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Timestamp: 2019-05-21 08:43:10+00:00

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Ppts de Crisis Convulsivas (1)
Convulsion Febril y estatus convulsivo
convulsiones febriles protocolo
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Tema 16 al 19
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ARCHIVO HISTORIÇQ
"Diseño y validación de un método analítico para la cuantificación de ácido valpróico en materia prima por electroforesis capilar"
PERTENECE AL PROYECTO GENÉRICO:
"Evaluación de productos relacionados con la salud".
Alumno: Agustín Flores Luna
Matrícula: 99345658
Asesores: M. en C. Ma. Luisa Margarita Vázquez Ramírez M. en C. Edilberto Pérez Montoya
LUGAR DE REALIZACIÓN: Departamento de Biofarmacia en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional.
FECHA DE INICIO: Febrero, 2003 FECHA DE TÉRMINO: Octubre, 2003
1. Características generales del ácido valproico
Características generales de la electroforesis capilar
III. Validación de métodos analíticos en electroforesis capilar
OBJETIVO GENERAL Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS DESARROLLO EXPERIMENTAL RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS CONCLUSIONES REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS RESUMEN ANEXOS
El ácido vaiproico (Ay), así como sus sales de sodio y magnesio han sido reconocidos como uno de los antiepilépticos de primer nivel, de amplio espectro activos frente a muy diversos tipos de crisis epilépticas (generalizadas convulsivas y no convulsivas).
El AV es uno de los antiepilépticos más utilizados en todo el mundo, principalmente en monoterapia, y a diferencia de otros fármacos está indicado en todos los tipos de epilepsia como medicamento de primera línea. (1)
Actualmente el método analítico para la valoración del AV como materia prima está reportado en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (2) y en la farmacopea Europea por medio de una titulación con hidróxido de tetrabutil amonio e hidróxido de sodio respectivamente, las cuales son metodologías de baja especificidad y sensibilidad, así como baja precisión. En la farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) se utiliza una metodología analítica desarrollada por cromatografía de gases, en la cual se emplean temperaturas elevadas, presiones de gas elevada y en donde se utilizan disolventes orgánicos para la preparación de la muestra, a diferencia de la metodología por electroforesis capilar, en la que se trabaja a temperatura ambiente, con agua como disolvente y en ocasiones bajas concentraciones de disolventes orgánicos, y sales inorgánicas; obteniendo electroferogramas de alta sensibilidad y eficiencia a tiempos de migración relativamente cortos y con bajos riesgos a la seguridad del analista.
Como en cualquier método analítico, es necesario tener bajo control las variables críticas, para obtener un método confiable, lo cual sólo se demuestra con la validación del mismo (4).
1.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DEL ÁCIDO VALPRÓICO
El AV es un líquido ligeramente viscoso e incoloro y tiene un olor característico (5).
1.1 Nombres químicos
El AV es conocido como Ácido 2-propilpentanóico, ácido n-diropiI acético, ácido 2-propil valérico y DPA
1.2 Peso molecular, fórmula desarrollada y condensada.
P.M.: 144.21 g/mo!
2.0 Propiedades fisicoquímicas 2.1 Constante de disociación
En experimentos realizados (5), se demostró que el valor de pKa del
AV es de 4.6.
Los siguientes valores de solubilidad han sido determinados para AV a temperatura ambiente:
>10% y/y
>10%v/v
NaOH aq. 1 N
HcI aq. 0.1 N
2.3 Espectro UI! e IR
El Espectro UY que se muestra a continuación es a partir de una solución de AV al 0.1% en metano!. El barrido se realizó de 400 a 205 nm y se encontró la
longitud de onda máxima a los 213 nm (E = 86). El experimento se llevó a cabo en im espectrofotómetro Beckman Acta V.
ESPECTRO UVNIS ÁCIDO VALPROICO
di. u.
WÁVENQnI(n4
El espectro infrarrojo fue medido usando el método capilar.
ESPECTRO INFRARROJO ÁCIDO VALPROICO
J5Ø:
2.4 Índice de refracción
IDO: 7w
El AV tiene un índice de refracción de ND245: 1.425
La gravedad específica del AV a 25 oc tiene un valor de 0.904 g/mL
3.0 Estabilidad
El AV es un compuesto muy estable. No se ha observado degradación por la acción del calor, la luz, soluciones alcalinas y ácidas fuertes. (5)
4.0 Usos
Es un ácido graso, con un perfil único de acción anticonvulsivante tanto desde el punto de vista experimental como clínico. En dosis no tóxicas es eficaz contra convulsiones tónicas inducidas por electroshock o por estricnina, así como contra convulsiones de umbral mínimo inducidas por petilenetetrazol, bicuculina o picrotoxina. La eficacia clínica confirma este amplio espectro de actividad anticonvulsivante. Es uno de los fármacos de elección en el manejo de las convulsiones con ausencias simples. De manera similar, responden bien las convulsiones con ausencias atípicas y las epilepsias mioclónicas y como no ha habido una droga completamente satisfactoria para estos tipos de epilepsia de la infancia, ésta constituye un importante avance. También es eficaz en convulsiones tónico-clónicas generalizadas. En algunos pacientes refractarios, ha sido utilizada eficazmente para tratar las convulsiones parciales con sintomatología compleja (temporales o psicomotoras) o convulsiones mioclónicas y acinéticas. A semejanza de la carbamazepina, el valproato ha sido empleado con algún éxito en el manejo de trastornos bipolares y en el tratamiento de la agresión o la violencia. (6)
5.0 Farmacocinética y metabolismo del fármaco
El AV es un fármaco que se une a las proteínas plasmáticas, el volumen de distribución oscila entre 0.1 a 0.5 L/kg (media 0.2 L/kg) y la vida media varía desde 6 hasta 17 h en los adultos y de 4 a 14 h en niños. El nivel plasmático terapéutico oscila entre 50 y 100sg/mL, los niveles superiores a lOOj.tg/mL son potencialmente tóxicos. En sangre y en orina humanas, se han identificado más de diez metabolitos. Sólo del 0.5 al 20% se elimina sin cambios por la orina. De los diferentes metabolitos, sólo el ácido 2-propil-2 pentanóico (2-en-VPA) se acumula
en el cerebro. El matabolito 2-en-VPA es aproximadamente 1.3 veces más potente que la droga original, y puede contribuir significativamente al efecto anticonvulsivante del vaiproato administrado crónicamente. (7)
El mecanismo preciso de su acción anticonvulsivante es aún desconocido. Se ha postulado que inhibe la GABA transminasa y, de ese modo, aumenta la concentración del GABA cerebral. Sin embargo, otros ácidos grasos de cadena lineal saturados (propiónico, butírico y pentanóico), que carecen de propiedades anticonvulsivantes, son inhibidores más potentes de la GABA transaminasa que el AV. También se ha comunicado una fuerte correlación entre la potencia anticonvulsivante del valproato y de otros ácidos grasos de cadena ramificada y la capacidad de reducir la concentración de aspartato cerebral. (7)
El AV puede disminuir la unión a proteínas séricas o bloquear el metabolismo hepático del fenobarbital. La administración del fármaco a pacientes en el estado de equilibrio mientras están medicados con fenobarbital (o primidorna, que se metaboliza a fenobarbital) puede aumentar los niveles séricos de fenobarbital del 35 al 200% y causar somnolencia excesiva. Evidencias actuales indican que esto se debe a una inmediata disminución en la velocidad de eliminación del fenobarbital. Esta droga interactúa impredeciblemente con la fenitoína, se la ha asociado no sólo con niveles séricos disminuidos de fenitoína y aumento de las frecuencias de las convulsiones, sino también con niveles aumenados de fenitoína libre y toxicidad por fenitomna. Se ha hallado que el valproato aumenta significativamente la depuración del felbamato y, por lo tanto, reduce su concentración plasmática. A la inversa, el fenobarbital, la primidona, la fenitoína y otros agentes pueden inducir enzimas que metabolizan este fármaco, y reducen su vida media. (7)
Por el contrario, el felbamato aumenta la concentración plásmática del valproato, cuando se administran simultáneamente.
Se han comunicado más de 40 casos de insuficiencia hepática fatal en pacientes que recibieron este tratamiento. El riesgo de insuficiencia hepática es extremadamente menor en pacientes con monoterapia (ca 1/37.000) que en los que reciben politerapia (1/6500). Por otra parte, la incidencia es mucho mayor en niños menores de 2 años y en politerapia (monoterapia 1.42/10.000 ; politerapia, ca
1/500).
Los efectos colaterales más frecuente en pacientes que reciben monoterapia (valproato) son aumento de peso (11%), sedación (10%), náuseas (6%), cefalea (3%), temblor (3%) , caída del cabello (1%) y mareos (1%). Otros efectos adversos poco frecuentes son erupciones cutáneas, enuresis, insomnio, ansiedad, fatiga y parestesias. Se han comunicado efectos teratogénicos en animales. Sin embargo, su uso para mujeres con epilepsia durante el primer trimestre (3 meses) del embarazo comunicado por el Centro para Control de las Enfermedades (Centers for Diseases Control, USPHS) parece estar asociado con un mayor riesgo (1.2%) de espina bífida en sus hijos.
Aunque la mayoría de las mujeres con epilepsia que toman esta medicación tienen hijos no afectados, se recomienda realizar las pruebas prenatales para evaluar los defectos de la médula espinal. (7)
6.0 Dosis
Adulto y pediátrico, inicialmente, 15 mg/kg/día; aumentar a intervalos de 1 semana de 5 a 10 mg/kg/día; dosis máxima diaria 30 mg/kg (algunos pacientes pueden necesitar hasta 60 mg/kg/día). Si la dosis diaria excede los 250 mg debe administrarse fraccionada. (6)
Cápsulas: 250 mg; jarabe: 250 mg en 5 mL.
II.- CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA ELECTROFORTESIS CAPILAR (EC)
1.0 Definición de electroforesis
La electroforesis ha sido definida como el movimiento o desplazamiento diferencial de especies cargadas (iones), sustancias neutras o migración pasiva, por atracción o repulsión en un campo eléctrico. (3)
Las técnicas que más se han desarrollado están en la actualidad aplicadas al campo de las proteínas y productos de la biología molecular, como son los geles de agarosa y proliacrilamida en placas o películas de distinto espesor verticales u horizontales (figl).
Gel verdcal
Gel hoñzoxilal
Fig 1. Electroforesis en placa
1.1 Características de la EC
El empleo de capilares para la separación de sustancias neutras o iones cargados eléctricamente, apareció en 1967 en un experimento desarrollado por Hjerten empleando capilares milimétricos, los que eran cortados a través de su sección longitudinal para evitar los efectos de la convección. Virtanen y Mikkers en
1979 desarrollaron las separaciones empleando electroforesis en capilares de 200 jim de diámetro interno en vidrio y teflón respectivamente.
En 1980, Jorgenson y Lukacs empleando técnicas avanzadas en la obtención de capilares de sílica fundida utilizan diámetros de 75 pm y Jorgenson clarifica teóricamente las relaciones entre los parámetros operacionales y las cualidades de la separación revelandó el elevado potencial analítico de esta técnica.
Los capilares de 75 a 100 cm de largo y con diámetros internos de 50-70-100 tm y de 300 a 400 im de diámetro externo son los que permiten una capacidad elevada de resolución. (3) N>200.000 platos /m.
La fuerza electroosmótica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie interna de capilar da como resultado una corriente plana del frente de liquido que contrasta con el frente parabólico de la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) (fig. 2).
Frenteplanar -
Frente pwabókco - HPIC
rio. a comparación entre Ec y HF'LC
La EC separa iones de acuerdo a la movilidad del electrolito en lugar de una interacción con la fase estacionaria, por lo que se detectan primero los cationes pequeños mono y divalentes, posteriormente los cationes de mayor peso
molecular y moléculas neutras y por último los aniones mayor y menor peso
molecular.(8)
La ventaja de esta técnica es que el capilar de silica fundida que generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene una ventana a través de ella que permite el paso de la luz U y de tal manera que la detección es en línea.
Con esta técnica descrita es posible separar cationes, aniones, proteínas, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea. (3)
2.0 Aplicaciones
El explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido al área biomédica, en el campo de las proteínas, ADN, análisis de líquidos de perfusión, monitoreo de fármacos, marcadores genéticos tumorales y neurobioquímicos, fármacos xenobióticos, de abuso, y pericias forenses.
En el área biofarmacéutica, para el control de calidad de productos farmacéuticos y biotecnológicos, quimioterápicos y de estructura quiral.
En el área de alimentos, se le aplica el fraccionamiento y cuantificación de aminoácidos, hidratos de carbono, ácidos orgánicos, aditivos y contaminantes.
En el área de control ambiental, permite la identificación de contaminantes y sus metabólitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos.
Como todo desarrollo de un área analítica nueva, la incorporación de técnicas acopladas como la espectroscopía de masa, fluorescencia inducida por láser y otras variantes permiten augurar un promisorio futuro. (3)
3.0 Desarrollos tecnológicos que contribuyeron ala EC
Seis desarrollos tecnológicos han concurrido para el desarrollo comercial de la instrumentación, que constituye en la actualidad la EC.
1. Los capilares de sílica fundido revolucionaron la cromatografía de gases (CC) y han producido la cámara de separación de la EC.
2. La disponibilidad de fuentes de poder de alto voltaje (20 a 30 kV), altamente estabiIizads y automatizadas para el mantenimiento estable de la tensión y corriente.
3. Los detectores desarrollados para HFLC, de absorbancia de alta sensibilidad pudieron ser aplicados con modificaciones ópticas al tubo capilar.
4. Los desarrollos obtenidos por la electroforesis en geles de tamizado molecular como la poliacrilamida, agarosa y otros, en la separación de proteínas.
5. El desarrollo de lo anfolitos, obtenidos por copulación de ácido acrílico y las polietilen poliaminas que han permitido generar ambientes de pH continuos y estables, donde se logra separar proteínas de puntos isoeléctricos (pI) muy próximos.
6. El análisis computacional aplicado a la resolución de productos obtenidos por separación por HPLC o EC que pueden ser estudiados, espectralmente a través del software para tal fin.
4.0 Ventajas
Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales, en un ámbito capilar, que además ofrece más facilidad y velocidad que el HPLC.
Mientras elimina los problemas de los disolventes del HPLC, la toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones acuosas en su gran mayoría con muy baja concentración iónica, incorpora los principios de la automatización a través de un hardware creado especialmente con un software altamente optimizado.
Las separaciones se obtienen en pocos minutos, en línea con la corrida, obteniéndose simultáneamente resultados cuantitativos. En oposición a los procedimientos tradicionales que utilizan horas o días.
La EC ofrece mayores ventajas para la separación de iones que la cromatografía iónica (IC), ya que la separación es más rápida y con mayor resolución, además la columna requerida para la separación por IC es más cara en comparación con el capilar de silica fundida. (10)
5.0 Fundamento
La separación por electroforesis esta basada en la diferencia de velocidad de solutos en un campo eléctrico. La velocidad de un ion esta dada por
Y: Velocidad jónica
¡le: movilidad electroforética
Existe una relación entre el voltaje aplicado y la longitud del capilar en volts /cm, la movilidad de un ion es una constante, la que puede ser determinada por el coeficiente friccional a través de un medio elegido
Fuerza Eléctrica (F[) Ftierza friécional
La fuerza eléctrica está representada en la siguiente ecuación
F E = qE
Y para un lón esférico la fuerza friccional esta determinada por la ecuación
FF-6lcflrv
q:Carga jónica ip Viscosidad de la solución r:Radio iónico y: Velocidad del ión
En el estado estacionario, las fuerzas son iguales y opuestas:
qE = 6 It 11 r y
qE = 6 it ri r y ¡¡, E
k= qW6iti r
6 it t
Con lo expuesto queda en evidencia que especies altamente cargadas tienen movilidades elevadas.
La movilidad electroforética se le encuentra usualmente en las tablas de constantes
físicas.(3)
6.0 Principio fisicoquímico
Las moléculas son separadas por las fuerzas del campo eléctrico aplicado y las muestras separadas en un capilar son monitoreadas por el detector (fig 3).
H Ók.
- 1+)
FIG.3 Representación del fenánienode polarización del
capilar, desplazamiento jónico y detección
Los picos del electroferograma son similares a los de HPLC, y se generan como consecuencia de la concentración de los analitos y de su velocidad de migración (fig 3 bis).
Eloctrotorear
12 ECWB -3 1.2 DIMM
Las muestras son introducidas en el capilar de dos modos, migración hidrostática y por electromigración. (8)
Durante la inyección electroforética (electromigración), el capilar está sumergido en la muestra y se aplica el alto voltaje.
Los iones de la muestra migran dentro del capilar en relación a sus movilidades electroforéticas.
Si la fuerza iónica de la solución muestra es más baja que el buffer electroforético, los cambios en el campo eléctrico de la interfase muestra-buffer producen un efecto de enfoque o stacking, en el cual los iones del analito aparecen concentradas alrededor de la zona de la interfase. Este proceso de delineamiento de la zona, puede producir incrementos en la detección de la sensibilidad y poder de resolución (fig 4).
+—. +—+ —+ — + t;t -t-
Mtenøol
Oesgnns del
FIG.4. ENFOQUE DE LA MUESTRA EN LA MIGRACIÓN ELECTROFORÉTICA
El efecto de enfoque puede producir cambios sustanciales en la inyección electroforética (fig5).
C.p4ts Is *
Dncttz LJV
Fuøntt øe poder
MtOVMI$
FIG.5 Condiciones experimentales.
7.0 Flujo electrosmótico (FEO)
El FEO es el componente efector más importante en la EC, surge con la consecuencia de aplicar un campo eléctrico que genera una doble capa eléctrica entre la solución y la pared del capilar.
En condiciones acuosas, la fase sólida posee un exceso de cargas negativas, como resultado de los procesos físicoquímicos, la ionización de la superficie (que es un equilibrio ácido-base) y por otra parte la adsorción de especies jónicas sobre la superficie del capilar. (10)
Estos procesos ocurren en el capilar al paso de la corriente eléctrica y la FEO se encuentra altamente controlada por los numerosos grupos silanoles (SiOH) que también pueden existir como Si-O -
* Los cationes en la mayoría de los casos mantienen el balance de cargas; ese potencial se llama potencial zeta. Cuando se aplica el voltaje a través del capilar, los cationes que forman la doble capa eléctrica migran hacia el polo positivo(fig. 6).
Figura 6. flujo de cargas hacia el cátodo.
Por consiguiente, la doble capa eléctrica llene un balance que está a su vez en equilibrio con la pared que corresponde al potencial zeta.
La magnitud de la FEO puede ser expresada en términos de la movilidad y velocidad por la fórmula siguiente:
V FE0= ( c Ç ! fl) E
RFEO = (E Ç / 1)
Vo Velocidad po: Movilidad del flujo electroosmótico
e: Constante dielécfrica Ç: Potencial Z
8.0 Equipo de EC
El equipo está constituido por una fuente de poder de alto voltaje (20 a 30 kV) y de O a 200 jiA, y un capilar de sílica de 25 a 75 i.xm de diámetro interno y de 100 a 200 j.xm de diámetro externo, el que puede estar refrigerado por aire o líquido.
Los electrodos de platino se encuentran ubicados en el recipiente que contiene el buffer, que además de servir para su contacto recibe los extremos del capilar.
Es posible controlar la temperatura del carrusel que almacena las muestras y los buffer.
Los capilares de sílica dejan pasar la luz UV/ Visible a distintas longitudes de onda, generando por arreglos de diodos, los espectros para la identificación de los compuestos separados. (fig. 7).
lomocalizácmn
Oetcçto,
de dEodo
£Factroç*o
Carrousffl de 'nue1ri
t3uNer
F1G7 Esquema de un aparato deEc
Los aparatos desarrollados por la industria instrumental recién aparecieron en 1988, y el primer simposio internacional del año siguiente, permitió mostrar los avances extraordinarios de este logro analítico.
Los aparatos comerciales de FC comprenden dos compartimientos electroforéticos unidos por un compartimento que contiene un capilar, a una fuente de alta tensión de 20 a 30 kV, el que es sometido a la luz UV con detector unido con un registrador, que grafica las diferencias de absorbancia; a un sistema de
administración de datos. Las terminales de salida permiten, por su conexión, el registro de voltaje, tiempo de corrida, y registro de temperatura del capilar, a través de un software que está incluido en una computadora (fig 8).
Figura S. Carrousel para muestras en una EC
9.0 Tipo de inyecciones
La inyección electrocinética, consiste en introducir el material empleando una combinación de la bomba electroendosmótica y la movilidad electroforética. La inyección por desplazamiento puede ser realizada por aplicación de la muestra con gas inerte a presión (por ej. nitrógeno) o por vacío en el extremo del capilar.
Inyección por diferencia de altura. Idéntico efecto puede obtenerse por cambio en las alturas relativas de la muestra o de los viales de salida del buffer (inyección por gravedad).
La inyección electroforética, produce un desplazamiento iónico, debida a un campo eléctrico donde migran los iones
El efecto de enfoque, puede producir cambios sustanciales en la inyección electroforética. (FIG. 9)
_±iidrodii1
Sitonado
EPuçtrocinéica
Burisí
8:ffevI
FIG. 9 Diagrama de los tres métodos de introducción de muestra
10.0 Volúmenes empleados
El empleo de microvolúmenes y la rapidez de la EC en comparación al HPLC, consume microlitros de muestra y volúmenes del orden de los nanolitros para la soluciones electrolíticas, lo que la hace una técnica altamente versátil y económica.
TABLA 1 Volúmenes inyectados para varios capilares
50prn
lOOgm
ml,ar
5.2 nL
16.4 nL
7.8 nL
24.6 nL
10.4 nL
32.8 nL
11.0 Tipos de capilares
La eletroforesis se efectúa en capilares de sílica fundida, de 25- 75 jim de diámetro interno; los capilares son recubiertos externamente con una película de poliamhias, para protegerlos de los daños mecánicos y provistos de una ventana de detección. (3)
12.0 Voltaje
Las fuentes estabilizadas de corriente continua generan 10 a 30 kV y elevados campos eléctricos (100 a 500 V/cm.) al capilar, pueden variar de 25 a 75 jim. de diámetro interno, pudiendo llegar a 300 pm. de diámetro externo. Las longitudes pueden ser de 1 m,, pero normalmente no exceden los 75 cm. (FIG. 10).
FJG 10 Esquema de un capilar
25 um u 75 tm de 'gá,nMro nterno y
300 Otr, de diatn*c eateu'o
En algunos aparatos, el capilar se encuentra dentro de un soporte de plástico en el cual se ha prealineado el capilar con una lente de micro enfoque, para obtener una detección más sensible y estable. Los soportes de plástico que contienen el capilar son herméticos y en su interior se hacen circular líquidos refrigerantes.
Es imprescindible mantener la temperatura La elevada resistencia eléctrica del capilar limita la corriente y el calentamiento interno. Se logran campos eléctricos muy elevados (100 a 500 V/cm.) con mínima generación de calor. El empleo de campos eléctricos muy elevados permite reducir drásticamente el tiempo de
realización de la corrida, y la elevada relación del área al volumen disipa en forma eficaz el calor que se pueda producir.( 3)
13.0 Polaridad
La FC puede ser desarrollada empleando polaridad normal o invertida. El valor del pH permite definir el sentido de la migración a pH bajos, muchas proteínas y péptido son catiónicos y migran hacia el cátodo en el extremo del capilar. Inversamente, a pH elevados muchas bimoléculas tienen una carga neta negativa y migran hacia el ánodo.
El conocimiento del pK para distintos componentes de las muestras (péptidos y aminoácidos) como también el pi para las proteínas, permite seleccionar los buffer apropiados para determinar el sentido de la migración para que los compuestos se orienten hacia el detector; normalmente se emplean campos eléctricos de 200 a 400 y/cm.
Para muchas aplicaciones, el empleo de capilares de longitud elevada (hasta 1 m.) permite y requiere voltajes mayores de 20 kV para encontrar el campo eléctrico adecuado.
14.0 Detección
Una amplia variedad de detectores han sido desarrollados para la EC (incluyendo fluorescencia, electroquímica y conductividad) pero los detectores más usados comercialmente son los que emplean el UY/visible.
Los detectores son similares a los de I-[PLC, usando fuentes de deuterio con filtros o detección con longitudes de onda seleccionadas.
%IItH1MICÜ SERVICIOS BE 1NFORMAc1A
ARCHIVO UISTORIGQ
Las fuentes de luz generalmente provienen de un haz de luz entre un fotodiodo de referencia y un micro enfocado óptico en el estuche capilar.
El barrido es a través de un detector que ilumina el capilar con luz blanca luego dispersada y analizada a través de un policromador por arreglo de fotodiodos (detector PDA para óptica reversa).
Alternativamente, el sistema óptico convencional puede ser empleado por una banda espectral aislada por un monocromador colocado entre la fuente de luz y el capilar.
El barrido puede ser controlado rápidamente por un sistema computarizado que controla el movimiento del monocromador en el rango espectral en el tiempo de milisegundos.
Este sistema de detección produce menos ruido de fondo, y mucha más sensibilidad que el detector con arreglo de diodos PDA.
15.0 Reactivos en EC
Una amplia variedad de buffer y aditivos puede ser usada para las separaciones; la mayoría de ellos son buffer no tóxicos, de fosfato, borato y TRIS. No emplea sustancias orgánicas, inflamables o tóxicas como acetonitrilo, hexano, metanol y tetrahidro furano, como en HPLC. Se requieren volúmenes muy pequeños de soluciones de electrolitos que no presentan los principios de toxicidad encontrados en I-JPLC.
16.0 Selección de buffer
Esta es una de las etapas básicas en la separación por EC. La sensibilidad de la FEO a un determinado pH requiere buffer que mantengan el pH constante.
Los sistemas buffer efectivos tienen un rango de aproximadamente dos unidades de pH alrededor del valor del pKa. Los buffer polibásicos como los de fosfato, y citrato tienen más de un pKa para usar, y pueden ser utilizados en un rango de pH más amplio.
El buffer que se emplea en EC debe reunir una serie de propiedades:
1) Buena capacidad amortiguadora en el rango encontrado
2) Baja absorbancia en la longitud de onda empleada en la detección.
3)Baja movilidad (para lo cual se necesita baja concentración iónica)
Las separaciones de proteínas y péptidos son regidas por las alteraciones del pH que están íntimamente ligadas al pl. Los cambios de pH afectan también al comportamiento del FEO, pues a pH próximos a 3 la superficie interna del capilar se encuentra cargada negativamente por los grupos silanol.
El empleo de uniones covalentes en la superficie del capilar puede reducir dramáticamente el FEO, sobre todo en la separación de las proteínas (FIC.11).
anodt:
pH FEO
HG.11 Electroendoosmosis
Cátoda
Particular cobertura en la superficie interna del capilar, en condiciones de pH alcalino o neutro, permiten muy buenas separaciones.
El FEO puede ser afectada ajustando la concentración y la fuerza iónica del buffer; elevadas concentraciones del buffer son útiles para la limitación de las interacciones iónicas, por disminución de las alteraciones iónicas contra la pared, pero el calentamiento de los capilares limita el uso de las concentraciones elevadas de los buffer.
La concentración de los buffer debe oscilar entre 10 a 50 mM, aunque es posible emplear concentraciones entre 100 a 500 mM.
Las modificaciones del FEO pueden ser controladas alterando la cubierta dinámica, agregando aditivos al buffer, o con cubiertas covalentes.
III. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS EN FC
1.0 Características generales
El uso de un método analítico, se justifica sólo después de haber descubierto que es válido (6).
El objetivo de validar un método analítico es demostrar que éste es apropiado para cuantificar lo que pretende. (4).
2.0 Especificidad/ Selectividad
Es la habilidad de un método analítico para obtener una respuesta debida únicamente a la sustancia de interés y no a otros componentes de la muestra. (9)
3.0 Precisión (repetibilidad)
La precisión de un método analítico es el grado de concordancia entre resultados analíticos individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a diferentes muestreos de una muestra homogénea del producto. Usualmente se expresa en términos de Desviación Estándar o del Coeficiente de Variación. (9)
La precisión es una medida del grado de reproducibilidad y/o repetibilidad del método analítico bajo las condiciones normales de operación.
Se determina por el análisis sextuplicado de una misma solución estándar correspondiente al 100% establecido en la linearidad del sistema.
4.0 Linearidad
La linearidad de un sistema o método analítico es su habilidad para asegurar que los resultados analíticos, los cuales pueden ser obtenidos directamente o por medio de una transformación matemática bien definida, son proporcionales a la concentración de la sustancia dentro de un intervalo determinado. (9)
Se determina, construyendo una curva de calibración (concentración vs respuesta media) utilizando cuando menos 5 diluciones preparadas a partir de una misma solución patrón y haciendo análisis cuando menos por duplicado para cada dilución
4.1 Unearidad del sistema
En la linearidad del sistema se demuestra la relación lineal que existe entre la concentración de analíto adicionada y la respuesta del instrumento.
5.0 Exactitud
La exactitud de un método analítico es la concordancia entre un valor obtenido experimentalmente y el valor de referencia. Se expresa como el por ciento de recobro obtenido del análisis de muestras a las que se les ha adicionado cantidades conocidas de la sustancia. (9)
Se determina de, cuando menos, 6 muestras de manera independiente con la cantidad necesaria de la sustancia de interés para obtener la concentración del
100%, utilizando el método propuesto o bien, realizar la prueba a tres niveles de concentración por triplicado. Haciendo el análisis en las mismas condiciones de operación y por el mismo analista.
6.0 Otros parámetros a evaluar
Estabilidad de la muestra. Es la propiedad de una muestra preparada para su cuantificación, de conservar su integridad fisicoquímica y la concentración de la sustancia de interés, después de almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas.
Estabilidad del buffer. Es la propiedad de una sustancia amortiguadora de conservar sus características fisicoquímicas para llevar a cabo la separación de la muestra bajo condiciones precisas y exactas.
Diseñar y validar un método analítico para la cuantificación de ácido valpróico como materia prima por Electroforesis Capilar.
Establecer las condiciones necesarias para la preparación de la muestra, como disolventes utilizados, concentración final, pH, temperatura, tiempo de agitación, y sonicación. Determinar las condiciones adecuadas para la conservación de la muestra y el sistema buffer empleado. Establecer las condiciones operacionales para el análisis en el equipo de CE, como tipo y diámetro interno del capilar, longitud total y efectiva del mismo, polaridad, temperatura, voltaje, corriente, volumen de inyección, tipo de separación, entre otros Establecer los parámetros de adecuabilidad del sistema como área bajo la curva, simetría del pico, resolución y eficiencia. Desarrollar un sistema buffer adecuado para la cuantificación del ácido valpróico de forma directa tomando en cuenta las propiedades ácido-básicas de la molécula y las condiciones operacionales del equipo para establecer el pH y concentración (fuerza iónica) del mismo. Evaluar la especificidad/selectividad del método demostrando que el método es capaz de cuantificar sólo el analíto de interés. Evaluar la precisión del sistema (repetibilidad) con una desviación estándar relativa no mayor a 2%.
• Evaluar la exactitud con un por ciento de recobro de 98 a 102% y una desviación estándar relativa no mayor a 2%. Evaluar la linearidad del sistema demostrando un coeficiente de determinación mayor a 0.98.
Para el desarrollo y validación del método analítico se empleó un equipo de Electroforesis capilar marca Beckman coulter modelo MDQ P/ACE equipado con una fuente de poder para generar los electroferogramas; un capilar negativo de siica de 75 ism de diametro interno y una longitud efectiva de 50 cm, para la detección se empleó un detector de arreglo de diodos con un filtro óptico a 200 nm y para la identificación un barrido de 190 a 400 nm. La inyección de la muestra fue de forma hidrodinámica. Se emplearon viales de borosilicato estándar de 2 mL para contener la muestra y el buffer de separación.
Además se emplearon reactivos y disolventes con las siguientes características:
Estándar de referencia y muestra:
Ácido Valpróico ST
5LR109863
Ácido Valpróico MTA
J100326
Nombre Agua grado HPLC
&Jackson
sodio Hidróxido de sodio
ACS/ HPLC
Diseño del método analítico
En base a las características fisicoquímicas del analito, se realizaron las
Se pesaron 20 mg de AV en un matraz Volumétrico de 100 mL aforando con
las siguientes mezclas de disolventes:
Agua 100%, agua-metanol 95:05, 90:10, 85:15 y 80:20; con agitación
Nota: Se adicionó en primera instancia el metanol y después, lentamente el agua con agitación constante.
SELECCIÓN DEL BUFFER DE SEPARACIÓN
Para garantizar que la molécula se encuentre ionizada, se trabajo a un pH
arriba de 4.6 (valor de pKa del Ay), por lo que se realizaron experimentos con
buffer de fosfatos a pH 7.2 y de boratos a pH 8.3.
El buffer de separación de fosfatos a pH 7.2 fue preparado a partir de
Fosfato monobásico de sodio monohidratado y ajustado el pH con hidróxido de
sodio 1 N y el buffer de boratos de pH 8.3 a partir de ácido bórito ajustado el pH
de igual forma con hidróxido de sodio 1 N.
Se inyectaron por duplicado utilizando cada buffer a polaridad normal e
invertida muestras de AV a una concentración de la muestra de 1 mg/mL y 75 mM
la concentración del buffer, a 20 kV con inyección hidrodinámica a 5 psi de
presión, con una temperatura de capilar ambiente en corridas de 20 minutos.
Todas las muestras y buffer de separación se sonicaron por 5 minutos y se filtraron
a través de un filtro Millipore de 0.22 jim antes de su uso. El buffer se preparó cada
día de experimentación.
AJUSTE DEL MÉTODO
De acuerdo al buffer de separación seleccionado, se ajustaron los siguientes
• Voltaje de separación
• Temperatura del capilar
o Concentración de la muestra
• Secuencia de lavado (acondicionado del capilar)
• Concentración del buffer
Se establecieron las condiciones de adecuabilidad del sistema para el
método (platos teóricos, asimetría, área y resolución, además del coeficiente de
variación para cada uno de estos parámetros), con lo que se demostró que el
equipo, reactivos utilizados y condiciones de trabajo no afectaron en los resultados.
Para realizar la validación se evaluó:
1.0 Especificidad/Selectividad:
Se inyectó por duplicado:
• Una solución de estándar de AV a 200 jig/mL
• Una muestra de materia prima de AV a 200 jig/mL
• Una solución blanco
• Solución Buffer
Linearidad del sistema
Se realizó por triplicado una solución stock, de la cual se obtuvieron las
siguientes concentraciones en la curva de calibración:
raáaa5
vaiproico (kg/mL)
Previamente verificados los parámetros de adecuabilidad del sistema de
electroforesis capilar, se realizaron dos inyecciones de cada nivel de concentración.
3.0 Exactitud del método
Se preparó de manera independiente 6 muestras de ácido valproico al 100% de
concentración (200 ig/mL) de materia prima de a cuerdo a la preparación de la
muestra, indicada en la metodología.
Una vez verificado el cumplimiento de los parámetros de adecuabilidad del
sistema se realizaron dos inyecciones de cada muestra.
4.0 Precisión (repetibilidad)
Se analizaron de manera independiente, pero de la misma solución patrón 6
muestras al 100% de la concentración de prueba (200 j.tg/mL), utilizando
Una vez verificado el cumplimiento de los parámetros de adecuabilidad, se
inyectaron por duplicado las muestras en el equipo de electroforesis capilar.
5.0 Estabilidad del buffer de separación.
Se inyectó una misma muestra de AV varias veces, hasta que el buffer perdiera
la capacidad de mantener el voltaje y corriente de separación apropiados para
1.0 Preparación de la muestra
Se observó rápida disolución de la muestra en la mezcla 95:5 agua-metanol, con un tiempo de agitación no mayor a 5 minutos.
2.0 Sistema Buffer de separación
Experimento Buffer de boratos pH 8.3 con polaridad nornal Buffer de boratos pH 8.3 con polaridad invertida Buffer de fosfatos pH 7.2 con polaridad normal
Buffer de fosfatos pH 7.2 con polaridad invertida
Resultado No se observó respuesta
No se observó respuesta
Se observó respuesta del analito, lo que fue corroborado por medio de analisis espectral. No se observó respuesta
3.0 AJUSTE DEL MÉTODO
Se disminuyó la concentración de la muestra, para proporcionar mayor simetría al pico, al aumentar la temperatura del capilar y disminuir la concentración del buffer de separación, se logró disminuir el tiempo de migración de la molécula y de acuerdo a los resultados obtenidos, se estableció la secuencia apropiada de acondicionamiento del capilar previo a la inyección de la muestra, obteniendo las siguietes características del método analítico:
Preparación de la muestra: Pesar 20 mg de AV en un matraz volumétrico de 100 mL, adicionar 5 mL de metano! grado HPLC y lentamente aforar con agua.
Preparación del buffer de separación (fosfatos 5OmM): Pesar 1.2 g de fosfato monobásico de sodio y agregar 160 mL de agua a un matraz agitar hasta completa disolución, ajustar el pH con hidróxido de sodio 0.1 N a 7.2 y aforar a 200mL.
Condiciones de separación: Previo a la inyección de la muestra se acondiciona el capilar con el buffer de separación por 2 minutos a 20 psi de presión, se inyecta por 10 segundos a 1 psi de presión la muestra de AV y posteriormente se inyecta durante 5 segundos a 0.5 psi de presión buffer de separación (para asegurar la eficiencia de separación); Para la separación se aplica un voltaje de 26 kV con una temperatura de capilar de 30 oc en un capilar de 50 cm de longitud efectiva, con un diámetro interno de 75 jim. Las muestras son conservadas en el carrousel a 20 °c con un tiempo de corrida de 8 minutos y un tiempo de migración del AV de 5.5 minutos. La detección se realiza mediante un detector fotométrico UV sencillo a 200 nm.
Adecuabilidad del sistema. Después del ajuste del método, se observó que el método es consistente siempre y cuando se demuestre que el sistema cumple con los parámetro establecidos para la adecuabilidad del sistema
Área bajo a curva Platos teóricos Resolución Asimetría
%cV c 2%
de 0.5 a 1.5
1.0 ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD
1.1 Adecuabilidad del Sistema.
Adecuabihdad
Ácido _vaiproico
05-1.5
Mayor a 6000
Eficiencia (N)
Mayor a 50.000
1.2 Prueba Analítica.
Coiícentración. F
-final AY
/Árede pico
(iig/mL)
El espectro UV obtenido al tiempo de migración
Estándar AV
58849.8
del AV es igual al reportado bibliográficamente.
62368.7
El espectro Uy obtenido
es igual al del estándar. No se observa
interferencia del blanco
en el electroferograma
ni en el espectro. No se observa interferencia del fuifer
en el electroferograma m en el espectro.
Figura El. Estándar de AV a 200 RgImL.
D:\32KaraIData\AcidovaIproico\ESPECIFICIDAD STÓa-Repl
o1I<
Figura E2. Muestra de AV a 200 jsglmL.
D:\32KaraflDatacjdovaIproj\EspEcIF ,cloAo MTAa-Rep2
,.,.U-
¡1:
—;--;;••
Figura S. Blanco de disolventes
O:32Karat\Data\AcjdovaIproico\EspEcIFlcIDAD BLANCOa-Rep2
Figura E4. Buffer de separación
D:32Karat\Data\AcidovaIprojcoESPEcIFlciDAD BUFFa-Repl
-. -lv
2.0 LINEARIDAD DEL SISTEMA
!WÁ7cid6a1jiiók&P !
iIñ3/ecdóiill
}Iñédón 21 IPfohtédiól irsj
10.54.5
0.0.55907
17.48246
14.70641
16.09443
Area bajo la
2.2 Prueba Analítica
Peso Muestra 1: 258 mg
Peso Muestra 2: 247 mg
Peso Muestra 3: 252 mg
Peso teórico: 250 mg
Preparacón de los niveles de concentración:
Stock (250 mg/SO mL) x 6mL1I00mL
Stock (250 mg/SO mL) x SmUlOOmL
Stock (250 mg/SO mL) x 4mL1100mL=
Stock (250 mg/SO mL) x 3mUI00mL=
Stock (250 mg/SO mL) x 2mUI00mL
Çncentrad óiJ
FÍnaIdeAV
Z(/L)
•fl -_
ftme dio
1 103.2
87543.5
3 100.8
84459.5
73271.0
70375.5
58606.0
56600.5
41075.5
41257.0
27420.5
3 302.4
28011.5
1.Ü
9Ü0.Ü
-t-Stcdç3
+Promecio
Regresán lineal
icoco.a
3.0 EXACTITUD
3.1 Adecuabilidad del sistema
3.2 Prueba analítica
4.1 Adecuabilidad del sistema
PaTámetro d
:Adecuabihdad
Adecuabilidad
0.56036
v••:
Inyección 2:
18.79032
18.57679
4.2 Prueba analítica
Area bajo la curva de AV
- Peso AV
de AV (j.tg/mL)
52936.5
53049.0
52412.5
53208.3
Estabilidad de buffer
5.1 Adecuabilidad del sistema
PáfáffiéffbTdé1 E5édfkádóff
FAai Lsfr'Si
tSAcidó vaIFóicfl
Réii1tido
IIñyétEóff II lcióff
Iñ3 eccióñ 31
0.56853 0.57332
18.80345
18.69675
18.99162
7.2 Prueba analítica. Muestra: 204 gg/mL
Un par de viales de buffer son estables para 23 corridas.
AE?N ..
tt'nt"'fl Media
104 26WW
*aas_Desvést 0.97 SI
rtana.%Cv
093tL_-
Se logró diseñar un método analítico especifico para la cuantificación del
ácido valproico como materia prima por electroforesis capilar, mediante
detección fotométrica directa a 200 mu, con polaridad normal y tiempo de
corrida de 8 minutos, con un tiempo de migración del ácido valproico de 5.8
Se establecieron los parámetros de adecuabilidad del sistema para el
Se estableció el número de inyecciones apropiadas para un mismo par de
viales de buffer de separación.
Se demostró, mediante la validación, que es un método especifico, exacto,
preciso (repetible) y lineal.
a. Diseño del Método
El método desarrollado está diseñado para cuantificar ácido vaiproico
como materia prima por electroforesis capilar.
Es un método sencillo, utiliza una mezcla agua-metano¡ 95:5 como disolvente del
ácido valproico, la temperatura de trabajo es de 30 °C durante la separación, se
emplea un buffer de fosfatos 50mM a pH de 7.2, con tiempos de corrida de 8
minutos y utilizando un detector UV sencillo a una longitud de onda de 200 nm,
obteniendo picos simétricos, con alta resolución y eficiencia.
b. Validación del Método
El método analítico diseñado y validado para la cuantificación de ácido
valproico como materia prima por electroforesis capilar es específico, ya que el
análisis espectral el estándar al tiempo de migración del AV (5.8 mm) es similar
al reportado bibliográficamente para este fármaco, así como no se observa
interfer4encia del blanco de disolventes, ni del buffer de separación empleados;
es exacto, ya que se demostró un por ciento de recobro del 99.75%, con una
desviación estándar relativa de 1.10 0/o; es preciso, ya que se obtuvo una
desviación estándar relativa de 1.51%; y linear, ya que se obtuvo un coeficiente
de determinación (r2) de 0.9993.
El buffer es capaz de mantener la corriente y el voltaje, hasta en 23 inyecciones
un mismo par de viales.
PRECISIÓN DEL SISTEMA EXACTITUD DEL MÉTODO
LINEARIDAD DEL SISTEMA ROBUSTEZ. ESTABILIDAD DEL BUFFER
RESULTADO El análisis espectral del AV demuestra que el método es específico para este fármaco. No interfieren ni disolventes de preparación, ni el buffer de separación
%CV = 1.51%
Recobro: 99.75%
%C.V.= 1.10%
El buffer de separación es estable hasta 23 inyecciones del mismo par de viales.
1. Rabasseda, X. 1994. Drugs of today. Departamento de información y Documentación médica Prous Xcience, Barcelona. sup!. 7.
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12.United States Pharmacopeia. XXVII. 2004. CC [1225]. Validation of
Coinpendial Methods. p.2622-2625.
VoBo DEL CONTENIDO ACADEMICO
2 /JX
M. en C. Ma. Luisa Margarita
Vázquez Ramírez
M.en C. Edilberto Pérez
"Diseño y validación de un método analítico para la cuantificación de
ácido valpróico en materia prima por electroforesis capilar"
PERTENECE AL PROYECTO GENÉRICO
Dirección: Diamante # 35 Col. Estrella, México D.F.
Teléfono: 57-59-60-38.
M. en C. Ma. Luisa Margarita Vázquez Ramírez
M. en C. Edilberto Pérez Montoya
LUGAR DE REALIZACIÓN: Departamento de Biofarmacia en la Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional
FECHA DE INICIO: Febrero, 2003
FECHA DE TERMINACIÓN: Octubre, 2003
El ácido valpróico (AV) y sus sales de magnesio y sodio son fármacos
antiepliépticos de primer nivel (Rabasseda, 1994).
El análisis de la pureza de este fármaco, en las distintas farmacopeas está
reportado por medio de titulación y cromatografía de gases (CG).
EL AV es una molécula muy pequeña, con una doble ligadura en el grupo
carboxilo, con un Xmax 213 nm, lo que dificulta su detección de manera directa
por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), ya que emplea
disolventes orgánicos que interfieren con la lectura a esa longitud de onda tan baja.
Con el avance tecnológico, una alternativa al uso de la cromatografía en separación
y cuantificación de macromomoléculas y micromoléculas es la Electroforesis
capilar (EC), la cual ofrece grandes ventajas con respecto a la cromatografía, ya que
para el manejo de las muestras no se requiere del empleo de grandes temperaturas,
uso de disolventes tóxicos y de alto costo, gases, tiempos de análisis prolongados,
muestra mayor selectividad y eficiencia en la separación, etc.; puesto que en su
gran mayoría, se emplean soluciones acuosas con muy baja concentración iónica.
La EC es una técnica moderna, en la que la separación se realiza por cargas y peso
molecular del analíto en una matriz sencilla o compleja, dentro de un capilar de
silice fundido, al aplicar cierto voltaje que propicie la migración de las moléculas
dependiendo de su tamaño y carga (positiva o negativa). Las moléculas migran del
ánodo al cátodo en fase normal. Las moléculas que se detectan primero son los
cationes pequeños, luego los cationes grandes, posteriormente las moléculas
neutras (sin carga) y al último los aniones grandes y pequeños.
El flujo electroosmótico (FEO) es un fenómeno fisicoquímico, que permite explicar
la capacidad de esta técnica para separar compuestos de cualquier tipo, incluso
moléculas neutras y está directamente relacionado con la estructura interna del
Para la separación se usan buffer, por lo general iónicos, a concentraciones bajas y
la inyección de la muestra puede ser por presión, vacío o electrocinética.
Los componentes esenciales de un equipo de EC son una fuente de poder, capilar,
electrodos y el detector, controlados a través de una computadora. Se acondiciona
el capilar con el buffer de separación, después toma la muestra y posteriormente
inicia la separación al introducir los electrodos dentro del buffer de separación y al
aplicar voltaje, la señal es recibida por el detector y comienza a monitorear la
corrida, observándose así los electroferogramas.
Los parámetros críticos de la separación en EC son: el pH, que permite modificar la
fuerza del FEO y de esta manera inducir la movilidad de las moléculas neutras.
Permite también la ionización de las moléculas con características ácido-básicas; y
la fuerza iónica (concentración del buffer) que es el contenido de iones dentro del
buffer de separación. Su control permite modificar la corriente generada durante la
Establecer las condiciones necesarias para la preparación de la muestra, como
disolventes utilizados, concentración final pH, temperatura, tiempo de
agitación, y sonicación.
Determinar las condiciones adecuadas para la conservación de la muestra y el
sistema buffer empleado.
Establecer las condiciones operacionales para el análisis en el equipo de CE,
como tipo y diámetro interno del capilar, longitud total y efectiva del mismo,
polaridad, temperatura, voltaje, corriente, volumen de inyección, tipo de
separación, entre otros
• Establecer los parámetros de adecuabilidad del sistema como tiempo de
migración, simetría del pico, resolución.
• Desarrollar un sistema buffer adecuado para la cuantificación del ácido
vaiproico de forma directa tomando en cuenta las propiedades ácido-básicas de
la molécula y las condiciones operacionales del equipo para establecer el pH y
concentración (fuerza iónica) del mismo.
• Evaluar la especificidad/selectividad del método demostrando que el método
es capaz de cuantificar sólo el analíto de interés.
Evaluar la precisión del sistema (repetibilidad) con una desviación estándar
relativa no mayor a 2%.
Evaluar la exactitud del método con un por ciento de recobro de 98 a 102% y
una desviación estándar relativa no mayor a 2%.
Evaluar la linearidad del sistema demostrando un coeficiente de
determinación mayor a 0.98.
Para el desarrollo y validación del método analítico se empleó un equipo de
Electroforesis capilar marca Beckman coulter modelo MDQ P/ACE equipado con
una fuente de poder para generar los electroferogramas; un capilar negativo de
silica de 75 p.m de diámetro interno y una longitud efectiva de 50 cm de largo, para
la detección se empleó un detector de arreglo de diodos con un filtro óptico a 200
nm y para la identificación un barrido de 190 a 400 nm. La inyección de la muestra
fue de forma hidrodinámica. Se emplearon viales de borosilicato estándar de 2 mL
para contener la muestra y el buffer de separación.
Todas las soluciones fueron preparadas usando agua grado HPLC marca Burdik &
Jackson, se sonicaron por 5 minutos y se filtraron a través de un filtro Millipore de
0.22 jim antes de su uso. El buffer se preparó cada día de experimentación.
Con el fin de ionizar la molécula de AV se realizaron experimentos con buffer de
separación de boratos y fosfatos a pH de S. y 7.2 respectivamente, con polaridad
normal e invertida, onservando fijas variables como: Voltaje de separación: 20 kV,
Temperatura de capilar: ambiente, Concentración del buffer: 75 mM,
Concentración de la muestra: lmg/mL y tiempo de corrida: 20 minutos.
Del resultado de estos experimentos se seleccionó el buffer más apropiado y se
realizaron los ajustes necesarios a las condiciones operacionales del método y del
equipo, para obtener las condiciones optimas del método y establecer los
parámetros de adecuabilidad del sitema.
El método analítico se validó bajo los parámetros de exactitud, precisión,
linearidad, robustez y especificidad.
Preparación de la muestra: Pesar 20 mg de AV en un matraz volumétrico de 100 mL, adicionar 5 mL de metano? grado H.PLC y lentamente aforar on agua.
Preparación del buffer de separación (fosfatos 50mM): Pesar 1.2 g de fosfato monobásico de sodio y agregar 160 mL de agua a un matraz agitar hasta completa disolución, ajustar el pH con hidróxido de sodio 0.1 N a 7.2 y aforar a 200mL.
Condiciones de separación: Previo a la inyección de la muestra se acondiciona el capilar con el buffer de separación por 2 minutos a 20 psi de presión, se inyecta por 10 segundos a 1 psi de presión la muestra de AV y posteriormente se inyecta durante 5 segundos a 0.5 psi de presión buffer de separación (para asegurar la eficiencia de separación); Para la separación se aplica un voltaje de 26 kV con una temperatura de capilar de 30 °C en un capilar de 50 cm de longitud efectiva, con un diámetro interno de 75 j.tm. Las muestras son conservadas en el carrousel a 20 °C con un tiempo de corrida de 8 minutos y un tiempo de migración del AV de 5.5 minutos. La detección se realiza mediante un detector fotométrico 11V sencillo a 200 nm.
Adecuabilidad del sistema. Después del ajuste del método, se observó que éste es consistente siempre y cuando se demuestre que el sistema cumple con los parámetro establecidos para la adecuabilidad del sistema
Área bajo acurva
Platos teóricos
PRECISIÓN DEL SISTEMÁ EXACTITUD
LINEARIDAD DEL SISTEMA ROBUSTEZ ESTABILIDAD DEL BUFFER
El análisis espectral del AV demuestra que
el método es específico para este fármaco.
No interfieren ni disolventes de preparación,
ni el buffer de separación
r20.9993
El buffer de separación es estable hasta 23
inyecciones del mismo par de viales.
El método desarrollado está diseñado para cuantificar ácido valproico como
materia prima por electroforesis capilar.
Es un método sencillo, utiliza una mezcla agua-metanol 95:5 como disolvente del
minutos y utilizando un detector U y sencillo a una longitud de onda de 200 nm,
valproico como materia prima por electroforesis capilar es específico, exacto,
preciso y linear.
1. Rabasseda, X. 1994. Drugs of today. Departamento de información y Documentación médica Prous Xcience, Barcelona. supi. 7.
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VoBo DEL CONTENIDO ACADÉMICO
M.eifÉ. Edilberto Pérez Montoya
REPORTE DE SERVICIO SOCIAL DESARROLLO DEL METODO
Mk,utot
Mfi,uIts
w2uÍñ
acinuin
t000Uo
000J131N 130 0110nIv53a 1VIJOS OIDIMI35 aa 310d3I
£OlflUWd
0000•0
00013V4 130 01101JV530 1VIDOS OIDIMI3S 30 3180d3
SaInLIM
00i3IAJ i;a O11OiVS3G
1VIDOS 0IDIMI3S 30 3JOd3
co1nhjiI'
OGIflIJM
00013IN iaa 0110v53a 1VOOS OIDIMI3S 3a 3flIOd3I
VALORACIONI ACIDO VALPROICO
VALIDACION DEL METODO ANALITICO
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD BCO 1124105 5:21:06 PM
D:32KaratData'iAcidovalproico\ESPECIFICtDAD BLANCOa-Repl
-lolo --
VALORACION ACIDO VALPROICO
VALIDACION DEL MET000 ANALITICO
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD BUFF 1124105 4:55:34 PM
D:\32Karat\Data\Acidovalproico\ESPECIFICIDAD BUFFa-Repl
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD STD 1124105 5:59:45 PM
D:\32Karat\Data\AcidovaIproicoESPECIFICIDAD STDa-Rep2
Estabilidad del Buffer Mta: ESPECIFICIDAD MTA 1124105 6:12:46 PM
D:\32KaratData'iAcidovaIproico\ESPEClFlCIDAD MTAa-Repl
REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION DE ACIDO VALPROICO
asyrnm
vaiproico
tpusp
PREC 1510
17.72504
PREC LS LO
PRECISION DEL SISTEMA
8209.16
52434.00
PRECSION3
8747.92
7998.17
52739.00
8662.20
8906.97
52399.00
53208.33
8426.03
SM 0ev:
01122105 02:13:29 PM
sgsetwq
REPORTE DE SERVICIO SOCIAL VALORACION ACIDO VALPROICO
VALIDACION DEL MET000 ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISIONI 1121/05 7:25:28 PM
13V - 200nm
Asymmetiy
concentration plates (USP)
VALIDACION DEL METODO ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISION2 1/21105 7:51:41 PM
UV-200nm
Asynuaetiy
concentration piales (USP)
VALIDACION DEL METODO ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISION3 1121105 8:18:40 PM
0-ole
Mhutos
concentration plates (OSP)
15.10731
VALIDACION DEL METODO ANALITICO Precision del sistema Muestra PRECISION4 1121/05 8:45:37 PM
Mtñes
15V - 20

References: resolución 
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 Resolución 
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