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Timestamp: 2018-08-14 08:48:01+00:00

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Resolucion de la estructura tridimensional de proteinas - Apuntes de Bioquímica - Docsity
paulagil-2 18 de enero de 2018
Resolucion de la estructura tridimensional de proteinas, Apuntes de Bioquímica. Universidad Autónoma de Madrid (UAM)
Bioquímica,Biología y Química
Prof. Mauricio García Mateu
Asignatura: Estructura de Macromoléculas, Profesor: Mauricio García Mateu, Carrera: Bioquímica, Universidad: UAM
IDENTIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL VIRUS MVM Necesitamos encontrar la estructura tridimensional del virus diminuto del ratón (MVM): es un virus esférico de 25nm de diámetro con 60 subunidades idénticas, cada una de las cuales tiene 660 aas. Presenta una cavidad en cuyo interior se encuentra el ácido nucleico (ssDNA: DNA de banda simple). La cápsida está constituida por 60 copias de proteínas iguales VP2.
En concreto necesitamos conocer la estructura tridimensional del MVM mutado en N170A (cápsida del virus). Esta mutación es letal, de esta manera una sola mutación puede hacer a un virus no competitivo.
Hace unos 50 años se resolvieron las primeras estructuras de macromoléculas biológicas.
-James Watson y Francis Crick, recibieron el Premio Nobel por la determinación de la estructura tridimensional no a nivel atómico (difracción de fibras por rayos X) del DNA.
-Max Perutz: austríaco que solventó el problema de fases y dio la clave para resolver la estructura de proteínas por cristalografía de rayos X. Tampoco llegó a nivel atómico.
-John Kendrew: eligió la mioglobina en lugar de la hemoglobina elegida por Max. La mioglobina era una proteína más pequeña por lo que permitía una mayor resolución pudiendo llegar al nivel atómico.
¿Si usamos cristalografía de rayos X como sabemos con garantía que vamos a llegar a nivel atómico? ¿Hasta qué punto estamos seguros de la disposición espacial de los átomos?
Cristalografía de rayos X: fue la primera técnica que podría resolver la estructura tridimensional de macromoléculas.
Hoy, el éxito de esta tecnología es tal que tenemos decenas de miles de proteínas y muchos ácidos nucleicos y complejos supramoleculares resueltos por cristalografía de rayos X.
La estructura tridimensional a nivel atómico del ribosoma: se intentó resolver durante decenios sin conseguirlo a nivel atómico, no se tenía suficiente información.
Limitación de la cristalografía: si una estructura es muy flexible no es capaz de cristalizar, el tamaño grande también lo dificulta. Cuanto más grande es la estructura más datos hay que recoger (problema de recogimiento de datos: se necesitaba una base de datos, el Protein Data Bank)
Numero de estructura atómicas de proteínas y ácidos nucleicos depositadas en el Protein Data Bank:
A partir del año 90 empieza a haber un número suficiente de estructuras para que la proteína cristalice y se pueda determinar la estructura tridimensional. En los últimos 15 años aún ha subido más.
Estructura de Macromoléculas2ºBioquímicaPaula Gil Cabrerizo
La hemoglobina por ejemplo ha sido caracterizada en distintas especies. De esta manera se ha podido descubrir sus distintas mutaciones y establecer una comparación evolutiva. El hecho de que se conozca la estructura de 100000 proteínas no implica que estas sean totalmente distintas.
Se elaboraron proyectos de genómica estructural que permitieron secuenciar todos los genes de un organismo (Fred Sanger). Lo que define la función no es la secuencia, la secuencia define la estructura tridimensional. Conociendo esta, conoceremos su función.
Información que puede derivarse de la estructura tridimensional
1. Posición relativa de varios grupos: complejos catalíticos, motivos estructurales y funcionales.
2. Forma y propiedades electrostáticas.
3. Composición molecular de su superficie: unión a antígenos.
4. Plegamiento
5. Estructura cuaternaria cristalizada o en una alta concentración de soluto.
6. Localización de mutantes, SNPs y residuos conservados.
7. Ligandos afines.
Técnicas que se disponen en la actualidad para determinar la estructura tridimensional de una proteína:
-CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
No es capaz de llegar a resolución atómica. Teóricamente, la utilización de electrones nos permitiría llegar a resolución atómica, pero, en la práctica, debido a la preparación de la muestra, tinción …etc. no se veía ninguna posibilidad de llegar a resolución atómica con proteínas, ácidos nucleicos y sustancias moleculares.
Artículo de divulgación científica: The revolution will not be crystallized, Callaway (2015) Nature, 525,172.
Microscopía electrónica vs criomicroscopía electrónica:
Max Knoll y Ernst Ruska, inventaron el primer microscopio electrónico. 70 años después se llegó a la criomicroscopía electrónica (‘’Crio: frío’’).
Cuando queremos observar una muestra por microscopía electrónica se prepara una rejilla con la muestra deshidratada en condiciones de vacío. A continuación, se tiñe con algún metal pesado (agente de contraste) para distinguirla del fondo porque las muestras biológicas son prácticamente transparentes a los electrones al pasar los fotones a su través. Esto es lo que se conoce como microscopía electrónica por tinción negativa.
Sin embargo, esta técnica al utilizar la muestra deshidratada y cubierta por el agente de contraste, no nos ofrece una descripción con garantía sobre la verdadera estructura de la muestra.
En criomicroscopía electrónica, la rejilla se sumerge en etano líquido y la muestra se vitrifica (la muestra se encuentra ahora en estado vítreo, hidratada en el vacío) lo que permite que se sigan dando fuerzas entrópicas en las proteínas. Además, la muestra no se tiñe, luego las imágenes son tremendamente tenues y no hay apenas contraste entre la muestra y el fondo. Para solucionar esto se toman imágenes de miles o de decenas de miles de la muestra a analizar.
Imaginemos que tenemos tres imágenes de un ribosoma. Cuando éste se disponga en la rejilla adoptará distintas orientaciones. Asumimos que todos los ribosomas de una misma especie son idénticos. Como están en distintas posiciones, se obtienen distintas proyecciones que se combinan en una única imagen mediante algoritmos implementados con un software en el ordenador. Como resultado se obtiene un modelo a cierta dimensión de la estructura tridimensional.
Promediando las imágenes en primer lugar, conseguimos aumentar el contraste entre cada parte de la imagen, la partícula y el fondo.
En segundo lugar, aumentamos la relación señal-ruido: imaginemos que los ribosomas tienen una impureza situada en un sitio distinto en cada uno. Promediando las imágenes, las impurezas se eliminan prácticamente, se limpia la imagen de ruido.
En tercer lugar, al utilizar proyecciones distintas del mismo objeto conseguimos una resolución tridimensional al haber información de todas las partes de la estructura.
La criomicroscopía sustituyó o complemento a las técnicas de microscopia de tinción negativa.
Algunas estructuras biológicas determinadas mediante criomicroscopía electrónica:
-El virus de la fiebre aftosa con el Fab de un anticuerpo neutralizante.
-Estructura a baja resolución de un bacteriófago Épsilon 15. Si usáramos el microscopio electrónico con tinción negativa no podríamos ver el interior ya que pondríamos una coraza opaca a la muestra. La criomicroscopía electrónica permite ver el interior de la muestra. Algunos electrones se retienen lo cual nos permite obtener un mínimo contraste entre cada parte de la estructura que a su vez aumenta al procesar la imagen.
Se ve como esta compactado el DNA y unas proteínas internas que forman un canal por el cual el DNA se empaqueta cuando forma la capsula viral y por el que sale cuando infecta a las células.
Inconvenientes de la criomicroscopía electrónica: realmente dependiendo de cómo sea la estructura de la proteína hay una serie de razones técnicas que dificultan llegar a resolución atómica ya que con proteínas pequeñas hay dificultad para el procesamiento de las imágenes y por tanto llegar a conseguir su estructura tridimensional. La criomicroscopía electrónica es más óptima para partículas complejas. (Para proteínas de tamaño normal de momento utilizar la cristalografía).
-CRIOTOPOGRAFÍA ELECTRÓNICA:
En este caso en lugar de tomar muchas imágenes de muchas partículas, se obtienen muchas imágenes de una misma partícula con diferentes orientaciones.
Ponemos la muestra en un portamuestras especial y el haz de electrones cambia la orientación de la rejilla y por tanto la de la muestra obteniéndose así muchas imágenes de la misma partícula en diferentes orientaciones.
Ejemplo, estructura tridimensional del virus del herpes simple obtenida en un solo virus: se ven los detalles de la estructura que se han coloreado, varias cápsidas, la estructura de cada capa, lípidos…
El virus de la gripe el virus del sarcoma de Rous.
El problema de la criotopografía electrónica es que tiene dificultad para obtener la estructura tridimensional a nivel atómico
La mayor parte de las muestras se necesita muy poca cantidad para un material biológico. La muestra no es el factor limitante. Desventaja: no puede distinguir impurezas.
La ventaja principal es que podemos ver diferencias entre dos partículas. Por ejemplo, en un virus, puede pasar que se dé un cambio conformacional entre una forma y otra encontrando la una expandida y otra contraída. Este cambio de conformación permite la entrada o salida del ácido nucleico. Además, podemos comparar diferencias entre poblaciones de virus.
La imagen de la derecha es una imagen de una célula infectada por un adenovirus. Se observan componentes del citoesqueleto, vacuolas… No se llega a nivel atómico, pero podemos ver cada elemento con un detalle superior que nos permiten otras técnicas.
La criomicroscopía electrónica es actualmente una técnica que permite llegar a nivel atómico en la resolución de la estructura tridimensional de macromoléculas. (Premio Nobel día 4 octubre)
-CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X
Max Perutz y John Kendrew son los creadores de la cristalografía de rayos X de proteínas.
El modelo tridimensional de Perutz de la hemoglobina no llega a resolución atómica. Era la primera estructura que se determinaba y había muchas deficiencias.
El modelo tridimensional de Kendrew de la mioglobina de cachalote si llega a resolución atómica. Es un modelo de wallframe ya que vemos la posición exacta de cada centro de cada átomo. Se trataba de una molécula más pequeña y fácil de cristalizar.
La cristalografía de rayos X sigue siendo la técnica estándar para resolver la estructura tridimensional de macromoléculas a nivel atómico, no va a ser reemplazada por la criomicroscopía.
-Etapas en la determinación de la estructura atómica de proteína y ácidos nucleicos mediante cristalografía de rayos X.
1. Obtener proteína pura y abundante (purificación).
2. Cristalización.
3. Optimizar los cristales.
4. Difractar y determinar la fase (cálculos matemáticos).
5. Construir el modelo.
6. Entendimiento estructura-función.
1. Obtener proteína pura y abundante (purificación): Es necesaria mucha más cantidad de proteína que la que se usa para criomicroscopía (en criomicroscopía basta con 1mg mientras que en cristalografía de rayos X suelen ser necesarios 20mg).
Esto puede ser una limitación dependiendo de nuestra proteína de estudio. Si queremos cristalizar una proteína de membrana, al ser muy insolubles son más difíciles de purificar por lo que no será fácil obtener grandes cantidades de proteína. Si la proteína se puede clonar o expresar en un sistema eucariótico tenemos la posibilidad de crear mayores cantidades.
Actualmente, la mayoría de las proteínas se obtienen por ingeniería genética clonando el gen de interés.
La pureza de la proteína tiene que ser prácticamente del 100% en cristalografía por rayos X mientras que en criomicroscopía con el promedio de imagen la contaminación no era muy grave.
2.Cristalización: cristales moleculares pequeños.
Los cristales son materiales cuyos constituyentes, átomos, moléculas o iones, se empaquetan de un modo regular y periódico, formando una estructura microscópica ordenada. Estos constituyentes están unidos entre sí mediante diferentes tipos de fuerzas interatómicas (enlaces químicos), tales como el enlace metálico, el enlace iónico, el covalente, las fuerzas de van der Waals, y otros.
En la imagen observamos dos moléculas en distinta orientación en el cristal. Sin embargo, si nos fijamos de dos a dos moléculas observamos que está combinación se va repitiendo y sus átomos adoptan las mismas posiciones en el espacio. A cada par de moléculas se le denomina celdilla unidad: mínima unidad del cristal que se repite por traslación ordenada en todo el cristal. La celdilla unidad define la forma del cristal (cúbica, romboide…). Hay ocasiones en las que la repetitividad se rompe, no es exacta, y precisamente esa característica es lo que diferencia a los cristales de los vidrios o en general de los llamados materiales amorfos.
- Obtención de cristales:
La cristalización es el proceso mediante el cual las moléculas se ordenan de un modo natural formando un retículo repetitivo que denominamos cristal.
El método más común para estos experimentos es el basado en la técnica de la gota colgante. Se colocan unos pocos microlitros (1-2 μl) de la solución de proteína en el centro de un cubreobjetos de vidrio y se le añaden otros tantos microlitros de la solución del precipitante contenido en un pocillo, al cual previamente se le ha equilibrado su pH mediante un tampón. El cubreobjetos que contiene a la gota de mezcla se le da la vuelta y con él se tapa el pocillo mencionado. Este sistema cerrado evolucionará por equilibrio de vapor, y como la mezcla de proteína y precipitante en la gota está menos concentrada que la solución de precipitante en el pocillo, el agua de ésta se evaporará, uniéndose a la solución del pocillo. Como resultado de este proceso, la concentración de la proteína y del precipitante aumentarán lentamente en la gota, y si las condiciones son las adecuadas, se formarán cristales.
Condiciones a tener en cuenta para que la proteína cristalice: temperatura, fuerza de gravedad, presión, pH, fuerza iónica...
Cada molécula del cristal está constituida por 6 átomos con una distribución espacial, ángulos y distancias concretas adoptando una disposición estable y favorable.
Para llevar a cabo la cristalografía de rayos X necesitamos una fuente de rayos X que emita un chorro de fotones en la longitud de onda de los Rayos X, es decir muy pequeñas, que se haga incidir sobre la molécula a cristalografiar.
Para resolver dos puntos a través de radiación electromagnética la longitud de onda ha de ser menor que la distancia entre los dos puntos a resolver. Los fotones o electrones, por tanto, han de tener poca longitud de onda. Si estos fotones fuesen de luz visible, no se llegaría a resolución atómica porque su longitud de onda es muy larga.
Cuando llegan a la muestra, cada átomo tiene su nube electrónica y difracta los rayos x en diferentes longitudes. Los rayos x que pasen más cerca del núcleo se desviarán (en las zonas cercanas al núcleo la densidad electrónica es máxima mientras que en el centro del núcleo la probabilidad de encontrar un electrón es bajísima- Shrödinger) por lo que no nos van a permitir ver la posición de la alta densidad electrónica que rodea a cada núcleo.
Hace falta un dispositivo para concentrar los rayos difractados. Una lente reconstruye físicamente las trayectorias de los fotones dispersados de forma que por las leyes de la física y de la óptica geométrica obtenemos una imagen en principio idéntica en cuanto a su forma y no necesariamente en su tamaño de la imagen original.
En criomicroscopía se emplea una lente electromagnética que concentra los electrones dispersados obteniéndose así, una imagen muy ampliada.
Los únicos elementos que pueden reconstruir imágenes de rayos X difractados son los espejos (estrellas, supernovas…), carecemos de lente.
Lo que se hace es recoger los fotones dispersados por el objeto mediante una pantalla sensible a rayos X o un detector electrónico de tipo CCDS (film). Cuanto más grande sea el detector y más cercano esté menos intensidad necesitamos y además recogemos más datos. Después, esta información se interpreta a través de fórmulas matemáticas que reflejan las leyes de la óptica en física.
Si la intensidad de rayos X no es suficiente si el cristal es muy pequeño ya que por mucho que sea sensible el detector la imagen no llega. Uno de los grandes avances ha sido obtener rayos x potentísimos utilizándose aceleradores de partículas como el sincrotrón. La radiación de sincrotrón es la radiación electromagnética generada por partículas cargadas (tales como electrones) que se mueven según una trayectoria curva a alta velocidad (una fracción apreciable de la velocidad de la luz) en un campo magnético. Cuanto más rápido se mueven los electrones, más corta es la longitud de onda de la radiación Los electrones se aceleran a velocidades relativistas muy próximas a la velocidad de la luz.
Si la partícula se mueve será complicado recoger la información luego hay que usar una velocidad de obturación muy alta (instantánea) (los tiempos de exposición son cortos ya que los rayos X son muy dañinos para las moléculas biológicas) y se necesita mucha más luz porque el tiempo de emisión es mucho menor (intensidad máxima posible para no dar la muestra).
En los cristales al estar todas las moléculas orientadas de la misma manera obtenemos la ventaja de que difractarían la luz exactamente igual. La intensidad que necesitamos es proporcionalmente menor cuantas más moléculas haya en el cristal. Las moléculas suman sus efectos de difracción y necesitamos detectores menos sensibles y proyectores de rayos X menos potentes. Aumentar la intensidad de los detectores no es posible porque ya es máxima y si aumentásemos la intensidad de radiación, la muestra se estropearía. Por ello, para llegar a una resolución atómica, el cristal ha de ser lo más grande y ordenado posible.
Existen cámaras de cristalización donde se almacenan las placas. El gasto de proteínas es muy grande. La mayoría de las proteínas pueden cristalizarse y pueden ser necesarias cantidades muy grandes de proteína para que cristalice, esto dependerá en muchas ocasiones del esfuerzo y empeño del cristalógrafo, aunque en algunos casos muy especiales y minoritarios la proteína no podrá cristalizar nunca. Parte de la dificultad del proceso radica en que no se conocen los valores de concentración, temperatura y pH que han de utilizarse para que cristalice la proteína. Por ejemplo, la lisozima se puede cristalizar en tan solo una hora.
En un cristal molecular las moléculas están en solución por lo que se encuentra en condiciones fisiológicas y su estructura es nativa. La mayor parte del cristal de proteína es agua lo que permite la entrada de sustratos. En el caso de un anticuerpo, cuando el parátopo está siendo bloqueado estéricamente con alguna otra parte de la molécula de proteína, su estructura no va a variar, pero no va a ser capaz de unir el ligando. Las ligeras deformaciones no son fisiológicas.
La estructura del cristal no se puede definir con antelación. El anticuerpo de las figuras a) y b) ha cristalizado en el sistema hexagonal.
La maquinaría de cristalización está constituida por un proyector de rayos X, un cabezal goniométrico que permite cambiar el ángulo de orientación del cristal, un chorro de nitrógeno a muy bajas temperaturas para reducir el calor que generan los fotones y un detector.
Es necesario girar el cristal, ya que si sólo obtuviésemos una imagen no podríamos ver todas sus partes debido a que el patrón de difracción de los rayos X es tridimensional. Es por ello por lo que se gira la placa para obtener la máxima información posible.
Los fotones que salen difractados por la muestra llegan al detector donde dibujan un patrón de difracción. La intensidad de la reflexión (puntos negros) varía a lo largo del patrón de difracción que es como una huella digital del cristal molecular.
Sin embargo, no todos los datos están recogidos en el patrón de difracción. El cristal dispersa fotones en todas las direcciones del espacio y muchos de ellos son interferidos por otros fotones impidiendo que lleguen a la pantalla (fenómeno de interferencia). Las dos ondas anulan sus fases: interferencia negativa. De esta manera con el patrón de difracción se puede determinar la intensidad de la radiación y las posiciones a las que llegan las radiaciones (mediante un sistema de coordenadas hkl (xyz)), pero no la fase de la radiación.
Una vez conseguido el patrón de difracción hay que encontrar la relación que tiene éste con la estructura molecular del cristal, esto se hace aplicando fórmulas matemáticas de acuerdo con las leyes de la óptica física.
Suponemos que hemos resuelto el problema de la fase.
Para saber la posición relativa de los núcleos atómicos de la molécula con respecto a un origen de coordenadas utilizamos la siguiente ecuación matemática:
Sumatorio de las intensidades para cada mancha en el patrón de difracción en las coordenadas hkl multiplicado por las posiciones de cada mancha de difracción por cada variable de coordenadas xyz. Fi es la fase de los fotones que llegan a cada uno de los puntos en el patrón de difracción para la posición hkl.
La variable dependiente son las coordenadas de los núcleos atómicos y la independiente son los datos obtenidos en el experimento de difracción menos la fase calculada. La ecuación se resuelve para cada posición de la celdilla unidad en el sistema de tres dimensiones. Fi es la fase de los fotones que llegan a hkl.
Mediante la fórmula matemática anteriormente expresada se obtienen mapas de densidad electrónica que representan los máximos de densidad electrónica en cada celdilla.
No obstante, una posición en el patrón de difracción no se corresponde con una posición en la celdilla unidad, sino que cada punto de intensidad recoge información de cada punto de la celdilla unidad.
En criomicroscopía también se obtienen mapas de densidad de electrónica por lo que el resultado final es el mismo en criomicroscopía electrónica que para cristalografía de rayos X.
-Determinación de las fases: se utilizan 3 métodos:
• Molecular Replacement (MR):
Se emplea cuando tenemos una proteína problema X de estructura desconocida y otra proteína de la que ya se ha determinado su estructura tridimensional (coordenadas atómicas y fases almacenadas en el PDB). Si se parecen estructuralmente (son homólogas) se pueden usar las fases de la conocida para calcular las de la problema. Para comprobar si las proteínas son homólogas se compararían sus secuencias. Si tienen un porcentaje de identidad de secuencia mayor del 30% es muy probable que sus estructuras tridimensionales sean muy parecidas y por tanto, se podrá utilizar la información contenida en el PDB.
Este método se usa para un número de proteínas limitado ya que no todas las estructuras están resueltas. No hay un número ilimitado de estructuras tridimensionales genéricas para las proteínas si no que son variaciones sobre unos temas generales.
Las fases de los fotones no son idénticas, pero si parecidas por lo que sirven como punto de partida para después con un método de cálculo por ordenador resolver las diferencias y calcular con exactitud sus fases. Complejidad baja.
• Multiple Isomorphus Replacement (MIR): cambio de la estructura de la molecula metiendo atomos pesados
En el cristal de la proteína se infiltran átomos pesados que se unan a determinadas partes de la proteína. Los átomos pesados tienen más electrones, luego difractan más los rayos X, produciendo un cambio en el patrón de difracción. Comparando el patrón de difracción de la proteína nativa con el patrón de difracción de la proteína con átomos pesados se pueden calcular algunas de las fases.
Es un proceso muy lento ya que tenemos que obtener cristales de la misma forma y mismo tamaño que la celdilla unidad e insertar un átomo pesado distinto en cada uno. No está limitado a un numero de proteínas, pero es más complejo y se tarda más tiempo. Complejidad muy alta.
• Anomalous Scattering (MAD-Multiple Anomalous Dispersion, SAD-Single Anomalous Dispersion)
La proteína es marcada metabólicamente con un átomo especial. Por ejemplo, se sustituye el azufre por selenio en un aminoácido metionina. Nutrimos a la bacteria con selenio-metionina, por lo que en cada proteína de esa bacteria habrá selenio-metionina en lugar de solo metionina. Purificamos la proteína recombinante y la cristalizamos. La proteína final emitirá rayos X en condiciones anómalas pudiendo obtener un patrón de difracción y mediante proceso de refinado llegaremos a la obtención de sus fases. Complicación media.
5. Construcción del modelo atómico
Con el mapa de densidad electrónica obtenemos las coordenadas atómicas para cada punto de la celdilla unidad. En el mapa se observan zonas de alta densidad electrónica y baja densidad electrónica, nuestra molécula se encontrará en la estructura de alta densidad electrónica. Las nubes electrónicas se corresponden con las zonas más cercanas a los núcleos de los átomos, aunque no sabemos el tipo de enlace que los une.
Puesto que el mapa de densidad electrónica solo nos proporciona información sobre la conformación de la molécula, necesitaremos establecer un modelo que nos indique su estructura covalente. Para ello hemos de secuenciar la proteína y se representa en un
programa de ordenador. Establecemos un modelo en el que no se pueden alterar las distancias de enlace, ni deformar por ejemplo el anillo de la fenilalanina (los enlaces peptídicos tienen carácter de doble enlace y son trans). No obstante, si podemos cambiar las posiciones de los átomos unidos por enlaces simples.
Después, se ajusta la estructura covalente a la conformación que define el mapa de densidad electrónica. De esta forma tenemos definida la estructura tridimensional de la proteína con cierta precisión. La precisión se mejorará durante el proceso de refinamiento: maximizando las interacciones atractivas, disminuyendo las interacciones estéricas (parte estadística automatizada).
Las fases no son muy correctas porque se determinan de forma aproximada o a partir de las ya conocidas de otras proteínas y por tanto el mapa de densidad electrónica no va a ser muy preciso. Para comprobar el grado de similitud entre nuestra muestra y la imagen existe el método del factor R.
En el experimento obtenemos un patrón de difracción en el que hemos medido, intensidades, posiciones y calculado fases obteniendo así un modelo atómico. (La variable independiente serían las posiciones xyz. Las intensidades en cada una de las posiciones del patrón de difracción serían la variable dependiente.)
Se comparan el patrón de difracción del cristal molecular original con el patrón de difracción del modelo atómico experimental. Si ambos patrones son similares habremos obtenido un modelo atómico de nuestra proteína fiable y acorde con la realidad. Los patrones de difracción nunca pueden ser completamente idénticos porque no podemos ver exactamente la realidad sino imágenes de la misma.
A continuación, se cuantifican las pequeñas diferencias en promedio y se obtiene el factor R: una medida de calidad, que dice cuanto de parecido es el modelo con respecto a la realidad.
Si calculamos mal las fases sale que la estructura de la proteína es a) si no hubiésemos cometido los errores habríamos obtenido la estructura b).
En el ordenador se va refinando el modelo estructural mediante ajustes estadísticos. El objetivo es hacer que el modelo encaje lo mejor posible con el mapa de densidad electrónica obtenido desde el punto de vista fisicoquímico. Si el factor R sube el modelo se hace más distinto a la estructura real, pero si baja indica que el modelo estructural es muy válido (0,15 como valor R es muy bueno).
Libros referencia 18 en sustitución al Rhodes y referencia 19 que complementa el 1º libro sobre RMN.
Kurt Wüthrich obtuvo el Premio Nobel de espectroscopía RMN de proteínas.
Se emplean espectroscopios que son aparatos caros y de gran tamaño con campos magnéticos muy grandes (900 Mhtz es el límite que se puede conseguir).
El espectroscopio está constituido por un emisor y un detector de radiofrecuencias (detecta los fotones de las moléculas cuando vuelven a su estado basal); un campo magnético (permite orientar la muestra en la dirección que queremos). La muestra se coloca en un tubo entre dos imanes.
La muestra se encuentra en solución lo cual crea un entorno con unas condiciones muy aproximadas a las fisiológicas. Es necesario que la muestra (proteína) esté muy concentrada. Esto puede suponer un problema porque puede agregar al encontrarse a temperaturas moderadas. Como la muestra ha de ser muy concentrada, se necesitan grandes cantidades de la misma, aunque menores que en cristalografía ya que en esta no sabíamos si la proteína iba a cristalizar o no mientras que en RMN es muy probable.
Irradiamos la muestra con fotones de ondas de radios (de gran longitud de onda). Cuando dejamos de excitar las moléculas, sus partes vuelven a su estado fundamental y emiten energía dentro de la frecuencia de las ondas de radio que son detectadas por el detector. Mediante esta técnica no resolvemos distancias interatómicas de forma directa sino indirectamente.
En concreto se miden cambios de excitación en los núcleos atómicos que constituyen la muestra. Los átomos de H1, C13 y N15 tienen dos estados rotacionales (spin=+- ½) por lo que al aplicar el campo magnético se producirá una transición entre sus estados rotacionales. En las moléculas biológicas estos átomos se encuentran en sus formas C12 y N14 por lo que deberán sustituirse en las células mediante medios mínimos de glucosa con C12 y N14. La intensidad del campo magnético es baja porque las ondas de radio tienen una longitud de onda muy larga y, por tanto, muy poca energía. La diferencia de energía entre los dos estados de spin es muy baja, pero se puede medir la longitud de onda de los fotones que emite la molécula. Así cada átomo tendrá una frecuencia de emisión. El entorno químico influye en la separación de los dos estados cuánticos de spin entre estado basal y excitado.
Cuanto mas fuerte sea el campo magnético, mayor resolución podremos obtener y podremos llegar a un mayor número de átomos (proteínas más grandes). En proteínas grandes el espectro de RMN tendrá un mayor número de picos, es decir habrá un alto solapamiento y para resolver su estructura será necesaria una mayor intensidad de campo magnético.
Si representamos el desplazamiento químico (pensar en longitud de onda o frecuencia) de la molécula CH3-CH2-OH (ppm) en función de la intensidad del campo magnético obtenemos 4 picos en el espectro de RMN. El 4º pico no es de la molécula, sino que se pone de referencia como control mientras que los picos a), b) y c) corresponden a cada hidrógeno de la molécula. Si aumentamos la intensidad el campo magnético, al haber una mayor resolución, los picos se despliegan y se observan mejor.
De esta manera, la espectroscopía RNMN está limitada por el tamaño de la muestra y la intensidad del campo magnético. Existen tecnologías de espectroscopía bidimensional que nos permiten aumentar la resolución del espectro sin aumentar la intensidad del campo magnético, aun así, sigue habiendo un cierto límite de tamaño. Hoy en día no se pueden resolver proteínas con un peso molecular que supere a los 100.000 Da (límite).
Una vez obtenidos el espectro de RMN se analiza y se le asignan y determinan parámetros que son la base experimental que permite al espectroscopista determinar la estructura de la proteína (son los análogos a las posiciones, intensidades y fases en criomicroscopía electrónica).
Se obtienen restricciones geométricas en la molécula: ángulos fi y psi de cada aminoácido (restricciones angulares), distancias entre átomos de hidrógeno (restricciones de distancia), orientación de enlaces NH, CH, CC (restricciones de orientación), enlaces de hidrógeno…
Estas restricciones permiten calcular la estructura tridimensional y elaborar un número limitado de modelos en función de si éstas encajan bien con los datos experimentales obtenidos a partir de esos parámetros.
Imaginemos una molécula compuesta por solo 3 átomos de hidrogeno. Usaremos la restricción ms importante: distancia en el espacio entre dos hidrógenos (parámetro NOE). Las distancias experimentales obtenidas para sus 3 hidrógenos son:
D1-2: 2 Angstroms
D2-3: 2 Angstroms
D3-1: 2 Angstroms
Con estas distancias podemos deducir que la estructura de la molécula es un triángulo equilátero sin duda. Sin embargo, los datos de RMN no son tan precisos y es más habitual que den rangos de distancias. Se obtienen así varios modelos compatibles que satisfacen las distintas restricciones. Siempre habrá más de un modelo que satisfaga las condiciones experimentales.
Ninguna conformación es mejor que otra. Dentro de esas conformaciones puede haber zonas en las que las posiciones de los átomos en el espacio prácticamente coincidan y otras en las que sean muy diferentes. El hecho de que haya zonas en los modelos muy distintas puede deberse a que se trate de zonas de la molécula con un grado de libertad conformacional elevado o también que no haya suficientes restricciones geométricas.
Con los datos de RMN no podemos saber si una zona de la molécula es dinámica o no.
El modelo de la derecha tiene más resolución, se han obtenido muchas restricciones y por tanto hay menos modelos. A más restricciones mayor número de modelos.
El PDB en general, enseñara un modelo. Normalmente suele ser un promedio de los mejores modelos que no por ello tiene que ser el mejor.
La estructura covalente de las macromoléculas es conocida de antemano, lo que se pretende obtener es la conformación tridimensional de la misma.
No es una técnica de imagen puesto que no se obtienen imágenes sino un perfil del objeto/ un mapa topográfico del objeto. Puede llegar a resolución atómica si las condiciones son adecuadas, pero no en moléculas biológicas. Cada vez se emplea más en biología.
Los inventores fueron Heinrich Ronh…
La microscopía de proximidad (STM) es similar a la AFM que es una variante del primer microscopio de efecto túnel.
Principio del microscopio de fuerzas atómicas:
Es similar al que lleva a cabo una persona ciega. Tiene una pequeña palanca terminada en una punta muy fina que puede detectar en casos muy extremos un sólo átomo. Con esa punta escanea una muestra en dos dimensiones horizontales. Mueve la punta a lo largo del objeto en el eje x y el eje y, cuando ha acabado de escanear si choca con el objeto sube la punta y mide la altura. De esta manera obtenemos un perfil topográfico en tres dimensiones del objeto y una altura del mismo. Todos estos datos van a un ordenador.
Uno de los inconvenientes de esta técnica es que no nos permite ver el interior del objeto porque no puede penetrarlo.
Con moléculas biológicas puede determinar sus detalles estructurales pero su resolución sólo es de 1nm (10A) ¿para llegar a resolución atómica serían necesarios al menos el doble? Si las condiciones son ideales, no biológicas, puede llegar a resolver la estructura de una molécula a nivel atómico (ej: molécula de pentaceno). Se puede determinar el carácter del enlace , si es simple doble, sus dimensiones. Además, cada molécula se ve individualmente, no hay promedio de imágenes.
Hoy por hoy no es competitiva con ninguna de las otras técnicas para llegar a resolución atómica.
En 2 minutos se obtiene la estructura de la molécula como un virus. Lo hace en solución acuosa que puede ser perfectamente fisiológica (2150mM NaCl y pH7) además podemos ver como el virus infecta a una célula en tiempo real, pero sacrificas la resolución y no puedes ver el interior de lo que estas observando. Cada vez se usa más como complemento.
Podemos estudiar el movimiento (dinámica) de las células en condiciones fisiológicas y en tiempo real. El tiempo depende de la velocidad con la que el microscopio actúe.
Toshiba ando ha desarrollado unos microscopios de fuerzas atómica de alta velocidad que permiten ver imágenes de video de 20- 30 nm por segundo.
La resolución es bastante mala porque necesitamos una velocidad muy alta. Con estas imágenes se puede medir la velocidad del rotor que es una de las pocas técnicas que lo permiten hacer.
También se puede medir la fuerza de plegamiento de las proteínas mediante esta técnica. Para ello hay que pegar la proteína por un extremo a un soporte y por el otro a la punta de la palanca, esta se levanta hacia arriba y hace que la proteína se estire.
Los cambios conformacionales oscilan entre a una diezmilésima de segundo, y están fuera del alcance de técnicas AFM, pero dentro de técnicas RMN. Intercambio de hidrogeno de deuterio es una técnica de RMN que permite ver cambios conformacionales muy pequeños en la estructura. Si queremos estudiar movimientos más rápidos nos encontramos con limitaciones técnicas experimentales.
Hay técnicas computacionales como la dinámica molecular en la que se puede predecir el movimiento de cada átomo en esa molécula y con ordenadores podemos simular el movimiento
de cada átomo en moléculas tan grandes como virus. Es una predicción basada en una serie de supuestos por lo que solo es una hipótesis, no se puede tomar como cierta. Sera necesario verificar experimentalmente. Esta técnica nos permite llegar a ver el centro activo de una enzima.
La dinámica molecular solo simula tiempos muy cortos (tan solo unos pocos picosegundos) como la catálisis enzimática, pero para movimientos más lentos no es poderosa hasta que no suba la potencia de cálculo de los supercomputers.
Por tanto, se combinan técnicas experimentales y computacionales:
-NMR (amplia escala de tiempo biológico).
-AFM (técnica de fututo próximo para movimientos más lentos en el tiempo)
-Cálculos de dinámica molecular (movimientos muy rápidos con mucha precisión, es una técnica computacional y está sujeta a verificación experimental).
-También se podría recurrir a la sucesión de fotos fijas si es que es lo suficientemente estable como para poder ser detectado el movimiento (por cristalografía entre dos imágenes).
Apuntes sobre las Proteinas
Tema 3  Estructura tridimensional de proteïnes
Química orgánica- estructura tridimensional de compuestos
Proteinas. Estructura de las proteinas
Proteínas y estructuras
Resolucion de la estructura tridimensional de proteinas
Bioquímica 05 2013

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