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Mara Sacristán San Cristóbal. Eva María Díaz Peña. Borja Alarcón Aguareles. Carlos Vicente Córdoba. María Estrella Legaz González. - PDF
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Cristóbal Villalobos Castilla
1 Curso de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC): Prácticas de laboratorio y cuestiones teórico-prácticas. Parte III. Práctica de laboratorio: optimización en la separación de compuestos semejantes mediante modificación de la fase móvil Mara Sacristán San Cristóbal. Eva María Díaz Peña. Borja Alarcón Aguareles. Carlos Vicente Córdoba. María Estrella Legaz González. Departamento de Biología Vegetal I (Fisiología Vegetal). Facultad de Biología. Universidad Complutense de Madrid. Avenida José Antonio Novais, Madrid. España. Resumen: En la práctica que se plantea, el alumno debe resolver la separación de una mezcla de seis analitos en sus componentes individuales. Para ello se utilizan mezclas de fase móvil con eluciones isocráticas o en gradiente. El análisis de los resultados sobre factor de capacidad, eficiencia, selectividad y resolución, obtenidos en cada una de las condiciones de análisis, permite concluir las condiciones óptimas de la separación. Una vez elegida la mejor condición de análisis, se predice el orden de elución de los compuestos en función de sus características estructurales, masa molecular y polaridad, principalmente. Palabras clave: Analito. Eficiencia. Elución isocrática. Elución en gradiente. Fase estacionaria. Fase móvil. HPLC. Polaridad. Resolución. Selectividad. Separación. Tiempo de retención. INTRODUCCIÓN El objetivo primario que se persigue en la separación de componentes de una mezcla es la adecuada resolución (R s ) entre los picos, con la mayor pureza y en el menor tiempo posible. El sistema de HPLC debe ser seleccionado sobre la base de las separaciones que interesa realizar, escogiendo fases estacionarias, fases móviles y detectores adecuados y compatibles con la mezcla objeto de estudio. Normalmente, el analito de interés tarda entre 5 y 10 veces más tiempo en recorrer la columna que un analito no retenido, de tiempo muerto (t M ). El t M o V M (volumen muerto) puede ser estimado como se indica a continuación: V M Ldc 2 /2; t M Ldc 2 /2F 48
2 donde, F, es el flujo de fase móvil, en (ml min -1 ) y dc, el diámetro de la columna, en (cm). Bajo condiciones óptimas (cerca de H min ), el número de platos teóricos de una columna de longitud L es: N L (cm)/dp ( m) donde, dp, es el diámetro de partícula. Las partículas pequeñas reducen la difusión de Eddy (término A) y la distancia que el soluto debe difundir en la fase móvil (término C), (ver Introducción de la Parte I). Una vez seleccionada la fase estacionaria, la optimización de la separación queda restringida a variar la temperatura o la fase móvil. En la presente práctica se discutirá exclusivamente el efecto de la fase móvil. En el mecanismo de separación mediante reparto en fase reversa (RP-HPLC o RPC), la fase estacionaria es apolar y la fase móvil, moderadamente acuosa y polar. La fase estacionaria es sílice tratada con metil clorosilano de longitud de cadena variable (RMeSiCl), donde R, es una cadena lineal de grupos alquilo (C 18 H 37 ). En este tipo de fase estacionaria, las moléculas polares eluyen antes que las menos polares o apolares. Una buena separación cromatográfica requiere un equilibrio adecuado entre las fuerzas intermoleculares existentes entre soluto, fase móvil y fase estacionaria. Estas fuerzas intermoleculares se describen cualitativamente en términos de polaridad relativa de cada uno de los reactivos. Las polaridades en orden creciente para varios grupos funcionales del analito son: hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes. La polaridad de los distintos grupos funcionales se muestra en la Tabla 1. El agua es más polar que cualquier compuesto que contenga alguno de los anteriores grupos funcionales. La retención se puede incrementar añadiendo más agua a la fase móvil; haciendo la afinidad del analito hidrofóbico por la fase estacionaria hidrofóbica, más afín que por la fase móvil, ahora más hidrofílica. De igual manera, la retención puede disminuir añadiendo mayor cantidad de disolvente orgánico a la fase móvil. El mecanismo de fase reversa opera con el principio de fuerzas hidrofóbicas de tal manera que el ligamiento del analito a la fase estacionaria es proporcional a la superficie de contacto alrededor del segmento apolar del analito en asociación con el ligando en la fase móvil acuosa. Este efecto se denomina solvófobo (Fig. 1). La teoría del efecto solvófobo, propuesta por Horvath et al. (1976), propone que el soluto, debido a la alta tensión superficial de la fase móvil y a su propia hidrofobicidad, es expulsado de la fase móvil contra las cadenas hidrocarbonadas de la fase estacionaria. 49
3 CADENA HIDROCARBONADA DE LA FASE ESTACIONARIA Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, Grupo Funcional Momento Dipolar, (debyes) Amina -N= 0,8 a 1,4 Éter -O- 1,2 Sulfuro -S- 1,4 Tiol -SH 1,4 Ácido Carboxílico -COOH 1,7 Hidroxilo -OH 1,7 Halógenos -F -Cl 1,6 a 1,8 -Br -I Éster -COO- 2,3 Aldehído -CHO- 2,5 Cetona -CO- 2,7 Nitro -NO 2-3,2 Nitrilo -C=N- 3,5 Sulfóxido -SO- 3,5 Tabla 1. Polaridad de los diferentes grupos funcionales. Tomado de Smyth (1955). REDUCCIÓN EN EL VOLUMEN LIBRE PARTE NO POLAR FUERZAS DE VAN DER WAALS ENTRE ESPECIES QUÍMICAS SOLUTO CON UNA PARTE NO POLAR Y OTRA POLAR INTERACCIÓN ELECTROSTÁTICA CON EL DISOLVENTE PARTE POLAR INTERACCIÓN DE VAN DER WAALS CON EL DISOLVENTE REDUCCIÓN DE CAVIDAD EN EL DISOLVENTE Figura 1. Ilustración esquemática de la asociación entre una molécula de un soluto que contiene una parte polar y otra apolar con una cadena hidrocarbonada de la fase estacionaria, efecto solvófobo. Las flechas rellenas en color gris indican las fuerzas que tienden a unir y las flechas vacías, las fuerzas que tienden a separar. 50
4 Al elegir una columna para una separación cromatográfica mediante mecanismo de reparto, la polaridad de la fase estacionaria ha de ser bastante similar a la de los analitos y, para la elución, se utiliza entonces una fase móvil con polaridad considerablemente distinta. Este procedimiento por lo general resulta más adecuado que si las polaridades del soluto y de la fase móvil son parecidas, pero difieren mucho con respecto a la fase estacionaria. En resumen, para obtener buenas separaciones en un tiempo razonable, tienen que armonizarse las polaridades del soluto, la fase móvil y la fase estacionaria. Selección de la fase móvil en cromatografía de reparto De los tres métodos para mejorar la resolución de una columna basados en la variación del número de platos teóricos (N), factor de capacidad (k ) y selectividad (α), en cromatografía de líquidos, k es el más fácilmente manipulable de los tres debido a que este parámetro depende considerablemente de la composición de la fase móvil. Para una separación adecuada: - 0,5 k 20 - R s 2 - P 15 MPa (150 bar) - 0,9 factor asimetría (A s ) 1,5 En algunos casos, el ajuste de k no es suficiente para obtener picos individuales sin superposición y entonces se debe recurrir a la variación de α. La forma más fácil de producir variaciones en α es modificando la composición de la fase móvil, procurando mantener k dentro de un intervalo razonable. La optimización de la fase móvil puede realizarse con dos métodos diferentes: 1. Método de elución isocrática (= composición constante), palabra acuñada por Csaba Horvath de la Yale University, uno de los pioneros en HPLC. Se lleva a cabo con un solo disolvente o con una mezcla de disolventes, constante, en el tiempo de análisis. 2. Método de elución en gradiente. Se lleva a cabo variando de forma continua la composición de los disolventes de forma que su fuerza vaya incrementando durante el tiempo de análisis (Fig. 2). Normalmente se procede de esta forma, utilizando una fuerza de fase móvil más débil al principio para ir incrementándola después. Existe dos tipos de gradientes: Lineales (curva 5). La velocidad de cambio del disolvente fuerte es lineal en el tiempo. Exponenciales. (curvas 1 a 4 y 6 a 9). Éstos a su vez pueden ser: - Convexos (curvas 1-4). Rápidas en alcanzar la composición final de la fase móvil. Se utilizan para picos superpuestos al final del cromatograma. 51
5 - Cóncavos (curvas 6-9). Lentas en alcanzar la composición final de la fase móvil. Se utilizan para picos superpuestos al principio del cromatograma. Los diferentes tipos de gradientes se muestran en la Fig CONCENTRACIÓN FINAL DE A EN (A+B) CONCENTRACIÓN INICIAL DE A EN (A+B) TIEMPO Figura 2. Diferentes tipos de gradientes de fase móvil. A, representa el disolvente más fuerte y B, el disolvente más débil en términos de fuerza extractiva de los solutos. Efecto de la fuerza del disolvente sobre k A los disolventes que interaccionan fuertemente con los solutos, a menudo se les denomina disolventes fuertes. Para descubrir cuantitativamente la polaridad de los disolventes se han desarrollado varios índices. El más útil en cromatografía de reparto es el índice de polaridad, desarrollado por Snyder (P ). También se utilizan el parámetro de solubilidad de Hildebrand ( ), (Hildebrand y Scott, 1962) y la fuerza eluotrópica como disolvente ( o ). A continuación se describe brevemente cada uno de ellos. a) Índice de polaridad (P ) Utilizando los datos de Rohrschneider (1969), Snyder en 1978, calculó los nuevos coeficientes de reparto corregidos (K g ) para interacciones dispersivas y efectos de la masa molecular. Sabiendo que: K s = s s / s m log K g = log K g log K v 52
6 donde, K g = K g V s y, K v, es un valor de K g para un hipotético n-alcano con el mismo volumen molar del soluto. Asumiendo que hay tres interacciones moleculares aditivas donación de protones (d), aceptación de protones (e) y dipolos fuertes (n), el coeficiente de reparto corregido para cada efecto contribuiría al total del índice de polaridad (P ), de manera que: P = log (K g ) d + log (K g ) e + log (K g ) n donde los subíndices d, e y n se refieren a las tres fuerzas. Este índice de polaridad mide la atracción intermolecular entre un soluto y un disolvente y, en resumen, se basa en las medidas de solubilidad para la sustancia en cuestión en tres disolventes: dioxano (un aceptor de protones de dipolo débil), nitrometano (un aceptor de protones de dipolo intenso) y etanol (un donador de protones de dipolo intenso). P, por tanto, es una medida numérica de la polaridad relativa de varios disolventes. El índice varía entre 10,2 para un compuesto muy polar como el agua hasta 2 para fluoroalcanos muy poco polares. En la Tabla 2 se muestran los valores de éste y otros índices que ahora comentaremos, así como alguna de las propiedades de los disolventes más comúnmente utilizados como fases móviles en HPLC. Snyder fue más allá y calculó también tres parámetros de selectividad representativas de las tres fuerzas ( d ), ( e ) y ( n ) que no son objeto de estudio en este momento. b) Parámetro de solubilidad de Hildebrand ( ) Este parámetro, a diferencia de P, se define para un disolvente puro y fue introducido para predecir la solubilidad de unos líquidos en otros. El índice es una medida de las fuerzas entre moléculas o, de la presión interna de una substancia. En la práctica se define como función de polaridades y se expresa como: = ( E vap / V) 1/2 donde, E vap, es la energía molar de evaporación, en (J cm -3 ) y V, el volumen molal del líquido. A bajas tensiones de vapor, esta igualdad se corresponde con la energía de vaporización por cm 3. Los valores de incrementan con la polaridad, desde un valor 6 para los alcanos fluorosubstituidos a 21 para el agua (Tabla 2). En la actualidad, se tienden a utilizar con más frecuencia las series eluotrópicas. 53
7 Disolvente Índice de refracción Límite inferior de transparencia en el UV Punto de ebullición ( C) Viscosidad a 20 ºC (cp) Parámetro de Hildebrand (η) ( ) Índice de polaridad (P ) Fuerza eluotrópica ( o enal 2 O 3 ) iso-octano 1, ,2 0,5 7 0,4 0,01 0,01 n-hexano 1, , ,3 0 0,01 0,03 ciclohexano 1, ,7 0,98 8,2 0 0,04 0,04 n-decano 1, ,1 0,92 7,8 0,3 0,04 tetracloruro de carbono 1, ,5 0,97 8,6 1,7 0,18 0,12 iso-propil éter 1, ,3 0,33-0,37 7,3 2,2 0,28 0,22 tolueno 1, ,6 0,59 8,9 2,3 0,29 0,23 benceno 1, ,1 0,65 9,2 3 0,32 0,25 cloroformo 1, ,2 0,57 9,2 3,4-4,4 0,36-0,4 0,26 diclorometano 1, ,44 9,6 3,4 0,4 0,32 cloruro de metileno 1, ,8 0,44 9,7 3,4 0,42 0,32 tetrahidrofurano 1, ,55 9,1 4,2 0,45 0,35 dicloruro de etileno 1, ,5 0,79 9,7 3,7 0,49 0,38 metil etil cetona 1, ,43 9,3 4,5 0,51 0,39 Acetona 1, ,3 0,32 9,6 5,4 0,56-0,58 0,47-0,53 Acetonitrilo 1, ,6 0,37 11,7 6,2 0,55-0,65 0,46 Acetato de etilo 1, ,1 0,46-0,47 9,1 4,3 0,58 0,41 Acetato de metilo 1, ,3 0,37-0,45 9,2 4,4 0,6 Dimetil sulfóxido 1, ,24 12,8 6,5 0,62 Piridina 1, ,3 0,94 10,7 5,3 0,71 2-metoxietanol 1, ,6 1,72 5,7 0,74 2-propanol 1, ,4 2,35 4,3 0,82 Etanol 1, ,7 1,2 12 5,2 0,88 0,68 Metanol 1, ,3 0,6 13,7 6,6 0,95 0,73 Ácido acético 1, ,7 1,1-1,26 12,4 6,2 alto agua 1, , alto Fuerza eluotrópica ( o en SiO 2 ) o Tabla 2. Algunas propiedades de los disolventes más utilizados en HPLC. Los parámetros η,, P y definidos en el texto. Tomada de eluotropic_series_extended.html. c) Fuerza eleutrópica o fuerza como disolvente ( o ) Este parámetro define la energía de adsorción de cada disolvente por unidad de o superficie de sílice respecto al valor de del pentano, que es igual a zero. Cuanto mayor es la polaridad del disolvente, mayor es su valor de o. En la Tabla 2 aparecen representados estos valores para los disolventes más utilizados. Los valores de o para otros adsorbentes como alúmina fueron calculados por Snyder (1968), quien demostró la siguiente relación: o (sílice)= 0,77 o (alúmina) Siempre y cuando los disolventes sean miscibles (ver Tabla. 3), se pueden hacer combinaciones binarias, ternarias o incluso cuaternarias variando las proporciones de cada uno de ellos con objeto de obtener una amplia gama de valores de o. Aunque 54
8 depende del sistema cromatográfico empleado y el valor de o no varía linealmente con la composición de una mezcla, en la práctica resulta útil la siguiente aproximación: o mezcla % mezcla = o 1 % 1 + o 2 % 2 Queda lo suficientemente claro que a mayor valor de del disolvente pero conviene recordar que: o, mayor es la polaridad En cromatografía de reparto en fase normal, la fuerza de arrastre de la fase móvil es mayor cuanto mayor sea su valor de o. Por ejemplo, una fase móvil de n-hexano puro ( o = 0,01) tiene menor fuerza de arrastre que una mezcla de n- hexano:cloroformo (50:50, v/v) ( o = 0,205). En cromatografía de reparto en fase reversa, la fuerza de arrastre de la fase móvil es menor cuanto mayor sea su valor de o. Por ejemplo, una fase móvil de acetonitrilo puro ( o = 0,65) tiene menor fuerza de arrastre que una mezcla de acetonitrilo:acetona (50:50, v/v) ( o = 0,605). Se había subrayado que la forma más fácil de mejorar R S de dos especies es manipular el valor de k, el cual puede a su vez modificarse cambiando el valor de la polaridad. Normalmente, un cambio de 2 unidades en el valor de P origina una variación de unas 10 veces en k. La elución en gradiente disminuye la retención de los últimos solutos haciendo que eluyan antes y sean más estrechos. También incrementa la altura del pico, lo cual es importante en análisis de trazas. El programa de gradiente puede incluir pasos de incremento rápido en la concentración del componente orgánico (el disolvente de mayor fuerza de arrastre, esto es, el menos polar en fase reversa) o pendientes a diferentes tiempos, de acuerdo a la separación óptima deseada. A continuación, se enumeran una serie de reglas generales para las operaciones en gradiente: a) La utilización de gradiente está justificada cuando se trata de mezclas de componentes con un amplio rango de polaridad. b) Es conveniente hacer primero un gradiente amplio (entre el 5% y el 100% de disolvente fuerte, en minutos), para decidir si se utiliza una elución isocrática o en gradiente. Si t R / t G > 0,25, utilizar elución en gradiente. Si t R / t G < 0,25, utilizar elución isocrática. donde, t R, es la diferencia en t R entre el primero y el último pico del cromatograma y t G, el tiempo de gradiente: el tiempo en el que cambia la composición de la fase móvil. 55
9 c) Si una vez realizado el paso anterior, se elige hacer un gradiente, eliminar las porciones de éste, anterior a la elución del primer pico y posterior a la elución del último pico. Hacer entonces el mismo gradiente mencionado en b). d) Si la separación que se obtiene es aceptable, hay que intentar reducir el tiempo del gradiente para reducir el tiempo de análisis. Si la separación no es aceptable intentar otro tipo de gradiente no lineal. Una vez terminado el análisis en gradiente, la columna debe ser equilibrada de nuevo antes de hacer la siguiente inyección. Para ello se realiza un re-equilibrado que consiste en volver a las condiciones iniciales de composición de la fase móvil. Normalmente se realiza en unos 20 minutos pero es el cromatografista quien lo decide en función de las propiedades de la muestra y el sistema cromatográfico. En la práctica que se plantea a continuación, se realizarán eluciones con fases móviles isocráticas y en gradiente, sin modificaciones de la fase estacionaria ni variación de la temperatura con objeto de obtener los valores más indicados de k. Tabla 3. Tabla de miscibilidad de algunos disolventes empleados en HPLC. Tomada de 56
10 OBJETIVO DE LA PRÁCTICA El objetivo que se plantea es la separación de seis substancias de estructura molecular semejante en el menor tiempo posible, con la mejor R s y los valores más adecuados de k. Para ello, se realizarán separaciones cromatográficas en distintas condiciones de fase móvil, sin variar la fase estacionaria ni la temperatura. En primer lugar, se trabajará en condiciones isocráticas y después en gradiente de fase móvil. Se calcularán los siguientes parámetros: k, R s, y N para cada pico (o pareja de picos contiguos) obtenido y se discutirá cuál de los gradientes planteados por los alumnos es mejor y por qué. Por último, deberá discutirse y justificarse el orden de elución de las seis substancias separadas. En esta práctica, es el alumno el que debe plantear, en discusión con sus compañeros y el profesor, las condiciones de fase móvil que resultarían oportunas para la mejor separación cromatográfica. El profesor debe ir discutiendo con ellos las condiciones más adecuadas y evitar, en la medida de lo posible, que se pierda tiempo en pruebas que no conduzcan a resultados plausibles. MATERIAL Y MÉTODOS Equipo cromatográfico. Cromatógrafo de Líquidos de Alta Resolución Cromatógrafo líquido. Spectra Physics 8810 (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA), con un loop de inyección de 20 L. Bomba. SP 8810 LC (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA), eléctrica alternante de pistón recíproco. Fase estacionaria. Columna: Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain). Tipo: Fase Reversa. Longitud (L): 120 mm. Diámetro de partícula (dp): 5µm. Diámetro interno (di): 4,6 mm. Temperatura. 25 o C. Fase móvil. Reservorio A: Acetonitrilo (ACN). Reservorio B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q. Fase móvil: Según se especifique en cada condición. Flujo de fase móvil: Según se especifique en cada condición, en (ml min 1 ). 57
11 Detector SP 8490 UV-Visible (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA). Longitud de onda de análisis: 280 nm (según los máximos de absorbancia obtenidos en los diferentes espectros de absorbancia de los seis analitos objeto de estudio, (ver Figs. 4 a 9). Rango (UAFE): 0,005 unidades. Sistema de integración. DataApex Clarity Lite TM software para Windows (DataApex Ltd., Praha, Czech Republic). Muestras empleadas y composición de la mezcla Se trata de seis fenoles de diversa naturaleza, de masa molecular (M.M.) distinta. La estructura de cinco de ellos es similar y la de otro, ácido clorogénico, diferente. La fórmula estructural de cada uno de ellos se muestra a continuación (Fig. 3). O OH HO O HO O OH OH Ácido clorogénico (M.M.=354,31) OH CH=CH-COOH COOH CH 3 O CH 3 O OCH 3 OH Ácido ferúlico (M.M.=194,2) OH Ácido siríngico (M.M.=198,2) COOH CH=CH-COOH CH=CH-COOH HO OH Ácido p-hidroxibenzoico (M.M.=138,1) OH Ácido cafeico (M.M.=180,2) OH Ácido p-cumárico (M.M.=164,2) Figura 3. Estructura molecular de los ácidos clorogénico, ferúlico, siríngico, p-hidroxibenzoico, cafeico y p-cumárico. 58
12 Composición cuantitativa La concentración de todos ellos, excepto la de ácido clorogénico, es igual, 0,16 mg ml -1, lo que da una masa inyectada de 3,3 ng. El ácido clorogénico se prepara a una concentración casi tres veces mayor, 0,5 mg ml -1, que da una masa inyectada de 10 ng. La composición cuantitativa de la muestra se muestra en la Tabla 4. Sustancia Concentración (mg ml -1 ) Masa inyectada (ng) Ácido cafeico 0,16 3,3 Ácido clorogénico 0,5 10 Ácido ferúlico 0,16 3,3 Ácido p-cumárico 0,16 3,3 Ácido p-hidroxibenzoico 0,16 3,3 Ácido siríngico 0,16 3,3 Tabla 4. Composición cuantitativa del contenido de la mezcla de análisis. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Lo primero que debe realizarse, como en los casos anteriores, es un espectro de absorbancia de cada uno de los analitos disueltos en 4% ácido acético en agua Milli- Q:ACN (80:20, v/v). En las Figs. 4 a 9 se muestran estos espectros. Excepto los ácidos siríngico y p-hidroxibenzoico que sólo muestran un máximo principal de absorbancia, todos tienen dos máximos, uno en el entorno de nm y el otro a nm. Sobre esta base, se elige una longitud de onda de análisis a la que todos los analitos muestren una cierta absorbancia. La situación de compromiso que se acepta es 280 nm, aunque podría haberse escogido otra longitud de onda en el entorno, siempre teniendo en cuenta los criterios de absortividad de todos los analitos presentes en la muestra problema. 59
13 2 1 Figura 4. Espectro de absorción del ácido clorogénico a una concentración de 5 g ml -1 disuelto en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los máximos de absorción a 235 nm y 330 nm respectivamente. 2 1 Figura 5. Espectro de absorción del ácido ferúlico a una concentración de 5 g ml -1 disuelto en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los máximos de absorción a 240 nm y 325 nm respectivamente. 60
14 1 Figura 6. Espectro de absorción del ácido siríngico a una concentración de 5 g ml -1 disuelto en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el número 1 representa el máximo principal de absorción a 280 nm. 1 Figura 7. Espectro de absorción del ácido p-hidroxibenzoico a una concentración de 5 g ml -1 disuelto en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, el número 1 representa el máximo principal de absorción a 256 nm. 61
15 2 1 Figura 8. Espectro de absorción del ácido cafeico a una concentración de 5 g ml -1 disuelto en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los máximos de absorción a 235 nm y 325 nm respectivamente. 2 1 Figura 9. Espectro de absorción del ácido p-cumárico a una concentración de 5 g ml -1 disuelto en 4% ácido acético en agua Milli-Q:ACN (80:20, v/v). Sobre la curva, los números 1 y 2 representan los máximos de absorción a 235 nm y 310 nm respectivamente. 62
16 Una vez escogida la longitud de onda de análisis, 280 nm, sin modificar la fase estacionaria, se procede a trabajar con diferentes fases móviles. Según se comentó, estas fases pueden ser constantes en su composición a lo largo del tiempo de análisis (procedimiento isocrático) o variar a lo largo del tiempo (procedimiento en gradiente). Si vamos de lo más sencillo a lo más complejo, debemos empezar por los análisis isocráticos. 1. Análisis isocráticos Se plantean tres tipos de análisis isocráticos, según se muestra a continuación en la Tabla 5. Análisis isocrático (nº) Reservorio A (%) Reservorio B (%) Flujo (ml min -1 ) , , ,7 Tabla 5. Análisis isocráticos planteados. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q. En los tres tipos de análisis se mantiene constante, tanto la composición de la fase móvil como la velocidad de flujo de ésta. El análisis isocrático nº 1 tiene una fase móvil con una fuerza de arrastre muy grande, pues el acetonitrilo (ACN) está en una alta proporción. Los análisis isocráticos nº 2 y nº 3 tienen menor proporción de ACN en la mezcla y, por tanto, la fuerza eluotrópica de la fase móvil es menor. La diferencia de proporción de ACN entre el 70% y el 80% puede ser importante a la hora de la separación. Se procede entonces a inyectar la muestra problema, preparada a la concentración que se especificó en la Tabla 4, en cada una de estas condiciones de análisis. En las Figs y en las Tablas 6-8 se muestran los cromatogramas obtenidos en cada uno de estos análisis, así como los resultados de la respuesta del detector, en cuentas de área y en porcentaje de cada pico. Cromatograma obtenido mediante las condiciones del análisis isocrático nº1 En las condiciones de análisis isocrático nº 1 (Fig.10 y Tabla 6) sólo se obtiene un pico aun habiendo inyectado una muestra que estaba compuesta por seis substancias. Todos los analitos eluyen juntos porque no da tiempo suficiente a que se produzca el correspondiente equilibrio de cada uno de ellos entre las fases estacionaria y móvil. 63
17 Unidades de Absorbancia Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, Tiempo (minutos) Figura 10. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis isocrático nº 1, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q) (70:30, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 ml min -1. Pico (número) Resultado (%) t R (min) Cuentas de área ( 10 6 ) 1 99,5 3,17 318,07 Tabla 6. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis isocrático nº 1, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (70:30, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 ml min -1. Cromatograma obtenido mediante las condiciones del análisis isocrático nº2 En las condiciones de análisis isocrático nº 2 aparecen cuatro picos claros y resueltos (Fig. 11) con los tiempos de retención especificados en la Tabla 7. Existe un quinto pico, de t R =4,18 min que no queda resuelto del siguiente (del pico de 4,36 min que llamamos nº 3 en la Tabla 7) pero que comienza a aparecer. 64
18 Unidades de Absorbancia Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, Tiempo (minutos) Figura 11. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis isocrático nº 2, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (30:70, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 ml min -1. Pico (número) Resultado (%) t R (min) Cuentas de área ( 10 6 ) 1 16,17 3,39 57,66 2 8,38 4,18 29, ,31 4,36 158, ,96 5,39 74, ,18 5,71 36,3 Tabla 7. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis isocrático nº 2, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (30:70, v/v) y un flujo 0,7 ml min -1. Cromatograma obtenido mediante las condiciones del análisis isocrático nº3 En las condiciones del análisis isocrático nº 3 (Fig. 12 y Tabla 8), aparecen cinco picos, aunque la resolución entre el segundo y el tercero no es buena. Al haber disminuido la fuerza eluotrópica de la fase móvil, los solutos son capaces de interaccionar más tiempo con la fase estacionaria y retenerse más en ella, logrando así una mejor separación. La Tabla 9 muestra un resumen de los picos obtenidos en cada condición de análisis isocrático. 65
19 Unidades de Absorbancia Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, Tiempo (minutos) Figura 12. Cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis isocrático nº 3, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (20:80, v/v) y una velocidad de flujo 0,7 ml min -1. Pico (número) Resultado (%) t R (min) Cuentas de área ( 10 6 ) 1 20,9 4,88 59,8 2 8,21 5,66 23, ,48 5,96 155,9 4 9,7 8,47 27,76 5 6,72 9,44 19,22 Tabla 8. Tabla del cromatograma de la mezcla de los seis fenoles, realizado según las condiciones del análisis isocrático nº 3, con una composición de fase móvil: ACN: 4% ácido acético en agua Milli-Q (20:80, v/v) y un flujo 0,7 ml min -1. Análisis Isocrático (nº) Reservorio A Reservorio B Flujo (%) (%) (ml min -1 ) nº de picos Tiempos de retención (min) ,7 0,7 0, t R1 =3,17 t R1 =3,39 t R2 =4,18 t R3 =4,36 t R4 =5,39 t R5 =5,71 t R1 =4,88 t R2 =5,66 t R3 =5,96 t R4 =8,47 t R5 =9,44 Tabla 9. Resultados de los análisis isocráticos. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q. 66
20 % A en (A+B) Reduca (Biología). Serie Técnicas y Métodos. 4 (3): 48-78, Análisis en gradiente A la vista de los resultados obtenidos mediante procedimientos isocráticos, se plantea la posibilidad de realizar un gradiente con objeto de obtener la separación completa de los seis solutos componentes de la muestra. El primer gradiente que se plantea es el que se refleja en la Tabla 10. Se trata de un gradiente lineal con dos pendientes diferentes; en los primeros 15 min más suave y algo más pronunciada entre los 15 y los 30 min, de forma también lineal. En la Fig. 13 se representa de forma gráfica, explicando también el re-equilibrado programado para la recuperación de la columna y la vuelta a las condiciones iniciales de fase móvil re-equilibrado re-equilibrado Gradiente 1 Gradiente 2 Gradiente Tiempo (minutos) Figura 13. Representación gráfica de los gradientes empleados y su correspondiente re-equilibrado. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q. TIEMPO (min) %A %B Flujo (ml min -1 ) , , , , , ,7 Tabla 10. Desglose de las distintas etapas que conforman el gradiente nº 1. A: Acetonitrilo (ACN) y B: 4% de ácido acético en agua Milli-Q. 67
Borja Alarcón Aguareles. Eva María Díaz Peña. Mara Sacristán San Cristóbal. Carlos Vicente Córdoba. María Estrella Legaz González.
Curso de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC): Prácticas de laboratorio y cuestiones teórico-prácticas. Parte IV. Cuestiones Teórico-Prácticas Borja Alarcón Aguareles. Eva María Díaz Peña.

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