiene que ser tomada con el mínimo de contaminación de los tejidos, órganos o secreciones adyacentes.
CONSIDERACIONES GENERALES DE LA TOMA DE MUESTRAS:
● Para una óptima recolección de los microorganismos debe utilizarse una serie adecuada de dispositivos de recuperación, envases para muestras y medios de cultivo.
● Deben usarse recipientes estériles
● Es ideal obtener los cultivos antes del uso de antibióticos.
TRANSPORTE DE MUESTRAS:
El transporte de muestras biologicas tiene importancia a nivel mundial. Un manejo incorrecto de sustancias con agentes infecciosos puede ocacionar morbilidad y mortalidad.
1. ENVASE ESTÉRIL DE BOCA ANCHA: Para biopsias, orinas, escamas, líquidos, esputos,
2. TUBO ESTÉRIL DE TAPÓN VERDE: Para líquidos estériles. Para estudiar micobacterias,
microorganismos aerobios y hongos.
No válido para microorganismos anaerobios, ni para líquidos con alto contenido hemático
3. HISOPO CON MEDIO DE TRANSPORTE AMIES: Para abscesos y heridas recogidas con
escobillón. Estudia microorganismos aerobios y hongos.
No válido para: anaerobios y micobacterias.
4. TUBO DE PLÁSTICO ESTÉRIL: Para catéteres, tejidos y líquidos. Se puede estudiar:
microorganismos aerobios, hongos, micobacterias. Se requiere de 3-4 ml por frasco.
RECOLECCION DE MUESTRAS:
a) LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO: La recolección de líquido cefalorraquídeo (LCR) es un examen para analizar el líquido que rodea el cerebro y la médula espinal. El líquido cefalorraquídeo actúa como un amortiguador, protegiendo el cerebro y la columna de lesiones. Por lo regular, el líquido es transparente. Tiene la misma consistencia que el agua. El examen también se utiliza para medir la presión en dicho líquido.
- RESULTADOS NORMALES: Los valores normales normalmente fluctúan de la siguiente manera:
- Presión de 70 a 180 mm H20
- Apariencia: transparente, sin color
- Proteína total en LCR: 15 a 60 mg/100 mL
- Gamma globulina: 3 a 12% de la proteína total
- Glucosa en LCR: 50 a 80 mg/100 mL (o mayor a 2/3 del nivel de azúcar en la sangre)
- Conteo de células del LCR: 0 a 5 globulos blancos (todos mononucleares) y ausencia de globulos rojos.
- Cloruro: 110 a 125 mEq/litro
- SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS ANORMALES: Si el LCR luce turbio, eso podría significar que hay una infección o una acumulación de glóbulos blancos o proteína. Si el LCR luce sanguinolento o rojo, puede ser un signo de sangrado u obstrucción de la médula
espinal. Si es marrón, naranja o amarillo, puede ser un signo de aumento de la proteína en el LCR o un sangrado previo (hace más de 3 días). Puede haber sangre en la muestra proveniente de la punción raquídea misma. Esto hace más difícil la interpretación de los resultados del examen.
- PRESIÓN DEL LCR: El aumento de la presión en el LCR puede deberse al aumento de la presión intracraneal (presión en el cráneo). La disminución en la presión del LCR puede deberse a un tumor de médula espinal, shock, desmayo o coma diabético.
- PROTEÍNA EN EL LCR: El aumento de la proteína en el LCR puede deberse a sangre en dicho líquido, diabetes, polineuritis, tumores, lesión o cualquier afección inflamatoria o infecciosa. La disminución de la proteína es un signo de producción rápida de LCR.
- GLUCOSA EN EL LCR: El aumento de la glucosa en el LCR es un signo de nivel de azúcar elevado en la sangre. La disminución de la glucosa en el LCR puede deberse a hipoglucemia (azúcar bajo en la sangre), infección bacteriana o micótica (como meningitis), tuberculosis o ciertos tipos de meningitis.
- CÉLULAS SANGUÍNEAS EN EL LCR: El aumento de los glóbulos blancos en el LCR puede ser un signo de meningitis, infección aguda, inicio de una enfermedad crónica, tumor, absceso, accidente cerebrovascular o una enfermedad desmielinizante (como la esclerosis múltiple). La presencia de glóbulos rojos en la muestra de LCR puede ser un signo de sangrado en dicho líquido o el resultado de una punción lumbar traumática.
- OTROS RESULTADOS EN EL LCR: El aumento de los niveles de gammaglobulina en el LCR puede deberse a enfermedades tales como esclerosis múltiple, neurosífilis o síndrome de Guillain-Barré.
b) LÍQUIDO PLEURAL - LIQUIDO SINOVIAL: El análisis del líquido pleural es un examen
con el que se analiza el líquido que se ha acumulado en el espacio pleural, que es el espacio entre el revestimiento de la parte externa de los pulmones (pleura) y la pared torácica. Cuando el líquido se acumula en el espacio pleural, la afección se denomina derrame pleural.
- RESULTADOS NORMALES: La cavidad pleural contiene normalmente menos de 20 mililitros de líquido transparente y amarillento (seroso).
- SIGNIFICADO DE LOS RESULTADOS ANORMALES: Los resultados anormales pueden indicar las posibles causas de derrame pleural, como: Cáncer, Cirrosis, Insuficiencia cardíaca, Infección, Desnutrición grave, Traumatismo, Conexiones anormales entre el espacio pleural y otros órganos (por ejemplo, el esófago). Si el proveedor sospecha la existencia de una infección, se realiza un cultivo del líquido para ver si hay bacterias. El examen también se puede llevar a cabo en busca de hemotórax, una
acumulación de sangre en la pleura.
c) LÍQUIDO PERITONEAL – LIQUIDO ASCITICO: El análisis del líquido peritoneal se utiliza para ayudar a diagnosticar la causa de una inflamación del peritoneo (peritonitis) y/o de una acumulación de líquido peritoneal (ascitis). Existen dos causas principales por las que se acumula líquido y se utiliza un conjunto de pruebas iniciales (niveles de albúmina en líquido, recuento celular y apariencia del líquido) para diferenciar estos dos tipos de fluidos que se pueden producir.
Un desequilibrio entre las presiones de los vasos sanguíneos (se favorece la salida de fluido de los vasos) y la cantidad de proteínas en la sangre (favorece la retención de líquido en los vasos) puede provocar la acumulación de líquido con características de trasudado. La insuficiencia cardíaca congestiva y la cirrosis constituyen las principales causas de trasudados. Si el líquido acaba siendo un trasudado no suelen requerirse pruebas adicionales.
Un daño, lesión o inflamación del peritoneo ocasiona la formación de un exudado. Los exudados se asocian a diversos procesos y enfermedades, y normalmente, se solicitan pruebas adicionales que permitan establecer el diagnóstico final, como por ejemplo:
- PROCESOS INFECCIOSOS: Ocasionados por virus, bacterias u hongos. Las infecciones pueden proceder de otros sitios del organismo u originarse en el peritoneo, por ruptura del apéndice o perforación del intestino o de la pared abdominal, o por contaminación durante una intervención quirúrgica. - PROCESOS INFLAMATORIOS: La peritonitis puede ser consecuencia de la exposición a ciertas sustancias químicas, puede aparecer después de un tratamiento con radioterapia o más raramente, ser consecuencia de una enfermedad autoinmune.
- Cáncer: Sería el caso de mesoteliomas, hematomas (tumores del hígado), linfomas o cánceres metastáticos.
- Pancreatitis: En caso de tratarse de un exudado se pueden solicitar las siguientes pruebas adicionales:Glucosa, amilasa y marcadores tumorales en líquido peritoneal. - EXAMEN MICROSCÓPICO: en caso de sospecha de infección o de cáncer. Se puede examinar directamente el líquido peritoneal o examinarlo una vez se ha centrifugarlo con una centrífuga especial (citoentrífuga) con la finalidad de concentrar las células. La muestra se coloca en un portaobjetos, se tiñe y se evalúan los distintos tipos de células presentes.
- Tinción de Gram: observación directa de bacterias u hongos al microscopio; normalmente no debería de existir ningún microorganismo
- Cultivo bacteriológico y antibiograma: para detectar microorganismos y para orientar el tratamiento antimicrobiano. Existen algunas pruebas que se solicitan menos frecuentemente, por ejemplo para detectar infecciones por virus, micobacterias (cultivo de micobacterias) y parásitos. d) SECRECION DE ABSCESOS – SECRECION DE HERIDAS: Aspiración del líquido cavitario o pus de las profundidades de heridas pustulares o vesiculares con aguja y jeringa estériles es el método más apropiado para obtener material para cultivo. El sitio a partir del cual se va a obtener el cultivo es el primero en ser descontaminado con jabón quirúrgico y luego alcohol isopropílico al 70%.
V.- DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LAS ENFERMEDADES VÍRICAS
La anamnesis del paciente y sus síntomas proporcionan las primeras claves para el diagnóstico de una infección vírica, a menudo tras excluir otros tipos de infección (p. ej., bacteriana, fúngica). Las pruebas víricas de laboratorio pretenden:
1) confirmar el diagnóstico identificando el agente vírico de la infección; 2) seleccionar un tratamiento antivírico adecuado;
3) definir el cuadro patológico; 4) hacer un seguimiento epidemiológico de la enfermedad, y 5) educar a médicos y pacientes.
Los métodos de laboratorio permiten llevar a cabo las siguientes tareas:
1. Descripción de los efectos citopatológicos (ECP) inducidos por el virus en las células.
2. Visualización de partículas víricas al microscopio electrónico.
3. Aislamiento y crecimiento del virus.
4. Detección de componentes víricos (p. ej., proteínas, enzimas, genomas).
5. Evaluación de la respuesta inmunitaria del paciente frente al virus (serología).
5.1. OBTENCIÓN DE MUESTRAS
La sintomatología del paciente y sus antecedentes de viajes, la estación del año y el diagnóstico de sospecha ayudan a determinar las técnicas adecuadas para identificar a un agente vírico. La elección de la muestra adecuada para el cultivo vírico acostumbra a ser complicada debido a que diversos virus son capaces de producir un mismo cuadro clínico. Por ejemplo, la meningitis aséptica puede ser provocada por varios agentes víricos, por lo que puede ser necesario obtener diversos tipos de muestras para identificar al virus causante de la misma.
Las muestras se deben obtener en una etapa precoz de la fase aguda de la infección, antes de que deje de difundirse el virus. Por ejemplo, los virus respiratorios solamente se pueden diseminar durante un período comprendido entre tres y siete días, y su diseminación puede interrumpirse con anterioridad a la desaparición de los síntomas. El VHS y el virus de la varicela-zóster (VVZ) no se pueden obtener de las lesiones transcurridas más de cinco días desde la aparición de la sintomatología. Tan sólo es posible aislar un enterovirus del líquido cefalorraquídeo 2-3 días después de la aparición de las manifestaciones del sistema nervioso central. Además, el anticuerpo producido como respuesta a la infección puede impedir la detección del virus. Cuanto menor sea el intervalo transcurrido entre la obtención de la muestra y su remisión al laboratorio, mayor será la posibilidad de aislar un virus. Los motivos son que muchos virus son lábiles y que las muestras son susceptibles de contaminación bacteriana o fúngica.
La mejor forma de transportar y almacenar los virus es en hielo y en un medio especial que contenga antibióticos y proteínas, como albúmina sérica o gelatina. Cuando los virus encapsulados (p. ej., VHS, VVZ, virus de la gripe) se mantienen a temperatura ambiente o congelados a -20 °C se producen disminuciones significativas en los títulos de infección. Esto no constituye un riesgo para los virus no encapsulados (p. ej., adenovirus, enterovirus).
CONCEPTOS BASICOS PARA LA TOMA DE MUESTRA:
 Elegir el material que mejor represente el proceso infeccioso.
 Tomar la muestra en el momento adecuado y en lo posible antes de que el paciente reciba antivirales.
 Obtener la muestra evitando contaminarla con la flora normal del paciente.
 Tamaño o volumen de la muestra adecuado.
 Utilizar un recipiente estéril y adecuado para su conservación y transporte.
 Identificar la muestra correctamente.
5.2. CITOLOGÍA
El examen citológico de las muestras permite elaborar un diagnóstico inicial rápido de las infecciones víricas que producen unos ECP característicos. Entre estos ECP observados habitualmente en las muestras tisulares o los cultivos celulares figuran modificaciones de la morfología celular, lisis celular, formación de vacuolas, sincitios y cuerpos de inclusión. Los sincitios son células gigantes multinucleadas formadas como consecuencia de la fusión vírica de células individuales. Los paramixovirus y los virus VHS, VVZ y VIH estimulan la formación de sincitios.
Los cuerpos de inclusión constituyen cambios histológicos de las células provocados por componentes víricos o bien alteraciones de las estructuras celulares inducidas por los virus. Por ejemplo, los cuerpos nucleares de inclusión en ojo de buho presentes en las células de tejidos infectados por citomegalovirus (CMV) o en el sedimento de la orina de pacientes con una infección se identifican con facilidad. Las inclusiones de Cowdry de tipo A en las células o en los grandes sincitios (múltiples células fundidas) son un hallazgo característico en las células infectadas por VHS o VVZ. La rabia se puede diagnosticar cuando se encuentran cuerpos de Negri (inclusiones del virus de la rabia) en los tejidos cerebrales.
5.3. AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL VIRUS
Para cultivar virus se utilizan tipos específicos de células de cultivo tisular. Los cultivos de células primarias se obtienen por tratamiento de algún órgano animal específico con tripsina o colagenasa. Las células obtenidas con este método se cultivan en monocapa (fibroblastos o células epiteliales) o en suspensión (linfocitos) en medios artificiales complementados con suero bovino u otra fuente de factores de crecimiento. Las células primarias se pueden separar con tripsina, se diluyen y crecen en nuevas monocapas (subcultivos) para convertirse en cultivos celulares secundarios. Las líneas de células diploides son cultivos de un único tipo de célula con los que se puede hacer un gran número de pases, aunque finito, antes de presentar signos de senescencia o experimentar cambios significativos en sus características. Las líneas celulares tumorales y las líneas celulares inmortalizadas, iniciadas a partir de tumores de pacientes o por efecto de virus o compuestos químicos respectivamente, se componen de células de un solo tipo que pueden ser sometidas a pases continuos sin envejecer.
En general, la detección de cualquier virus en los tejidos, líquido cefalorraquídeo, sangre o líquido vesicular del organismo anfitrión se puede considerar un hallazgo altamente significativo. Sin embargo, la diseminación vírica también puede estar inducida por cualquier trastorno subyacente (p. ej., otra infección, un estado de inmunosupresión, estrés) y, por tanto, puede que no guarde relación con los síntomas de la enfermedad. Algunos virus pueden eliminarse de forma intermitente sin provocar síntomas en la persona afectada, durante períodos que oscilan desde unas semanas (enterovirus en las heces) hasta muchos meses o años (VHS o CMV en la bucofaringe y la vagina; adenovirus en la bucofaringe y en el tubo digestivo). Por otra parte, puede que no se pueda aislar un virus a partir de una muestra cuando la manipulación de la misma haya sido incorrecta, contenga anticuerpos neutralizantes o se haya obtenido con anterioridad al comienzo de la diseminación de las partículas víricas.
5.4. DETECCIÓN DE PROTEÍNAS VÍRICAS
Durante la multiplicación vírica se sintetizan enzimas y otras proteínas que se pueden detectar a través de métodos bioquímicos, inmunológicos y de biología molecular. La detección y el análisis de las enzimas características o sus actividades permiten identificar y cuantificar virus específicos.
Los anticuerpos se pueden utilizar como instrumentos sensibles y específicos para detectar, identificar y cuantificar virus y antígenos víricos en muestras clínicas o cultivos celulares (inmunohistoquímica).
La detección del CMV y otros virus se puede intensificar utilizando una combinación de cultivo celular y medios inmunológicos. Con este método la muestra clínica se centrifugasobre células cultivadas en un cubreobjetos o en el fondo de un shell vial reforzado (tubo de cristal). Este paso aumenta la eficacia del método y acelera la progresión de la infección en las células localizadas en el cubreobjetos. A continuación, las células se analizan mediante técnicas de inmunofluorescencia (fluorescencia directa) o EIA de detección de antígenos víricos precoces, los cuales se pueden detectar al cabo de 24 horas en lugar de los 7 a 14 días que precisa la aparición de ECPs.
5.5. DETECCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO VÍRICO
La estructura del genoma y la secuencia genética son características diferenciales de la familia, tipo y cepa de virus.
Los patrones electroforéticos del ácido ribonucleico (ARN) (virus de la gripe, reovirus) o las longitudes de los fragmentos de restricción resultantes de la digestión del ADN del genoma vírico por una endonucleasa son semejantes a las huellas dactilares genéticas de estos virus. Las sondas de ADN con secuencias complementarias a regiones específicas del genoma vírico se pueden utilizar como herramientas sensibles y específicas para detectar un virus, igual que los anticuerpos. Estas sondas son capaces de detectar el virus incluso en ausencia de multiplicación vírica. Los genomas víricos también se pueden detectar en muestras clínicas aplicando la transferencia puntual o de Southern.
El ARN vírico separado por electroforesis (transferencia de Northern: hibridación de sonda ARN:ADN) y aplicado sobre un filtro de nitrocelulosa se puede detectar de forma similar. La detección de genomas víricos mediante PCR, PCR con transcriptasa inversa (PCR-TI) y otras pruebas relacionadas con las anteriores se han convertido en el instrumento principal de detección e identificación de diversos virus en un gran número de laboratorios. La cuantificación de la cantidad de VIH de un paciente (carga vírica) se lleva a cabo a través de la PCR en tiempo real. La concentración de genoma de este virus en una muestra sérica es proporcional a la tasa de amplificación por PCR del ADN genómico. Otras técnicas de amplificación y detección genómicas son semejantes al método de ELISA. Estos abordajes emplean secuencias inmovilizadas de ADN que son complementarias para una secuencia genómica vírica relevante y permiten capturar el genoma vírico.
5.6. SEROLOGÍA VÍRICA
Se utilizan estudios serológicos para identificar los virus difíciles de aislar y cultivar en cultivos celulares, así como para aquellos virus que provocan enfermedades de larga duración.
Las pruebas serológicas se pueden utilizar para identificar un virus y su cepa o serotipo con el fin de determinar si se trata de una enfermedad aguda o crónica y definir si la infección es de tipo primario o bien constituye una reinfección. Los datos serológicos sobre una infección vírica los proporcionan el tipo y el título de anticuerpos y la naturaleza de las dianas antigénicas. El curso crónico de la infección también puede determinarse a partir de un perfil serológico. Concretamente, la presencia de anticuerpos frente a determinados antígenos víricos clave y sus títulos se pueden utilizar para identificar la fase de la enfermedad provocada por determinados virus. Este planteamiento es especialmente útil para el diagnóstico de las enfermedades víricas de evolución lenta (p. ej., hepatitis
B, mononucleosis infecciosa producida por el virus de Epstein- Barr). En general, los primeros anticuerpos que se detectan son los que van dirigidos contra los antígenos más accesibles para el sistema inmunitario (p. ej., expresados en el virión o en las superficies de las células infectadas). Se puede utilizar una batería o panel serológico para el análisis de diversos virus en el diagnóstico de determinadas enfermedades. Los factores epidemiológicos locales, la época del año y factores del anfitrión tales como inmunocompetencia, los antecedentes de viajes y la edad, influyen en el tipo de análisis víricos que se deben incluir en un panel. Por ejemplo, el VHS y los virus de la parotiditis, las encefalitis equinas occidental y oriental, la encefalitis de San Luis y la encefalitis de California se pueden incluir en un panel de análisis de enfermedades del sistema nervioso central.
LIMITACIONES DE LOS MÉTODOS SEROLÓGICOS:
 La presencia de un anticuerpo antivírico indica una infección previa, pero no basta para indicar cuándo se produjo la misma.
 En los análisis se producen resultados falsos positivoso falsos negativos que también pueden confundir el diagnóstico.
 Las reacciones serológicas cruzadas entre los distintos virus también pueden generar confusión con respecto a la identidad del agente infectante (p. ej., los virus paragripal y del sarampión expresan antígenos similares).
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