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Timestamp: 2018-09-19 00:04:34+00:00

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El Método del Tocino: Hay un límite que rompe el deseo : Nobel de Química 2014
Hay un límite que rompe el deseo : Nobel de Química 2014
En una entrega anterior del método del tocino hablamos sobre la naturaleza de la luz visible y la importancia que tiene el ser capaces de ver cosas progresivamente más pequeñas, especialmente para el estudio de los seres vivos. Conocimos también que hay un límite de resolución en todas las herramientas ópticas, el cual permaneció sin poder superarse por varios siglos. El premio Nobel de Química de este año fue otorgado a Eric Betzig, Stefan Hell y William Moerner por sus logros en mejorar la resolución en sistemas de fluorescencia. La maravilla de superar este límite de resolución, es que nos permite estudiar la naturaleza de manera más dinámica, incluso en organismos que permanezcan vivos. En la columna de esta semana, entenderemos cómo funciona la fluorescencia y cómo hizo el grupo de Stefan Hell (con su sistema STED) para superar esta barrera.
Recordemos que cualquier tipo de onda sólo interactúa con estructuras de tamaño similar a su longitud. Por ejemplo, la luz visible (~500 nanómetros) no es capaz de interferir con diversas estructuras moleculares (~10 nanómetros) de tal forma que podamos verlas directamente. Esto explica por qué no tiene mucho sentido hablar de color en estructuras tan pequeñas como los átomos, o el mismo ADN, pues interactúan con longitudes de onda que están muy lejos del espectro visible y muy por debajo del límite de resolución, unos 200 nanómetros (nm) aproximadamente, ver link.
La primera estrategia para ver más allá del límite de resolución se desarrolló alrededor de 1930, reemplazando la luz (compuesta de fotones) por electrones. Los electrones, al igual que los fotones, se comportan como ondas, sin embargo, los electrones además tienen carga y una pequeña masa. La diferencia es que su longitud de onda es tremendamente más pequeña que la de cualquier tipo de luz visible, por lo tanto, permiten un límite de resolución que va de 2 a 10 nm, osea, unas 100 veces mejor que un microscopio óptico convencional (figura 1).
Figura 1. Micrografía electrónica del ADN. Varias hebras de ADN se dispusieron en fibras para poder visualizarlo mejor, esquemas de la izquierda. En el inserto de la derecha es posible ver las hendiduras de la doble hélice que se indican con flechas rojas. Fuente: google images.
A pesar de las ventajas de la microscopía electrónica en cuanto a resolución, existe una gran limitante y ésta es que no sirve para estudiar organismos vivos, pues la gran energía que se transmite hace que literalmente se “quemen” las células bajo estudio. Entonces, ¿Podemos ir más allá con la luz visible?
Highway to (Stefan) Hell
Antes de continuar, primero tenemos que familiarizarnos con el concepto de emisión de luz visible desde la propia muestra. Frecuentemente, para estudiar componentes celulares muy pequeños es necesario hacer una marca específica con un emisor de luz. Esto suele hacerse mediante el uso de moléculas fluorescentes o fluoróforos. Un fluoróforo es una molécula capaz de excitarse con una longitud de onda específica para luego emitir luz, pero de un color diferente (figura 2A). Esto sucede porque los electrones que forman parte de la estructura electrónica de la molécula, al interactuar con un haz de luz de cierta frecuencia, pueden ser excitados a un estado de mayor energía que al decaer a su estado inicial emite una onda luminosa de menor frecuencia (la longitud de onda de emisión es siempre mayor que la de excitación), cuando esto ocurre hablamos entonces de fluorescencia. Uno de los fluoróforos más usados es la proteína fluorescente verde o "green fluorescent protein" (GFP); la proteína fluorescente roja o "red fluorescent protein" (RFP) o mezclas de colores que operan bajo el mismo principio como es el sistema “brainbow” para células del cerebro (figura 2C). Estos fluoróforos pueden estar acoplados mediante estrategias genéticas a diversas estructuras biológicas que se requiera estudiar. En la figura 2B, por ejemplo, se muestra una línea de ratones geneticamente modificados para expresar (producir) la proteína fluorescente verde acoplada a una proteína que se expresa específica y abundantemente en huesos. La única salvedad para poder ver estas maravillas es que necesitamos iluminar la muestra con una lámpara o láser de estimulación específico.Si queremos mejorar la resolución en estos sistemas, el desafío consiste en lograr una estimulación lo más fina posible pra luego hacer un "escaneo" completo de la imágen (ver link). Es en esta parte de la historia donde el ingenio humano se hace presente.
Figura 2. Fluoróforos. A. Esquema de emisión de fluorescencia por un electrón. B. Ratas transgénicas en donde la proteína fluorescente verde está asociada a una proteína del esqueleto. C. Corte de cerebro con neuronas y astrocitos marcados con fluorescencia mediante el sistema “Brainbow”. Fuente: google images
STED by me
La emisión de estos fluoróforos se comporta bajo los mismos límites de resolución que hemos mencionado anteriormente para la luz visible*. Sin embargo, existen diferentes estratégias, tanto físicas como de procesamiento de imágenes, que han permitido superar esta barrera. Dentro de la estrategias físicas, se encuentra la que usó Stefan Hell en 1994, mediante la depleción de emisión estimulada o STED (en inglés). Este fenómeno le ocurre a los fluróforos cuando sus electrones reciben estimulación adicional mientras están en el estado de máxima excitación. Esta energía “extra” se disipa luego en un estado de vibración, y al volver a su estado basal, les hace emitir una onda de muy baja frecuencia que no se detecta por el microscopio. De manera que se depleta (elimina) o apaga la emisión de señal en esta zona de sobre-estimulación. Este fenómeno físico ya había sido predicho por Einstein.
La genialidad del sistema STED consiste en tener un típico láser de estimulación, pero acoplado a un láser de eliminación o depleción de la fluorescencia. El láser de depleción forma una especie de dona tridimensional que rodea al láser de estimulación y sólo permite que exista emisión en una zona extremadamente pequeña de su centro (figura 3, izquierda). Este disco, se podría estrechar virtualmente de manera ilimitada, mejorando cada vez más la resolución * Con STED se ha podido establecer, por ejemplo, qué tan cerca están dos componentes moleculares como los que forman pequeños poros en la membrana del núcleo de las células (figura 3, derecha) y cómo se comportarían en el tiempo si es que diéramos las condiciones para que los sistemas sigan vivos. Por ejemplo, en el siguiente video (ver link) se muestra como se mueven filamentos de tubulina (componente del "esqueleto" celular) los cuales, al estar bajo el límite de resolución, serían imposibles de ver sin STED.
Figura 4. STED by STED. Izquierda, esquema de un microscópio con el láser de estimulación acoplado al de depleción, generando rayo de estimulación más estrecho en la muestra. Derecha, tinción con anticuerpos asociados a fluoróforos en componentes del complejo del poro de la membrana nuclear mediante microscopia confocal (tradicional) y por STED (derecha). Podemos ver que mientras la técnica no supera los 300 nm de resolución sólo vemos una nube borrosa, STED está cerca de los 20nm y permite distinguir estructuras finas. Fuente: google images.
En este artículo hemos mencionado la microscopía electrónica y STED como técnicas de “superresolución”. Sin embargo, esto es sólo el comienzo y a la fecha existen muchas más. Por otro lado, existen un sinnúmero de estrategias informáticas que superan el límite de resolución sin modificar aspectos físicos de la estimulación. Es inimaginable lo que el ser humano puede llegar a ver algún día, tanto en células y moléculas, como en las galaxias lejanas
* En 1873 Ernst Abbe describió la ecuación para el límite de resolución en telescopios y microscopios, mediante una ecuación idéntica a la de Raleigh, de forma simplificada : d= λ/2 NA. Donde d es la distancia mínima de resolución, λ es la longitud de onda de la luz incidente (recordemos que la luz visible tiene una longitud de onda que puede estar entre 400 y 700 nanómetros); NA es la apertura numérica del lente que se usa. El término apertura numérica (NA) fue introducido por Abbe y contempla el ángulo de incidencia de la luz (dependiente del lente) junto al índice de refracción del medio. La Refracción es básicamente el cambio de dirección que sufre cualquier onda cuando atraviesa un medio de diferente densidad, por ejemplo, como el paso de luz desde el aire al vidrio del lente que sucede en cualquier microscopio. Generalmente, en un buen microscopio de fluorescencia el límite de resolución está dado simplemente por λ/2
Con ciertos cálculos, del grupo de Stefan Hell, a la ecuación original de Abbe se agregan los términos I (intensidad del láser de depleción) e Isat (intensidad con que se logra la máxima excitación del fluróforo), podemos ver que la ecuación del límite de resolución de Abbe se extiende a lo siguiente: d= λ/2π NA Multiplicado por la raíz cuadrada de I dividido por Isat.
Publicadas por Alejandro Luarte a la/s 15:17
Etiquetas: Abbe, fluorescencia, Microscopía, Stefan Hell, Super resolución

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