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Publicado en BOE n�m. 265 de 05 de Noviembre de 1999
Vigencia desde 06 de Noviembre de 1999. Esta revisi�n vigente desde 01 de Abril de 2007
Art�culo 2 ��mbito de aplicaci�n y vigencia del programa
Art�culo 3 �Ex�menes oficiales
Art�culo 4 �Obligaci�n de notificaci�n
Art�culo 5 �Medidas cautelares
Art�culo 6 �Confirmaci�n de la presencia del organismo
Art�culo 7 �Medidas fitosanitarias a adoptar sobre el material contaminado
Art�culo 8 �Medidas aplicables para evitar la contaminaci�n mediante patata de siembra
Art�culo 9 �Prohibici�n
Art�culo 10 �Excepciones con fines cient�ficos
Art�culo 11 �Medidas adicionales
Art�culo 12 �Indemnizaciones
DISPOSICION TRANSITORIA UNICA �Medidas provisionales
Primera �Comunicaci�n al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n
Segunda �Normativa general aplicable
Tercera �Car�cter b�sico
SECCI�N I.� Lista de plantas hu�sped de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. a las que se refiere el art�culo 1
SECCI�N II.� Ex�menes
M�todo de diagn�stico, detecci�n e identificaci�n de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
SECCI�N I.� APLICACI�N DEL M�TODO
SECCI�N II.� M�TODOS DETALLADOS DE DETECCI�N DE R. SOLANACEARUM EN TUB�RCULOS DE PATATA Y PLANTAS DE PATATA, TOMATE U OTRAS PLANTAS HU�SPED CON S�NTOMAS DE LA PODREDUMBRE PARDA O LA MARCHITEZ BACTERIANA
SECCI�N VI.� PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA LA DETECCI�N E IDENTIFICACI�N DE R. solanacearum
AP�NDICE 1 .�Laboratorios que han participado en la optimizaci�n y la validaci�n de los protocolos
AP�NDICE 2 .�Medios para el aislamiento y el cultivo de R. solanacearum
AP�NDICE 4 .�Tampones para procedimientos de ensayo
AP�NDICE 5 .�Determinaci�n del nivel de contaminaci�n en las pruebas IF y FISH
AP�NDICE 6 .�Protocolos y reactivos PCR validados
AP�NDICE 7 .�Reactivos validados para la prueba FISH
AP�NDICE 8 .�Condiciones de cultivo para el tomate y la berenjena
ANEXO III .� Conservaci�n de las pruebas anal�ticas en caso de aparici�n de un brote sospechoso
ANEXO IV .� Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinaci�n de la probable contaminaci�n
ANEXO V .� Medidas bajo control oficial
ANEXO VI .� M�todos oficialmente autorizados para la eliminaci�n de residuos
ANEXO VII .� Disposiciones que se deben cumplir para la eliminaci�n de los residuos
R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, y su normativa de desarrollo, declarados expresamente vigentes, por el n�mero 2 de la disposici�n transitoria tercera de la Ley 43/2002, de 20 de noviembre, de sanidad vegetal (�B.O.E.� 21 noviembre).
El organismo nocivo Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., conocido anteriormente por Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith, es causa de las enfermedades de la "podredumbre parda" en los tub�rculos de patata y de la "marchitez bacteriana" en las plantas de patata, tomate y otras especies de solan�ceas, y representa una grave amenaza para las producciones de estos cultivos.
Debido a que en los �ltimos a�os han aparecido brotes de las enfermedades citadas en algunas partes de la Comunidad Europea y que a�n subsisten algunos focos de infecci�n aislados, y en particular respecto a Espa�a se han producido algunas intercepciones en Castilla y Le�n y Galicia y, dicha bacteria est� presente con una distribuci�n localizada en la isla de La Palma en Canarias; considerando la importancia econ�mica de los citados productos vegetales; y teniendo en cuenta que el conocimiento actual de la biolog�a y epidemiolog�a de Ralstonia solanacearum en las condiciones europeas es incompleto y que puede preverse la necesidad de revisar en el futuro las medidas y los procedimientos de an�lisis aqu� establecidos, se hace preciso adoptar las medidas m�nimas necesarias contempladas en la Directiva 98/57/CE del Consejo, de 20 de julio de 1998, sobre el control de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. mediante el correspondiente programa de erradicaci�n y control y ello sin perjuicio de que se adopten las medidas adicionales m�s estrictas que resulten necesarias.
En consecuencia, mediante este Real Decreto, se incorpora al ordenamiento interno la Directiva 98/57/CE, del Consejo, de 20 de julio, de acuerdo con las competencias atribuidas al Estado con car�cter exclusivo por el art�culo 149.1.13.a de la Constituci�n Espa�ola en materia de bases y coordinaci�n de la planificaci�n general de la actividad econ�mica.
En su virtud, a propuesta del Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n, previo informe del Ministro de Administraciones P�blicas, de acuerdo con el Consejo de Estado, y previa deliberaci�n en el Consejo de Ministros del d�a 22 de octubre de 1999,
La presente disposici�n establece el programa de erradicaci�n y control del organismo Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., anteriormente denominado Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith (denominado en lo sucesivo "del organismo") de acuerdo con el art�culo 12 del Real Decreto 1190/1998, de 12 de junio, por el que se regulan los programas nacionales de erradicaci�n o control de organismos nocivos de los vegetales a�n no establecidos en el territorio nacional, con el fin de que, en lo que respecta a las plantas hu�sped del organismo indicadas en la secci�n I del anexo I del presente Real Decreto (denominadas en lo sucesivo "del material vegetal indicado"), se adopten las medidas necesarias para:
a) localizar el organismo y determinar su distribuci�n;
b) impedir su aparici�n y propagaci�n; y
c) en caso de que aparezca, evitar su propagaci�n y controlarlo con vistas a su erradicaci�n.
2. Se declaran de utilidad p�blica las medidas contempladas en el presente Real Decreto, de conformidad con lo establecido en el Real Decreto 1190/1998.
Art�culo 2 �mbito de aplicaci�n y vigencia del programa
1. El programa que se aprueba y las medidas de �l dimanantes ser�n de aplicaci�n en todo el territorio nacional.
2. En tanto la Comisi�n de las Comunidades Europeas no se pronuncie al respecto, la duraci�n del programa se prev� ilimitada. En todo momento y como consecuencia de la situaci�n de la enfermedad, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n podr� introducir las modificaciones que se consideren necesarias o determinar su conclusi�n.
Art�culo 3 Ex�menes oficiales
1. Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma, a los que se hace referencia en el art�culo 11.2 b) del Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protecci�n contra la introducci�n y difusi�n, en el territorio nacional y de la Comunidad Europea, de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales; as� como para la exportaci�n y tr�nsito hacia pa�ses terceros y el �rgano competente de la Comunidad Aut�noma de Canarias, llevar�n a cabo anualmente ex�menes oficiales sistem�ticos para detectar la posible presencia del organismo en el material vegetal indicado originario de su territorio.
Con objeto de determinar otras posibles fuentes de contaminaci�n existentes para el cultivo del material vegetal indicado, los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma llevar�n a cabo una evaluaci�n de riesgo y, salvo que no se haya detectado riesgo alguno de propagaci�n durante dicha evaluaci�n, efectuar�n, en las zonas productoras de dicho material, ex�menes oficiales orientados espec�ficamente a la detecci�n del organismo en plantas distintas de ese material, incluidas las solan�ceas silvestres hu�sped, as� como en las aguas de superficie que se utilicen para regar tal material y en los residuos l�quidos vertidos por las instalaciones industriales de transformaci�n o de embalaje en las que se manipule el material indicado y que se utilicen para regar el material vegetal indicado. La extensi�n de estos ex�menes orientados se determinar� en funci�n del riesgo observado.
Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma podr�n realizar tambi�n ex�menes oficiales destinados a la detecci�n del organismo en otros materiales, como el medio de cultivo, el suelo y los residuos s�lidos procedentes de las instalaciones industriales de transformaci�n o de embalaje.
2. Los ex�menes oficiales previstos en el apartado 1 del art�culo 3 se efectuar�n:
a) en el caso del material vegetal indicado, de acuerdo con las normas establecidas en el punto 1 de la secci�n II del anexo I del presente Real Decreto; y,
b) en el caso de las plantas hu�sped del organismo distintas del material vegetal indicado y en el de las aguas, incluidos los residuos l�quidos, aplicando m�todos apropiados y, cuando proceda, tomando muestras y someti�ndolas a an�lisis de laboratorio oficiales o bajo supervisi�n oficial;
c) cuando resulte apropiado, en el caso de otros materiales, utilizando m�todos adecuados.
Para la realizaci�n de esos ex�menes, los pormenores de los procedimientos de inspecci�n as� como el n�mero, origen y clasificaci�n de las muestras y el calendario de su recogida ser�n decididos por los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma bas�ndose en principios cient�ficos y estad�sticos s�lidos y en la biolog�a del organismo y teniendo en cuenta, seg�n la regi�n de que se trate, los sistemas concretos que se utilicen para la producci�n del material vegetal indicado y, en su caso, de otras plantas hu�sped del organismo.
3. Los detalles y resultados de los ex�menes oficiales previstos en el apartado 1 del art�culo 3 ser�n notificados al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n, y �ste, a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, a los dem�s Estados miembros y a la Comisi�n Europea cada a�o, siguiendo, a tal efecto, las disposiciones del punto 2 de la secci�n II del anexo I del presente Real Decreto. Estas notificaciones se presentar�n, a m�s tardar, el 15 de mayo, salvo en el caso de las patatas utilizadas para siembra en la propia explotaci�n, que se presentar�n, a m�s tardar, el 15 de agosto. Los detalles y resultados relativos a los cultivos se referir�n a la producci�n del a�o anterior.
Art�culo 4 Obligaci�n de notificaci�n
Los productores, los almacenes colectivos y los centros de expedici�n de los materiales contemplados en la secci�n I del anexo I del presente Real Decreto deber�n notificar inmediatamente a los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma, en las que est�n situadas sus parcelas o establecimientos, la aparici�n sospechosa o la presencia confirmadas del organismo en el material que produzca o comercialice.
Art�culo 5 Medidas cautelares
1. En todos los casos de sospecha de brote, los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma afectada velar�n por la realizaci�n de an�lisis de laboratorio oficiales o bajo supervisi�n oficial en los que se aplique, para el material vegetal indicado, el m�todo pertinente establecido en el anexo II y en las condiciones determinadas en el punto 1 del anexo III del presente Real Decreto o, en todos los dem�s casos, cualquier otro m�todo aprobado oficialmente que permita confirmar o despejar la sospecha en cuesti�n. En caso de confirmaci�n, ser�n de aplicaci�n los requisitos dispuestos en el punto 2 del anexo III del presente Real Decreto.
2. En espera de la confirmaci�n o disipaci�n de la sospecha a la que se refiere el apartado 1 del art�culo 5, en todos los casos en que:
i) se hayan observado s�ntomas de las enfermedades causadas por el organismo y se hayan obtenido resultados positivos en la prueba o pruebas de detecci�n r�pida que se contemplan en el punto 1 de la secci�n I y en el punto 1 de la secci�n II del anexo II del presente Real Decreto; o
ii) se haya obtenido un resultado positivo en la prueba o pruebas de detecci�n contempladas en el punto 2 de la secci�n I y en la secci�n III del anexo II del presente Real Decreto,
Los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma, en lo que respecta a la producci�n propia:
a) prohibir�n la circulaci�n de las plantas y tub�rculos de todos los cultivos, lotes o partidas de los que se hayan tomado las muestras, salvo que tal circulaci�n tenga lugar bajo su control y siempre que se haya comprobado que no existe ning�n riesgo identificable de propagaci�n del organismo;
b) tomar�n las medidas necesarias para descubrir el origen del presunto brote;
c) establecer�n, en lo que respecta especialmente a la producci�n del material vegetal indicado y al movimiento de lotes de patata de siembra distintos de los mencionados en la letra a), producidos en el lugar de producci�n del que se hayan obtenido las muestras mencionadas en la letra a), medidas preventivas complementarias que, bas�ndose en el nivel de riesgo estimado, sean adecuadas para prevenir toda propagaci�n del organismo.
3. En los casos de sospecha de brote en que exista un riesgo de contaminaci�n del material vegetal indicado o de las aguas de superficie que procedan o se dirijan a otra u otras Comunidades Aut�nomas o, en su caso, a otro Estado miembro, la Comunidad Aut�noma en la que se haya observado el presunto brote informar� inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n de los detalles de dicho brote y del nivel de riesgo identificado para que �ste a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, informe a las Comunidades Aut�nomas o a los Estados miembros afectados, y dichas Comunidades Aut�nomas cooperar�n en consecuencia. Las Comunidades Aut�nomas a las que as� se informe aplicar�n medidas preventivas acordes con lo dispuesto en la letra c) del apartado 2 del art�culo 5 y tomar�n cualquier otra medida que resulte adecuada de conformidad con lo dispuesto en los apartados 1 y 2 del mismo.
Art�culo 6 Confirmaci�n de la presencia del organismo
1. Si la presencia del organismo en una muestra, tomada en cumplimiento del presente Real Decreto, fuere confirmada por an�lisis de laboratorios oficiales o bajo supervisi�n oficial en los que se utilice, para el material vegetal indicado, el m�todo establecido en el anexo II del presente Real Decreto o, para todos los dem�s casos, cualquier otro m�todo oficialmente aprobado, los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma, bas�ndose a tal efecto en principios cient�ficos s�lidos, en la biolog�a del organismo y en los sistemas concretos de producci�n, comercializaci�n y transformaci�n que se utilicen en su territorio para las plantas hu�sped del organismo, adoptar�n las siguientes medidas:
i) emprender�n una investigaci�n para determinar el alcance y la fuente o fuentes primarias de la contaminaci�n, con arreglo a las disposiciones del anexo IV del presente Real Decreto y efectuando nuevos an�lisis, de conformidad con el apartado 1 del art�culo 4, como m�nimo, en todas las existencias de patata de siembra relacionadas cl�nicamente;
ii) declarar�n contaminados el material vegetal indicado, la partida o el lote de los que se haya tomado la muestra, as� como la maquinaria, veh�culo, nave, almac�n, o unidades de �ste, y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que hayan estado en contacto con el material vegetal indicado al que pertenezca la muestra tomada; asimismo, declarar�n contaminados, en su caso, el campo o campos, la unidad o unidades de producci�n de cultivos protegidos y el lugar o lugares de producci�n en los que se haya cosechado el material vegetal indicado y de los que proceda la muestra; adem�s, en el caso de las muestras tomadas durante la fase de cultivo, declarar�n contaminados el campo o campos, el lugar o lugares de producci�n y, si procediere, la unidad o unidades de producci�n de cultivos protegidos de los que se haya tomado la muestra;
iii) determinar�n, con arreglo a las disposiciones del punto 1 del anexo V del presente Real Decreto, el alcance de la contaminaci�n que probablemente se haya producido por contactos anteriores o posteriores a la cosecha, por nexos en la producci�n, riego o por relaciones clonales con la contaminaci�n declarada; y
iv) delimitar�n una zona en funci�n de tres factores: la declaraci�n de contaminaci�n contemplada en el inciso ii) anterior, el alcance de la contaminaci�n probable que se determine en el marco del inciso iii) anterior y la posible propagaci�n del organismo, con arreglo a las disposiciones del inciso i) del punto 2 del anexo V del presente Real Decreto.
b) en el caso de los cultivos de plantas hu�sped distintas del material mencionado en la letra a) en los que se haya identificado un riesgo para la producci�n del material vegetal indicado:
i) emprender�n una investigaci�n de acuerdo con lo dispuesto en el inciso i) de la letra a);
ii) declarar�n contaminadas las plantas hu�sped del organismo de las que se haya tomado la muestra; y
iii) con respecto a la producci�n del material vegetal indicado, determinar�n el alcance de la contaminaci�n probable y delimitar�n una zona de conformidad con los incisos iii) y iv) de la letra a), respectivamente.
c) en el caso de las aguas de superficie (incluidos los vertidos de residuos l�quidos procedentes de instalaciones industriales de transformaci�n o envasado en las que se manipule el material vegetal indicado) y en el de las solan�ceas silvestres hu�sped del organismo asociadas en las que, por causa del riego, aspersi�n o inundaci�n con dichas aguas, se haya identificado un riesgo para la producci�n del material vegetal indicado:
i) emprender�n una investigaci�n para determinar el alcance de la contaminaci�n, realizando en los momentos oportunos, un examen oficial de muestras de las aguas de superficie y, en su caso, de las solan�ceas silvestres hu�sped del organismo;
ii) proceder�n, en la medida que sea pertinente y sobre la base de la investigaci�n mencionada en el inciso i), a declarar contaminadas las aguas de superficie de las que se hayan tomado la muestra o muestras; y,
iii) determinar�n el alcance de la contaminaci�n probable y delimitar�n una zona en funci�n de la declaraci�n de contaminaci�n contemplada en el inciso ii) anterior y de la posible propagaci�n del organismo, teniendo en cuenta las disposiciones del punto 1 y del inciso ii) del punto 2 del anexo V del presente Real Decreto.
2. De conformidad con las disposiciones de los puntos 3 y 4 del anexo V del presente Real Decreto, las Comunidades Aut�nomas notificar�n inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n, y �ste, a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, a los otros Estados miembros y a la Comisi�n Europea, cualquier caso de contaminaci�n declarada en virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso ii) de la letra c) del apartado 1 del art�culo 6, as� como los datos relativos a la zona que se haya delimitado con arreglo al inciso iv) de la letra a) del apartado 1 del art�culo 6 y, en su caso, al inciso iii) de la letra c) de ese mismo apartado.
3. Como resultado de la notificaci�n dispuesta en el apartado 2 y de los datos en ella contenidos, las Comunidades Aut�nomas afectadas emprender�n una investigaci�n de acuerdo con el inciso i) de la letra a) del apartado 1 del art�culo 6 y, en su caso, con el inciso i) de la letra c) del mismo apartado, y tomar�n las medidas complementarias que sean adecuadas de conformidad con los apartados 1 y 2 del art�culo 6.
4. Se crea en el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n un registro de las explotaciones, los almacenes colectivos y los centros de explotaci�n afectados.
Art�culo 7 Medidas fitosanitarias a adoptar sobre el material contaminado
1. Se prohibe la plantaci�n del material vegetal indicado que se haya declarado contaminado en virtud del inciso ii) de la letra a) del apartado 1 del art�culo 6 y, bajo el control y aprobaci�n de los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma, dicho material ser� sometido a una de las disposiciones del punto 1 del anexo VI del presente Real Decreto con el fin de que pueda establecerse que no existe ning�n riesgo identificable de propagaci�n del organismo.
2. Se prohibe la plantaci�n del material vegetal indicado que, en virtud del inciso iii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del art�culo 6, se haya considerado probablemente contaminado, incluido el material vegetal indicado respecto del que se haya detectado la existencia de alg�n riesgo, producido en lugares de producci�n que con arreglo al inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del art�culo 6 se hayan considerado probablemente contaminados, y, bajo el control de los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma, dicho material se destinar� a un uso adecuado o se eliminar� de acuerdo con el punto 2 del anexo VI del presente Real Decreto a fin de que pueda establecerse que no existe ning�n riesgo identificable de propagaci�n del organismo.
3. Toda maquinaria, veh�culo, nave, almac�n o unidades de �stos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que se hayan declarado contaminados en virtud del inciso ii) de la letra a) y del inciso iii) de la letra c) del apartado 1 del art�culo 6 o que se hayan considerado probablemente contaminados en virtud del inciso iii) de la letra a) del apartado 1 del mismo art�culo ser� destruido o descontaminado, aplicando m�todos apropiados, de conformidad con el punto 3 del anexo VI del presente Real Decreto. Tras su descontaminaci�n, todos estos objetos dejar�n de considerarse contaminados.
4. Sin perjuicio de las medidas que se ejecuten en virtud de los apartados 1, 2 y 3 del art�culo 7, en la zona delimitada con arreglo a los incisos iv) de la letra a) y iii) de la letra c) del apartado 1 del art�culo 6 se aplicar�n una serie de medidas acordes con lo dispuesto en los puntos 4.1 y 4.2 del anexo VI del presente Real Decreto. Cada a�o se notificar�n detalles de estas medidas al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n, y �ste, a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, a los dem�s Estados miembros y a la Comisi�n Europea.
5. Las medidas fitosanitarias ordenadas por los organismos oficiales responsables de cada Comunidad Aut�noma contempladas en los apartados 1, 2, 3 y 4 del art�culo 7 ser�n realizadas, bajo control oficial, por el propietario del material afectado.
En el caso de que los afectados no ejecuten a su debido tiempo y forma las medidas a que se refiere el p�rrafo anterior, la Comunidad Aut�noma proceder� a ejecutarlas, con sus propios medios o empleando servicios ajenos, cargando los gastos correspondientes a los interesados, cuyo importe podr� exig�rseles por v�a de apremio, con independencia de las sanciones a que hubiere lugar.
Art�culo 8 Medidas aplicables para evitar la contaminaci�n mediante patata de siembra
1. Las patatas de siembra deber�n reunir los requisitos del Real Decreto 2071/1993 y proceder, en l�nea directa, de patatas que, habi�ndose obtenido en el marco de un programa oficialmente aprobado, hayan dado resultados negativos en cuanto a la presencia del organismo en an�lisis oficiales u oficialmente supervisados en los que se haya utilizado el m�todo pertinente establecido en el anexo II del presente Real Decreto.
2. Dichos an�lisis ser�n efectuados:
a) en los casos en que se haya confirmado la presencia del organismo en la producci�n propia de patatas de siembra,
i) analizando el material propagado anteriormente, incluida la selecci�n clonal inicial y analizando sistem�ticamente los clones de patatas de siembra de base, o
ii) en los casos en que se haya demostrado que no hay relaci�n clonal, analizando todos los clones de patatas de siembra de base o el material propagado anteriormente, incluida la selecci�n clonal inicial, y
b) en los dem�s casos, analizando en cada una de las plantas de la selecci�n clonal inicial o muestras representativas de las patatas de siembra de base o del material propagado anteriormente.
Art�culo 9 Prohibici�n
Se prohibe la conservaci�n y manipulaci�n del organismo a que se refiere el presente Real Decreto.
Art�culo 10 Excepciones con fines cient�ficos
Sin perjuicio de las disposiciones del Real Decreto, 2071/1993, se podr�n autorizar excepciones a lo dispuesto en los art�culos 7 y 9 del presente Real Decreto, de conformidad con las normas establecidas para la realizaci�n de pruebas e investigaciones cient�ficas o de estudios en materia de selecciones varietales en el Real Decreto 401/1996, de 1 de marzo, por el que se establecen las condiciones para la introducci�n en el territorio nacional de determinados organismos nocivos, vegetales, productos vegetales y otros objetos, con fines de ensayo, cient�ficos y para la actividad de selecci�n de variedades y en el Real Decreto 39/1998, de 16 de enero, por el que se modifica el Real Decreto 401/1996, de 1 de marzo, por el que se establecen las condiciones para la introducci�n en el territorio nacional de determinados organismos nocivos vegetales, productos vegetales y otros objetos, con fines de ensayo, cient�ficos y para la actividad de selecci�n de variedades.
Art�culo 11 Medidas adicionales
1. Los �rganos competentes de las Comunidades Aut�nomas podr�n adoptar las medidas complementarias o m�s estrictas que sean necesarias para combatir el organismo o impedir su propagaci�n, siempre que tales medidas se ajusten a las disposiciones del Real Decreto 2071/1993.
2. Los detalles de estas medidas deber�n ser notificados al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n, y �ste, a su vez, los notificar�, a trav�s del cauce correspondiente, a los dem�s Estados miembros y a la Comisi�n.
Art�culo 12 Indemnizaciones
1. Se aplicar� el sistema de indemnizaciones previsto en el art�culo 18 del Real Decreto 1190/1998, de 12 de junio, por el que se regulan los programas nacionales de erradicaci�n o control de organismos nocivos de los vegetales a�n no establecidos en el territorio nacional.
2. No son indemnizables los gastos ocasionados ni el material vegetal destruido en aplicaci�n de una medida oficial, cuando el propietario de los vegetales o productos vegetales afectados haya incumplido la normativa vigente y, especialmente, lo determinado en el Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protecci�n contra la introducci�n y difusi�n en el territorio nacional y de la Comunidad Econ�mica Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales; as� como para la exportaci�n y tr�nsito hacia pa�ses terceros.
3. En el caso de que el afectado por la contaminaci�n de un lote suministrado por un productor, almacenista u operador que hubiera incumplido lo determinado en la legislaci�n vigente, percibiera indemnizaci�n por parte de cualquiera de estos sujetos, y por parte de la Administraci�n, reembolsar� a la Administraci�n la indemnizaci�n percibida.
4. El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n, dentro de los l�mites establecidos por los cr�ditos disponibles para estos fines, participar�, con cargo a sus presupuestos, en la cuant�a del 50 por 100 de los gastos ocasionados en la ejecuci�n del programa.
DISPOSICION TRANSITORIA UNICA Medidas provisionales
En tanto no se pronuncie la Comisi�n Europea y para garantizar unos niveles de seguridad comparables entre las diferentes Comunidades Aut�nomas, se podr�n adoptar, previo informe favorable del Comit� Fitosanitario Nacional:
Los m�todos apropiados para los ex�menes y an�lisis previstos en las letras b) y c) del p�rrafo primero del apartado 2 del art�culo 3 y cualquier precisi�n de los procedimientos previstos en el p�rrafo segundo del apartado 2 del mismo.
Las medidas complementarias previstas en la letra c) del apartado 2 del art�culo 5.
Las normas de desarrollo de la letra a) del apartado 2 del art�culo 8 y las disposiciones aplicables a las muestras representativas a las que se refiere la letra b) del mismo apartado y art�culo.
El Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n solicitar� su adopci�n a la Comisi�n Europea a trav�s del cauce establecido en el art�culo 16 bis de la Directiva 77/93/CEE, del Consejo, de 21 de diciembre de 1976, relativa a las medidas de protecci�n contra la introducci�n en la Comunidad de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales y contra su propagaci�n en el interior de la Comunidad.
Primera Comunicaci�n al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n
Sin perjuicio de las notificaciones estipuladas en los apartados 3 de los art�culos 3 y 5, en el apartado 2 del art�culo 6 y en el art�culo 11 los �rganos competentes de las Comunidades Aut�nomas, comunicar�n al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n:
a) Los resultados de las investigaciones a que se refiere el apartado 3 del art�culo 6 del presente Real Decreto.
b) Los datos del registro de explotaciones, almacenes colectivos y centros de expedici�n afectados en cada Comunidad Aut�noma.
c) Las medidas fitosanitarias realizadas por las Comunidades Aut�nomas a que se refiere el art�culo 7 de este Real Decreto.
d) Los an�lisis establecidos en el art�culo 8 de este Real Decreto, realizados por los �rganos competentes de las Comunidades Aut�nomas.
Segunda Normativa general aplicable
El Real Decreto 2071/1993, de 26 de noviembre, relativo a las medidas de protecci�n contra la introducci�n en el territorio nacional y de la Comunidad Econ�mica Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales y el Real Decreto 1190/1998, de 12 de junio, por el que se regulan los programas nacionales de erradicaci�n o control de organismos nocivos de los vegetales a�n no establecidos en el territorio nacional ser�n aplicables sin perjuicio de las normas espec�ficas del presente Real Decreto.
Tercera Car�cter b�sico
Lo dispuesto en el presente Real Decreto tendr� car�cter de normativa b�sica, al amparo de lo establecido en el art�culo 149.1.13.a de la Constituci�n, que reserva al Estado la competencia en materia de bases y coordinaci�n de la planificaci�n general de la actividad econ�mica.
Se faculta al Ministro de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n para dictar, en el �mbito de sus competencias, las disposiciones necesarias para el desarrollo y aplicaci�n del presente Real Decreto y, en particular, previo informe del Comit� Fitosanitario Nacional, las normas provisionales de desarrollo de las letras a) y b) del apartado 2 del art�culo 8 y, a la vista de la evoluci�n de los conocimientos cient�ficos o t�cnicos, las modificaciones que sea preciso introducir en los anexos del presente Real Decreto, en tanto la Comisi�n Europea no resuelva al respecto.
Lista de plantas hu�sped de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. a las que se refiere el art�culo 1
Plantas (incluidos los tub�rculos), salvo las semillas verdaderas, de Solanum tuberosum L.: Patata.
1. Los ex�menes oficiales contemplados en la letra a) del apartado 2 del art�culo 3 se basar�n en la biolog�a del organismo, as� como en los sistemas de producci�n concretos que se utilicen en la Comunidad Aut�noma de que se trate, e incluir�n lo siguiente:
en los momentos oportunos, una inspecci�n visual del cultivo en crecimiento, y/o muestras de patatas de siembra y de otras patatas durante la fase de crecimiento o almacenadas; estas muestras se someter�n a una inspecci�n visual oficial o bajo supervisi�n oficial, para lo cual se proceder� a seccionar los tub�rculos, y
en el caso de las patatas de siembra y, si procede, de otras patatas, an�lisis de laboratorio oficiales o bajo supervisi�n oficial en los que se utilice el m�todo establecido en el anexo II del presente Real Decreto;
en los momentos oportunos, una inspecci�n visual de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas destinadas a la replantaci�n para utilizaci�n profesional.
2. La notificaci�n de los ex�menes oficiales dispuesta en el apartado 3 del art�culo 3 incluir� los datos siguientes:
i) en el caso de los ex�menes de patatas:
la superficie total estimada, en hect�reas, de los cultivos de patatas de siembra y de otras patatas,
la clasificaci�n por categor�as (de siembra y de consumo) y, en su caso, por regiones,
la cantidad de muestras tomadas para los an�lisis y el momento de su recogida,
el n�mero de inspecciones visuales efectuadas en el campo, el n�mero de inspecciones visuales realizadas en tub�rculos (y la cantidad de muestras);
ii) en el caso de los ex�menes de, al menos, el cultivo en crecimiento de plantas de tomate destinadas a la replantaci�n para utilizaci�n profesional:
la cantidad total estimada de plantas,
el n�mero de inspecciones visuales;
iii) en el caso de los ex�menes de plantas hu�sped del organismo distintas de la patata y el tomate, incluidas las solan�ceas silvestres hu�sped:
la cantidad de muestras tomadas y el momento de su recogida,
la zona o r�o objeto del muestreo, seg�n proceda,
el m�todo de an�lisis;
iv) en el caso de los ex�menes de aguas y de los vertidos de residuos l�quidos procedentes de las instalaciones industriales de transformaci�n o de embalaje:
la zona, r�o o ubicaci�n de la instalaci�n objeto del muestreo, seg�n corresponda, el m�todo de an�lisis.
�MBITO DE APLICACI�N DEL M�TODO
El presente m�todo describe los diversos procedimientos relacionados con:
i) el diagn�stico de la podredumbre parda en los tub�rculos de patata y de la marchitez bacteriana en las plantas de patata, tomate y otras plantas hu�sped,
ii) la detecci�n de Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) en muestras de tub�rculos de patata, plantas de patata, tomate y otras plantas hu�sped, agua y suelo,
iii) la identificaci�n de R. solanacearum.
En los ap�ndices se presentan protocolos optimizados para los diferentes m�todos y reactivos validados, as� como informaci�n detallada para la preparaci�n de materiales de prueba y control. En el ap�ndice 1 se presenta una lista de los laboratorios que se incluyeron en la optimizaci�n y validaci�n de los protocolos.
Habida cuenta de que los protocolos implican la detecci�n de un organismo de cuarentena y de que incluir�n la utilizaci�n de cultivos viables de R. solanacearum como materiales de control, ser� preciso llevar a cabo los procedimientos bajo condiciones de cuarentena apropiadas, con instalaciones adecuadas de eliminaci�n de residuos y en aplicaci�n de las condiciones de obtenci�n de los permisos apropiados emitidos por las autoridades oficiales de cuarentena de las plantas.
Los par�metros de las pruebas deben garantizar una detecci�n coherente y reproducible de niveles de R. solanacearum en los l�mites establecidos en los m�todos seleccionados.
Es imprescindible una preparaci�n precisa de los controles positivos.
Asimismo, la realizaci�n de pruebas con arreglo a los niveles requeridos implica la utilizaci�n de los par�metros correctos, el mantenimiento y el calibrado del equipo, una preservaci�n y manipulaci�n cuidadosa de los reactivos y todas las medidas para evitar la contaminaci�n entre las muestras, como por ejemplo la separaci�n de los controles positivos de las muestras de ensayo. Deben aplicarse normas de control de la calidad para evitar errores administrativos y de otro tipo, especialmente de etiquetado y documentaci�n.
Una sospecha de brote, tal como se menciona en el art�culo 5, apartado 2, de este real decreto, implica la obtenci�n de un resultado positivo de las pruebas de diagn�stico o selecci�n efectuadas a una muestra tal como se especifica en los siguientes diagramas de flujo. Un resultado positivo en la primera prueba de selecci�n (prueba IF, PCR/FISH, aislamiento selectivo) debe confirmarse con una segunda prueba de selecci�n basada en un principio biol�gico diferente.
Si la primera prueba de selecci�n proporciona un resultado positivo, se sospecha entonces la contaminaci�n con R. solanacearum y debe efectuarse una segunda prueba de selecci�n. Si la segunda prueba de selecci�n proporciona un resultado positivo, se confirma entonces la sospecha (sospecha de presencia) y debe continuar la prueba con arreglo al m�todo. Si la segunda prueba de selecci�n proporciona un resultado negativo, se considera entonces que la muestra no est� contaminada con R. solanacearum.
Una presencia confirmada, tal como se menciona en el art�culo 6, apartado 1, de este real decreto, implica el aislamiento y la identificaci�n de un cultivo puro de R. solanacearum con confirmaci�n de patogenicidad.
Anexo II redactado por el art�culo �nico de la OM APA/719/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos II a VII del R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al (�B.O.E.� 27 marzo).Vigencia: 1 abril 2007
1. M�todo de detecci�n para el diagn�stico de la podredumbre parda y la marchitez bacteriana (R. solanacearum) en tub�rculos de patata y plantas de patata, tomate u otras plantas hu�sped con s�ntomas de podredumbre parda o marchitez bacteriana
El procedimiento de an�lisis est� destinado a los tub�rculos de patata y a las plantas que presentan s�ntomas t�picos de la podredumbre parda o la marchitez vascular o que permiten la sospecha de su presencia. Incluye una prueba de selecci�n r�pida, el aislamiento del pat�geno del tejido vascular infectado en un medio (selectivo) y, en caso de resultado positivo, la identificaci�n del cultivo como R. solanacearum.
2. M�todo de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en muestras asintom�ticas de tub�rculos de patata
El protocolo de an�lisis tiene por objeto la detecci�n de infecciones latentes en tub�rculos de patata. Un resultado positivo de un m�nimo de dos pruebas de selecci�n, basadas en diferentes principios biol�gicos, debe complementarse con el aislamiento del pat�geno, seguido, en caso de aislamiento de colonias t�picas, por la confirmaci�n de un cultivo puro como R. solanacearum. Un resultado positivo de solamente una de las pruebas de selecci�n no es suficiente para considerar sospechosa la muestra.
Las pruebas de selecci�n y las pruebas de aislamiento deben permitir la detecci�n de 10 3 a 10 4 c�lulas/ml de precipitado resuspendido, incluidas como controles positivos en cada serie de pruebas.
3. M�todo de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en muestras asintom�ticas de patatas, tomates y otras plantas hu�sped
M�TODOS DETALLADOS DE DETECCI�N DE R. SOLANACEARUM EN TUB�RCULOS DE PATATA Y PLANTAS DE PATATA, TOMATE U OTRAS PLANTAS HU�SPED CON S�NTOMAS DE LA PODREDUMBRE PARDA O LA MARCHITEZ BACTERIANA
1. S�ntomas
(v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main)
1.1 S�ntomas en patata:
En planta de patata. La fase inicial de la infecci�n en el campo se reconoce por un marchitamiento de las hojas en progresi�n ascendente hacia el extremo superior de la planta, bajo el efecto de las temperaturas diurnas altas, con una recuperaci�n durante la noche. En las primeras fases del marchitamiento, las hojas siguen estando verdes, pero posteriormente se desarrolla necrosis parda y amarilleo. Tambi�n se produce epinastia. El marchitamiento de un brote o de plantas enteras se hace r�pidamente irreversible y ocasiona el colapso y la muerte de la planta. El tejido vascular de los tallos de las plantas marchitadas cortados transversalmente suele ser pardo, y de la superficie del corte brota un exudado mucoso bacteriano o este puede extraerse apretando el tallo. Si se coloca verticalmente un tallo cortado en agua, de los haces vasculares salen hilos viscosos.
En tub�rculo de patata. Los tub�rculos de patata deben cortarse transversalmente cerca de la parte basal (estol�n) o bien longitudinalmente sobre el estol�n. Posteriormente, la decoloraci�n vascular adquiere un tono pardo m�s marcado y la necrosis puede extenderse al tejido parenquim�tico. En las fases avanzadas, la infecci�n progresa desde la parte basal y los ojos, por las que pueden fluir exudados bacterianos, lo que hace que se adhieran part�culas del suelo. Pueden aparecer en la piel lesiones ligeramente hundidas de color pardo rojizo debido al colapso interno de los tejidos vasculares. En las fases avanzadas de la enfermedad es habitual el desarrollo secundario de podredumbres blandas causadas por hongos y bacterias.
1.2 S�ntomas en tomate
En planta de tomate. El primer s�ntoma visible es el aspecto fl�cido de las hojas m�s j�venes. Si se producen condiciones medioambientales favorables para el pat�geno (temperaturas del suelo de 25 �C; humedad saturada), en un plazo de pocos d�as se produce epinastia y marchitamiento de un lado de la planta o de toda ella, lo que desemboca en un colapso total de la planta. En condiciones menos favorables (temperatura del suelo por debajo de 21 �C), se produce un menor marchitamiento, pero pueden surgir numerosas ra�ces adventicias del tallo. En ocasiones se observan estr�as h�medas desde la base del tallo, lo que demuestra la existencia de necrosis en el sistema vascular.
Al cortar transversalmente el tallo, los tejidos vasculares que presentan una decoloraci�n parda exudan gotas de l�quido bacteriano blanco o amarillento.
1.3 Sintomas en otros hu�spedes
Plantas de Solanum dulcamara y S. nigrum. En condiciones naturales, en pocos casos se observan s�ntomas de marchitamiento en estos hu�spedes herb�ceos a no ser que la temperatura del suelo supere los 25 �C o los niveles de in�culo sean extremadamente elevados (por ejemplo, para S. nigrum que crezca junto a plantas enfermas de patatas o tomates). Cuando se produce el marchitamiento, los s�ntomas son como los descritos para el tomate. Las plantas de S. dulcamara, que no se marchitan y que crecen con tallos y ra�ces en el agua, pueden mostrar una decoloraci�n interna pardo claro de los tejidos vasculares en una secci�n transversal de la base del tallo, o de las partes del tallo que se encuentran bajo el agua. Pueden fluir bacterias de los tejidos vasculares cortados, o formar hilos viscosos, si el tallo cortado se coloca verticalmente en el agua, incluido en caso de inexistencia de s�ntomas de marchitamiento.
2. Pruebas de selecci�n r�pida
Las pruebas de selecci�n r�pida facilitan el diagn�stico de presunci�n, pero no son esenciales. Real�cese una o m�s de las siguientes pruebas validadas:
2.1 Prueba de la exudaci�n del tallo (V�ase la secci�n VI.A.1.)
2.2 Prueba de la detecci�n de gr�nulos de poli-β-hidroxibutirato (PHB)
Los gr�nulos de PHB caracter�sticos en las c�lulas de R. solanacearum se visualizan ti�endo frotis de exudado bacteriano fijado con calor procedente de tejido infectado en un portaobjetos con azul Nilo A o negro Sud�n B (v�ase la secci�n VI.A.2).
2.3 Pruebas de aglutinaci�n serol�gica (V�ase la secci�n VI.A.3.)
Otras pruebas de selecci�n r�pida apropiadas incluyen la prueba IF (v�ase la secci�n VI.A.5), la prueba FISH (v�ase la secci�n VI.A.7), las pruebas ELISA (v�ase la secci�n VI.A.8) y las pruebas PCR (v�ase la secci�n VI.A.6).
a) Coger exudado o secciones de tejido decolorado del anillo vascular del tub�rculo o de los haces vasculares del tallo de la planta de patata, de tomate o de otras plantas hu�sped en proceso de marchitamiento. Poner en suspensi�n en un volumen reducido de agua destilada est�ril o en tamp�n fosfato 50 mM (ap�ndice 4) y dejar entre cinco y diez minutos.
b) Preparar una serie de diluciones decimales de la suspensi�n.
c) Echar 50-100 μl de la suspensi�n y las diluciones en un medio nutritivo general (NA, YPGA o SPA; v�ase el ap�ndice 2) y/o en un medio de tetrazolio de Kelman (ap�ndice 2) y/o un medio selectivo validado (por ejemplo, SMSA; v�ase el ap�ndice 2). Extender o hacer estr�as con una t�cnica adecuada de diluci�n en placas. Si se considera �til, preparar un conjunto de placas distintas con un cultivo de una suspensi�n celular diluida de R. solanacearum biovar 2 como control positivo.
d) Incubar las placas entre dos y seis d�as a 28 �C.
- En un medio nutritivo general, los aislados virulentos de R. solanacearum desarrollan colonias de color blanco nacarado, planas, irregulares y fluidas, que con frecuencia presentan los verticilos caracter�sticos en el centro. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas peque�as, redondas y no fluidas, que son completamente blancas.
- En los medios de tretrazolio de Kelman y SMSA, los verticilos son de color rojo sangre. Las formas avirulentas de R. solanacearum forman colonias butirosas peque�as, redondas y no fluidas, que son totalmente de color rojo oscuro.
4. Pruebas de identificaci�n de R. solanacearum
Las pruebas para confirmar la identidad de presuntos aislados de R. solanacearum se muestran en la secci�n VI.B.
1. M�todos detallados de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en muestras asintom�ticas de tub�rculos de patata
1.1 Preparaci�n de la muestra
- El tama�o normal de la muestra es de 200 tub�rculos. Un muestreo m�s intensivo requiere m�s pruebas en muestras de este tama�o. Un mayor n�mero de tub�rculos en la muestra producir� inhibici�n o una interpretaci�n dif�cil de los resultados. Sin embargo, el procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras de menos de 200 tub�rculos, cuando se disponga de pocos tub�rculos.
- La validaci�n de todos los m�todos de detecci�n descritos a continuaci�n se basa en la realizaci�n de pruebas a muestras de 200 tub�rculos.
- El extracto de patata descrito a continuaci�n puede utilizarse tambi�n para la detecci�n de la bacteria de la necrosis bacteriana de la patata, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Pretratamiento opcional previo a la preparaci�n de la muestra:
a) incubaci�n de muestras a 25-30 �C, hasta un m�ximo de dos semanas antes de la realizaci�n de la prueba, con el fin de alentar la multiplicaci�n de cualquier poblaci�n de R. solanacearum;
b) lavar los tub�rculos. Utilizar desinfectantes apropiados (compuestos de cloro cuando vaya a utilizarse la prueba PCR a fin de eliminar el ADN pat�geno) y detergentes entre cada muestra. Secar al aire los tub�rculos. Este procedimiento de lavado es especialmente �til (pero no obligatorio) para las muestras con exceso de tierra y si debe realizarse una prueba PCR o un procedimiento de aislamiento directo.
1.1.1 Quitar la epidermis de la parte basal (estol�n) del tub�rculo con un bistur� o un cuchillo limpio y desinfectado, de modo que los tejidos vasculares queden a la vista. Extraer con cuidado una cu�a c�nica peque�a de tejido vascular de la parte basal y extraer el m�nimo volumen posible de tejido no vascular.
(v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main).
Nota: Retirar los tub�rculos (podridos) que presenten s�ntomas sospechosos de �podredumbre parda� y analizarlos por separado.
Si durante la extracci�n de la cu�a de la parte basal se observan s�ntomas sospechosos de podredumbre parda, deber� efectuarse una inspecci�n visual del tub�rculo, y cortarse este cerca de la parte basal. Todo tub�rculo cortado con s�ntomas sospechosos deber� guardarse durante un m�nimo de dos d�as a temperatura ambiente a fin de permitir la suberizaci�n y almacenar refrigerado (a 4-10 �C) en condiciones de cuarentena apropiadas. Todos los tub�rculos, incluidos los que presenten s�ntomas sospechosos, deber�n mantenerse con arreglo a lo establecido en el anexo III.
1.1.2 Colocar las cu�as de la parte basal en recipientes desechables no utilizados que puedan cerrarse y/o sellarse (en caso de reutilizaci�n de los recipientes, deber�n limpiarse y desinfectarse por completo utilizando compuestos de cloro). Es conveniente procesar las cu�as inmediatamente. Si esto no es posible, almacenarlas en el recipiente, sin a�adir ning�n tamp�n, refrigeradas durante un per�odo m�ximo de 72 horas o de 24 horas a temperatura ambiente.
Procesar las cu�as por uno de los m�todos siguientes:
a) bien cubrir las cu�as con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tamp�n de extracci�n (ap�ndice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cuatro horas por debajo de 24 �C o refrigeradas entre 16 y 24 horas,
b) homogeneizar las cu�as con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tamp�n de extracci�n (ap�ndice 4) en una trituradora (por ejemplo, Waring o Ultra Thurax) o machac�ndolas en una bolsa de maceraci�n desechable sellada (por ejemplo, Stomacher o Bioreba de politeno de gran calibre, 150 mm � 250 mm; esterilizada por radiaci�n) utilizando un mazo de goma o un aparato de trituraci�n adecuado (por ejemplo, Homex).
Nota: Existe un elevado riesgo de contaminaci�n cruzada de muestras cuando se homogenizan las muestras utilizando una trituradora. Tomar precauciones a fin de evitar la generaci�n de aerosoles o el vertido durante el proceso de extracci�n. Debe asegurarse que se utilizan para cada muestra recipientes y cuchillas de trituradora esterilizados. Si se utiliza la prueba PCR, evitar la transferencia de ADN en los recipientes o el aparato de trituraci�n. Al utilizar PCR, se recomienda machacar el material en bolsas desechables y utilizar tubos desechables.
1.1.3 Se decanta el sobrenadante. Si es demasiado turbio, clarificarlo con una centrifugaci�n a baja velocidad (no m�s de 180 g durante diez minutos a una temperatura entre 4-10 �C) o mediante filtraci�n al vac�o (40-100 μm), lavando el filtro con tamp�n de extracci�n adicional (10 ml).
1.1.4 Concentrar las bacterias por centrifugaci�n a 7.000 g durante 15 minutos (o 10.000 g durante diez minutos) a una temperatura entre 4-10 �C y descartar el sobrenadante sin perturbar el sedimento.
1.1.5 Resuspender el precipitado en 1,5 ml de tamp�n de precipitado (ap�ndice 4). Utilizar 500 μl para pruebas de R. solanacearum, 500 μl para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus y 500 μl para referencia. A�adir glicerol est�ril a la concentraci�n final de 10-25 % (v/v) a los 500 μl de la al�cuota de referencia y a la restante al�cuota de prueba, mezclar y almacenar a una temperatura comprendida entre -16 a -24 �C (semanas) o entre -68 a -86 �C (meses). Mantener las al�cuotas de prueba a entre 4-10 �C durante la prueba.
Si debe transportarse el extracto, entr�guese en un recipiente fr�o en un plazo de 24 a 48 horas.
1.1.6 Es de capital importancia tratar por separado todos los controles y muestras positivos de R. solanacearum para evitar la contaminaci�n. Esto se aplica a los portaobjetos IF y a todas las pruebas.
1.2 An�lisis
V�ase el diagrama de flujo y la descripci�n de las pruebas y los protocolos optimizados en los ap�ndices pertinentes:
Aislamiento selectivo (v�ase la secci�n VI.A.4)
Prueba IF (v�ase la secci�n VI.A.5)
Pruebas PCR (v�ase la secci�n VI.A.6)
Prueba FISH (v�ase la secci�n VI.A.7)
Pruebas ELISA (v�ase la secci�n VI.A.8)
Bioensayo (v�ase la secci�n VI.A.9)
2. M�todos detallados de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en muestras asintom�ticas de patatas, tomates y otras plantas hu�sped
2.1 Preparaci�n de la muestra
Nota: Para la detecci�n de poblaciones latentes de R. solanacearum se aconseja someter a prueba muestras mixtas. El procedimiento puede aplicarse convenientemente a muestras mixtas de hasta 200 partes del tallo. Cuando se efect�en ex�menes, deber�n basarse en una muestra estad�sticamente representativa de la poblaci�n de plantas investigada.
2.1.1 Colocar segmentos de tallo de 1-2 cm en un recipiente est�ril cerrado con arreglo a los siguientes procedimientos de muestreo:
Pl�ntulas de tomate de vivero: con un cuchillo limpio y desinfectado, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo.
Plantas de tomate cultivadas en el campo o en un invernadero: con un cuchillo limpio y desinfectado, arrancar el brote lateral m�s inferior de cada planta cortando justo por encima de la uni�n con el tallo principal. Cortar un segmento de 1 cm del extremo inferior de cada brote lateral.
Otros hu�spedes: con un cuchillo limpio y desinfectado o con tijeras de podar, cortar un segmento de 1 cm de la base de cada tallo, justo por encima del nivel del suelo. En el caso de S. dulcamara o de otras plantas hu�sped que crecen en el agua, cortar secciones de 1-2 cm de los tallos bajo el agua o estolones con ra�ces acu�ticas.
Cuando se muestree un lugar espec�fico, se recomienda analizar una muestra estad�sticamente representativa de un m�nimo de diez plantas por punto de muestreo de cada hu�sped herb�ceo potencial. La detecci�n del pat�geno ser� m�s fiable a finales de primavera, en verano y en oto�o, aunque las infecciones naturales pueden detectarse durante todo el a�o en Solanum dulcamara perenne que crece en cursos de agua. Los hu�spedes conocidos incluyen plantas de patata espont�neas (groundkeepers), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium y otros miembros de la familia Solanaceae. Otros hu�spedes son Pelargonium spp. y Portulaca oleracea. Entre las especies herb�ceas europeas que pueden albergar potencialmente poblaciones de R. solanacearum biovar 2/raza 3 en ra�ces y/o rizosferas, en condiciones medioambientales espec�ficas, se incluyen: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra y Urtica dioica.
Nota: Puede efectuarse en este momento el examen visual para detectar s�ntomas internos (coloraci�n vascular o l�quido bacteriano). Retirar todos los segmentos del tallo con s�ntomas y analizarlos por separado (v�ase la secci�n II).
2.1.2 Desinfectar brevemente los segmentos del tallo con etanol al 70 % y secar inmediatamente con un pa�uelo de papel. A continuaci�n, procesar los segmentos del tallo mediante uno de los procedimientos siguientes:
a) cubrir los segmentos con un volumen suficiente (aproximadamente 40 ml) de tamp�n de extracci�n (ap�ndice 4) y agitar en un agitador rotatorio (50-100 rpm) durante cuatro horas por debajo de 24 �C o refrigerados entre 16 y 24 horas,
b) procesar inmediatamente machacando los segmentos en una bolsa de maceraci�n resistente (por ejemplo, Stomacher o Bioreba) con un volumen apropiado de tamp�n de extracci�n (ap�ndice 4) utilizando un mazo de goma o un aparato de trituraci�n adecuado (por ejemplo, Homex). De no ser posible, almacenar los segmentos del tallo refrigerados durante un m�ximo de 72 horas o un m�ximo de 24 horas a temperatura ambiente.
2.1.3 Desechar el sobrenadante tras 15 minutos de sedimentaci�n.
2.1.4 No suele ser necesaria otra clarificaci�n del extracto o la concentraci�n de la fracci�n bacteriana, pero puede conseguirse por filtraci�n y/o centrifugaci�n tal como se describe en la secci�n III.1.1.3 a 1.1.5.
2.1.5 Dividir el extracto de la muestra pura o concentrada en dos partes iguales. Mantener una mitad entre 4 y 10 �C durante el an�lisis y almacenar la otra mitad con glicerol est�ril al 10-25 % (v/v) entre - 16 y - 24 �C (semanas) o entre - 68 y - 86 �C (mes) en caso de que deban efectuarse nuevas pruebas.
2.2 An�lisis
1. Esquema del m�todo de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en el agua
2. M�todos de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en el agua
El m�todo validado de detecci�n que se describe en la presente secci�n es aplicable a la detecci�n del pat�geno en muestras de aguas superficiales y puede aplicarse asimismo a las muestras para an�lisis del proceso de transformaci�n de la patata o de aguas residuales. No obstante, es importante se�alar que la sensibilidad previsible de la detecci�n variar� en funci�n del sustrato. La sensibilidad de la prueba de aislamiento se ve afectada por las poblaciones de bacterias saprofitas competidoras, que son generalmente muy superiores en el proceso de transformaci�n de la patata y las aguas residuales que en las aguas superficiales. Si bien se espera que el m�todo que se describe a continuaci�n solamente detecte 10 3 c�lulas por litro de aguas superficiales, la sensibilidad de la detecci�n en el proceso de transformaci�n de la patata o las aguas residuales ser� con toda probabilidad mucho menor. Por este motivo, se recomienda analizar las aguas residuales despu�s de todo tratamiento de purificaci�n (por ejemplo, sedimentaci�n o filtraci�n), durante el cual las poblaciones de bacterias saprofitas se reducen. Deber�n tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad del m�todo de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido. Si bien se ha utilizado con �xito este m�todo en trabajos de investigaci�n para determinar la presencia o ausencia del pat�geno en las aguas superficiales, deber�n tenerse en cuenta sus limitaciones cuando se utilice en investigaciones similares del proceso de transformaci�n de la patata o de aguas residuales.
- La detecci�n de R. solanacearum en las aguas superficiales es m�s fiable a finales de primavera, en verano y en oto�o, cuando la temperatura del agua supera los 15 �C.
- Un muestreo repetido en diferentes momentos durante los per�odos mencionados en puntos de muestreo designados incrementar� la fiabilidad de la detecci�n al reducir los efectos de la variaci�n clim�tica.
- T�nganse en cuenta los efectos de las fuertes precipitaciones y la geograf�a del curso de agua a fin de evitar que se produzcan importantes efectos de diluci�n que puedan ocultar la presencia del pat�geno.
- Tomar muestras de agua superficial en las inmediaciones de plantas hu�sped si estos hu�spedes est�n presentes.
2.1.1 Recoger muestras de agua en puntos de muestreo seleccionados llenando botellas o tubos est�riles desechables, a una profundidad, si es posible, por debajo de 30 cm y a 2 m de la orilla. Para los efluentes resultantes de la transformaci�n de la patata y las aguas residuales, recoger muestras en el punto de vertido de las aguas residuales. Se recomiendan las muestras de hasta 500 ml por punto de muestreo. Si se prefieren muestras m�s peque�as, se aconseja tomar muestras como m�nimo en tres ocasiones por punto de muestreo, cada una de las cuales consistir� en dos submuestras duplicadas de un m�nimo de 30 ml. Para un trabajo de investigaci�n intensivo, seleccione como m�nimo tres puntos de muestreo por 3 km de curso de agua y aseg�rese de que tambi�n se toman muestras en los afluentes que desembocan en el curso de agua.
2.1.2 Transportar las muestras en un entorno fresco y oscuro (4-10 �C) y analizarlas en un plazo de 24 horas.
2.1.3 Si es preciso, podr� concentrarse la fracci�n bacteriana utilizando uno de los m�todos siguientes:
a) centrifugar 30-50 ml de submuestras de 10.000 g durante diez minutos (o 7.000 g durante 15 minutos), preferiblemente a 4-10 �C, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de tamp�n de precipitado (ap�ndice 4);
b) filtraci�n por membrana (tama�o m�nimo de los poros de 0,45 μm) y a continuaci�n lavado del filtro en 5-10 ml de tamp�n de precipitado y retenci�n de los lavados. Este m�todo es adecuado para grandes vol�menes de agua que contengan bajos niveles de saprofitas.
No suele aconsejarse la concentraci�n para muestras del proceso de transformaci�n de la patata o de aguas residuales, ya que unas poblaciones mayores de bacterias saprofitas competidoras inhibir�n la detecci�n de R. solanacearum.
V�ase el diagrama de flujo y la descripci�n de las pruebas en los ap�ndices pertinentes.
1. Esquema del m�todo de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en el suelo
2. M�todos de detecci�n e identificaci�n de R. solanacearum en el suelo
El m�todo validado de detecci�n que se describe en la presente secci�n es aplicable a la detecci�n del pat�geno en muestras del suelo, pero tambi�n puede utilizarse para analizar muestras de residuos s�lidos de la transformaci�n de la patata o de lodos de depuradora. No obstante, debe se�alarse que estos m�todos no son lo suficientemente sensibles para asegurar la detecci�n de poblaciones peque�as y/o irregularmente distribuidas de R. solanacearum que pueden encontrarse en muestras naturalmente infectadas de estos sustratos.
Deber�n tenerse en cuenta las limitaciones de sensibilidad de este m�todo de prueba a la hora de evaluar la fiabilidad de cualquier resultado negativo obtenido, as� como cuando se utilice en investigaciones para determinar la presencia o ausencia del pat�geno en el suelo o los lodos. El m�todo m�s fiable para determinar la presencia del pat�geno en el suelo del campo es plantar un posible hu�sped del mismo y supervisar si se produce infecci�n, pero incluso con este m�todo no se detectar�n niveles bajos de contaminaci�n.
2.1.1 El muestreo del suelo del campo deber� seguir los principios habituales utilizados para el muestreo de nematodos. Para muestrear 0,3 ha, recoger muestras de 0,5 a 1 kg de suelo en 60 puntos a una profundidad de 10 a 20 cm (o de una cuadr�cula de 7 � 7 metros). Si se sospecha la presencia del pat�geno, incrementar el n�mero de puntos de recogida a 120 por 0,3 ha. Mantener las muestras a una temperatura comprendida entre 12 y 15 �C antes del an�lisis. Tomar muestras de la transformaci�n de la patata y de lodos de depuradora, recogiendo un total de 1 kg de sitios que representen el volumen total de lodos que se analizar�. Mezclar adecuadamente cada muestra antes del an�lisis.
2.1.2 Dispersar submuestras de 10 a 25 g de suelo o lodos mediante agitaci�n rotatoria (250 rpm) en 60-150 ml de tamp�n de extracci�n (ap�ndice 4) durante un m�ximo de dos horas. En caso necesario, el a�adido de 0,02 % de Tween-20 est�ril y de 10 a 20 g de grava est�ril puede contribuir a la dispersi�n.
2.1.3 Mantener la suspensi�n a 4 �C durante el an�lisis.
PROTOCOLOS OPTIMIZADOS PARA LA DETECCI�N E IDENTIFICACI�N DE R. solanacearum
A. PRUEBAS DE DIAGN�STICO Y DETECCI�N
1. Prueba de la exudaci�n del tallo
La presencia de R. solanacearum en tallos de patata, tomate u otras plantas hu�sped marchitas puede observarse mediante la sencilla prueba de presunci�n que se indica a continuaci�n: cortar el tallo justo por encima del nivel del suelo. Suspender la superficie del corte en un tubo de agua limpia. Observar si se produce la caracter�stica exudaci�n espont�nea de hilos de flujo bacteriano de los haces vasculares cortados unos minutos despu�s.
2. Prueba de la detecci�n de gr�nulos de poli-β�-hidroxibutirato
1. Preparar un frotis de exudado bacteriano procedente del tejido infectado o de un cultivo de 48 horas en un medio YPGA o SPA (ap�ndice 2) en un portaobjetos.
2. Preparar frotis de control positivos de una cepa de biovar 2 de R. solanacearum y, si se considera �til, un frotis de control negativo de un PHB sp. negativo conocido.
4. Te�ir el preparado con azul Nilo A o negro Sud�n B y observar microsc�picamente tal como se describe a continuaci�n.
a) Ba�ar cada portaobjetos con una soluci�n acuosa de azul Nilo A al 1 % e incubar durante diez minutos a 55 �C.
b) Escurrir la soluci�n de tinci�n. Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pa�uelo de papel.
c) Ba�ar el frotis con �cido ac�tico acuoso al 8 % e incubar durante un minuto a temperatura ambiente.
d) Lavar suavemente al grifo durante unos instantes. Eliminar el agua sobrante con un pa�uelo de papel.
f) Examinar el frotis tintado con un microscopio epifluorescente a 450 nm con gota de aceite de inmersi�n,a 600- 1000 aumentos, utilizando un objetivo de inmersi�n en aceite o agua.
g) Observar si se produce la fluorescencia naranja brillante de los gr�nulos de PHB. Observar tambi�n con la luz normal transmitida para cerciorarse de que los gr�nulos son intracelulares y de que la morfolog�a celular es la t�pica de R. solanacearum.
Prueba del negro Sud�n
a) Ba�ar cada portaobjetos con una soluci�n acuosa de negro Sudan B al 0,3 % en etanol al 70 % e incubar durante diez minutos a temperatura ambiente.
b) Escurrir la soluci�n de tinci�n y lavar suavemente con agua del grifo durante unos instantes, eliminando el agua sobrante con un pa�uelo de papel.
c) Sumergir brevemente los portaobjetos en xilol y secar con un pa�uelo de papel. �Cuidado!: el xilol es nocivo, deben tomarse las precauciones de seguridad necesarias y debe trabajarse en una campana extractora de humos.
d) Ba�ar el frotis con safranina acuosa al 0,5 % (p/v) y dejar durante diez minutos a temperatura ambiente. �Cuidado!: la safranina es nociva, deben tomarse las precauciones de seguridad necesarias y debe trabajarse en una campana extractora de humos.
e) Lavar suavemente al grifo durante unos instantes, secar con un pa�uelo de papel y tapar con un cubreobjetos.
f) Examinar los frotis tintados con un microscopio �ptico que utilice luz transmitida con aceite de inmersi�n, a 1000 aumentos, utilizando un objetivo de inmersi�n en aceite.
g) Observar si los gr�nulos de PHB de las c�lulas de R. solanacearum se ti�en de negro azulado con un te�ido ros�ceo de las paredes de las c�lulas.
3. Pruebas de aglutinaci�n serol�gica
La mejor manera de observar la aglutinaci�n de c�lulas de R. solanacearum en l�quido bacteriano o extractos de tejido sintom�tico es utilizando anticuerpos validados (v�ase el ap�ndice 3) etiquetados con marcadores coloreados apropiados tales como c�lulas rojas de Staphylococcus aureus o part�culas coloreadas de l�tex. Si se utiliza un equipo comercializado (v�ase el ap�ndice 3), siga las instrucciones del fabricante. En caso contrario, aplique el procedimiento siguiente:
a) mezclar gotas de una suspensi�n de anticuerpos etiquetados y l�quido bacteriano (de aproximadamente 5 μl) en pocillos de portaobjetos de pocillos m�ltiples;
b) preparar controles positivos y negativos utilizando suspensiones de R. solanacearum biovar 2 y una cepa heter�loga;
c) observar si se produce aglutinaci�n en las muestras positivas tras mezclar suavemente durante 15 segundos.
Nota: Antes de utilizar este m�todo por primera vez, efect�e pruebas preliminares a fin de garantizar una detecci�n reproducible de 10 3 a 10 4 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml a�adido a extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.
Utilizar un medio selectivo validado adecuado tal como SMSA (modificado por Elphinstone et al., 1996; v�ase el ap�ndice 2).
Es preciso diferenciar R. solanacearum de otras bacterias que pueden desarrollar colonias en el medio. Adem�s, las colonias de R. solanacearum pueden mostrar morfolog�as at�picas si las placas est�n superpobladas o si tambi�n contienen bacterias antagonistas. Cuando se sospeche la existencia de efectos de la competencia o el antagonismo, deber� volver a analizarse la muestra con otro m�todo.
Para lograr la m�xima sensibilidad con este m�todo, utilizar extractos de muestras reci�n preparados. Sin embargo, este m�todo tambi�n puede aplicarse a extractos que se hayan almacenado con glicerol entre - 68 y - 86 �C.
Como controles positivos, preparar diluciones decimales de una suspensi�n de 10 6 cfu por ml de una cepa virulenta biovar 2 de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar toda posibilidad de contaminaci�n, preparar controles positivos totalmente separados de las muestras que van a analizarse.
Deber� examinarse la adecuaci�n para el crecimiento del pat�geno de cada lote reci�n preparado de un medio selectivo antes de utilizarlo para analizar muestras rutinarias.
4.1.1 Aplicar una t�cnica de diluci�n en placas apropiada a fin de garantizar la diluci�n de cualquier poblaci�n saprofita formadora de colonias que pudiera existir. Extender 50-100 μl por placa de extracto de muestra y de cada diluci�n.
4.1.2 Incubar las placas a 28 �C. Leer las placas 48 horas despu�s, y posteriormente a diario hasta un m�ximo de seis d�as. Las colonias t�picas de R. solanacearum en el medio SMSA son de color blanco lechoso, planas, irregulares y fluidas y, tras tres d�as de incubaci�n, se vuelven de color rosa a rojo sangre en el centro con rayas o espirales internas (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Nota: En algunos casos se forman colonias at�picas de R. solanacearum en este medio. Estas pueden ser peque�as, redondas, completamente rojas y no fluidas, o s�lo parcialmente fluidas y, por tanto, dif�ciles de distinguir de las bacterias saprofitas formadoras de colonias.
4.1.3 Purificar las presuntas colonias de R. solanacearum tras el estriado o la diluci�n en placas en un medio nutritivo general a fin de obtener colonias aisladas (v�ase el ap�ndice 2).
4.1.4 Almacenar los cultivos a corto plazo en agua est�ril (pH 6-8, sin cloro) a temperatura ambiente en la oscuridad, o a largo plazo en un medio crioprotector adecuado entre - 68 y - 86 �C o liofilizado.
4.1.5 Identificar los presuntos cultivos (v�ase la secci�n VI. B) y efectuar una prueba de patogenicidad (v�ase la secci�n VI. C).
Interpretaci�n de los resultados de la siembra en medio selectivo
La siembra en medio selectivo es negativa si no se observan colonias bacterianas al cabo de seis d�as ni se encuentran presuntas colonias t�picas de R. solanacearum, siempre que no haya sospechas de inhibici�n producida por la competencia o el antagonismo de otras bacterias y que en los controles positivos se encuentren colonias t�picas de R. solanacearum.
La siembra en medio selectivo es positiva si se a�slan presuntas colonias de R. solanacearum.
Utilizar un medio de enriquecimiento validado como el caldo Wilbrink modificado (v�ase el ap�ndice 2).
Este procedimiento puede utilizarse para incrementar selectivamente las poblaciones de R. solanacearum en extractos de muestras e incrementar la sensibilidad de la detecci�n. Asimismo, este procedimiento diluye efectivamente los inhibidores de la reacci�n PCR (1:100). Sin embargo, debe se�alarse que el enriquecimiento de R. solanacearum puede fallar debido a la competencia o el antagonismo de organismos saprofitas, que en muchos casos se enriquecen simult�neamente. Por este motivo, el aislamiento de R. solanacearum a partir de cultivos de caldos enriquecidos puede resultar dif�cil. Adem�s, debido a que pueden incrementarse las poblaciones de saprofitos serol�gicamente afines, se recomienda la utilizaci�n de anticuerpos monoclonales espec�ficos en lugar de anticuerpos policlonales cuando se aplique la prueba ELISA.
4.2.1 Para el enriquecimiento PCR, transferir 100 μl de extracto de muestras a 10 ml de caldo de enriquecimiento (ap�ndice 2) previamente alicuotados en tubos o matraces sin ADN. Para el enriquecimiento ELISA, pueden utilizarse proporciones m�s elevadas de extracto de muestras en el caldo (por ejemplo, 100 μl en 1,0 ml de caldo de enriquecimiento).
4.2.2 Incubar durante 72 horas entre 27 y 30 �C en un cultivo agitado o un cultivo est�tico manteniendo el tap�n del tubo sin apretar para que haya aireaci�n.
4.2.4 Tratar el caldo enriquecido de manera id�ntica a la muestra o las muestras de las pruebas anteriormente mencionadas.
Nota: Si se prev� una inhibici�n o un enriquecimiento de R. solanacearum debido a las elevadas poblaciones de determinadas bacterias saprofitas competidoras, pueden conseguirse mejores resultados con el enriquecimiento de extractos de muestras antes de cualquier centrifugaci�n o con otras medidas de concentraci�n.
Se recomienda utilizar la prueba IF como principal prueba de selecci�n debido a su capacidad demostrada para alcanzar los l�mites requeridos.
Cuando se utilice la prueba IF como principal prueba de selecci�n y su lectura sea positiva, deber� efectuarse la prueba de aislamiento, PCR o FISH como segunda prueba de selecci�n. Cuando se utilice la prueba IF como segunda prueba de selecci�n y su lectura sea positiva, deber� efectuarse una nueva prueba con arreglo al diagrama de flujo para completar el an�lisis.
Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/ Home/main). Se recomienda determinar el t�tulo para cada nuevo lote de anticuerpos. El t�tulo se define como la diluci�n m�s elevada en la que se produce una reacci�n �ptima cuando se analiza una suspensi�n que contenga de 10 5 a 10 6 c�lulas por ml de la cepa hom�loga de R. solanacearum, utilizando un conjugado de isotiocianato de fluoresce�na (FITC) apropiado, seg�n las recomendaciones del fabricante. Todo el antisuero policlonal validado debe presentar un t�tulo IF de al menos 1:2000. Durante el an�lisis, deber�n utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes al t�tulo.
La prueba deber�a efectuarse en extractos de muestras reci�n preparados. En caso necesario, puede realizarse con �xito enextractos almacenados entre - 68 y - 86 �C en glicerol. El glicerol puede eliminarse de la muestra si se a�ade 1 ml de tamp�n de precipitado (v�ase el ap�ndice 4), se recentrifuga durante 15 minutos a 7.000 g y se resuspende en un volumen equivalente de tamp�n de precipitado. En muchos casos no es necesario efectuar este procedimiento, especialmente si las muestras se han fijado en los portaobjetos mediante flameado.
Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa hom�loga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el ap�ndice 3, punto B, y opcionalmente en tamp�n.
Cuando sea posible, deber� utilizarse tejido naturalmente infectado (mantenido por liofilizaci�n o congelaci�n entre - 16 y - 24 �C) como control similar en el mismo portaobjetos.
Pueden utilizarse como controles negativos al�cuotas de extracto de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos de R. solanacearum.
En el ap�ndice 3 se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.
Utilizar portaobjetos de pocillos m�ltiples, de preferencia con diez pocillos de 6 mm de di�metro como m�nimo.
5.1 Preparar los portaobjetos seg�n uno de los procedimientos siguientes
i) Para precipitados con una cantidad relativamente peque�a de sedimento de almid�n:
Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 μl es suficiente para pocillos de 6 mm de di�metro; aumentar el volumen si el di�metro es mayor) de una diluci�n de 1/100 del precipitado de patata resuspendido en el primer pocillo. A continuaci�n, echar con una pipeta un volumen similar de precipitado sin diluir (1/1) en los pocillos restantes de la fila. La segunda fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 1.
Preparar diluciones decimales (1/10 y 1/100) del precipitado resuspendido en tamp�n de precipitado. Echar con una pipeta un volumen normalizado medido (15 μl es suficiente para pocillos de 6 mm de di�metro; aumentar el volumen si el di�metro es mayor) del precipitado resuspendido y de cada diluci�n en una fila de pocillos. La segunda fila puede utilizarse como duplicado o para una segunda muestra, tal como se indica en la figura 2.
5.2 Secar las gotitas a temperatura ambiente o calent�ndolas entre 40 y 45 �C. Fijar las c�lulas bacterianas al portaobjetos calent�ndolo (15 minutos a 60 �C), flame�ndolo con etanol del 95 % o con arreglo a las instrucciones espec�ficas de los suministradores de los anticuerpos.
En caso necesario, pueden almacenarse a continuaci�n portaobjetos fijos en un recipiente desecado durante el menor tiempo que resulte necesario (hasta un m�ximo de 3 meses) antes de efectuar nuevas pruebas.
i) Si el portaobjetos se ha preparado seg�n el punto 5.1.i):
Preparar un conjunto de diluciones a 1/2. El primer pocillo deber� contener 1/2 del t�tulo (T/2), los otros 1/4 del t�tulo (T/4), 1/2 del t�tulo (T/2), el t�tulo (T) y el doble del t�tulo (2T).
ii) Si el portaobjetos se ha preparado seg�n el punto 5.1.ii):
Preparar la diluci�n de trabajo (DT) del anticuerpo en el tamp�n IF. La diluci�n de trabajo afecta a la especificidad.
Figura 1. Preparaci�n del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.i) y 5.3.i)
Figura 2. Preparaci�n del portaobjetos con arreglo a los puntos 5.1.ii) y 5.3.ii)
5.3.1 Colocar los portaobjetos en un pa�uelo de papel humedecido. Cubrir cada pocillo completamente con la diluci�n o diluciones de anticuerpos. El volumen de anticuerpos aplicado en cada pocillo debe ser como m�nimo equivalente al volumen de extracto aplicado.
En caso de que no existan instrucciones espec�ficas de los suministradores de los anticuerpos deber� aplicarse el siguiente procedimiento:
5.3.2 Dejar en incubaci�n los portaobjetos en papel h�medo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 �C).
5.3.3 Sacudir las gotitas de cada portaobjetos y enjuagar cuidadosamente con tamp�n IF. Lavar por inmersi�n durante cinco minutos en tamp�n IF-Tween (ap�ndice 4) y posteriormente en tamp�n IF. Evitar la transferencia de aerosoles o gotitas que pudiera provocar contaminaciones cruzadas. Eliminar cuidadosamente el exceso de humedad sec�ndolo suavemente.
5.3.4 Colocar los portaobjetos en papel h�medo. Cubrir los pocillos con la diluci�n del conjugado FITC utilizado para determinar el t�tulo. El volumen de conjugado aplicado en los pocillos debe ser id�ntico al volumen de anticuerpos aplicado.
5.3.5 Dejar en incubaci�n los portaobjetos en papel h�medo durante 30 minutos a temperatura ambiente (18-25 �C).
5.3.7 Echar con una pipeta 5 a 10 μl de tamp�n fosfato glicerol de 0,1 M (ap�ndice 4) o un volumen de soluci�n comercial que proteja la fluorescencia (antifading) en cada pocillo y colocar un cubreobjetos.
5.4.1 Examinar los portaobjetos en un microscopio epifluorescente con filtros adecuados para que se produzca la excitaci�n del FITC, con aceite o agua de inmersi�n y a 500-1 000 aumentos. Recorrer los pocillos a lo largo de dos di�metros perpendiculares entre s� y alrededor del per�metro. En el caso de muestras que presenten un bajo n�mero de c�lulas o ninguna, deben observarse como m�nimo 40 campos microsc�picos.
En primer lugar, comprobar el control positivo. Las c�lulas deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente te�idas en el t�tulo de anticuerpos o la diluci�n de trabajo determinados. La prueba IF (secci�n VI.A.5) debe repetirse si la tinci�n no es correcta.
5.4.2 Comprobar si hay c�lulas fluorescentes brillantes con morfolog�a caracter�stica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente a la de la cepa de control positivo en la misma diluci�n de anticuerpos. Deber�n descartarse las c�lulas que presenten una tinci�n incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.
Deber� repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminaci�n. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren c�lulas positivas debido a la contaminaci�n del tamp�n o si se encuentran c�lulas positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.
5.4.3 Existen varios problemas inherentes a las caracter�sticas espec�ficas de la prueba de inmunofluorescencia. En los precipitados de cu�as basales de patata y los precipitados de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de c�lulas fluorescentes de morfolog�a at�pica y bacterias saprofitas con reacci�n cruzada cuyo tama�o y morfolog�a sean similares a los de R. solanacearum.
5.4.4 Tener solamente en cuenta las c�lulas fluorescentes con tama�o y morfolog�a t�picos en el t�tulo o la diluci�n de trabajo de los anticuerpos, tal como se describe en 5.3.
5.4.5 Interpretaci�n de la lectura de la prueba IF:
i) si se encuentran c�lulas fluorescentes brillantes con morfolog�a caracter�stica, estimar el n�mero medio de c�lulas t�picas por campo microsc�pico y calcular el n�mero de c�lulas t�picas por ml de precipitado resuspendido (ap�ndice 5).
La lectura IF es positiva en las muestras con un m�nimo de 5 � 10 3 c�lulas t�picas por ml de precipitado resuspendido. Se considera entonces que la muestra puede estar contaminada y deben efectuarse otras pruebas,
ii) la lectura IF es negativa en las muestras con menos de 5 � 10 3 c�lulas por ml de precipitado resuspendido, y se considera negativa la muestra. No es preciso efectuar m�s pruebas.
6. Prueba de reacci�n en cadena de la polimerasa (prueba PCR)
Cuando se utilice la prueba PCR como principal prueba de selecci�n y d� resultados positivos, deber� efectuarse la prueba de aislamiento o la IF como segunda prueba obligatoria de selecci�n. Cuando se utilice la PCR como segunda prueba de selecci�n y d� resultados positivos, deber�n efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagn�stico.
La aplicaci�n de este m�todo como principal m�todo de selecci�n s�lo se recomienda en el caso de que se hayan adquirido conocimientos especializados del mismo.
Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este m�todo deber�an permitir la detecci�n reproducible de 10 3 a 10 4 c�lulas de R. solanacearum por ml a�adidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos. Puede ser necesario llevar a cabo experimentos de optimizaci�n para lograr niveles m�ximos de sensibilidad y especificidad en todos los laboratorios.
Utilizar reactivos y protocolos PCR validados (v�ase el ap�ndice 6). Seleccionar preferiblemente un m�todo con control interno.
Tomar las precauciones adecuadas para evitar la contaminaci�n de la muestra con el ADN buscado. La prueba PCR debe ser efectuada por t�cnicos experimentados, en laboratorios especializados en biolog�a molecular, con el fin de reducir al m�ximo la posibilidad de contaminaci�n con el ADN buscado.
Como muestras finales del procedimiento siempre deben efectuarse controles negativos (para la extracci�n de ADN y los procedimientos PCR) que dejen constancia de si se ha producido arrastre de ADN.
- mezcla para la reacci�n PCR.
- al�cuotas de precipitados resuspendidos a los que se ha a�adido R. solanacearum (para la preparaci�n v�ase el ap�ndice 3, punto B),
- una suspensi�n de 10 6 c�lulas por ml de R. solanacearum en agua de un aislado virulento (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; v�ase el ap�ndice 3, punto B),
- siempre que sea posible, utilizar asimismo ADN extra�do de las muestras de control positivas en la prueba PCR.
Para evitar toda posible contaminaci�n, preparar los controles positivos en un entorno distinto al de las muestras que vayan a analizarse.
Los extractos de muestras deben contener la cantidad m�nima de tierra posible. En determinados casos puede ser recomendable preparar los extractos a partir de patatas lavadas cuando vayan a utilizarse protocolos PCR.
6.1 M�todos de purificaci�n del ADN
Utilizar muestras de control positivas y negativas como se indica m�s arriba (v�ase el ap�ndice 3).
Existen diferentes m�todos para purificar el ADN buscado a partir de sustratos de muestras complejas, separando de esta manera los inhibidores de PCR y otras reacciones enzim�ticas y concentrando el ADN buscado en el extracto de la muestra. Se ha optimizado el m�todo siguiente para su utilizaci�n con los m�todos PCR validados mostrados en el ap�ndice 6.
a) M�todo de Pastrik (2000)
1) verter con una pipeta 220 μl de tamp�n de lisis [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] en un tubo eppendorf de 1,5 ml;
2) a�adir 100 μl de extracto de muestra y colocar en un calentador o al ba�o mar�a a 95 �C durante diez minutos;
4) a�adir 80 μl de soluci�n est�ndar de lisozima (50 mg de lisozima por ml en 10 mM Tris HCl, pH 8,0) e incubar a 37 �C durante 30 minutos;
5) a�adir 220 μl de soluci�n A Easy DNA� (Invitrogen), mezclar adecuadamente por agitaci�n e incubar a 65 �C durante 30 minutos;
6) a�adir 100 μl de soluci�n B Easy DNA� (Invitrogen) y agitar vigorosamente hasta que el precipitado se mueva libremente en el tubo y la muestra sea uniformemente viscosa;
7) a�adir 500 μl de cloroformo y agitar hasta que disminuya la viscosidad y la mezcla sea homog�nea;
8) centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 �C para separar las fases y formar la interfase;
10) a�adir 1 ml de etanol al 100 % (- 20 �C), agitar brevemente e incubar en hielo durante diez minutos;
11) centrifugar a 15.000 g durante 20 minutos a 4 �C y retirar el etanol del precipitado;
12) a�adir 500 μl de etanol al 80 % (- 20 �C) y mezclar invirtiendo el tubo;
13) centrifugar a 15.000 g durante diez minutos a 4 �C, guardar el precipitado y retirar el etanol;
15) resuspender el precipitado en 100 μl de agua ultrapura est�ril y dejar a temperatura ambiente durante un m�nimo de 20 minutos;
16) almacenar a - 20 �C hasta que se necesite para la prueba PCR;
b) Otros m�todos
Pueden aplicarse otros m�todos de extracci�n del ADN, como por ejemplo Qiagen DNeasy Plant Kit, siempre que se haya demostrado que son igual de eficaces en la purificaci�n del ADN a partir de muestras de control que contengan de 10 3 a 10 4 c�lulas pat�genas por ml.
6.2.1 Preparar plantillas de ensayo y de control para la prueba PCR con arreglo a los protocolos validados (secci�n VI.A.6). Preparar una diluci�n decimal de extracto de ADN de la muestra (1:10 en agua ultrapura).
6.2.2 Preparar la mezcla de reacci�n PCR apropiada en un entorno sin contaminaci�n de acuerdo con los protocolos publicados (ap�ndice 6). Cuando sea posible, se recomienda utilizar un protocolo PCR multiplex que incorpore asimismo un control interno de la prueba PCR.
6.2.3 A�adir de 2 a 5 μl de extracto de ADN por 25 μl de reacci�n PCR en tubos PCR est�riles con arreglo a los protocolos PCR (v�ase el ap�ndice 6).
6.2.4 Incorporar una muestra de control negativo que contenga s�lo mezcla de reacci�n PCR y a�adir la misma fuente de agua ultrapura utilizada en la mezcla PCR en lugar de la muestra.
6.2.5 Colocar los tubos en el mismo termociclador utilizado en las pruebas preliminares y aplicar el programa PCR optimizado adecuado (ap�ndice 6).
6.3 An�lisis del producto de la PCR
6.3.1 Resolver los amplicones PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Aplicar como m�nimo 12 μl de mezcla de reacci�n de ADN amplificada de cada muestra mezclada con 3 μl de tamp�n de carga (ap�ndice 6) en 2,0 % (w/v) de geles de agarosa en un tamp�n de tris-acetato- EDTA (TAE) (ap�ndice 6) a 5-8 V por cm. Utilizar un marcador de ADN adecuado, por ejemplo, 100 pb ladder.
6.3.2 Revelar las bandas de ADN ti��ndolas con bromuro de etidio (0,5 mg/l) durante 30 a 60 minutos, tomando las precauciones adecuadas para el manejo de este mut�geno.
6.3.3 Observar el gel te�ido mediante transiluminaci�n en UV de onda corta (λ = 302 nm) para productos de la PCR amplificados del tama�o esperado (ap�ndice 6) y anotar los resultados.
6.3.4 En relaci�n con todos los nuevos descubrimientos o casos, para verificar la autenticidad del amplic�n PCR efectuar un an�lisis de la enzima de restricci�n en una muestra del ADN restante amplificado incubando a la temperatura �ptima y durante el tiempo necesario con una enzima y un tamp�n apropiados (v�ase el ap�ndice 6). Resolver los fragmentos digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa, al igual que antes, y observar el patr�n caracter�stico del fragmento de restricci�n con transiluminaci�n UV una vez te�ido con bromuro de etidio y comparar con el control positivo no digerido y digerido.
Interpretaci�n de los resultados de la prueba PCR La prueba PCR es negativa si el amplic�n PCR espec�fico de R. solanacearum del tama�o esperado no se detecta en la muestra en cuesti�n pero s� se detecta en todas las muestras de controles positivos (en caso de PCR multiplex con cebadores de control interno espec�ficos de la planta, se debe amplificar con la muestra en cuesti�n un segundo producto PCR del tama�o esperado).
La prueba PCR es positiva si se detecta el amplic�n PCR espec�fico de R. solanacearum del tama�o y patr�n de restricci�n esperado (cuando se exija), siempre que no se amplifique a partir de ninguna de las muestras de control negativo. La confirmaci�n fiable de un resultado positivo puede obtenerse tambi�n repitiendo la prueba con un segundo conjunto de cebadores de la PCR (ap�ndice 6).
Nota: Puede sospecharse la inhibici�n de la PCR si el amplic�n esperado se obtiene a partir de la muestra de control positivo que contiene R. solanacearum en agua, pero se obtienen resultados negativos de los controles positivos con R. solanacearum en extracto de patata. En protocolos PCR multiplex con controles PCR internos, la inhibici�n de la reacci�n se indica cuando no se obtiene ninguno de los dos amplicones.
Puede sospecharse la existencia de contaminaci�n si el amplic�n esperado se obtiene a partir de uno o varios de los controles negativos.
7. Prueba de hibridaci�n fluorescente in situ (prueba FISH)
Cuando se utilice la prueba FISH como primera prueba de selecci�n y esta proporcione resultados positivos, deber� efectuarse la prueba de aislamiento o la prueba IF como segunda prueba obligatoria de selecci�n. Cuando se utilice la prueba FISH como segunda prueba de selecci�n y d� resultados positivos, deber�n efectuarse las pruebas establecidas en el diagrama de flujo para completar el diagn�stico.
Nota: Utilizar oligosondas espec�ficas para R. solanacearum validadas (v�ase el ap�ndice 7). Las pruebas preliminares realizadas con este m�todo deber�an permitir la detecci�n reproducible de al menos 10 3 a 10 4 c�lulas de R. solanacearum por ml a�adidas a los extractos de muestras que hayan dado anteriormente resultados negativos.
El procedimiento siguiente deber�a efectuarse, a ser posible, con extracto de muestra reci�n preparado, pero tambi�n puede realizarse con �xito con extracto de muestra que se haya almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre - 16 y - 24 �C o entre - 68 y - 86 �C.
Utilizar como controles negativos al�cuotas de extracto de muestras que hayan dado previamente resultados negativos para R. solanacearum.
Como controles positivos, preparar suspensiones que contengan de 10 5 a 10 6 c�lulas por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo la cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; v�ase el ap�ndice 3) en tamp�n de fosfato de 0,01 M de un cultivo de tres a cinco d�as. Preparar en otro portaobjetos controles positivos de la cepa hom�loga o de cualquier otra cepa de referencia de R. solanacearum, suspendida en extracto de patata, tal como se especifica en el ap�ndice 3, punto B.
El uso de una oligosonda eubacteriana con etiqueta FITC ofrece un control para el proceso de hibridaci�n, ya que te�ir� todas las eubacterias presentes en la muestra.
En el ap�ndice 3, punto A, se enumeran los materiales normalizados de control positivo y negativo que pueden utilizarse en esta prueba.
7.1 Fijaci�n del extracto de patata
7.1.1 Preparar la soluci�n de fijaci�n (v�ase el ap�ndice 7).
7.1.3 Separar el sobrenadante y disolver el precipitado en 200 μl de soluci�n fijadora preparada con menos de 24 horas de antelaci�n. Agitar e incubar durante una hora en el refrigerador.
7.1.4 Centrifugar durante siete minutos a 7 000 g, separar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 75 μl de tamp�n de fosfato de concentraci�n 0,01 M (v�ase el ap�ndice 7).
7.1.5 Colocar 16 μl de las suspensiones fijadas en un portaobjetos m�ltiple limpio, tal como muestra la figura 7.1. Aplicar dos muestras diferentes por portaobjetos sin diluir y utilizar 10 μl para realizar una diluci�n a 1:100 (en tamp�n de fosfato de concentraci�n 0,01 M). La soluci�n de la muestra restante (49 μl) puede almacenarse a - 20 �C tras la adici�n de 1 volumen de etanol al 96 %. En caso de que sea necesario repetir la prueba FISH, separar el etanol mediante centrifugaci�n y a�adir un volumen equivalente de tamp�n de fosfato de concentraci�n 0,01 M (mezclar mediante agitaci�n).
Figura 7.1. Distribuci�n del portaobjetos para la prueba FISH.
7.1.6 Secar los portaobjetos al aire (o con secador de portaobjetos a 37 �C) y fijarlos flame�ndolos.
El procedimiento puede interrumpirse en esta fase, pudi�ndose proseguir con la hibridaci�n al d�a siguiente. Los portaobjetos deben almacenarse secos y sin polvo a temperatura ambiente.
7.2 Hibridaci�n
7.2.1 Deshidratar las c�lulas en series de etanol escalonadas al 50 %, 80 % y 96 % durante un minuto cada una. Secar las preparaciones en un portaobjetos.
7.2.2 Preparar una c�mara de incubaci�n h�meda recubriendo el fondo de una caja herm�tica con papel de seda o de filtro empapado en 1x hybmix (ap�ndice 7). Preincubar la caja en el horno de hibridaci�n a 45 �C durante un m�nimo de diez minutos.
7.2.3 Aplicar 10 μl de soluci�n de hibridaci�n (ap�ndice 7) a ocho pocillos (pocillos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 y 10; v�ase la figura 7.1) de cada portaobjetos dejando vac�os los dos pocillos centrales (3 y 8).
7.2.4 Aplicar cubreobjetos (24 � 24 mm) al primer y a los cuatro �ltimos pocillos evitando la entrada de aire. Colocar los portaobjetos en la c�mara h�meda precalentada y dejar que se produzca la hibridaci�n durante cinco horas a 45 �C en la oscuridad.
7.2.5 Preparar tres vasos de precipitado que contengan 1 l de agua Milli Q (grado molecular), 1 l de 1x hybmix (334 ml 3x hybmix y 666 ml agua Milli Q) y 1 l de 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix y 958 ml agua Milli Q). Preincubarlos al ba�o mar�a a 45 �C.
7.2.7 Lavar el exceso de sonda mediante incubaci�n durante 15 minutos en el vaso de precipitado con 1x hybmix a 45 �C.
7.2.8 Transferir el portaobjetos a una soluci�n de lavado de hybmix a 1/8 e incubar durante otros 15 minutos.
7.2.9 Sumergir las preparaciones brevemente en agua Milli Q y colocarlas en papel de filtro. Eliminar el exceso de humedad cubriendo la superficie con cuidado con papel de filtro. Verter de 5 a 10 μl de soluci�n de montaje protectora de la fluorescencia (por ejemplo Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA, o equivalente) en cada pocillo y aplicar un cubreobjetos grande (24 � 60 mm) sobre la totalidad de la preparaci�n.
7.3.1 Los portaobjetos deben examinarse inmediatamente utilizando un microscopio epifluorescente a 630 o 1.000 aumentos con aceite de inmersi�n. Con un filtro adecuado para isotiocianato de fluoresce�na (FITC), las c�lulas eubacterianas (incluida la mayor�a de las c�lulas gramnegativas) de la muestra aparecen te�idas de verde fluorescente. Utilizando un filtro para tetrametilrodamina-5-isotiocianato, las c�lulas de R. solanacearum marcadas con Cy3 aparecen te�idas de rojo fluorescente. Comparar la morfolog�a de las c�lulas con la de los controles positivos. Las c�lulas deben ser fluorescentes brillantes y estar completamente te�idas. La prueba FISH (secci�n VI.A.7) debe repetirse si la tinci�n es aberrante. Recorrer los pocillos a lo largo de dos di�metros perpendiculares entre s� y alrededor del per�metro. En el caso de muestras que presenten un bajo n�mero de c�lulas o ninguna, deben observarse como m�nimo 40 campos microsc�picos.
7.3.2 Comprobar si hay c�lulas fluorescentes brillantes con la morfolog�a caracter�stica de R. solanacearum en los pocillos de los portaobjetos (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/ Home/main). La intensidad de la fluorescencia debe ser equivalente o mejor que la de la cepa de control positivo. Deber�n descartarse las c�lulas que presenten una tinci�n incompleta o cuya fluorescencia sea escasa.
7.3.3 Deber� repetirse la prueba si se sospecha que se ha producido cualquier posible contaminaci�n. Este puede ser el caso cuando todos los portaobjetos de un lote muestren c�lulas positivas debido a la contaminaci�n del tamp�n o si se encuentran c�lulas positivas (fuera de los pocillos de los portaobjetos) en la superficie.
7.3.4 Existen varios problemas inherentes a la especificidad de la prueba FISH. En los precipitados de cu�as basales de patata y de segmentos del tallo pueden aparecer poblaciones de base de c�lulas fluorescentes de morfolog�a at�pica y bacterias saprofitas con reacci�n cruzada cuyo tama�o y morfolog�a sean similares a los de R. solanacearum, aunque con mucha menor frecuencia que en la prueba IF.
7.3.5 T�nganse en cuenta �nicamente las c�lulas fluorescentes de tama�o y morfolog�a t�picos.
7.3.6 Interpretaci�n de los resultados de la prueba FISH
i) Se obtendr�n resultados v�lidos en la prueba FISH siempre que en todos los controles positivos y en ninguno de los controles negativos se observen c�lulas te�idas de verde fluorescente brillante, cuyo tama�o y morfolog�a sean los t�picos de las de R. solanacearum, cuando se utilice el filtro FITC, y c�lulas te�idas de rojo fluorescente brillante cuando se utilice el filtro de rodamina. Si se encuentran c�lulas fluorescentes brillantes con morfolog�a caracter�stica, estimar el n�mero medio de c�lulas t�picas por campo microsc�pico y calcular el n�mero de c�lulas t�picas por ml de precipitado resuspendido (ap�ndice 4). Las muestras que presenten al menos 5 � 10 3 c�lulas t�picas por ml de precipitado resuspendido se consideran potencialmente contaminadas. Es preciso efectuar nuevas pruebas. Las muestras que presenten menos de 5 � 10 3 c�lulas t�picas por ml de precipitado resuspendido se consideran negativas.
ii) Los resultados de la prueba FISH ser�n negativos cuando no se observen c�lulas te�idas de rojo fluorescente brillante con un tama�o y morfolog�a t�picos de R. solanacearum utilizando el filtro de rodamina, siempre que se observen c�lulas te�idas de rojo fluorescente brillante t�picas en las preparaciones de control positivo cuando se utilice el filtro de rodamina.
8. Pruebas de ensayo de inmunoabsorci�n enzim�tica (ELISA)
Las pruebas ELISA solamente pueden utilizarse como prueba opcional adem�s de las pruebas IF, PCR o FISH, debido a la sensibilidad relativamente baja de esta prueba. Cuando se utilice ELISA-DASI, es obligatorio efectuar un enriquecimiento y utilizar anticuerpos monoclonales (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/ Home/main). Puede resultar de utilidad efectuar un enriquecimiento de las muestras antes de utilizar la prueba
Nota: Utilizar una fuente validada de anticuerpos de R. solanacearum (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main). Se recomienda determinar el t�tulo para cada nuevo lote de anticuerpos. El t�tulo se define como la diluci�n m�s elevada en la que se produce una reacci�n �ptima cuando se analiza una suspensi�n que contenga de 10 5 a 10 6 c�lulas por ml de la cepa hom�loga de R. solanacearum, utilizando conjugados de anticuerpos secundarios apropiados, seg�n las recomendaciones del fabricante. Durante el an�lisis, deben utilizarse los anticuerpos en diluciones de trabajo cercanas o equivalentes a la formulaci�n comercial.
Determinar el t�tulo de los anticuerpos en una suspensi�n de 10 5 a 10 6 c�lulas por ml de la cepa hom�loga de R. solanacearum.
Incluir una muestra de extracto que haya dado previamente resultados negativos para R. solanacearum y una suspensi�n de una bacteria que no tenga reacci�n cruzada en tamp�n fosfato salino (PBS) como controles negativos.
Como control positivo utilizar al�cuotas de extracto de muestra que haya dado previamente resultados negativos, mezcladas con 10 3 a 10 4 c�lulas por ml de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; v�ase el ap�ndice 3, puntos A y B). Para la comparaci�n de los resultados de cada placa utilizar una suspensi�n normalizada de 10 5 a 10 6 c�lulas por ml en PBS de R. solanacearum. Debe asegurarse que los controles positivos est�n bien separados en la placa de microtitulaci�n de la muestra o las muestras analizadas.
1) utilizar de 100 a 200 μl de al�cuotas de extracto de muestra. (Si se calienta a 100 �C durante cuatro minutos al ba�o mar�a o un calentador pueden reducirse en algunos casos los resultados no espec�ficos.);
2) a�adir un volumen igual de tamp�n de tapizado de doble concentraci�n (ap�ndice 4) y agitar;
3) aplicar 100 μl de al�cuotas en al menos dos pocillos de una placa de microtitulaci�n (por ejemplo, Nunc-Polysorp o equivalente) e incubar durante una hora a 37 �C o durante una noche a 4 �C;
4) quitar los extractos de los pocillos. Lavar estos tres veces con PBS-Tween (ap�ndice 4), dejando en ellos la �ltima soluci�n de lavado durante al menos cinco minutos;
5) preparar la diluci�n adecuada de anticuerpos contra R. solanacearum en tamp�n de bloqueo (ap�ndice 4). Para anticuerpos comerciales validados, utilizar las diluciones recomendadas (normalmente una concentraci�n que duplique el t�tulo);
6) a�adir 100 μl a cada pocillo e incubar durante una hora a 37 �C;
7) quitar la soluci�n de anticuerpos de los pocillos y lavar como se describe en el punto 4;
8) preparar la diluci�n adecuada de conjugado de fosfatasa alcalina de anticuerpos secundarios en tamp�n de bloqueo. A�adir 100 μl a cada pocillo e incubar durante una hora a 37 �C;
10) a�adir 100 μl de soluci�n de sustrato de fosfatasa alcalina (ap�ndice 4) a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente y leer la absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.
1) preparar la diluci�n adecuada de inmunoglobulinas policlonales contra R. solanacearum en tamp�n de bloqueo de pH 9,6 (ap�ndice 4). A�adir 200 μl a cada pocillo. Incubar a 37 �C de cuatro a cinco horas o a 4 �C durante 16 horas;
2) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (ap�ndice 4).
A�adir 190 μl de extracto de muestra en al menos dos pocillos. A�adir asimismo controles positivos y negativos en dos pocillos de cada placa. Incubar durante 16 horas a 4 �C;
3) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (ap�ndice 4);
4) preparar una diluci�n apropiada de anticuerpos monoclonales espec�ficos de R. solanacearum en PBS (ap�ndice 4) que contenga asimismo 0,5 % de seroalb�mina bovina (BSA) y a�adir 190 μl a cada pocillo. Incubar a 37 �C durante dos horas;
5) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (ap�ndice 4);
6) preparar una diluci�n apropiada de inmunoglobulinas anti-rat�n conjugadas con fosfatasa alcalina en PBS. A�adir 190 μl a cada pocillo. Incubar a 37 �C durante dos horas;
7) lavar tres veces los pocillos con PBS-Tween (ap�ndice 4);
8) preparar una soluci�n de sustrato de fosfatasa alcalina que contenga 1 mg de p-nitrofenil fosfato por ml de tamp�n de substrato (ap�ndice 4). A�adir 200 μl a cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente y leer la absorbencia a 405 nm a intervalos regulares durante 90 minutos.
Interpretaci�n de los resultados de la prueba ELISA La prueba ELISA es negativa si la lectura media de la densidad �ptica (DO) de los pocillos de cada muestra duplicada es < 2 veces la DO del pocillo de control del extracto de muestra negativa, siempre y cuando todas las DO de los controles positivos sean superiores a 1,0 (tras 90 minutos de incubaci�n con el substrato) y sean m�s de dos veces superiores a la DO obtenida a partir de extractos de muestra negativa.
Las lecturas ELISA negativas en pocillos de control positivo indican que no se ha efectuado correctamente la prueba o que ha estado inhibida. Las lecturas ELISA positivas en pocillos de control negativo indican que se ha producido contaminaci�n cruzada o uni�n de anticuerpos no espec�ficos.
Nota: Las pruebas preliminares realizadas con este m�todo deber�an permitir la detecci�n reproducible de 10 3 a 10 4 unidades formadoras de colonias de R. solanacearum por ml a�adidas a los extractos de muestras que previamente proporcionaron resultados negativos (para la preparaci�n v�ase el ap�ndice 3).
Se puede alcanzar la m�xima sensibilidad de detecci�n cuando se utilicen extractos de muestras que se acaben de preparar y cuando las condiciones de cultivo sean las �ptimas. No obstante, este m�todo puede aplicarse tambi�n con �xito a extractos que se hayan almacenado en glicerol a una temperatura comprendida entre - 68 y - 86 �C.
9.1 Utilizar diez plantas de prueba de un cultivar de tomate sensible (por ejemplo, Moneymaker o cultivar con sensibilidad equivalente determinado por el laboratorio de an�lisis) en la fase de la tercera hoja verdadera para cada muestra. Para m�s detalles de cultivo, v�ase el ap�ndice 8. Otra alternativa es utilizar berenjenas (por ejemplo, cultivar Black Beauty o cultivares con sensibilidad equivalente), �nicamente plantas en fase de hoja 2- 3 hasta la plena expansi�n de la tercera hoja verdadera. Se ha observado que los s�ntomas son menos graves y que se desarrollan m�s lentamente en la berenjena. Por tanto, cuando sea posible se recomienda utilizar pl�ntulas de tomate.
9.2.1 Inoculaci�n con jeringa Inocular los tallos de las patatas justo por encima de los cotiledones con una jeringa provista de una aguja hipod�rmica (no menos de 23G). Distribuir la muestra entre las plantas analizadas.
9.2.2 Inoculaci�n en estr�as
Sosteniendo la planta entre dos dedos, apl�quese con una pipeta una gota (de unos 5-10 μl) del precipitado en suspensi�n en el tallo situado entre los cotiledones y la primera hoja.
Con un bistur� est�ril practicar una incisi�n diagonal de aproximadamente 1,0 cm de largo y una profundidad de aproximadamente 2/3 del grosor del tallo, comenzando el corte a partir de la gota del precipitado.
Sellar el corte con vaselina est�ril utilizando una jeringa.
9.3 Inocular con la misma t�cnica cinco plantones con una suspensi�n acuosa de 10 5 a 10 6 c�lulas por ml preparada a partir de un cultivo de 48 horas de una cepa biovar 2 virulenta de R. solanacearum como control positivo y con tamp�n de precipitado (ap�ndice 4) como control negativo. Separar las plantas de control positivo y negativo de las otras para evitar la contaminaci�n cruzada.
9.4 Cultivar las plantas de prueba en instalaciones de cuarentena hasta un m�ximo de cuatro semanas entre 25 y 30 �C con elevada humedad relativa, reg�ndolas adecuadamente para evitar que se aneguen o se marchiten por deficiencia h�drica. Para evitar la contaminaci�n se deben incubar las plantas de control positivo y negativo en bancos claramente separados en un invernadero o c�mara de cultivo; en el caso de que se disponga de un espacio reducido, garantizar la estricta separaci�n entre tratamientos. En el caso de que deban incubarse juntas plantas para distintas muestras, deben separarse con las pantallas adecuadas. Durante la fertilizaci�n, el riego, la inspecci�n y cualquier otra manipulaci�n deben extremarse las precauciones para evitar la contaminaci�n cruzada. Es esencial mantener los invernaderos y las c�maras libres de toda plaga de insectos, ya que estos pueden transmitir la bacteria de una muestra a otra.
Comprobar si se aprecian s�ntomas de marchitamiento, epinastia, clorosis y/o crecimiento reducido.
9.5 Aislarlas de las plantas infectadas (secci�n II.3) e identificar cultivos purificados de presunta R. solanacearum (secci�n VI. B).
9.6 Si no se observan s�ntomas despu�s de tres semanas, efectuar una prueba IF/PCR/Aislamiento en una muestra mixta de secciones de 1 cm del tallo de cada planta analizada, tomadas por encima del punto de inoculaci�n. Si la prueba es positiva, efectuar una diluci�n en placas (secci�n 4.1).
9.7 Identificar cualquier cultivo purificado de presunta R. solanacearum (secci�n VI. B).
Interpretaci�n de los resultados de la prueba del bioensayo Se obtienen resultados v�lidos de la prueba del bioensayo cuando las plantas del control positivo muestran s�ntomas t�picos, pueden reaislarse las bacterias de estas plantas y no se encuentran s�ntomas en los controles negativos.
La prueba del bioensayo es negativa si las plantas analizadas no est�n infectadas por R. solanacearum, siempre que se detecte R. solanacearum en los controles positivos.
La prueba del bioensayo es positiva si las plantas analizadas est�n infectadas por R. solanacearum.
B. PRUEBAS DE IDENTIFICACI�N
Identificar cultivos puros de aislados de presunta R. solanacearum utilizando al menos dos de las pruebas siguientes basadas en principios biol�gicos diferentes.
Cuando proceda, incluir cepas de referencia conocidas para cada prueba efectuada (v�ase el ap�ndice 3).
1. Pruebas de identificaci�n nutricional y enzim�tica
Determinar las propiedades fenot�picas siguientes que est�n universalmente presentes o ausentes en R. solanacearum, de acuerdo con los m�todos de Lelliott y Stead (1987), Klement et al. (1990) y Schaad (2001).
2.1 Preparar una suspensi�n de aproximadamente 10 6 c�lulas por ml en tamp�n IF (ap�ndice 4).
2.2 Preparar una serie de diluciones a 1/2 de un antisuero adecuado (v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
2.3 Aplicar el procedimiento IF (secci�n VI.A.5).
2.4 La prueba IF ser� positiva si el t�tulo IF del cultivo es equivalente al del control positivo.
Nota: Si solamente se efect�an dos pruebas de identificaci�n, no debe utilizarse ninguna otra prueba serol�gica adem�s de este m�todo.
3.1 Preparar una suspensi�n de aproximadamente 10 8 c�lulas por ml en 1X PBS (ap�ndice 4).
3.2 Llevar a cabo un procedimiento ELISA adecuado con un anticuerpo monoclonal espec�fico de R. solanacearum.
3.3 La prueba ELISA ser� positiva si la lectura ELISA obtenida del cultivo es como m�nimo la mitad de la obtenida para el control positivo.
4.1 Preparar una suspensi�n de aproximadamente 10 6 c�lulas por ml en agua est�ril de grado molecular.
4.2 Calentar 100 μl de la suspensi�n celular en tubos cerrados en un calentador o al ba�o mar�a a 100 �C durante cuatro minutos. Las muestras pueden almacenarse entonces a una temperatura de - 16 a - 24 �C hasta que sea necesario.
4.3 Aplicar los procedimientos PCR adecuados para amplificar los amplicones espec�ficos de R. solanacearum [por ejemplo, Seal et al. (1993); Pastrik y Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997); Weller et al. (1999)].
4.4 Se lograr� la identificaci�n positiva de R. solanacearum si los amplicones de la PCR son del mismo tama�o y tienen los mismos polimorfismos de la longitud del fragmento de restricci�n que los de la cepa de control positivo.
5.1 Preparar una suspensi�n de aproximadamente 10 6 c�lulas por ml en agua ultrapura.
5.2 Aplicar el procedimiento FISH (secci�n VI.A.7) con al menos dos oligosondas espec�ficas para R. solanacearum( ap�ndice 7).
5.3 La prueba FISH ser� positiva si se obtienen las mismas reacciones del cultivo y el control positivo.
6. Perfiles de �cidos grasos (Fatty acid profiling o FAP)
6.1 Mantener el cultivo en agar de tripticasa de soja (Oxoide) durante 48 horas a 28 �C.
6.3 La prueba FAP ser� positiva si el perfil del presunto cultivo es id�ntico al del control positivo. Los �cidos grasos cuya presencia es caracter�stica son 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH y 18:1 2OH, y la ausencia de 16:0 3OH es altamente indicativa de Ralstonia sp.
7. M�todos de caracterizaci�n de las cepas
Se recomienda efectuar la caracterizaci�n de las cepas con uno de los m�todos siguientes para cada nuevo caso de aislamiento de R. solanacearum.
7.1 Determinaci�n de los biovares
R. solanacearum se separa en biovares en funci�n de la capacidad para utilizar y/o oxidar tres disac�ridos y tres hexosas alcoh�licas (Hayward, 1964 y Hayward et al., 1990). Los medios nutritivos para la prueba del biovar se describen en el ap�ndice 2. Esta prueba puede efectuarse con �xito inoculando los medios por perforaci�n con cultivos puros de aislados de R. solanacearum e incubando a 28 �C. Si los medios se distribuyen en placas est�riles de cultivo de c�lulas de 96 pocillos (200 μl por pocillo) puede observarse en un plazo de 72 horas un cambio de color, del verde oliva al amarillo, lo que indica un resultado positivo de la prueba.
7.2 Obtenci�n de la huella dactilar gen�mica
La diferenciaci�n molecular de las cepas en el complejo de R. solanacearum puede conseguirse mediante diferentes t�cnicas, entre las que se incluyen:
7.2.1 An�lisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricci�n (RFLP) (Cook et al., 1989).
7.2.3 An�lisis de los polimorfismos de la longitud del fragmento amplificado (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).
7.3 M�todos PCR
Pueden utilizarse cebadores espec�ficos de PCR (Pastrik et al, 2002; v�ase el ap�ndice 6) para diferenciar cepas que pertenezcan a la divisi�n 1 (biovares 3, 4 y 5) y la divisi�n 2 (biovares 1, 2A y 2T) de R. solanacearum, tal como se define originalmente con el an�lisis RFLP (Cook et al., 1989) y la secuenciaci�n de 16S rADN (Taghavi et al., 1996).
C. PRUEBA DE CONFIRMACI�N DE PATOGENICIDAD
Como confirmaci�n final del diagn�stico de R. solanacearum y para la evaluaci�n de la virulencia de cultivos identificados como R. solanacearum debe realizarse la prueba de patogenicidad:
1) preparar un in�culo de aproximadamente 10 6 c�lulas por ml de cultivos de 24 a 48 horas a partir del aislado que se vaya a someter a prueba y una cepa de control positivo adecuada de R. solanacearum (por ejemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; v�ase el ap�ndice 3);
2) inocular entre cinco y diez tallos de pl�ntulas de tomate o berenjena sensibles en la fase de la tercera hoja verdadera (v�ase la secci�n VI.A.9);
3) incubar durante un m�ximo de dos semanas a una temperatura de 25 a 28 �C, con humedad relativa alta y riego adecuado, evitando tanto el estancamiento del agua como el estr�s provocado por la sequ�a. Con los cultivos puros deber� obtenerse el marchitamiento t�pico en el plazo de 15 d�as. Si despu�s de este per�odo no se presentan los s�ntomas, no podr� confirmarse que el cultivo es una forma pat�gena de R. solanacearum;
4) comprobar si se aprecian s�ntomas de marchitamiento y/o epinastia, clorosis y crecimiento reducido;
5) aislar las plantas sintom�ticas separando una secci�n de tallo que est� 2 cm por encima del punto de inoculaci�n. Dilacerar y suspender en un peque�o volumen de agua destilada est�ril o en tamp�n fosfato 50 mM (ap�ndice 4). Aislar de la suspensi�n mediante diluci�n, extendiendo o haciendo estr�as en un medio adecuado, preferentemente en un medio selectivo (ap�ndice 2), incubar entre 48 y 72 horas a 28 �C y examinar la formaci�n de colonias t�picas de R. solanacearum.
Laboratorios que han participado en la optimizaci�n y la validaci�n de los protocolos
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave a 121 �C durante 15 minutos.
K 2 HPO 4 0,5 g MgSO 4 .7H 2 O 0,25 g
Casamino�cidos (Difco) 1,0 g
Enfriar a 50 �C y a�adir una soluci�n de cloruro de 2,3,5- trifenil tetrazolio (Sigma), esterilizada por filtraci�n, para conseguir una concentraci�n final de 50 mg/l.
Medio de base Casamino�cidos (Difco) 1,0 g
Bacto-agar (Difco) (v�ase la nota 2) 15,0 g
Enfriar a 50 �C y a�adir soluciones est�ndar acuosas, esterilizadas por filtraci�n, de los siguientes ingredientes, a fin de obtener las concentraciones finales especificadas:
1. La utilizaci�n de reactivos diferentes de los especificados arriba puede afectar al crecimiento de R. solanacearum.
2. Puede utilizarse Agar oxoide #1 en lugar de Bactoagar (Difco). En este caso, el crecimiento de R. solanacearum ser� m�s lento, aunque tambi�n puede reducirse el crecimiento de saprofitas competidoras. Las colonias t�picas de R. solanacearum pueden necesitar de uno a dos d�as m�s para formarse y la coloraci�n rojiza puede ser m�s ligera y difusa que en Bacto-agar.
3. Si se incrementa la concentraci�n de bacitracina a 2 500 U por l pueden reducirse las poblaciones de bacterias competidoras sin que se vea afectado el crecimiento de R. solanacearum.
Almacenar los medios y las soluciones est�ndar de antibi�ticos a 4 �C en la oscuridad y utilizar en el plazo de un mes.
Las placas deber�n carecer de condensaci�n de superficie antes de su utilizaci�n.
Deber� efectuarse un control de calidad tras la preparaci�n de cada nuevo lote de medio mediante siembra de una suspensi�n de un cultivo de referencia de R. solanacearum (v�ase el ap�ndice 3) y observaci�n de la formaci�n de colonias t�picas despu�s de incubaci�n a 28 �C de dos a cinco d�as.
MgSO 4 0,25 g
NaNO 3 0,25 g
Esterilizar en autoclave a 121 �C durante 15 minutos y enfriar a 50 �C.
A�adir soluciones est�ndar de antibi�ticos como para el caldo SMSA.
Se recomiendan los siguientes aislados bacterianos para su utilizaci�n como material normalizado de referencia, bien como controles positivos (cuadro 1) o durante la optimizaci�n de las pruebas para evitar reacciones cruzadas (cuadro 2). Todas las cepas est�n comercializadas por:
2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Pa�ses Bajos.
3. Collection Fran�aise de Bact�ries Phytopathog�nes (CFBP) - INRA Station Phytobact�riologie, Angers, Francia.
Cuadro 2. Panel de referencia SMT de bacterias serol�gica o gen�ticamente relacionadas para su utilizaci�n en la optimizaci�n de las pruebas de detecci�n
Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tub�rculos de patata sanos como control negativo para todas las pruebas.
Congelar precipitado seco de extracto de patata a partir de 200 tub�rculos de patata sanos que contengan de 10 3 a 10 4 y 10 4 a 10 6 c�lulas de R. solanacearum biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como controles positivos para pruebas serol�gicas y PCR. Teniendo en cuenta que la viabilidad de las c�lulas se ve afectada durante la criodesecaci�n, no son adecuados como controles normalizados para pruebas de aislamiento o de bioensayo.
Utilizar suspensiones fijadas con formalina de R. solanacearum biovar 2 (cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de 10 6 c�lulas por ml como controles positivos para pruebas serol�gicas.
B. Preparaci�n de controles positivos y negativos
Preparar un cultivo de 48 horas de una cepa virulenta de R. solanacearum raza 3/biovar 2 (por ejemplo, cepa NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) en medio base SMSA y suspender en tamp�n fosfato 10 mM para obtener una densidad celular de aproximadamente 2 � 10 8 cfu por ml. Esto se obtiene normalmente mediante una suspensi�n ligeramente turbia equivalente a una densidad �ptica de 0,15 a 600 nm.
Separar las cu�as basales de 200 tub�rculos de una variedad de piel blanca conocida por estar exenta de R. solanacearum.
Procesar las cu�as basales como es habitual y resuspender el precipitado en 10 ml.
Preparar diez microviales est�riles de 1,5 ml con 900 μl del precipitado resuspendido.
Transferir 100 μl de la suspensi�n de R. solanacearum al primer microvial. Homogeneizar por agitaci�n.
Establecer niveles decimales de contaminaci�n realizando nuevas diluciones en los cinco microviales siguientes.
Los seis microviales contaminados se utilizar�n como controles positivos. Los cuatro microviales no contaminados se utilizar�n como controles negativos. Etiquetar los microviales como corresponda.
Preparar al�cuotas de 100 μl en microviales est�riles de 1,5 ml para obtener de este modo nueve r�plicas de cada muestra de control. Almacenar a una temperatura de - 16 a - 24 �C hasta que se vayan a utilizar.
La presencia y la cuantificaci�n de R. solanacearum en las muestras de control deber� confirmarse en primer lugar mediante una prueba IF.
En las pruebas IF, FISH y PCR, debe detectarse R. solanacearum en al menos 10 6 y 10 4 c�lulas/ml de los controles positivos y en ninguno de los controles negativos.
GENERAL: Los tampones esterilizados que no se hayan abierto pueden almacenarse hasta un a�o.
1. Tampones para el procedimiento de extracci�n
1.1 Tamp�n de extracci�n (tamp�n fosfato 50 mM, pH 7,0)
Este tamp�n se utiliza para la extracci�n de la bacteria del tejido de las plantas mediante la homogeneizaci�n o la agitaci�n.
Na 2 HPO 4 (anhidro) 4,26 g
Disolver los ingredientes, verificar el pH y esterilizar en autoclave a 121 �C durante 15 minutos.
Los siguientes componentes adicionales pueden resultar �tiles:
1.2 Tamp�n de precipitado (tamp�n fosfato 10 mM, pH 7,2)
Este tamp�n se utiliza para la resuspensi�n y la diluci�n de extractos de cu�as basales de tub�rculos de patata tras la concentraci�n en un precipitado mediante centrifugaci�n.
2.1 Tamp�n IF [tamp�n fosfato salino (PBS) 10 mM, pH 7,2]
Este tamp�n se utiliza para la diluci�n de anticuerpos.
2.2 Tamp�n IF-Tween
Este tamp�n se utiliza para lavar los portaobjetos.
A�adir 0,1 % de Tween 20 al tamp�n IF.
2.3 Soluci�n de glicerol con tamp�n de fosfato, pH 7,6
Este tamp�n se utiliza como fluido de montaje en los pocillos de los portaobjetos de IF para aumentar la fluorescencia.
En el mercado pueden encontrarse soluciones de montaje que protegen la fluorescencia, como, por ejemplo, Vectashield � (Vector Laboratories) o Citifluor� (Leica).
3.1 Tamp�n fuerza doble para tapizado, pH 9,6
Puede a�adirse como antioxidante sulfito de sodio (0,2 %) si es necesario para evitar la acumulaci�n de compuestos arom�ticos oxidados.
3.2 Tamp�n fosfato salino (PBS), 10X pH 7,4
KH 2 PO 4 2,0 g
Na 2 HPO 4 .12H 2 O 29,0 g
3.4 Tamp�n de bloqueo (anticuerpos) (debe prepararse en el momento de su utilizaci�n)
3.5 Soluci�n de sustrato fosfatasa alcalina, pH 9,8
A�adir 0,2 g de MgCl2.
Disolver dos pastillas de 5 mg de sustrato fosfatasa (Sigma) por cada 15 ml de soluci�n.
4.1 Tamp�n de tapizado, pH 9,6
Na 2 CO 3 1,59 g
NaHCO 3 2,93 g
4.2 Tamp�n fosfato salino (PBS), 10X pH 7,2-7,4
NaH 2 PO 4 .2H 2 O 4,0 g
Na 2 HPO 4 .12H 2 O 27,0 g
4.4 Tamp�n de sustrato, pH 9,8
Determinaci�n del nivel de contaminaci�n en las pruebas IF y FISH
1. Contar el n�mero medio de c�lulas fluorescentes t�picas por campo de visi�n (c).
2. Calcular el n�mero de c�lulas fluorescentes t�picas por pocillo del portaobjetos del microscopio (C):
S = superficie del pocillo del portaobjetos m�ltiple
i = coeficiente de campo (var�a de 8 a 24 dependiendo del tipo ocular)
3. Calcular el n�mero de c�lulas fluorescentes t�picas por ml de precipitado resuspendido (N):
F = factor de diluci�n del precipitado resuspendido
Nota: Las pruebas preliminares deber�n permitir la detecci�n reproducible de al menos 10 3 a 10 4 c�lulas de R. solanacearum por ml de extracto de muestra.
Por otra parte, las pruebas preliminares no deben proporcionar resultados positivos falsos con respecto a un conjunto de cepas bacterianas seleccionadas (v�ase el ap�ndice 3).
1.1 Cebadores del oligonucle�tido
Tama�o esperado del amplic�n de los moldes de ADN de R. solanacearum = 288 pb.
1.2 Mezcla para la reacci�n PCR
1.3 Condiciones de reacci�n PCR
i) 2 minutos a 96 �C (desnaturalizaci�n del molde de ADN)
ii) 20 segundos a 94 �C (desnaturalizaci�n del molde de ADN)
iii) 20 segundos a 68 �C (hibridaci�n de los cebadores)
iv) 30 segundos a 72 �C (extensi�n de la copia) 1 ciclo de:
v) 10 minutos a 72 �C (extensi�n final)
vi) mantener a 4 �C.
Nota: Este programa se optimiz� para utilizarlo con un termociclador Perkin Elmer 9600. Puede ser preciso modificar la duraci�n de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilizaci�n con otros modelos.
1.4 An�lisis de la enzima de restricci�n del amplic�n
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricci�n caracter�stico con la enzima Ava II tras la incubaci�n a 37 �C.
2.1 Cebadores del oligonucle�tido
Tama�o esperado del amplic�n de los moldes de ADN de R. solanacearum = 553 pb.
2.2 Mezcla para la reacci�n PCR
2.3 Condiciones de reacci�n PCR Aplicar el siguiente programa:
i) 5 minutos a 95 �C (desnaturalizaci�n del molde de ADN)
ii) 30 segundos a 95 �C (desnaturalizaci�n del molde de ADN)
iii) 30 segundos a 68 �C (hibridaci�n de los cebadores)
iv) 45 segundos a 72 �C (extensi�n de la copia) 1 ciclo de:
v) 5 minutos a 72 �C (extensi�n final)
Nota: Este programa est� optimizado para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duraci�n de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilizaci�n con otros modelos.
2.4 An�lisis de la enzima de restricci�n del amplic�n
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricci�n caracter�stico con la enzima Taq I tras la incubaci�n a 65 �C durante 30 minutos. Los fragmentos de restricci�n obtenidos a partir del fragmento espec�fico de R. solanacearum tienen un tama�o de 457 pb y 96 pb.
3.1 Cebadores del oligonucle�tido
Tama�o esperado del amplic�n de los moldes de ADN de R. solanacearum = 718 pb (conjunto de cebadores RS).
Tama�o esperado del amplic�n de control PCR interno 18S rARN = 310 pb (conjunto de cebadores NS).
3.2 Mezcla para la reacci�n PCR
3.3 Condiciones de reacci�n PCR
iii) 30 segundos a 58 �C (hibridaci�n de los cebadores)
3.4 An�lisis de la enzima de restricci�n del amplic�n
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricci�n caracter�stico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubaci�n a 65 �C durante 30 minutos.
4. Protocolo PCR espec�fico del biovar de R. solanacearum (Pastrik et al, 2001)
4.1 Cebadores del oligonucle�tido
Tama�o esperado del amplic�n de los moldes de ADN de R. solanacearum:
4.2 Mezcla para la reacci�n PCR
a) Biovar 1/2 espec�fico PCR
b) Biovar 3/4/5 espec�fico PCR
4.3 Condiciones de reacci�n PCR Aplicar el siguiente programa a las reacciones espec�ficas de biovar 1/2 y biovar 3/4/5:
Nota: Este programa se optimiz� para utilizarlo con un termociclador MJ Research PTC 200. Puede ser preciso modificar la duraci�n de los ciclos ii), iii) y iv) para su utilizaci�n con otros modelos.
4.4 An�lisis de la enzima de restricci�n del amplic�n
Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando cebadores Rs-1-F y Rs-1-R producen un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricci�n caracter�stico con la enzima Bsm I o un Isoschizomere (por ejemplo, Mva 1269 I) tras la incubaci�n a 65 �C durante 30 minutos. Los productos PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacearum utilizando los cebadores Rs-1-F y Rs-3- R no poseen sitios de restricci�n.
5. Preparaci�n del tamp�n de carga
5.1 Azul de bromofenol (soluci�n est�ndar al 10 %)
5.2 Tamp�n de carga
6. 10X tamp�n de tris acetato EDTA (TAE), pH 8,0
Tamp�n tris 48,40 g
�cido ac�tico glacial 11,42 ml
EDTA (sal dis�dica) 3,72 g
Se encuentra tambi�n disponible en el mercado (por ejemplo, Invitrogen o equivalente).
Sonda espec�fica para R. solanacearum OLI-1-CY3:
Sonda eubacteriana no espec�fica EUB-338-FITC:
2. Soluci�n fijadora
�ADVERTENCIA! LA SOLUCI�N FIJADORA CONTIENE PARAFORMALDEH�DO QUE ES T�XICO. UTILIZAR GUANTES Y NO INHALAR. SE RECOMIENDA TRABAJAR EN UNA CAMPANA EXTRACTORA DE GASES.
i) Calentar 9 ml de agua de grado molecular, por ejemplo agua ultrapura, a 60 �C aproximadamente y a�adir 0,4 g de paraformaldeh�do. El paraformaldeh�do se disuelve cuando se a�aden 5 gotas de 1N NaOH y se remueve con un agitador magn�tico.
ii) Ajustar el pH a 7,0 mediante la adici�n de 1 ml de tamp�n de fosfato de concentraci�n 0,01 M y 5 gotas de 1N HCl. Verificar el pH con bandas indicadoras y ajustar si fuese necesario con HCl o NaOH. �ADVERTENCIA! NO UTILIZAR UN MEDIDOR DE PH EN SOLUCIONES QUE CONTENGAN PARAFORMALDEH�DO.
iii) Filtrar la soluci�n con un filtro de membrana de 0,22 μm y mantener libre de polvo a 4 �C hasta nueva utilizaci�n.
4. Soluci�n de hibridaci�n
Dodecilsulfato s�dico (SDS) 0,01 %
Preparar las cantidades de soluci�n de hibridaci�n de acuerdo con los c�lculos de la tabla 1. Para cada portaobjetos (que contenga dos muestras distintas por duplicado) se precisan 90 μl de soluci�n de hibridaci�n. IMPORTANTE: DEBE TENERSE EN CUENTA QUE LA FORMAMIDA ES MUY T�XICA, POR LO QUE DEBEN UTILIZARSE GUANTES Y TOMARSE LAS PRECAUCIONES DE SEGURIDAD NECESARIAS.
Tabla 1: Cantidades sugeridas para la preparaci�n de la mezcla de hibridaci�n
5. Tamp�n fosfato 0,1 M, pH 7,0
Sembrar semillas de tomate (Lycopersicon esculentum) o berenjena (Solanum melongena) en compost pasteurizado de semillas. Trasplantar las pl�ntulas con los cotiledones completamente abiertos (10 a 14 d�as) en compost pasteurizado de tiesto.
Las berenjenas o tomates deben cultivarse en un invernadero que cumpla las siguientes condiciones medioambientales antes de la inoculaci�n:
Duraci�n diurna: 14 horas o d�a natural si es de mayor duraci�n
diurna: 21 a 24 �C
nocturna:14 a 18 �C
Proveedores: v�ase el sitio web: http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main.
3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 10 5 ; 373-380.
14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akad�miai Kiad�, Budapest, 568 pp.
16. L�pez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.
19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA N�mero de portaobjetos 1 4 6 8 10 probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.
21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 10 8 , 831-842.
Conservaci�n de las pruebas anal�ticas en caso de aparici�n de un brote sospechoso
1. En cada caso de foco sospechoso para el que se haya realizado una o varias pruebas de selecci�n con resultados positivos de acuerdo con los m�todos establecidos en el anexo II para el material vegetal enumerado y para todos los otros casos, y se espere recibir confirmaci�n o refutaci�n por aplicaci�n de los citados m�todos, se deber� proceder a la retenci�n y adecuada conservaci�n, hasta completar los m�todos mencionados, de:
- todos los tub�rculos de los que se hayan obtenido muestras y, siempre que sea posible, todas las plantas de las que se hayan obtenido muestras,
- cualquier extracto sobrante y cualquier material adicional que se haya preparado para la prueba o pruebas de selecci�n, como por ejemplo placas de inmunofluorescencia, y
- toda la documentaci�n pertinente.
La retenci�n de los tub�rculos permitir� que se puedan llevar a cabo pruebas de variedades cuando se estime oportuno.
2. En el caso de confirmaci�n de la presencia del organismo, se proceder� a la retenci�n y adecuada conservaci�n hasta un mes despu�s, como m�nimo, en virtud del procedimiento establecido en el art�culo 6, apartado 2:
- de una muestra de las berenjenas o los tomates infectados inoculados con extracto de tub�rculo o de planta, cuando sea adecuado, y
Anexo III redactado por el art�culo �nico de la O.M. APA/719/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos II a VII del R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al (�B.O.E.� 27 marzo).Vigencia: 1 abril 2007
Elementos que deben tenerse en cuenta para la determinaci�n de la probable contaminaci�n
Los elementos de la investigaci�n que dispone el art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso i), ser�n, cuando proceda, los siguientes:
i) lugares de producci�n:
- en los que se est�n cultivando o se hayan cultivado patatas que est�n relacionadas cl�nicamente con aquellas en las que se haya comprobado la infecci�n por el organismo,
- en los que se est�n cultivando o se hayan cultivado tomates que procedan de las mismas fuentes que aquellos en los que se haya comprobado la infecci�n por el organismo,
- en los que se est�n cultivando o se hayan cultivado patatas o tomates que se hayan puesto bajo control oficial por sospecharse la presencia del organismo,
- en los que se est�n cultivando o se hayan cultivado patatas que est�n relacionadas cl�nicamente con las que hayan sido cultivadas en lugares de producci�n de los que se sospeche la infecci�n por el organismo,
- en los que se cultiven patatas o tomates y que est�n localizados en las proximidades de los lugares de producci�n infectados, incluidos aquellos en los que se compartan equipos e instalaciones de producci�n directamente o por intervenci�n de un contratista com�n,
- en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas de superficie de cualquier fuente en la que se haya confirmado o de la que se sospeche la infecci�n por el organismo,
- en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas de superficie de una fuente explotada en com�n con lugares de producci�n en los que se haya confirmado o de los que se sospeche la infecci�n por el organismo,
- que est�n o hayan sido anegados con aguas de superficie en las que se haya confirmado o de las que se sospeche la infecci�n por el organismo, y
ii) las aguas de superficie que se utilicen para el riego o rociamiento, o para la anegaci�n, de un campo o campos o de un lugar o lugares de producci�n en los que se haya confirmado la infecci�n
Anexo IV redactado por el art�culo �nico de la O.M. APA/719/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos II a VII del R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al (�B.O.E.� 27 marzo).Vigencia: 1 abril 2007
1. Al determinar, con arreglo al art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso iii), y al art�culo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), el alcance de la contaminaci�n probable, se incluir�n los elementos siguientes:
- el material vegetal indicado obtenido en un lugar de producci�n que haya sido declarado contaminado en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii),
- el lugar o lugares de producci�n que tengan una relaci�n de producci�n con el material vegetal indicado que haya sido declarado contaminado en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), incluidos aquellos lugares que compartan equipos e instalaciones de producci�n directamente o por intervenci�n de un contratista com�n,
- el material vegetal indicado que se haya producido en el lugar o lugares de producci�n contemplados en el gui�n anterior o que estuviera presente en tales lugares durante el tiempo en que el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), se hallara presente en el lugar de producci�n mencionado en el primer gui�n,
- las instalaciones que hayan manipulado el material vegetal indicado procedente de los lugares de producci�n a los que se refieren los guiones anteriores,
- cualquier maquinaria, veh�culo, buque, almac�n o unidades de estos y cualesquiera otros objetos, incluido el material de embalaje, que puedan haber estado en contacto con el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii),
- cualquier material vegetal indicado que haya sido almacenado o haya estado en contacto con cualquiera de las estructuras y los objetos mencionados en el gui�n anterior antes de la limpieza y desinfecci�n de estos,
- como resultado de la investigaci�n y de los an�lisis contemplados en el art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso i), en el caso de las patatas, aquellos tub�rculos o plantas que tengan una relaci�n clonal fraterna o parental y, en el caso del tomate, aquellas plantas que procedan de las mismas fuentes que el material vegetal indicado declarado contaminado en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), y para las cuales, aunque las pruebas de detecci�n del organismo hayan sido negativas, parezca probable la contaminaci�n a trav�s de un v�nculo clonal. Puede efectuarse una prueba de variedades para verificar la identidad de los tub�rculos o plantas contaminados que est�n relacionados cl�nicamente,
- el lugar o lugares de producci�n del material vegetal indicado a que se refiere el gui�n anterior,
- el lugar o lugares de producci�n del material vegetal indicado en los que se utilicen para las labores de riego o rociamiento aguas que hayan sido declaradas contaminadas en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra c), inciso ii),
- el material vegetal indicado producido en campos anegados con aguas de superficie en las que se haya confirmado la contaminaci�n.
2. Para la determinaci�n de la posible propagaci�n a la que se refieren el art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso iv), y el art�culo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), deber�n tenerse en cuenta los elementos siguientes:
i) en los casos previstos en el art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso iv):
- la proximidad de otros lugares de producci�n en los que se cultive el material vegetal indicado,
- la producci�n y utilizaci�n comunes de existencias de patatas de siembra,
- los lugares de producci�n en los que se utilicen aguas de superficie para el riego o rociamiento del material vegetal indicado cuando exista o haya existido el riesgo de escorrent�a, o de anegamiento, de aguas superficiales procedentes de un lugar o lugares de producci�n que hayan sido declarados contaminados en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii),
ii) en los casos en que se hayan declarado contaminadas aguas de superficie en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra c), inciso ii):
• la direcci�n y el nivel de flujo del agua declarada contaminada,
• la presencia de solan�ceas silvestres hu�sped.
3. La notificaci�n a la que se refiere el art�culo 6, apartado 2, deber�:
- efectuarse de manera inmediata una vez que la presencia del organismo haya sido confirmada por las pruebas de laboratorio con arreglo a los m�todos expuestos en el anexo II, y deber� recoger, como m�nimo:
b) el tipo (de consumo, de siembra, etc.) y, en su caso, la categor�a de siembra,
• para las tomateras: el nombre de la variedad del lote y, en su caso, la categor�a,
- sin perjuicio de los requisitos de notificaci�n de la sospecha de la presencia del organismo previstos en el art�culo 5, apartado 3:
• la Comunidad Aut�noma en la que se haya confirmado la presencia del organismo, cuando exista un riesgo de contaminaci�n del material vegetal indicado hacia otra u otras Comunidades Aut�nomas, transmitir� inmediatamente a las Comunidades Aut�nomas afectadas la informaci�n necesaria para cumplir el art�culo 6, apartado 3, que incluye:
b) el nombre y la direcci�n del expedidor y del destinatario,
d) el tama�o del lote de patatas o tomates entregado,
e) una copia del pasaporte fitosanitario o, como m�nimo, de su n�mero, cuando sea apropiado o, en su caso, el n�mero de registro del productor o comerciante y una copia del aviso de entrega.
Cuando se suministre dicha informaci�n, la Comunidad Aut�noma informar� de ello inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n.
• la Comunidad Aut�noma en la que se haya confirmado la presencia del organismo, cuando exista el riesgo de contaminaci�n del material vegetal indicado hacia otro u otros Estados Miembros, transmitir� inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y este a su vez, a trav�s del cauce correspondiente a los Estados Miembros afectados la informaci�n necesaria para, cumplir el art�culo 6, apartado 3, que incluye:
Cuando se suministre dicha informaci�n, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n informar� de ello inmediatamente a la Comisi�n.
• cuando exista el riesgo de contaminaci�n del material vegetal indicado procedentes de otro u otros Estados Miembros a ra�z de la correspondiente notificaci�n o notificaciones de los mismos, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n comunicar� la informaci�n recibida a las Comunidades Aut�nomas interesadas para, cumplir el art�culo 6, apartado 3.
4. Cuando hayan finalizado todas las investigaciones, y al objeto de posibilitar la notificaci�n adicional (complementaria), las comunidades aut�nomas facilitar�n, para cada caso:
a) la fecha en la que se confirm� la contaminaci�n;
b) una breve descripci�n de la investigaci�n llevada a cabo para identificar la fuente y posible propagaci�n de la contaminaci�n, incluido el nivel de muestreo efectuado;
c) informaci�n sobre la fuente o fuentes de contaminaci�n determinadas o presuntas;
d) detalles relativos al alcance de la contaminaci�n declarada, incluido el n�mero de lugares de producci�n y, en el caso de las patatas, el n�mero de lotes, con la indicaci�n de la variedad y, en el caso de las patatas de siembra, la categor�a;
e) detalles relativos a la delimitaci�n de la zona, incluido el n�mero de lugares de producci�n no declarados contaminados pero incluidos en la zona;
f) detalles relativos a la designaci�n del agua, incluido el nombre y la ubicaci�n de la masa de agua y el alcance de la prohibici�n de riego/designaci�n;
g) en el caso de cualquier partida o lote de tomateras declarado como contaminado, los certificados prescritos en el art�culo 10, apartado 1, letra a), del Real Decreto 58/2005, de 21 de enero, por el que se adoptan medidas de protecci�n contra la introducci�n y difusi�n en el territorio nacional y de la Comunidad Europea de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales, as� como para la exportaci�n y tr�nsito hacia pa�ses terceros, y el n�mero de pasaporte, de acuerdo con la lista que se recoge en el anexo V, parte A, secci�n I, punto 2.2, del Real Decreto 58/2005, de 21 de enero
h) cualesquiera otros datos que requiera el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n o, en su caso, la Comisi�n relativos al brote o los brotes confirmados.
Anexo V redactado por el art�culo �nico de la O.M. APA/719/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos II a VII del R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al (�B.O.E.� 27 marzo).Vigencia: 1 abril 2007
M�todos oficialmente autorizados para la eliminaci�n de residuos
1. Las disposiciones mencionadas en el art�culo 7, apartado 1, ser�n las siguientes:
- la utilizaci�n como piensos, previo tratamiento t�rmico adecuado, de forma que no haya riesgo alguno de supervivencia del organismo,
- la eliminaci�n en un vertedero de eliminaci�n de residuos autorizado oficialmente en donde no exista ning�n riesgo identificable de escape del organismo al medio ambiente, por ejemplo, a trav�s de filtraci�n a tierras agr�colas ni de contacto con fuentes de agua que puedan utilizarse para el riego de dichas tierras,
- la incineraci�n,
- la transformaci�n industrial mediante entrega directa e inmediata a una planta de transformaci�n dotada de instalaciones de eliminaci�n de residuos autorizadas oficialmente, para las que se establezca la ausencia de riesgos detectables de propagaci�n del organismo, y de un sistema de limpieza y desinfecci�n de los veh�culos de transporte, al menos,
- otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagaci�n del organismo; dichas medidas y su justificaci�n se notificar�n inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y este a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, a la Comisi�n y a los dem�s Estados miembros.
Cualquier residuo restante asociado con las opciones anteriores y derivado de ellas se eliminar� con m�todos autorizados oficialmente de conformidad con el anexo VII de este real decreto.
2. El uso adecuado o la eliminaci�n del material vegetal indicado dispuestos en el art�culo 7, apartado 2, deber�n efectuarse bajo el control de los organismos oficiales responsables interesados, as� como con la oportuna comunicaci�n entre estos organismos para garantizar en todo momento dicho control, y con la aprobaci�n del organismo oficial responsable de la Comunidad Aut�noma donde vayan a envasarse o transformarse las patatas, en lo que se refiere a los vertederos citados en los guiones primero y segundo, y consistir�n en lo siguiente:
i) en el caso de los tub�rculos de patata:
- la utilizaci�n como patatas de consumo destinadas al consumo, envasadas para su distribuci�n y venta directa sin cambio de envase, en un lugar dotado de instalaciones de eliminaci�n de residuos adecuadas. Las patatas destinadas a la siembra s�lo pueden manipularse en el mismo lugar si esto se realiza separadamente o tras la limpieza y desinfecci�n,
- su uso como patatas de consumo para la transformaci�n industrial y destinadas a la entrega directa e inmediata a una planta de transformaci�n dotada de instalaciones de eliminaci�n de residuos adecuadas y de un sistema de limpieza y desinfecci�n de los veh�culos de transporte, al menos,
- alg�n otro tipo de uso o eliminaci�n, siempre que se establezca que no existe ning�n riesgo identificable de propagaci�n del organismo, y previa aprobaci�n de los citados organismos oficiales responsables,
- la destrucci�n,
- cualquier otro uso o eliminaci�n, a condici�n de que se garantice que no existe riesgo identificable de dispersar el organismo, y previa aprobaci�n de los citados organismos oficiales responsables.
3. Los m�todos adecuados para la descontaminaci�n de los objetos a los que se refiere el art�culo 7, apartado 3, consistir�n en una limpieza y, en su caso, una desinfecci�n que permitan descartar todo riesgo identificable de propagaci�n del organismo; estas operaciones se efectuar�n bajo la supervisi�n de los organismos oficiales responsables de las Comunidades Aut�nomas.
4. La serie de medidas mencionadas en el art�culo 7, apartado 4, que deber�n aplicar las Comunidades Aut�nomas dentro de la zona o zonas delimitadas que se hayan establecido en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso iv), y del art�culo 6, apartado 1, letra c), inciso iii), ser�n las siguientes:
4.1 En los casos en que, en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), se hayan declarado contaminados lugares de producci�n, las medidas consistir�n en lo siguiente:
a) en los campos o unidades de producci�n de cultivos protegidos que se hayan declarado contaminados en virtud de esa misma disposici�n:
i) durante al menos los cuatro a�os de cultivo siguientes a la declaraci�n de la contaminaci�n:
- se adoptar�n medidas para eliminar las patatas y tomateras espont�neas as� como otras plantas que puedan ser hu�sped del organismo, incluidas las malas hierbas solan�ceas,
- no se plantar�n:
• tub�rculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata,
• teniendo en cuenta la biolog�a del organismo:
• otras plantas hu�sped,
• otros cultivos para los que exista un riesgo identificado de propagaci�n del organismo,
- en la primera temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente al per�odo indicado en el gui�n anterior, y siempre que se haya comprobado que, durante al menos los dos a�os de vegetaci�n inmediatamente, anteriores a la plantaci�n, el campo estuvo libre de patatas y tomateras espont�neas y de otras plantas hu�sped del organismo, incluidas las malas hierbas solan�ceas:
• en el caso de las patatas, solamente se autorizar� la producci�n de patatas de consumo,
• en el caso de las patatas y los tomates, los tub�rculos de patata cosechados, o las tomateras, seg�n corresponda, ser�n analizados de conformidad con el procedimiento detallado en el anexo II,
- en la temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente a la indicada en el gui�n anterior y tras un ciclo de rotaci�n adecuado, que ser� de un m�nimo de dos a�os si se cultivan patatas de siembra, se efectuar� un examen oficial tal como se dispone el art�culo 3, apartado 1,
ii) durante los cinco a�os de cultivo siguientes al de la declaraci�n de la contaminaci�n:
- se adoptar�n medidas para eliminar las patatas y tomateras espont�neas as� como otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, incluidas las malas hierbas solan�ceas,
- durante los tres primeros a�os, se dejar� y mantendr� el campo, bien en barbecho completo, bien para el cultivo de cereales, con arreglo al riesgo que se haya determinado, bien como pasto permanente, con siega intensa y frecuente o pastoreo intensivo, o bien como pastizal para la producci�n de semillas y, a continuaci�n, en los dos a�os subsiguientes, se plantar�n plantas que no sean hu�sped del organismo para las que no exista ning�n riesgo identificado de supervivencia o propagaci�n de este,
- en la primera temporada de cultivo de patatas o tomates siguiente al per�odo indicado en el gui�n anterior y, siempre que se haya comprobado que, durante al menos los dos a�os de vegetaci�n inmediatamente anteriores a la plantaci�n, el campo estuvo libre de patatas y tomateras espont�neas y de otras plantas hu�sped del organismo, incluidas las malas hierbas solan�ceas:
• en el caso de las patatas, se autorizar� la producci�n de patatas de siembra y de consumo,
• los tub�rculos de patata cosechados, o las tomateras, seg�n corresponda, ser�n analizados de conformidad con el procedimiento detallado en el anexo II;
b) en el resto de los campos del lugar de producci�n contaminado y a condici�n de que los organismos oficiales competentes tengan la certeza de que se ha eliminado adecuadamente el riesgo de plantas de patata y de tomate espont�neas y de cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo, incluidas las malas hierbas solan�ceas:
- durante el a�o de cultivo siguiente al de declaraci�n de contaminaci�n:
- o bien no se plantar�n tub�rculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata, ni cualquier otra planta que pueda contener naturalmente el organismo,
- en el caso de los tub�rculos de patata, se podr� plantar patata de siembra oficialmente certificada, pero s�lo para la producci�n de patata de consumo,
- en el caso de las tomateras, solamente se plantar�n tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE del Consejo, de 8 de mayo de 2000, relativa a las medidas de protecci�n contra la introducci�n en la Comunidad de organismos nocivos para los vegetales o productos vegetales y contra su propagaci�n en el interior de la Comunidad, para la producci�n de fruto,
- durante el segundo a�o de cultivo siguiente al de declaraci�n de contaminaci�n:
- en el caso de las patatas, solamente se plantar�n, para la producci�n de patatas de siembra o de consumo, patatas de siembra certificadas o patatas de siembra analizadas para determinar la inexistencia de podredumbre parda y cultivadas bajo control oficial en lugares de producci�n diferentes de los mencionados en el punto 4.1,
- en el caso de los tomates, solamente se plantar�n tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o, si se han propagado vegetativamente, de tomateras producidas a partir de esas semillas y cultivadas bajo control oficial en lugares de producci�n diferentes de los mencionados en el punto 4.1, para la producci�n de plantas o de fruto,
- durante al menos los tres a�os de cultivo siguientes a la declaraci�n de la contaminaci�n:
- en el caso de las patatas, se plantar�n para la producci�n de patatas de siembra o de consumo exclusivamente patatas de siembra certificadas o patatas de siembra que se hayan cultivado bajo control oficial a partir de patatas de siembra certificadas,
- en el caso de los tomates, solamente se plantar�n tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o tomateras cultivadas bajo control oficial a partir de estas plantas, para la producci�n de plantas o de fruto,
- en cada uno de los a�os de cultivo mencionados en los guiones anteriores, se tomar�n medidas para eliminar las plantas de patata espont�neas y otras plantas que puedan contener naturalmente el organismo, si existen, y se efectuar� una inspecci�n oficial del cultivo en crecimiento en los momentos pertinentes y, en cada campo de patatas, se efectuar�n pruebas oficiales de las patatas cosechadas con arreglo al procedimiento detallado en el anexo II;
c) inmediatamente despu�s de la declaraci�n de contaminaci�n prevista en el art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), y tras el primer a�o de cultivo siguiente:
- toda la maquinaria e instalaciones de almacenamiento del lugar de producci�n que se utilicen en la producci�n de patatas o tomates se limpiar�n y, en su caso, desinfectar�n utilizando m�todos adecuados de la forma que se dispone en el punto 3,
- con el fin de impedir la propagaci�n del organismo, se efectuar�n controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en caso necesario, se prohibir�n los mismos;
d) en el caso de las unidades de producci�n de cultivos protegidos que hayan sido declaradas contaminadas en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso ii), y en las que sea posible una sustituci�n total de los medios de cultivo:
- no se plantar�n tub�rculos, plantas ni semillas propiamente dichas de patata, ni otras plantas que puedan ser hu�sped del organismo, incluidas tomateras y semillas de tomateras, a menos que, por una parte, la unidad de producci�n se haya sometido a medidas oficialmente supervisadas que, teniendo por objeto la eliminaci�n del organismo y la retirada de todo el material vegetal hu�sped, incluyan, como m�nimo, un cambio completo de los medios de cultivo y una limpieza y, en su caso, una desinfecci�n de tales unidades y de todo el equipo y que, por otra parte, los organismos oficiales responsables hayan dado subsiguientemente su autorizaci�n para la producci�n de patatas o tomates,
- adem�s, la producci�n proceder�, en el caso de la patata, de patatas de siembra certificadas o de minitub�rculos o microplantas obtenidos de fuentes analizadas,
- en cuanto a la producci�n de tomates, la producci�n deber� proceder de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o, si se han propagado vegetativamente, de tomateras producidas a partir de estas semillas y cultivadas bajo control oficial,
- con el fin de impedir la propagaci�n del organismo, se efectuar�n controles oficiales de los planes de riego y rociamiento y, en caso necesario, se prohibir�n los mismos.
4.2 Dentro de la zona delimitada, y sin perjuicio de las medidas dispuestas en el punto 4.1, las Comunidades Aut�nomas:
a) inmediatamente despu�s de la declaraci�n de contaminaci�n, garantizar�n que se limpie y desinfecte toda la maquinaria e instalaciones de almacenamiento de la explotaci�n que se hayan utilizado para la producci�n de patatas y tomates, como resulte adecuado y con los m�todos apropiados, seg�n lo dispuesto en el punto 3;
b) inmediatamente y durante al menos tres a�os de cultivo despu�s de la declaraci�n de contaminaci�n:
ba) en los casos en que la delimitaci�n de la zona se haya efectuado en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso iv):
- garantizar�n que sus organismos oficiales responsables supervisen las instalaciones que cultiven, almacenen o manipulen tub�rculos de patata o tomates, as� como aquellas otras instalaciones que utilicen en el marco de un contrato maquinaria para la producci�n de patatas o tomates,
- requerir�n que, para todos los cultivos de patata dentro de la zona delimitada, se planten exclusivamente semillas certificadas o semillas cultivadas bajo control oficial, y se efect�e un an�lisis despu�s de cosechar los cultivos de patatas de siembra en lugares de producci�n determinados como probablemente contaminados seg�n el art�culo 6, apartado 1, letra a), inciso iii),
- exigir�n que se manipulen por separado las existencias de patatas de siembra y de patatas de consumo recolectadas en todas las explotaciones de la zona o, cuando sea adecuado, que se efect�e una desinfecci�n entre la manipulaci�n de las existencias de patatas de siembra y de patatas de consumo,
- exigir�n que, para todos los cultivos de tomate de la zona, solamente se planten tomateras obtenidas de semillas que cumplan los requisitos de la Directiva 2000/29/CE o, si se han propagado vegetativamente, de tomateras producidas a partir de estas semillas y cultivadas bajo control oficial,
- efectuar�n el examen oficial que dispone el art�culo 3, apartado 1;
bb) en los casos en que, en virtud del art�culo 6, apartado 1, letra c), inciso ii), se hayan declarado contaminadas aguas de superficie o en que, de conformidad con el anexo V, punto 2, se hayan incluido dichas aguas entre los factores de la posible propagaci�n del organismo:
- realizar�n un examen anual, en los momentos oportunos, con una toma de muestras de las aguas de superficie y, cuando sea oportuno, de las plantas hu�sped solan�ceas en las fuentes h�dricas pertinentes, as� como an�lisis con arreglo a los m�todos pertinentes establecidos en el anexo II para el material vegetal indicado y para otros casos,
- con el fin de impedir la propagaci�n del organismo, establecer�n controles oficiales de los planes de riego y rociamiento, as� como una prohibici�n del uso de las aguas declaradas contaminadas para el riego y rociamiento del material vegetal indicado y, en su caso, de otras plantas hu�sped. Esta prohibici�n podr� reexaminarse en funci�n de los resultados obtenidos en el examen anual mencionado, y podr�n revocarse las declaraciones cuando los organismos oficiales responsables tengan la certeza de que las aguas superficiales ya no est�n contaminadas. Podr� autorizarse el uso del agua sometida a prohibici�n, bajo control oficial, para el riego y el rociamiento de las plantas hu�sped, cuando se utilicen t�cnicas aprobadas oficialmente que eliminen el organismo y eviten su propagaci�n,
- en los casos en que se hayan contaminado vertidos de residuos l�quidos, establecer�n controles oficiales de la eliminaci�n de los residuos s�lidos o l�quidos procedentes de las instalaciones industriales de transformaci�n o envasado que manipulen el material vegetal indicado;
c) establecer�n, cuando sea pertinente, un programa para la sustituci�n en un plazo adecuado de todas las existencias de patatas de siembra.
Anexo VI redactado por el art�culo �nico de la O.M. APA/719/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos II a VII del R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al (�B.O.E.� 27 marzo).Vigencia: 1 abril 2007
Disposiciones que se deben cumplir para la eliminaci�n de los residuos
Los m�todos de eliminaci�n de residuos autorizados oficialmente mencionados en el anexo VI, punto 1, deber�n cumplir las disposiciones que se indican a continuaci�n con el fin de evitar todo riesgo identificable de propagaci�n del organismo:
i) los residuos de patatas y tomates (incluidas las patatas, mondaduras y tomates descartados) y cualquier otro residuo s�lido asociado con las patatas y los tomates (incluido el suelo, las piedras y otros restos) se eliminar�n de una de las siguientes maneras:
- en un vertedero de eliminaci�n de residuos autorizado oficialmente en donde no exista ning�n riesgo identificable de escape del organismo al medio ambiente, por ejemplo, a trav�s de filtraci�n a tierras agr�colas ni de contacto con fuentes de agua que puedan utilizarse para el riego de dichas tierras. Los residuos se conducir�n directamente al vertedero en unas condiciones de confinamiento que impidan todo riesgo de p�rdida de los mismos,
- mediante incineraci�n,
- a trav�s de otras medidas, siempre que se descarte el posible riesgo de propagaci�n del organismo. Dichas medidas se notificar�n inmediatamente al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y este a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, a la Comisi�n y a los dem�s Estados miembros,
ii) residuos l�quidos: antes de la eliminaci�n, los residuos l�quidos que contengan s�lidos en suspensi�n se someter�n a procesos de filtraci�n o sedimentaci�n para eliminar dichos s�lidos. Estos s�lidos se eliminar�n tal como se establece en el inciso i).
A continuaci�n, los residuos l�quidos:
- se calentar�n a un m�nimo de 60 �C en todo su volumen durante un m�nimo de 30 minutos antes de la eliminaci�n,
- se eliminar�n, previa autorizaci�n oficial y bajo control oficial, de manera que no exista ning�n riesgo identificable de que los residuos puedan entrar en contacto con tierras agr�colas ni fuentes de agua que pudieran utilizarse para la irrigaci�n de tierras agr�colas. Los detalles de estas medidas se notificar�n al Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentaci�n y este a su vez, a trav�s del cauce correspondiente, a los dem�s Estados miembros y a la Comisi�n.
Las opciones descritas en el presente anexo se aplican asimismo a los residuos asociados a la manipulaci�n, la eliminaci�n y el tratamiento de lotes contaminados.
Anexo VII redactado por el art�culo �nico de la O.M. APA/719/2007, de 15 de marzo, por la que se modifican los anexos II a VII del R.D. 1644/1999, de 22 de octubre, sobre el control del organismo nocivo denominado Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al (�B.O.E.� 27 marzo).Vigencia: 1 abril 2007

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