Source: https://www.jove.com/video/57087/filamentos-intermedios-y-microtbulos-con-microscopa-de-reconstruccin?language=Spanish
Timestamp: 2018-06-25 11:44:19+00:00

Document:
Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy | Protocol (Translated to Spanish)
Visualización de la actina y los microtúbulositoesqueletos en la sinapsis inmune de células B mediante microscopía de emisión (STED) el agotamiento…
Monitoreo de actina desmontaje con la Microscopía e Time-lapse…
El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células fijas
El citoesqueleto, compuesto de microfilamentos de actina, microtúbulos y filamentos intermedios (IF), desempeña un papel clave en el control de la forma celular, la polaridad y la motilidad. La organización de las redes de actina y microtúbulos ha sido extensamente estudiada pero de IFs no es todavía completamente caracterizado. IFs tiene un diámetro promedio de 10 nm y forma una red que se extiende por todo el citoplasma de la célula. Se asocian físicamente con actina y microtúbulos a través de motores moleculares y linkers del citoesqueleto. Esta asociación estrecha está en el corazón de los mecanismos de regulación que garanticen la regulación coordinada de las tres redes citoesqueléticas necesarios para la mayoría de las funciones de la célula. Por lo tanto, es fundamental visualizar IFs solas y también conjuntamente con cada una de las otras redes citoesqueléticas. Sin embargo, las redes de IF son extremadamente densas en más tipos de células, especialmente en células gliales, que hace que su resolución sea muy difícil de conseguir con microscopía de fluorescencia estándar (lateral resolución de ~ 250 nm). Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es una técnica que permite un aumento en la resolución lateral de un orden de magnitud. Aquí, mostramos que resolución dSTORM lateral es suficiente para resolver la organización densa de las redes de IF y, en particular, de los paquetes de IF que rodea a los microtúbulos. Asociación tan apretado es probable que participan en la regulación coordinada de estas dos redes y mayo, explicar cómo plantilla de IFs vimentin y estabilizar la organización microtubular como podría influir en tráfico vesicular dependiente de microtúbulos. Más en general, nos muestran cómo la observación de dos componentes citoesqueléticos con técnica de doble color dSTORM trae nuevas perspectivas en su mutua interacción.
Filamentos intermedios citoplasmáticos (IFs) son 10 nm de diámetro homo - o heteropolymers de un subconjunto específico de tipo de célula de las proteínas de los IF. IFs participan en una amplia gama de funciones celulares tales como respuestas de motilidad, proliferación y estrés celular. Su papel fundamental se destaca por el hecho de que más de 90 enfermedades humanas son causadas directamente por las mutaciones en las proteínas de la IF; por ejemplo, cambios en la composición de IF acompaña a crecimiento del tumor y propagación1,2,3. Existe una creciente evidencia de que los tres sistemas de citoesqueleto trabajan en colaboración para el control de las funciones celulares tales como polarización celular, división y migración2,3. Puesto que hay un acoplamiento apretado entre la arquitectura espacial y funciones, es crucial obtener ideas sobre la organización estructural de la IF con los otros filamentos y comprender mejor la diafonía citoesqueleto. Este artículo proporciona un protocolo para llevar a cabo la resolución súper técnica doble color dSTORM (directo estocástico reconstrucción microscopía óptica)4 y cómo se utiliza para investigar la interacción entre si y microtúbulos en fijo, cultivadas células en 2 dimensiones (2D).
Varias técnicas de superresolución se han desarrollado durante el pasado decenio y descubrimientos allí estaban en el origen del Premio Nobel de química en 20145. Entre todas estas técnicas se encuentra los molécula única localización métodos como PALM6 (microscopía de localización Photo-Activated) que utiliza proteínas fluorescentes fotoconmutables, tormenta7 con pares de fluoróforos o dSTORM4 con fluoróforos convencional. Todos estos métodos se basan en el mismo principio que consiste en (i) el interruptor de la mayoría de los reporteros fluorescentes en un estado de "off" "la estado de (no fluorescente), (ii) la activación estocástica de un subconjunto de ellos en un fluorescente para localizar su posición espacial con precisión de nanómetros y (iii) la repetición de este proceso para activar tantos subconjuntos de fluoróforos como sea posible. Una imagen final es reconstruida usando todas las localizaciones de las moléculas activadas, proporcionando una resolución lateral de ~ 20-40 nm. Varios sistemas ópticos comercializados que tormenta de Palma ya están disponibles para los biólogos para experimentos de la rutina. Aquí, un sistema de este tipo fue utilizado para el estudio de la Asociación estructural de los microtúbulos e IFs. Entre todos los sola molécula basada en la localización de métodos, la técnica de doble color dSTORM fue seleccionada, porque es idóneo para observar las regiones laminares muy finas (< 1 μm) de células adherentes y pueden proporcionar una mejoría significativa de la resolución de la imagen con inversión mínima de tiempo y dinero. De hecho, dSTORM es una técnica muy conveniente y versátil que es compatible con el estándar colorantes orgánicos habitualmente utilizados para la tinción celular e inmunofluorescencia.
Mientras que un color dSTORM imágenes son relativamente fáciles de obtener con el fluoróforo Alexa6478, color doble dSTORM requiere para optimizar las condiciones experimentales para que dos tintes pueden parpadear correctamente en el buffer elegido, especialmente cuando hay limitada energía del laser. Excelentes artículos ya están disponibles en los métodos para crear imágenes de múltiples colores con dSTORM9,10,11,12,13, y estos documentos explican detalladamente las posibles fuentes de artefactos y la resolución de la imagen degradada y cómo superarlos. En este artículo, las condiciones experimentales óptimas en términos de fijación de las células, immunostaining, preparación de muestras, adquisición de imágenes y reconstrucción de la imagen se describen para adquirir imágenes de densas redes de IF citoplásmicas y microtúbulos en células gliales con doble color dSTORM. Brevemente, el método de extracción/fijación descrito en Chazeau et al12 fue adaptado a las células gliales y utilizado con un paso de la fijación, concentración de anticuerpos optimizado, un búfer de tormenta con 10 mM MEA descrito en9 de Dempsey et al. que fue encontrado para ser óptimo para el montaje experimental y el tipo de muestra.
Células gliales expresan principalmente tres tipos de proteínas de los IF: vimentina, nestina y GFAP (proteína ácida fibrilar glial). Estas tres proteínas mostraron Co polimerizarse en astrocitos14. Previamente demostramos mediante microscopía de iluminación súper resolución estructurada (SR SIM) que estas tres proteínas IF pueden encontrarse en el mismo filamento único de IF y que muestran similar dinámica y distribución en las células gliales 15. Debido a las similitudes entre las tres proteínas de IF, vimentin tinción fue utilizado como reportero para la red IF. Con dSTORM, hemos logrado resolver cómo haces de forma IF a lo largo de los microtúbulos, que no era posible con la difracción limitada de técnicas de microscopía15. Estas observaciones pueden ayudar a entender cómo vimentin IFs pueden microtúbulos de plantilla y regular la trayectoria de crecimiento, promoviendo el mantenimiento de un eje de polaridad durante la migración de la célula16. Imágenes de súper-resolución proporcionaron información clave en la interacción mutua de los dos subsistemas de citoesqueleto y trajeron la visión de la relación entre Asociación espacial y función local que podría ser el tipo de célula específica17. En general, dSTORM dos colores puede utilizarse para el estudio de la diafonía entre elementos citoesqueléticos u otros tipos de organelos, que immunostaining buenas condiciones se alcanzan en términos de densidad y especificidad. Esta técnica será útil para caracterizar mejor a los cambios del citoesqueleto observados astrogliosis y glioblastoma, el tumor más frecuente y más maligno del sistema nervioso central, donde la expresión de proteínas de IF es alterado 18 ,19,20,21.
1. cubreobjetos preparación (día 1, 30 min)
Colocar el cubreobjetos de vidrio 18 mm nº1.5H (170 μm +-5 μm) en una rejilla de plástico.
Poner la rejilla en un vaso de precipitados de 100 mL con acetona y remojo durante 5 minutos.
Transferencia de la bandeja un vaso de precipitados de 100 mL con etanol absoluto y remojo durante 5 minutos.
Transferencia de la parrilla un nuevo vaso de precipitados de 100 mL con etanol absoluto y colocar el vaso en un dispositivo limpiador ultrasónico (véase tabla de materiales) a temperatura ambiente. Presione "on" y esperar 10 minutos.
Rack bajo campana de flujo laminar y el cubre-objetos seco o seco el cubreobjetos con el flujo de aire filtrado.
Poner la rejilla con cubreobjetos en un dispositivo limpiador de plasma. Encienda la bomba de vacío, cerrar la puerta, espere 3 minutos hacer el vacío y poco después de la limpieza del interruptor en el plasma durante 1 minuto uso el cubreobjetos. No los guarde.
2. galjanoplastia (1 día, 20 min) de la célula
Crece la línea celular glial U373 en medio esencial mínimo (MEM) con 10% Suero Fetal bovino, 1% penicilina-estreptomicina, 1% no esenciales aminoácidos y en plato de petri plástico de 10 cm de diámetro.
Colocar el cubreobjetos de vidrio limpio en placas 12-bien debajo de la campana de flujo laminar y agregar 1 mL de medio de celular precalentado por pozo.
Tomar un plato que contiene las células de la incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO2).
Quite el medio y añadir 10 mL de PBS.
Retirar el PBS y añadir 1 mL 0.05% tripsina-EDTA.
Vuelva a colocar el plato en la incubadora durante 2-3 minutos.
Añadir 10 mL de medio caliente precalentado a 37 ° C en el plato y resuspender las células.
Semillas alrededor de 100 000 células por pocillo (~ 150 μL de células) en las placas de 12 pocillos que contienen el cubreobjetos.
Espere al menos 6 h (o noche) permitir la difusión de la célula.
3. fijación de cell (día 2, 2h)
Preparar el buffer del citoesqueleto con tubos de 80 mM, 7 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl y ajustar el pH a 6,9.
Lavar las células una vez con PBS.
Retirar el PBS y suavemente añadir 1 mL por pocillo de la solución de extracción/fijación (glutaraldehído al 0.25%, 0.3% Tritón X-100 en el búfer de citoesqueleto) precalentado a 37 ° C.
Incubar por 60 s a temperatura ambiente.
Retirar la solución y suavemente añadir 1 mL por pozo de precalentado y recién preparado 4% solución PFA (paraformaldehído) diluido en el búfer de citoesqueleto.
PRECAUCIÓN: Utilice guantes y trabajar bajo la campana química.
Coloque la placa de 12 pozos en la incubadora a 37° C durante 10 minutos.
Retire la PFA y añadir 3 mL de PBS por pozo.
Nota: Trabajar debajo de la campana química con guantes y poner la PFA reciclado en una ubicación específica.
Lavar dos veces con PBS.
Retirar el PBS y añadir solución recién preparada 10 mM NaBH4 diluido en PBS con el fin de saciar el autofluorescence de glutaraldehído.
Incubar durante 7 min a temperatura ambiente.
Poner el reciclado de NaBH4 en una ubicación específica.
Lavar tres veces con PBS 5 min.
Retire el PBS y la solución de bloqueo (5% solución de BSA en PBS).
Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 ° C).
Nota: El búfer del citoesqueleto puede almacenarse a temperatura ambiente durante unos meses. PFA, NaBH4 y glutaraldehído deben manejarse con especial cuidado (capucha, guantes y contenedores de reciclaje específicos). Soluciones se deben agregar y quitar suavemente con el fin de preservar la integridad de las células. Es importante no dejar que las células secas.
4. inmunotinción (día 2, 5h)
Preparar la solución de anticuerpos primarios anti-vimentina y anti-tubulina con una dilución de 1: 500 en la solución de bloqueo.
Poner gotas de 100 μl de anticuerpos primarios diluidos sobre una capa de película de parafina y colocar el cubreobjetos encima de ellos con celdas hacia abajo.
Incubar las células con anticuerpos primarios para 2 h. Ponga el cubreobjetos en una placa de 12 pozos llenos con PBS. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS a temperatura ambiente en un agitador orbital.
Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpos secundaria usando anti-ratón Alexa647 y anti-rata Alexa555 a la dilución de un 1:1, 000 en la solución de bloqueo. Incubar las células con anticuerpos secundarios por 1 h a temperatura ambiente. Proceder como 4.2. proteger las células de la luz.
Volver a poner el cubreobjetos en una placa de 12 pozos llenada de PBS. Enjuague tres veces durante 5 minutos cada vez en PBS a temperatura ambiente en un agitador orbital. Retirar el PBS y añadir 0,5 mL de PBS con 1 μl de 0,1 μm de tetraspeck.
Poner los pocillos en un agitador orbital para 30 minutos enjuague con PBS. Retirar el PBS e incubar las células durante 5 minutos con una solución PFA 4% en PBS. Enjuague tres veces en PBS.
Nota: Las células fijas pueden conservarse durante un par de semanas en PBS a 4° C. Inmunotinción puede hacerse en el último minuto.
5. preparación (día 3, 5 min)
Poner alícuotas de MEA (cisteamina, 1 M, pH 8,3), glucosa oxidasa (100 x, 50 mg/mL), catalasa (500 x, 20 mg/mL) en una cesta de hielo.
Preparar 50 mL de tampón de Tris-NaCl (50 mM Tris, 10 mM NaCl, pH = 8) suplementado con 10% de glucosa (100 mg/mL).
Preparar 1,2 mL de tampón justo antes de la proyección de imagen de 10 mM MEA, oxidasa de glucosa 0, 5 mg/mL (75 U/mL), la catalasa de 40 μg/mL (80-200 U/mL) la proyección de imagen en el tampón de Tris-NaCl con 10% de glucosa.
Monte el cubreobjetos que contiene las células etiquetadas en el portamuestras magnética (e.g. cámara de chamlide) y añadir el buffer de imagen para llenar completamente la cámara. Ponga la tapa en y asegúrese de que no existe ninguna burbuja de aire entre la tapa y el buffer de imagen.
Limpiar la superficie de la muestra con etanol absoluto y verificar que no hay escape. Utilice grasa para sellar el portamuestras correctamente si es necesario.
Nota: Preparar 1 M stock de solución MEA (pH 8.3 ajustado con ácido clorhídrico), acción de la oxidasa de glucosa 50 mg/ml y acción de la catalasa en 20 mg/mL en el agua, hacer alícuotas y almacenarlos a-20 ° C hasta por un mes para MEA y un año para glucosa oxidasa y catalasa. No vuelva a congelar alícuotas. Preparar el tampón de Tris-NaCl con antelación y almacenar a temperatura ambiente durante varios meses. Añadir la glucosa el día del experimento (paso 5.3).
6. adquisición de imágenes (día 3, ~ 1h por celda)
Encienda el microscopio. Encender el software de adquisición y presione Start sistema.
Seleccione la adquisición ficha expandir la herramienta de Configuración de imágenes en el grupo de herramienta de administrador de configuración. Seleccione el modo láser WF (gran campo) de adquisición. Seleccione el objetivo 100 X NA 1.46 . Seleccione el modo TIRF u-HP que utiliza un colimador para reducir el campo de visión se ilumina y concentrar la energía del láser en un área más pequeña. Utilice el optovar de la lente 1.6 x que da un tamaño de píxel de 100nm.
Seleccione la herramienta de series de tiempo y establecer el lapso de tiempo con los marcos de 50.000 y ms 0.0 entre marcos. Expanda la herramienta de canales en el grupo de herramienta de parámetros de adquisición y seleccione "Mostrar todo".
Configurar la pista Alexa647: retirar la 642 405 líneas para la excitación del laser y aceptar para activar el. Seleccione el filtro de emisión "655 LP" en la Configuración de imagen. Cambiar el nombre de "647".
Haga clic en '+' en la herramienta de canales para agregar otro paso de luz y seleccionar el modo de "interruptor de pista cada: marco" en la herramienta de Configuración de imágenes . Compruebe 561, 488 y láser de 405 líneas y aceptar para activar el. Seleccione el "BP 570-650 + LP750" emisión filtro y uso optovar lente 1.6 x. Compruebe que está seleccionado el modo de TIRF-uHP. Cambiar el nombre de la pista "555".
Seleccione la herramienta modo de adquisición y establecer el tamaño de marco 200 x 200 píxeles. Seleccione la herramienta estrategia y dispositivos de enfoque y ajustar el enfoque definido a 1 000 marcos (si existe un sistema de bloqueo de enfoque).
Poner el aceite en el objetivo y la muestra en. Seleccione la ficha Localice y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia. Encontrar el foco y buscar la celda a la imagen utilizando el ocular. Poner en el centro del campo de visión utilizando el joystick.
Seleccione la ficha de adquisición para volver al modo de adquisición. Seleccione la pista "647" ajustar la potencia del láser 642 al 0,2%, la potencia del láser de 405 se establece en 0, configurar el tiempo de exposición a 50 ms y la ganancia de 50. Seleccione el modo de adquisición continuo observar la célula en la pantalla. Ajuste el enfoque. Asegúrese de que hay al menos un grano de tetraspeck en el campo de visión, aumenta el contraste para ver si es necesario. Utilizar un modo de escala automática de la pantalla. Tomar una imagen de epifluorescencia de campo amplio de la red de vimentina haciendo clic en ajustar y guardar. Para comprobar la iluminación de la TIRF, haga clic en TIRF, ajustar el ángulo de iluminación o colimador si es necesario tener un campo de iluminación homogéneo y guardarlo.
Nota: Es importante que las imágenes TIRF y epifluorescente son de alta calidad antes de iniciar la adquisición de datos. Filamentos discontinuos, no uniformemente marcados dará lugar a imágenes de pobre calidad dSTORM.
Desactive la pista "647" y seleccione y marque la pista "555". Tomar una imagen de epifluorescencia de la red de microtúbulos y guárdelo. Tomar una imagen de la TIRF y ahorrar demasiado.
Desactive la pista "555", seleccione y verifique la pista "647", luego oprima continuo. Poner la ganancia a 0 y tiempo de exposición a la Sra. 10 establece el poder de 642 nm láser al 100% para la mayoría de los tintes Alexa647 la bomba al Estado oscuro (~ 2 kW/cm2). Una vez que los fluoróforos empiezan a parpadear, ponga la exposición a 15 ms y ganar hasta 300. Seleccione el modo TIRF de iluminación. Utilice el modo de indicador de rango sin escala automática para verificar que las señales a la sola molécula no saturan la cámara (indicada por el color rojo). En ese caso, disminuye la ganancia hasta que desaparezca la saturación. Tetraspeck granos permanecerá saturados al inicio de la adquisición. Pulse detener para detener la continua observación de la célula.
Expandir la herramienta en línea de procesamiento y verifique Online procesamiento PALM para visualizar la imagen de la tormenta durante la adquisición. Utilice los siguientes parámetros: 9 para el tamaño de la máscara de pico (diámetro 9 píxeles) y 6 para la intensidad de pico al ruido. Parámetros de tesis se definen las moléculas que se tienen en cuenta en el proceso (lo suficientemente brillante y no superpuestas). La herramienta Estadísticas de PAL , seleccione el tipo de parcela: histogramae histograma fuente: precisión. Pulse iniciar adquisición.
Durante la adquisición, vuelva a enfocar si es necesario (si no hay ningún dispositivo de bloqueo de enfoque). Ajustar los parámetros (exposición, potencias de láser) y finalmente en la línea de láser de 405 nm (a partir de 0,001%) mantener una densidad media de fluoróforos con una distancia mínima de 1 μm entre moléculas individuales (> 9 píxeles de 100 nm, el tamaño de la máscara de pico) ( Figura 1A-B). Si la densidad de la molécula es un poco demasiado alta, use el modo de HILO (muy inclinado y laminado óptica hoja) de la iluminación en lugar de TIRF. Esto aumentará la potencia del láser en un 20%. Asegúrese de que el pico de la precisión de la localización en el histograma debajo de la imagen reconstruida se centra alrededor o por debajo de 10 nm.
Nota: Generalmente el número de moléculas disminuye con el tiempo, y la potencia del láser de 405 nm aumenta lentamente en consecuencia. El objetivo es disminuir la precisión de localización (histograma aparece debajo de la imagen de la estupendo-resolución) tanto como sea posible con un pico por debajo de 10 nm (figura 1). Aumentar el contraste de la imagen de Palma si es necesario, si hay demasiadas perlas brillantes en el campo.
Pulse detener para detener la película cuando se han alcanzado más de 10 localizaciones de6 (por lo general después de 40 000 marcos). Poner los lasers a 0.2% (642 nm) y 0 (405 nm). Guardar los datos raws de la adquisición de tormenta con el formato .czi. Desactivar pista "647" en la herramienta de canales y seleccione comprobar pista "555".
Configurar el tiempo de exposición a 25 ms y ganancia a 0. Presione el botón de continuo y sistema láser 488 y 561 al 100% a los tintes de Alexa555 de la bomba al Estado oscuro (~ 2 kW/cm2 cada uno). Una vez que los fluoróforos empiezan a parpadear, que la ganancia de 250, utilice el modo de iluminación de HILO y comprobar que las moléculas individuales no saturan la cámara con el modo de indicador de escala. Si ese es el caso, disminuya la ganancia. Pulse Stop. Disminuir la energía del laser de 488 al 50%.
Pulse iniciar adquisición. Durante la adquisición, aumente progresivamente la ganancia para estar siempre en el límite de saturación. Aumentar gradualmente la potencia del láser de 405 nm para mantener una densidad media de una molécula en el campo de visión (ver paso 6.18). Disminuir la energía del laser de 488 a 20-30% cuando el láser 405 es superior al 15%. Luego disminuya gradualmente la 488 aumentando la línea de 405 láser para evitar el parpadeo de las moléculas lo más rápido posible. La línea de 488 láser juntada con el láser de 561 excitación a intensidad máxima aumenta en tanto el descuento en tarifas de los fluoróforos, mientras que la línea de 405 láser sólo aumenta la tasa de.
Detener la adquisición cuando se haya llegado a localizaciones más de 500 000 (después de unos 20 000 marcos) o más cuando no hay más moléculas están parpadeando. Guardar los datos raws de la adquisición de tormenta con el formato .czi.
Nota: Comience siempre con la mayor longitud de onda para evitar la decoloración o la activación de los otros colores. Puesto que no se sella la cámara de chamlide, es posible cambiar el buffer de imagen regularmente, por ejemplo, para probar las condiciones de amortiguamiento diferentes. Usar la línea de láser de 488 a agotar los tintes Alexa 555 es necesario sólo cuando la energía del 561 laser (con láseres de mW 100).
7. reconstrucción de imagen (5 min)
La herramienta PAL-Drift , utilizando el tipo de corrección basado en el modelo automáticos segmentos con un tamaño máximo de 8. Pulse aplicar varias veces seguidas hasta que se corrija la deriva. Esta basado en el modelo de corrección se aplica un algoritmo basado en el análisis de correlación cruzada que corrige la deriva.
Utilizando las herramientas de Filtro de PAL , mejorar el aspecto de la imagen de tormenta seleccionando sólo las moléculas que fueron mejor localizadas. Por ejemplo, limitar la precisión de la localización a 30 nm y la PSF a 120-180 nm.
Utilice una resolución de pixel de 5 o 10 nm en la herramienta render PAL , así como un modo de visualización gaussiano, con un factor de expansión de 1 PSF. Seleccione Render auto rango dinámico HR con un valor de 95% y rango dinámico de auto de procesamiento SWF con un valor de 90%. Seleccionar la mejor calidad de Render.
Seleccione convertir de Palma, en el menú de la Palma de la ficha de proceso (modo postproceso). Pulse seleccionar y aplicar. Guardar la imagen creada con un formato. LSM (y no .czi, muy importante).
Nota: La reconstrucción de la imagen puede realizarse inmediatamente después de la adquisición o más adelante usando el modo de procesamiento de imágenes de software de adquisición de la. En el modo de procesamiento posterior fuera de la línea, es posible analizar las pilas con diferentes valores de los parámetros (tamaño de la máscara de pico, intensidad máxima de ruido). Siempre elija "Descabar superpuestas de las moléculas" y no "promedio antes de localización".
8. estimación de la precisión de la localización de una imagen de la tormenta (10 min)
Abra los datos crudos de tormenta y utilice el procesamiento de imágenes ficha Seleccione el método de la Palma y luego Palma otra vez. Presione Selecc.
Pulse aplicar para iniciar la reconstrucción utilizando un tamaño de máscara de pico de 9 y una intensidad de pico de ruido de 6 (o los parámetros que usted elija para la imagen).
Seleccione la herramienta de gráficos de rectángulo y dibuje un rectángulo en la imagen cruda alrededor de una sola molécula presente en la superficie de vidrio. Generalmente son unas moléculas individuales allí.
Presione aplicar otra vez y sólo las moléculas presentes dentro de la región del rectángulo serán analizada.
La herramienta Estadísticas de PAL , seleccione el tipo de parcela: histograma y fuente del histograma: X o Y, visualizar los histogramas de posición.
Guarde la tabla con la lista de localizaciones de la izquierda debajo de las imágenes.
Utilizando un software de análisis de datos, crear histogramas de X y Y (figura 1).
Ajuste de las distribuciones por una gaussiana y guardar el σX y σY valores. El σ de la precisión de localizaciónSMLM se calcula por (σX *σY) ^ 0.5.
Repita el paso 8.3-8.8 en tantas moléculas como sea posible y media σSMLM
Abre la imagen de la tormenta de cada color con el software de Fiji (imagen J).
Seleccione la herramienta varita mágica para medir las posiciones de cada tetraspeck los granos.
Calcular los cambios de X y Y para cada cuenta y los promedio de.
Utilice el comando "Traducir" para traducir la segunda imagen con el calculado turnos X e Y.
Fusionar las dos imágenes utilizando el comando combinar canales.
Un microscopio equipado con 50 mW 405 nm y 100 mW 488, 561 y 642 nm láseres de estado sólido, un EMCCD cámara de 512 x 512, un alfa Apo Plan 100 X / 1,46 objetivo banda pasar 570-650 y pase largo 655 filtros de emisión se utilizó para los representante resultados presentados a continuación.
Figura 1A da un ejemplo de molécula densidad y señal a ruido que se debe utilizar durante la adquisición de la imagen raw. Se obtienen imágenes de buena calidad con un mínimo de ~ 1 μm entre moléculas vecinas. En buenas condiciones intermitentes, fluoróforos deben estar presente en un único marco. Parpadear bien requiere para ajustar las condiciones de buffer (pH, agente reductor, sistema de barrido de oxígeno) y potencias de láser, que influyen en el en-apagado-tasas y de los fluoróforos y por lo tanto el deber del ciclo (la fracción de tiempo que dedica a un fluoróforo en el estado)9,11. Figura 1B, por el contrario, da un ejemplo de imagen raw donde la densidad de la molécula es demasiado alta y no se puede resolver sola molécula.
Figura 1 muestra un histograma típico de precisiones de la localización de todas las moléculas detectado y analizado por el software del fabricante de una pila de 20 000 marcos. Este histograma corresponde a la imagen dSTORM de la red de microtúbulos que se muestra en la figura 3B. Valores de precisiones de localización proporcionadas por el fabricante software están en buen acuerdo con los valores estimados siguiente paso 8, con la precisión de apuntamiento de una sola molécula localizada en el tiempo diferentes puntos22 (figura 1).
Figura 2A muestra un ejemplo típico de imagen dSTORM de filamentos de vimentina immunolabeled con Alexa647. El aumento de resolución se puede observar claramente en comparación con la imagen obtenida con un microscopio estándar de campo amplio (figura 2B-C). Los perfiles de intensidad de fluorescencia en la Figura 2D muestran que la proyección de imagen de microscopia super-resolución permite resolver vimentin paquetes. La resolución de dSTORM es suficiente para contar el número de los filamentos presentes en los paquetes.
La figura 3 muestra un ejemplo típico de imagen dual-color dSTORM de la tubulina y el vimentin redes immunolabeled con Alexa647 y Alexa555 respectivamente. La superposición de las dos redes muestra que los paquetes de la vimentina a menudo se localizan a lo largo de microtúbulos, proporciona información estructural sobre el acoplamiento entre los dos subsistemas de citoesqueleto.
Figura 4 ilustra varios ejemplos de imágenes dSTORM de microtúbulos obtenidos en condiciones no óptimas. En primer lugar, utilizando Alexa488 y un buffer con 143 mM beta-mercaptoetanol (otro agente reductor utilizado en lugar de MEA9,10,11) y un sistema de barrido de oxígeno (compuesto por glucosa oxidasa de 0.5 mg/mL y 40 μg/mL catalasa), los fluoróforos se parpadea pero no fueron lo suficientemente brillantes para ser precisamente localizados (número de fotones demasiado bajo) (Figura 4A). En segundo lugar, con Alexa555 beta-mercaptoetanol de 143 mM, 50 mM MEA y oxígeno sistema de barrido, los fluoróforos no podría ser bombeado al Estado oscuro y por lo tanto no ser bien espacialmente separados (demasiado alto ciclo de deber, es decir, la fracción de tiempo en el estado "on" es demasiado largo) (Figura 4B). Por último, con Alexa568, beta-mercaptoetanol de 143 mM, 50 mM MEA y oxígeno sistema de barrido, los fluoróforos no fueron brillantes y se parpadea lentamente con muy largo "en" y "off" (ciclo de servicio demasiado alta y número de fotones bajo) los Estados (figura 4). En todas estas condiciones no óptimas, la red de microtúbulos fue rendida mal en las imágenes de súper resolución. En conclusión, las condiciones óptimas requieren fluoróforos con el número de fotones alta y baja deber ciclo9,10 en el búfer de imagen. Tenga en cuenta que optimizando etiquetado densidad imágenes condiciones de buffer para obtener buenas condiciones intermitentes es un procedimiento estándar para dSTORM de dos colores y no es específico a la imagen de la IF-microtúbulos.
Según el teorema de Nyquist-Shannon, es necesario contar con fluoróforos por lo menos cada 10 nm y tienen una resolución de 20 nm. Extendido a estructuras 2D, Dempsey et al estimado que es necesario un etiquetado de ~ 104 fluoróforos por μm2 . Como la red de IF es más densa y sus filamentos son más delgado en comparación a la red de microtúbulos (10 nm vs 25 nm de diámetro sin los anticuerpos primarios y secundarios), observamos que dos veces más localizaciones están necesarios para describir la red de IF. Obtuvimos buenas imágenes con de 5 000 localizaciones/μm2 pues si y 2500 localizaciones/mm² de microtúbulos, obtenida con 20 000 marcos y marcos de 40 000 respectivamente. La imagen con la resolución más alta se obtuvo con una precisión de localización de σSMLM ~ 8-12 nm Estimado después de paso 8 del Protocolo (22puntos en precisión de apuntamiento de una sola molécula localizada en otro momento). Esta estimación de la precisión de la localización fue en buen acuerdo con los valores proporcionados por el software del fabricante que se muestra en un histograma de precisiones de localización extraídos de todas las moléculas detectadas en los datos en bruto (ejemplo que se muestra en la figura 1). Tal precisión de localización podría proporcionar una imagen con una resolución de ~ 30 nm (2,35 * precisión) si la densidad de etiquetado es bastante alta. Habitualmente observamos filamento vimentin con un ancho total a media máxima (FWMH) de ~ 40 nm y microtúbulos con un ancho de FWMH ~ 55 nm. Puesto que la resolución de la imagen depende de la precisión de la localización y la densidad de localización, ofrecemos condiciones experimentales que permiten los mejores resultados teniendo en cuenta ambos criterios.
Figura 1 : Densidad óptima de las moléculas individuales en la adquisición y localización de estimación de la precisión.
(A-B) Izquierda: Representativas imágenes raw de un solo cuadro con una densidad óptima de las moléculas individuales en el estado brillante (A) y con una densidad muy alta (B) durante la adquisición de tormenta (paso 6.12.) de células U373 fijadas teñidas con anti-vimentina y anti-ratón Alexa647. Derecho: Imágenes RAW donde las moléculas individuales con el nivel de fluorescencia sobre la intensidad de pico de ruido umbral (6) están rodeadas por círculos (blanco o rojo). El diámetro del círculo se fija por el tamaño de la máscara de pico (set a 9 píxeles) y el color se determina si las moléculas superponen (rojo) o no (blanco). Tenga en cuenta esa alta densidad de las moléculas individuales (en (B)) conducen a una gran cantidad de moléculas que no son tomadas en cuenta para la reconstrucción de la imagen de tormenta que se superponen. A detalle: gráfico que muestra un perfil de intensidad de fluorescencia típico de una sola molécula en rojo y su gauss fit en negro. En este ejemplo, la precisión de localización es σx = 6.7 nm. Barra de escala, 1 μm. (C) histograma típico de precisiones de la localización de las moléculas detectadas y analizadas por el software del fabricante. Pueden ser visualizado y se actualiza regularmente durante la adquisición de los datos raws gracias al procesamiento en línea. Este histograma corresponde a la imagen dSTORM de la red de microtúbulos que se muestra en la figura 3B. (D) Izquierda: Imagen de la tormenta de una sola molécula presenta sobre la superficie después de la reconstrucción. Derecho: Histogramas de las posiciones X e Y obtenidas después de la colocación gaussiano. Gaussiano ajuste de las distribuciones de X y Y da una estimación de la precisión de localización. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Representante dSTORM imagen de una red de vimentin. imagen de dSTORM (A), el correspondiente estándar amplio campo imagen (B) y recubrimiento (C) que muestra la vanguardia de una célula glial U373 fijo como se describe en el protocolo y tinción para vimentina con Alexa647. Abajo: zoom de la región resaltada. (D) perfiles de intensidad transversal a lo largo de la línea amarilla en la imagen ampliada en el A y B. escala de la barra, 2 μm y 500 nm en el zoom. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Imagen de dSTORM representativo bicolor de redes vimentin y microtúbulos. (A) red Vimentin teñidas con Alexa647 (igual que en la figura 2A). (B) red de microtúbulos con Alexa555. (C) superposición de las redes de microtúbulos (Aguamarina) con una región de zoom a la derecha y vimentina (rojo). La imagen dSTORM de vimentina se obtuvo con ~1.5 millones de localizaciones fuera de 40 000 marcos. La imagen de la dSTORM de los microtúbulos se obtuvo con localizaciones ~ 850 000 de marcos de 20 000. Escala de la barra, 2 μm y 500 nm en el zoom. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Ejemplos de condiciones no óptimas imágenes de microtúbulos. Cuando los fluoróforos parpadearán pero no son lo suficientemente brillantes con un Alexa488 etiquetado de tubulina de las células gliales U373 y 143 mM BetaMercaptoethanol y limpiador del oxígeno en el buffer de imagen (A), cuando los fluoróforos son lo suficientemente brillantes pero no pueden ser correctamente agota en el estado oscuro (en la potencia máxima del láser) y parpadeo lentamente con Alexa555 etiquetado tubulina en 143 mM de BetaMercaptoethanol, 50 MEA y oxígeno carroñero tampón (B) y cuando fluoróforos parpadean lentamente y no son brillantes con Alexa568 etiquetado como tubulina en un buffer de tormenta que contiene 143 mM BetaMercaptoethanol, 50 mM MEA y limpiador del oxígeno (C). En todos estos casos, las imágenes dSTORM han degradado la resolución. Escala de la barra, 2 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Imagen representativa dSTORM de dos colores de redes vimentin y microtúbulos de una célula U373 fijado con metanol frío por 5 min (A) (B) y el Vimentin redes de microtúbulos etiquetados con Alexa647 y Alexa555 respectivamente con zooms resaltadas. Tenga en cuenta la presencia de moléculas individuales en la parte delantera de las células localizadas en el citoplasma disminuir la resolución global de las redes de filamentos. Escala de la barra, 2 μm y 500 nm en el zoom. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Comparación de dSTORM reconstruido imágenes
Imagen de dSTORM reconstruido por el software del fabricante (A) y tormenta (plugin de FiJi) (B). (C) superposición de (A) en magenta y (B) en verde. Escala de la barra, 2 μm y 500 nm en el zoom. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí presentamos un protocolo que reduce al mínimo los artefactos en las imágenes dSTORM de los microtúbulos e IFs en células gliales. Cada paso de la preparación de la muestra y proyección de imagen pueden crear artefactos: fijación, bloqueo, inmunomarcación, a la deriva durante la adquisición, no óptima intermitente condiciones23. Enumeramos a continuación los pasos más críticos.
El cubreobjetos la limpieza es un paso importante para limitar el atascamiento no específico de fluoróforos en la superficie y por lo tanto para limitar el ruido de fondo en la imagen dSTORM.
Le sugerimos fijar la muestra con un paso de las soluciones de extracción y fijación con una mezcla de glutaraldehido y triton y luego la fijación de PFA (paraformaldehído) (paso n ° 3). El protocolo de fijación fue adaptado de Chazeau et al12: disminuyó el tiempo de incubación de extracción/fijación paso a 60 s (paso 3.4), eliminar la glucosa de la solución tampón de citoesqueleto y saltarse el paso extra de permeabilización. La ventaja de este método es que las subunidades citoesqueleto libremente móviles están agotadas, permitiendo la proyección de imagen de super-resolución con menos fondo12. Más generalmente el paso de fijación es fundamental porque plomo de fijación mal (usando la vieja PDA, soluciones de frío, pasos de incubación muy largo/corto) a la destrucción parcial de las redes de filamento (microtúbulos rotos, los microtúbulos que no llegan a la parte delantera de la célula o en un baja densidad). Tenga en cuenta que también es posible utilizar fijación de metanol, sobre todo si sólo la red de vimentina es reflejada como se describe en Leduc et al15. Sin embargo, el ruido de fondo puede observarse dentro de la célula (figura 5). Aunque dSTORM imágenes obtenidas con metanol fijada las células son de menor calidad, todavía proporcionan información sobre qué tanto si y redes de microtúbulos deberían verse como por ejemplo en términos de densidad de filamentos. La fijación con glutaraldehído sólo dio resultados muy pobres para IFs, aunque es el mejor protocolo para fijación de microtúbulos23.
En la parte de inmunotinción, es importante utilizar anticuerpos anti-ratón que minimizan la reacción cruzada con los anticuerpos desarrollados en ratas. No podríamos utilizar fragmentos Fab (el ratón) por esta razón, ya que cruz-reaccionan no específicamente con la tubulina contra rata además el ratón anti-vimentina.
Debido a la energía del laser limitada disponible, es necesario utilizar líneas de láser de 488 y 561 nm a los tintes de Alexa555 de la bomba al Estado oscuro. Alta potencia de láser de 488 (~ 50%) también es necesario durante la adquisición de observar buena parpadeando y ciclo de trabajo baja (la fracción de tiempo de un fluoróforo pasa en el estado), aunque aumenta el ruido. El modo de iluminación de TIRF limita la excitación de fluoróforos en una capa delgada (~ 200 nm sobre el cubreobjetos de vidrio). Aumenta la relación señal a ruido por la disminución de la luz de fondo, pero también disminuye la energía de excitación. El modo de HILO permite seccionar axial y puede ser eficiente para optimizar la relación señal a ruido. Por lo tanto es un buen intermedio entre epi y TIRF. Usando el modo de HILO es esencial eficientemente excitar los fluoróforos Alexa555, que requieren láser de alta energía a parpadear correctamente.
Otro paso fundamental es la adquisición de datos (paso 6). Es necesario ajustar los parámetros de adquisición (exposición, ganancia, TIRF y el enfoque incluso cuando ningún dispositivo de bloque de enfoque está disponible) mientras que la película es adquirida. Mantener una densidad óptima de fluoróforos brillante es importante (figura 1A): debe ser lo suficientemente baja como para separar espacialmente cada tinte, pero lo suficientemente alto para visualizar toda la estructura después de 40 000 marcos. Si el número de moléculas activadas es demasiado bajo, se deben adquirir más pilas. Obtuvimos buenas imágenes con ~ 5000 localizaciones por mm² de IFs y 2 500 localizaciones por cm² de microtúbulos.
Modificaciones y problemas del método
Es importante trabajar con muestras frescas y búferes de imágenes optimizadas. pH debe ajustarse precisamente, especialmente para el MEA.
Vimentina y microtúbulos deberían verse uniformemente marcados cuando reflejada con técnica estándar microscopia de campo amplio (WF). Si filamentos puntuado/guiones con microscopía clásica, esto se amplificarán al usar super resolución. En este caso, es mejor preparar nuevas muestras. Condiciones de fijación no-optimizado (antiguo PFA, etc.) pueden resultar en microtúbulos mirada fragmentada. Fondo alto sobre la superficie de cristal puede surgir de un bloqueo ineficiente. En ese caso, BSA (albúmina de suero bovino) puede ser sustituido por FBS (suero bovino fetal) y utilizado en cada pasos de incubación.
Si la densidad del etiquetado es demasiado alta (figura 1B) y no puede ser suficientemente en el oscuro-estado, incluso con la más alta energía del laser, la cantidad de secundaria anticuerpos deben reducirse (mejor que disminuyendo la cantidad de anticuerpos primarios). Sin embargo, esto requiere la preparación de nuevas muestras. En general, es necesario evaluar empíricamente la cantidad de anticuerpos secundarias al uso.
Si los fluoróforos no parpadear normalmente (deben estar en el estado brillante durante sólo un fotograma), compruebe que el pH del buffer de imagen es correcto (pH 8.3). Preparar nuevas soluciones si el problema persiste (especialmente MEA). Compruebe siempre que el colimador de la TIRF es de (u_HP TIRF). Con energía limitada, obtención de centelleo adecuado puede ser difícil (la conexión y desconexión las tasas así como tinte brillo dependen de la energía del laser, como se describe en van de Linde et al11). Otros colorantes como Alexa488 o Atto488 pueden ser exploradas si más potencia del láser de excitación está disponible14.
Si los fluoróforos dejará de parpadear antes de finales de los de 40 000 marcos, cambiar el búfer de imagen que puede haber sido oxidado. Verifique que no haya ninguna burbuja de aire entre el tampón y la tapa después del cambio de tampón. Muestras selladas podrían ser reflejadas por unas horas en un raw.
Si peliculas de tormenta se adquieren en un microscopio TIRF regular equipado con un EMCCD, es posible utilizar tormenta24 para reconstruir las imágenes. Opciones similares existen para la corrección de deriva, filtrado de imágenes y procesamiento de imagen. Tempestad de truenos es un plugin para utilizar con el software de Fiji/imageJ. Resultados similares se obtuvieron con el software de fabricante y tormenta (figura 6).
CUNA (cyclooctatetraene) puede agregarse al búfer de imagen para mejorar la precisión de la localización de moléculas individuales. Aumenta el número de fotones emitidos por ciclo para Alexa64725. De hecho se observó una mejor precisión de localización (hasta 6 nm) al añadir 2 mM COT en el búfer de tormenta se describe en el paso 5 o con 100 mM de MEA como se describe en referencia25. Sin embargo, en estas condiciones, el número de moléculas brillantes durante la adquisición disminuye mucho más rápido que sin cuna, limitando el número total de localizaciones de la molécula al final de la adquisición y puede conducir a un muestreo insuficiente de la red de IF. Se registraron otros búferes de imágenes para trabajar bien con tintes de Alexa, por ejemplo utilizando lactasa y oxyrase como oxígeno Borrado de sistema26. En este protocolo, se presenta la composición del tampón que dio los mejores resultados en términos de resolución para nuestro tipo de muestras y establecer la proyección de imagen, pero cada tipo de muestra requiere optimización de buffer, además de etiquetado y optimización de las condiciones de fijación.
Limitaciones del método y posibles mejoras
El método presentado aquí se limita a las células fijas y las imágenes 2D. Utilizando un estándar de conjunto de imágenes hasta con un microscopio de la TIRF y un EMCCD, el factor más limitante era el poder láser (100 mW para el 561 nm láser no fue suficiente para que los tintes de Alexa555 parpadee). Una línea láser de 532 nm puede ser más eficiente para excitar estos tintes. Una posible mejora del método sería realizar 3D dSTORM con astigmatismo óptico27. Esto requeriría modificaciones mínimas del Protocolo, excepto una menor densidad de etiquetado y un número mayor. Color dual 3D imagen tormenta daría una mejor vista de IFs envuelto alrededor de los microtúbulos, sobre todo en paquetes. Tenga en cuenta que también podrían observar filamentos de actina mediante el mismo método de fijación y una cantidad optimizada de phalloidin fluorescente8. 3 color tormenta podría ser utilizado para observar la organización de los tres subsistemas de citoesqueleto.
Usando los anticuerpos primarios y secundarios aumenta el tamaño del objeto de interés puesto que el anticuerpo secundario se localiza hasta 20 nm del blanco. Típicamente, un microtúbulo de 25 nm de diámetro tiene una anchura de ~ 50 nm después de etiquetar. Una posibilidad para mejorar la distancia entre el objetivo y el tinte es etiquetar directamente los anticuerpos primarios con los tintes adecuados. Idealmente nanobodies marcados con colorantes orgánicos deben ser usados28.
Aquí ofrecemos sólo un método simple para estimar la precisión de la localización media de una sola molécula después de Endesfelder et al22. La resolución total de las imágenes que toma en cuenta ambos precisión de localización y etiquetado densidad, puede también ser medida usando la transformada de Fourier anillo correlación enfoque29.
Con respecto a la inscripción de canal, es difícil sobreponer perfectamente todos los granos presentes en el campo de visión. Una corrección más compleja puede encontrarse en Chazeau et al 12.
Limitaciones derivadas de la intermitente de fluoróforos y blanqueo de las sondas pueden superarse mediante el uso de ADN-pintura (acumulación de puntos de ADN para la proyección de imagen en nanoescala topografía)30. En este método, el parpadeo es necesario para la localización de la sola molécula es creado por la unión transitoria de oligonucleótidos marcados con tinte corto sus objetivos complementarios.
Este artículo presenta un protocolo robusto para realizar proyección de imagen de doble color dSTORM en 2 dimensiones de filamentos citoesqueléticos en células fijas. Las condiciones experimentales que fueron encontradas óptimas en cuanto a la fijación, inmunomarcación y proyección de imagen de búfer para nuestro tipo de muestra se describen en detalles. Entonces, el proceso de adquisición de datos y el tipo de imágenes parpadeantes que tienen que registrarse (densidad de la molécula, relación señal a ruido, fluoróforo deber ciclo etcetera) se presenta cómo reconstruir dSTORM imágenes, corregir la deriva y filtro de datos. Estos pasos son genéricos para la proyección de imagen de doble color dSTORM y no tipo específico de la muestra. Finalmente, se muestra cómo esta técnica ayuda a resolver la organización densa de las redes citoesqueléticas juntadas dos.
Agradecemos a Mickael Lelek, Orestis Faklaris Nicolas Bourg para la discusión fructífera, Andrey Aristov y Elena Rensen para ayuda con la técnica de súper-resolución y Shailaja Seetharaman para la cuidadosa lectura del manuscrito. Agradecemos Citech UtechS Bioimagen fotónica (Imagopole) del Instituto Pasteur (París, Francia), así como la red de infraestructuras de Bioimagen Francia apoyada por la agencia francesa de investigación nacional (ANR-10-INSB-04; Inversiones para el futuro) y la Région Ile (programa Domaine d'Intérêt mayor-Malinf) para el uso del microscopio Elyra. Este trabajo fue financiado por el el Ligue Contre le cáncer y la agencia francesa de investigación nacional (ANR-16-CE13-0019).

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