Source: https://www.scribd.com/document/350906188/Guia-Lab-Bio1113
Timestamp: 2018-07-18 16:59:21+00:00

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Guia Lab Bio1113
Uploaded by Cristian Andres Shute Zenteno
Description: guia bio
BIO-1113
Profesor	responsable
Prof.	Carolina	Salazar	R.	Ph	D	(c).
INSTITUTO	DE	BIOLOGÍA
PUCV	2016
NORMAS	DE	SEGURIDAD	DE	LABORATORIO
1.	Observe	atentamente	las	etiquetas	de	los	frascos	de	reactivos	antes	de	usarlos.	Si	es	necesario	léalos	dos	veces	para
asegurarse	de	que	se	usa	el	frasco	adecuado.	Después	de	usarlos,	déjelos	en	su	lugar	correspondiente.	Use	sólo	los	frascos
de	su	mesón.
2.	Los	experimentos	no	autorizados	están	estrictamente	prohibidos.
3.	Con	respecto	a	los	reactivos	químicos	recuerde	que:
a) No	debe	probar	nunca	ningún	compuesto	químico,	ni	solución.
b) No	debe	tocar	nunca	sustancias	químicas	con	las	manos,	a	no	ser	que	se	le	autorice.
c) Si	desea	conocer	el	olor	de	una	sustancia	no	acerque	directamente	la	cara	al	recipiente.	Abanicar	un	poco	de
vapor	hacia	la	nariz,	moviendo	la	mano	sobre	la	superficie	del	mismo.
d) Si	se	vierte	sobre	sí	un	ácido	u	otro	compuesto	químico,	lávese	inmediatamente	con	agua.
4.	Está	prohibido	comer,	beber	o	fumar	en	el	laboratorio.	No	lleve	sus	manos	o	lápiz	a	la	boca.
5.	Prepárese	siempre	para	cualquier	experimento	leyendo	las	instrucciones	de	la	guía	antes	de	ir	al	laboratorio.	Siga	las
instrucciones	teniendo	presente	todas	las	precauciones.
6.	Jamás	devuelva	soluciones	o	reactivos	al	frasco	de	origen.
7.	No	introduzca	ningún	objeto	en	un	frasco	de	reactivo,	excepto	la	pipeta	(con	su	respectiva	punta)	o	cuenta	gotas
cuando	sea	oportuno.
8.	Deje	pasar	bastante	tiempo	para	que	se	enfríe	el	vidrio	caliente,	recuerde	que	éste	tiene	el	mismo	aspecto	que	el	vidrio
9.	Nunca	apunte	la	boca	de	un	tubo	de	ensayo	hacia	Ud.	o	un	compañero	cuando	éste	calentando.
10.	No	vierta	un	líquido	cerca	de	un	mechero	encendido.
11.	En	caso	de	temblores,	aléjese	sin	correr,	pues	la	rotura	de	reactivos	y	sus	mezclas	pueden	liberar	sustancias	tóxicas,
letales,	inflamables	y	explosivas.
12.	En	caso	de	alarma	por	incendio,	mantenga	siempre	la	calma,	abandone	el	laboratorio	sin	correr	por	la	salida	más
13.	Vístase	adecuadamente	para	el	laboratorio.	Use	ropa	cómoda	pero	que	le	cubra	las	piernas	y	el	torso,	los	zapatos
deben	cubrir	los	pies	completamente.	Use	siempre	delantal	blanco,	guantes	y	cabello	tomado	(cuando	corresponda).
CUIDADO	DEL	MICROSCOPIO
El	microscopio	es	un	instrumento	costoso,	por	lo	tanto,	debe	dársele	el	mejor	trato	posible.	Siga	siempre	estas
instrucciones	generales	cada	vez	que	lo	vaya	a	utilizar:
1) Debe	transportarlo	con	ambas	manos:	una	por	debajo	de	la	base	y	la	otra	en	el	brazo	o	columna.
2) Debe	colocarlo	alejado	del	borde	de	la	mesa,	con	el	brazo	hacia	Ud.	Si	el	microscopio	posee	lámpara,	en	lugar	de
espejo,	debe	conectarlo	a	la	red	de	energía	eléctrica,	evitando	jalar	o	mover,	innecesariamente,	el	cable	que	lo	une	al
3) Es	conveniente,	al	trabajar	con	él,	quitar	previamente	de	la	mesa	trabajo,	aquellas	cosas	que	no	sean	absolutamente
4) Evite	los	movimientos	bruscos,	y	sobre	todo,	cambiarlo	de	posición	una	vez	que	haya	comenzado	a	utilizarlo.	Del
mismo	modo,	debe	apagar	la	lámpara	al	dejar	de	ocuparlo.
5) Nunca	limpie	las	lentes	del	microscopio	con	otra	cosa	que	no	sea	papel	para	lentes	o	en	su	defecto,	con	el	tipo	de
paño	que	se	indique.	Las	lentes	del	microscopio	cuestan	tanto	como	las	demás	partes	juntas.
6) Cuando	termine	su	trabajo,	guarde	el	microscopio,	no	sin	antes	colocar	el	objetivo	de	menor	aumento	en	la	posición
de	enfoque	y	bajar	la	platina.
INSTRUCCIONES	GENERALES
1. La	asistencia	es	obligatoria.
2. No	se	admitirán	alumnos	atrasados.
2.	Los	alumnos	deben	presentarse	al	trabajo	práctico	con	delantal	blanco,	práctico	a	realizar	impreso	y	cuaderno	de
apuntes,	guantes	y	cabello	tomado	(cuando	corresponda).
3.	Celulares	apagados.
4.	El	alumno	será	responsable	del	material	que	se	le	entregue.	Es	obligación	dejar	el	material,	mesón	y	frascos	de	reactivos
en	perfecto	orden	y	limpieza.	Nadie	podrá	retirarse	del	laboratorio	sin	haber	cumplido	esta	norma.
5.	Debe	mantenerse	la	disciplina	para	evitar	accidentes	y	aprovechar	al	máximo	el	tiempo	y	equipo	disponible.
Comportamiento	adecuado	y	respetuoso	con	docentes,	ayudantes	y	compañeros.
6.	El	conocimiento	de	la	teoría	correspondiente	a	cada	trabajo	práctico	es	imprescindible.	Deberá	estudiar	sus	guías	con
anterioridad	a	la	clase	y	llegar	preparado	para	cada	sesión	de	laboratorio.
8.	En	caso	de	dudas	consulte	siempre	al	PROFESOR	O	AYUDANTE.
¡RECUERDE	QUE	EL	LABORATORIO	ES	UN	LUGAR	DE	TRABAJO!
QUIZ	(al	comienzo	de	cada	clase):	20%
PRUEBA	I:	40%
PRUEBA	II:	30%
Tareas	y	presentaciones:	10%
No	se	eliminan	notas	de	Quiz.	Si	ha	faltado	a	un	laboratorio,	se	promediaran	las	notas	restantes	siempre	y	cuando	esté
debidamente	justificado.	Si	ha	faltado	a	más	de	un	laboratorio	debe	tener	siempre	su	inasistencia	justificada,	de	lo
contrario	se	evalúa	con	nota	mínima	(1.0).
Asistencia	obligatoria:	80%	sin	necesidad	de	justificar	el	20%.	Esto	no	se	aplica	a	las	2	Evaluaciones	de	Contenido,	las
cuales	deberán	ser	debidamente	justificadas	en	caso	de	ausencia.
*Solo	se	permitirá	un	atraso	de	máximo	5	minutos,	después	de	este	tiempo	quedara	fuera	del	práctico.
*La	persona	que	no	realice	a	un	Quiz	tendrá	nota	mínima	(1.0).
Evaluación	Recuperativa:	En	caso	de	inasistencia	a	alguna	evaluación	se	programa	una	prueba	recuperativa.	La	prueba
recuperativa	al	final	del	semestre	es	SOLO	PARA	LOS	ALUMNOS	DEBIDAMENTE	JUSTIFICADOS	Y	ABARCA	TODOS	LOS
CONTENIDOS	VISTOS	EN	EL	SEMESTRE.
Ponderación	final	de	Laboratorio:	20%.
HORARIO	CLASES:
Prof.	Carolina	Salazar	R.	Ph	D	(c)
Martes:	Grupo	Nº1B	y	3B	Claves	(1-4),	Comienzo	08:30	PM.	Sala	CU	BIO	103.
Jueves:	Grupo	Nº1A	y	3A	Claves	(7-10),	Comienzo	14:00	PM.	Sala	CU	BIO	104.
Viernes:	Grupo	Nº2A	y	2B	Claves	(1-4),	Comienzo	08:30	AM.	Sala	CU	BIO	104.
CRONOGRAMA	LABORATORIO	BIOLOGIA	CELULAR	BIO-328	1ºSEMESTRE	2016	SESIÓN	TEMAS	FECHA	GRUPOS	21/03/17	1B	23/03/17	1A	Extracción	de	DNA	y	24/03/17	2A	LAB1	Electroforesis	en	Geles	de	Agarosa.	28/03/17	3B	30/03/17	3A	31/03/17	2B	04/04/17	1B	06/04/17	1A	07/04/17	2A	LAB2	Extracción	y	Cuantificación	de	Proteínas	25/04/17	3B	27/04/17	3A	28/04/17	2B	SUSPENCIÓN	PRÁCTICOS	SEMANA	SANTA	10	al	14	de	abril	SEMANA	NOVATA	17	al	21	de	abril	02/05/17	1B	04/05/17	1A	05/05/17	2A	LAB3	Electroforesis	SDS-PAGE	09/05/17	3B	11/05/17	3A	12/05/17	2B	16/05/17	1B	y	3B	PRUEBA	I	18/05/17	1A	y	3A	19/05/17	2A	y	2B	23/05/17	1B	25/05/17	1A	26/05/17	2A	LAB4	Microscopía.	.	Forma	y	Tamaño	celular	30/05/17	3B	01/06/17	3A	02/06/17	2B	06/06/17	1B	08/06/17	1A	09/06/17	2A	LAB5	Inmunofluorescencia	13/06/17	3B	15/06/17	3A	16/06/17	2B	20/06/17	1B	y	3B	PRUEBA	II	22/06/17	1A	Y	3A	23/06/17	2A	y	2B	Revisiones	y	Correcciones	29	y	30	Junio	TODOS	*EL	CRONOGRAMA	PUEDE	ESTAR	SUJETO	A	CAMBIOS.
A	continuación	debe	romperse	también	la	membrana	nuclear	para	dejar	libre	el	ADN. Por	último	hay	que	proteger	el	ADN	de	enzimas	que	puedan	degradarlo	y	para	aislarlo	hay	que	hacer	que	precipite	con	alcohol.Agua	destilada	.Palillos	.	1.	• Conocer	los	fundamentos	de	la	separación	de	Ácidos	nucleicos	mediante	la	técnica	de	electroforesis	en	geles	de	agarosa.	El	ácido	desoxirribonucleico	(ADN)	es	un	polímero	de	diferentes	ácidos	nucleicos	que	forma	parte	de	todas	las	células.	pasar	el	plátano	a	un	vaso	precipitado	a	través	de	un	colador	y/o	una	gaza.	de	acuerdo	al	tipo	de	muestra.	INTRODUCCIÓN	Los	ácidos	nucleicos	son	moléculas	constituidas	por	C.	6. Una	vez	molido.	se	componen	de	un	pequeño	grupo	de	unidades	monoméricas	denominadas	nucleótidos.	. Posteriormente.Gotario	.	pero	cuando	se	encuentra	en	alcohol	se	desenrolla	y	precipita	en	la	interfase	entre	el	alcohol	y	el	agua.	contiene	la	información	genética	usada	en	el	desarrollo	y	el	funcionamiento	de	los	organismos	vivos	conocidos	y	de	algunos	virus.	N	y	P.	unidos	mediante	enlaces	covalentes	fosfodiester. Inclinar	el	tubo	de	ensayo	en	45°	y	agregar	etanol	90%	previamente	enfriado	cuidadosamente.	y	es	responsable	de	su	transmisión	hereditaria.	Cuidado	de	no	formar	burbujas.	además	de	permitirnos	ver	el	ADN.	• Observar	la	estructura	de	ADN	visible	desde	una	muestra	de	plátano.Mortero	.	H.	los	cuales	son	dejados	en	la	solución	acuosa.	8.	agregar	4	gotas	de	detergente	y	revolver	suavemente	para	homogenizar	el	detergente	con	el	plátano.	3.	el	alcohol	separa	el	ADN	de	otros	componentes	celulares.	No	agregar	más	de	la	mitad	de	la	muestra	de	plátano.	• Aprender	la	preparación	de	los	geles	de	agarosa.	la	cual	determinará	el	Genotipo	de	todo	individuo.Etanol	90%	(frio)	.Gradillas	.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	I	MATERIALES.Tubos	Falcon	15ml	y	50ml	. Cortar	el	plátano	por	la	mitad	y	molerlo	con	el	mortero	agregando	50ml	de	agua	destilada.	O.	Todas	las	células	portan	información	genética.	junto	con	el	equipamiento	requerido	para	la	corrida	electroforética.Pinzas	metálicas	. Traspasar	la	mezcla	de	plátano	hacia	un	tubo	de	15ml	(no	completar	más	de	la	mitad	del	tubo).	El	ADN	es	soluble	en	agua.	1. Ya	homogenizado	con	el	detergente.	Es	por	eso	que	en	este	práctico	realizaremos	la	extracción	simple	de	ADN	desde	una	muestra	de	plátano. En	primer	lugar	tienen	que	romperse	la	pared	celular	y	la	membrana	plasmática	para	acceder	al	núcleo	de	la	célula.Vasos	precipitados	. Añadir	a	la	mezcla	cloruro	de	sodio	0.	dejarlo	reposar	5	minutos.	2.	así	como	la	preparación	de	muestras	y	la	interpretación	de	resultados.	La	extracción	de	ADN	requiere	una	serie	de	etapas	básicas.	que	se	relacionan	con	la	conservación	del	material	genético	de	los	organismos.	3.	7.	2.9%	.Gaza	y	colador	.9%.	Conocer	la	estructura	y	función	la	macromolécula	de	ADN	ha	permitido	grandes	avances	científicos	en	los	últimos	años. Agregar	una	cucharada	de	jugo	de	piña	a	la	mezcla	de	plátano	en	el	tubo	de	ensayo.Detergente	(lavaloza)	.Plátano	.Espátula	.Jugo	de	Piña	.	es	el	componente	químico	primario	de	los	cromosomas	y	el	material	del	que	los	genes	están	formados.Cloruro	de	Sodio	0.	.	4.	5. GUÍA	LABORATORIO	Nº1:	EXTRACCIÓN	DE	ADN	y	ELECTROFORESIS	EN	GELES	DE	AGAROSA	OBJETIVOS	• Conocer	el	protocolo	de	extracción	de	ADN.Hielo	METODOLOGÍA.	• Determinar	con	criterios	bioquímicos	las	condiciones	electroforéticas.
entre	otros	factores.	El	gel	forma	una	matriz	cuya	densidad	está	determinada	por	la	concentración	de	agarosa.	Los	más	comunes	son:	bromuro	de	etidio.	dependiendo.	La	agarosa	es	más	comúnmente	utilizada	puesto	que	no	es	tóxica.	los	grupos	fosfato	confieren	carga	neta	negativa	a	estas	moléculas. 9.	los	métodos	electroforéticos	son	de	alta	sensibilidad. Esperar	a	que	aparezca	la	medusa	de	ADN	y	rescatarla	con	un	palillo.	las	moléculas	de	mayor	tamaño	serán	retardadas	respecto	a	las	de	menor	tamaño.	en	el	que	se	separan	biomoléculas.	dependiendo	en	combinación	de	su	carga.	Dado	que	la	carga	del	ADN	está	dada	por	los	grupos	fosfato	y	que	por	cada	par	de	bases	hay	dos	grupos	fosfato.	(a) Tamaño	del	ADN:	Las	moléculas	de	ADN	lineal	de	doble	hebra	migran	a	través	del	gel	a	velocidades	que	son	inversamente	proporcionales	al	log	del	número	de	pares	de	bases.	La	electroforesis.	En	la	electroforesis	en	geles	de	agarosa.	y	recientemente	SYBER	SAFE.	el	ADN	migra	hacia	el	ánodo.-	Ilustración	de	las	fuerzas	que	se	ejercen	sobre	una	partícula	cargadas	que	determina	su	movilidad	en	la	electroforesis.	Syber	Green.	.	la	relación	carga/masa	es	la	misma	para	moléculas	de	ADN	de	diferente	tamaño.	Pero.	Gel	Red.	y	sirven	como	método	de	separación	de	mezclas	complejas	de	ácidos	nucleicos.	Figura	1.	peso	molecular	y	estructura	tridimensional.	La	solución	fundida	es	puesta	en	un	molde	donde	gelifica.	Los	geles	de	agarosa	se	preparan	fundiendo	agarosa	en	presencia	del	buffer	adecuado	hasta	que	se	logre	una	solución	transparente.	esto	se	efectúa	mediante	la	separación	por	electroforesis	en	geles	de	agarosa	o	de	poliacrilamida.	debido	a	la	fricción	que	impone	la	malla	del	gel	de	agarosa.	A	escala	analítica.	Electroforesis	de	Ácido	nucleicos:	Una	vez	que	se	ha	realizado	la	extracción	de	ADN	es	necesario	revisar	la	integridad	y	la	cantidad	del	mismo.	de	su	carga	bajo	la	acción	de	un	campo	eléctrico.	las	moléculas	de	ADN	lineales	migran	según	su	tamaño	y	se	pueden	visualizar	mediante	tinción.	algunos	de	los	cuales	son	detallados	a	continuación.	poder	de	resolución	y	versatilidad.	La	velocidad	de	migración	está	determinada	por	varios	parámetros.	(b) Concentración	de	la	agarosa:	Un	fragmento	de	ADN	lineal	migra	a	diferentes	velocidades	dentro	de	geles	con	diferentes	concentraciones	de	agarosa.	nitrato	de	plata.	Los	geles	son	teñidos	con	diferentes	colorantes	para	visualizar	el	ADN.	Cuando	se	aplica	un	campo	eléctrico	a	través	del	gel.	estas	partículas	migran	hacia	el	cátodo	o	ánodo	(electrodos	+	y	-).	proteínas	y	otras	biomoléculas.	La	tabla	siguiente	muestra	concentraciones	de	agarosa	usadas	para	resolver	fragmentos	de	ADN	en	los	intervalos	indicados.	etc.	A	los	valores	de	pH	en	los	cuales	usualmente	se	trabaja	con	ácidos	nucleicos.	es	la	migración	de	solutos	iónicos	bajo	la	influencia	de	un	campo	eléctrico.	Syber	Gold.	ELECTROFORESIS	EN	GELES	DE	AGAROSA	La	electroforesis	es	un	método	analítico–semipreparativo.
(e) Otros	factores	Otros	factores	que	influyen	son:	la	dirección	del	campo	eléctrico.	EDTA	0.	Syber	green.Buffer	de	corrida	TBE	1X	.	5ª	Edición.	10.0)	20	Ml.	Aires. (c) Conformación	del	ADN	El	ADN	circular	cerrado	de	doble	hebra	superenrollado	(forma	I).	§ De	Robertis	E.5%	w/v	.	2011.	Ediciones	Omega	S.	la	velocidad	de	migración	de	los	fragmentos	lineales	es	proporcional	al	voltaje	aplicado.	2000.Solución	para	teñir	ADN	.5	M	(pH	8.	si	es	mayor	hacer	los	cálculos	conservando	la	proporción	de	la	concentración	del	gel).	(d) Corriente	aplicada	A	bajo	voltaje.	el	circular	relajado	con	un	corte	en	una	de	las	hebras	(forma	II)	y	la	forma	lineal	(forma	III)	que	tengan	idéntico	peso	molecular	y	misma	secuencia	van	a	migrar	a	distinta	velocidad	en	los	geles	de	agarosa. Colocar	20	mL	de	TBE	en	un	vaso	de	precipitado	de	100	mL	(para	un	volumen	de	gel	de	20	mL.	El	Ateneo. Mezclar.	Ácido	Bórico	27. Verter	la	solución	en	una	canastilla	para	electroforesis.	3.).-	Preparación	de	los	geles	de	agarosa	1.	Ciudad	de	México.	Sin	embargo	a	medida	que	la	fuerza	del	campo	eléctrico	aumenta.	Ed.-	Muestras	de	ADN	. Colocar	la	canastilla	adentro	de	la	cámara	de	electroforesis.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	II	MATERIALES	.	&	Ponzio	R.	2010.	.	11.	P200	y	P10	.Juego	de	micropipetas	P1000. Visualizar	el	gel	en	el	transiluminador.	&	Lewis	J.	METODOLOGÍA	1.Solución	de	Agarosa	0.	9.Tubos	Eppendorf	de	1.	4. Colocar	el	formador	de	pozos	(peine)	en	la	canastilla.	. Calentar	hasta	fundir	completamente.Puntas	(10.	pero	también	están	influidas	por	otros	factores	como	la	corriente	eléctrica	aplicada.5µL	de	reactivo	para	teñir	ADN	(GelRed.-	Marcador	de	Peso	Molecular	(100pb)	.-	Fuente	de	poder.	México.	5. Agregar	buffer	de	corrida	(TBE	1X).	Bs..	Las	movilidades	relativas	de	las	tres	formas	dependen	primariamente	de	la	concentración	de	agarosa.	la	movilidad	de	los	fragmentos	de	ADN	de	alto	peso	molecular	se	incrementa	menos.-	Transiluminador	.	12.	6.	Biología	Molecular	de	la	Célula.	2. Colocar	las	muestras	dentro	de	los	pozos.	la	fuerza	iónica	del	buffer	y	de	la	cantidad	del	colorante	presente	(fundamentalmente	en	el	caso	de	la	forma	I).	G.	4ª	Edición.5	mL.	Biochemistry.	8.	Saunders	College	Publishing.	Bray	D.	Rojo	Texas.	13.	Soluciones:	TBE:	Prepare	una	solución	madre	5x	en	1	litro	de	H2O. Adicionar	0.	200	y	1000	µL)	.	McGraw-Hill.	BIBLIOGRAFÍA	§ Alberts	B.	Hib	J.	Tris	base	54	g.-	Agua	desionizada	.	A.	14.	Biología	Celular	y	Molecular.	Barcelona.	7.5	g.	Por	lo	tanto	el	intervalo	efectivo	de	separación	en	los	geles	de	agarosa	disminuye	a	medida	que	el	voltaje	es	incrementado.	la	temperatura	y	la	composición	del	buffer	de	electroforesis.	la	composición	de	bases	de	los	fragmentos	a	analizar..	Biología	Celular	y	Molecular:	conceptos	y	experimentos.	§ Karp. Agregar	150	mg	de	agarosa. Llevar	a	cabo	la	electroforesis	a	100	V	x	30	min.	§ Campell	MK.	1995.	Second	edition. Preparar	las	muestras	a	analizar	(con	buffer	de	carga.	. Dejar	gelificar	(cubrir	el	gel	con	papel	aluminio).	no	más	de	10	µL	en	total).-	Cámara	electroforética.	etc.
transporte.	Estos	métodos	producen	la	rotura	de	las	membranas	celulares.	Extracción	de	Proteínas	Animales.	INTRODUCCIÓN	Las	proteínas	son	macromoléculas	de	máxima	importancia	morfo-fisiológica.	Dependiendo	del	tipo	de	tejido	(animal	o	vegetal.	enzimática.	reactividad	y	grupos	funcionales	propios	y	únicos)	les	confiere	a	las	proteínas	una	gama	amplia	de	funciones	(estructural.	La	posterior	centrifugación	permite	eliminar	restos	celulares.	pueden	adoptar	espontáneamente	estructura	secundaria	(α-hélice	y	hoja-β)	luego.	Este	proceso	se	llama	homogenización.	causando	su	hinchamiento	y	rotura.	Las	proteínas	en	la	célula	pueden	localizarse	en	un	organelo.	originalmente	sintetizadas	como	una	cadena	lineal	de	aminoácidos.	suavemente.	defensa.	La	rotura	se	produce	al	someter	las	células	a	un	cambio	brusco	de	temperatura.	por	ende	si	el	DNA	es	la	macromolécula	que	guarda	la	información	de	la	estructura	y	funcionamiento	del	organismo.	Esto	se	consigue	homogenizando	el	tejido	empleando	procedimientos	mecánicos	suaves.	laxo	o	fibroso)	se	utilizan	técnicas	distintas	para	homogenizar	y	se	asisten	agregando	un	tampón	de	lisis.	Las	proteínas	vienen	codificadas	en	genes	dentro	del	DNA.	dentro	de	los	que	se	encuentran:	shock	osmótico.	Lisis	celular.	mortero	(fricción)	y	sonicación.	metabólica.	Según	las	características	de	las	proteínas	es	posibles	solubilizarlas. GUÍA	DE	LABORATORIO	Nº2:	EXTRACCION	Y	CUANTIFICACION	DE	PROTEINAS	OBJETIVOS	• Comprender	las	técnicas	para	la	extracción	de	proteínas	desde	distintos	tejidos	y	fluidos.	Entre	estos	métodos	se	encuentran	la	homogenización	(hacer	pasar	las	células	entre	un	tubo	y	un	pistón	de	vidrio	que	ajustan	casi	totalmente).	y	romperlas.	inhibidores	de	proteasas	(enzimas	que	degradan	proteínas)	y	algún	detergente	para	ayudar	a	disgregar	las	membranas	celulares.	Tanto	la	composición	aminoacídica	como	su	disposición	en	el	espacio.	Las	distintas	combinaciones	de	20	aminoácidos	(cada	uno	con	propiedades	ácido-base.	Las	proteínas.	separarlas	y	purificarlas	mediante	diversos	métodos.	Éste	es	una	solución	que	tampona	a	pH	fisiológico.	Para	obtener	las	proteínas	desde	un	tejido	es	necesario	disgregarlo	en	células	individuales.	.	conformadas	por	hetero-polímeros	de	aminoácidos.	pero	no	es	suficiente	para	células	vegetales	o	bacterias.	moler	en	un	mortero	y	la	sonicación	(someter	las	células	a	vibraciones	de	ultrasonido)	Congelación-descongelación.	el	complejo	multiproteico	o	la	estructura	subcelular	se	encuentre	en	condiciones	que	permitan	su	aislamiento.	El	primer	paso	en	la	purificación	de	la	mayoría	de	las	proteínas	y	estructuras	subcelulares	es	la	rotura	de	los	tejidos	o	de	las	células	para	obtener	un	“lisado”	celular	en	el	que	la	proteína.	Conforman.	Válido	para	células	sin	pared	celular	como	las	células	de	tejidos	animales.	Consiste	en	suspender	las	células	en	una	solución	hipotónica	(más	diluida	que	el	interior	celular).	Debido	a	la	diferencia	osmótica	el	agua	difunde	al	interior	de	la	célula.	contiene	sales	en	concentración	adecuada.	las	proteínas	son	sus	productos	efectores.	• Comprender	los	distintos	métodos	que	existen	para	cuantificar	las	proteínas.	dado	por	la	estructura	tridimensional.	congelando	primero	a	-196	ºC	(con	nitrógeno	líquido)	y	pasándolas	rápidamente	a	temperatura	ambiente	(25°C).	El	rol	del	buffer	de	lisis	es	entonces	recuperar	proteínas	cuidando	de	que	mantengan	su	integridad	estructural	y	funcional.	en	resumidas	cuentas	“la	mano	de	obra”	de	todo	lo	que	realiza	el	organismo.	son	claves	en	la	función	que	cumplen.	señalización).	Destrucción	mecánica.	en	el	citoplasma.	por	plegamiento	adoptan	estructuras	terciarias	y	cuaternarias.	en	la	membrana	o	asociada	a	otras	moléculas.	con	lo	que	se	libera	el	contenido	celular.
durante	el	proceso	de	rotura.	Agitar	muestra	en	Vortex	a	máxima	potencia	durante	2	minutos.	NaCl	0.	A	la	hora	de	centrifugar	hay	que	tener	en	cuenta	que	la	centrífuga	sea	refrigerada.	3. Rotule	el	tubo	y	déjelo	en	la	cubeta	de	hielo.000	rpm	durante	15	minutos	a	4ºC.Tras	la	rotura	o	bien.	6.	mientras	genera	saliva	“raspe”	con	fuerza.	la	fase	soluble	(con	o	sin	detergente)	constituye	el	extracto	crudo	donde	se	encuentra	la	proteína	de	interés	objeto	de	la	purificación.	4.	Almacenar	en	Hielo.	Para	evitar	o	minimizar	estos	factores	la	manipulación	de	las	proteínas	durante	el	proceso	de	purificación	suele	llevarse	a	cabo	en	disoluciones	tamponadas.	Nota:	Si	no	produce	mucha	saliva.	soluciones	acuosas	de	tampones	específicos	para	proteínas	solubles	o	bien	que	contengan	además	detergentes	si	se	pretende	purificar	proteínas	asociadas	a	membranas.	2.	Agitar	el	tubo	previamente	puesto	en	hielo	durante	20	segundos.	7.	para	el	diagnóstico	de	enfermedades.5ml	y	falcon	15ml)	. Obtención	de	muestra	biológica	1.	tomar	un	poco	de	agua.	enjuagar	vigorosamente	durante	30	segundos	y	botar	con	cuidado	el	agua	en	el	tubo	de	15mL.Cotones	.Piscetas	con	agua	destilada	.	se	utilizan	tampones	de	extracción	para	solubilizar	las	proteínas.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	I	MATERIALES	.	que	contiene	las	proteínas	solubles.	con	esto	se	desprenderán	células	de	este	tejido	(mucosa	bucal).	El	resultado	de	todos	estos	tratamientos	es	un	lisado	u	homogenizado	que	contiene	una	mezcla	de	enzimas.	Esta	preparación	se	somete	a	centrifugación	(10.	2.Puntas	10/200/1000	ul	.	Agregar	1mL	de	Buffer	de	Lisis	(Tris	0.	temperaturas	extremas	y	la	acción	de	las	proteasas	(enzimas	que	hidrolizan	los	enlaces	peptídicos)	son	los	principales	factores	que	pueden	desnaturalizar	las	proteínas.	cuando	se	quiere	conocer	la	actividad	específica	de	una	preparación	enzimática.	así	como	para	otros	muchos	propósitos.1M.	a	bajas	temperaturas	(4°C)	y	se	procura	que	el	proceso	sea	lo	más	corto	posible.	las	paredes	bucales.Juego	micropipetas	.	si	se	requiere.	En	cualquier	caso.Timer	.	CUANTIFICACIÓN	DE	PROTEÍNAS.000-15.	II.	.Buffer	de	lisis	.	membranas	y	células	rotas.02%).Hielo	.	Una	vez	que	la	proteína	se	ha	extraído	de	su	entorno	natural	está	expuesta	a	muchos	agentes	que	pueden	dañarla.	balancear	los	tubos	y	asegurarse	siempre	que	los	rotores	estén	fijos.	además	en	ocasiones	es	necesario	añadir	el	tampón	de	extracción	agentes	protectores	de	grupos	funcionales	específicos	de	la	proteína	o	bien	inhibidores	de	proteasas.Guantes	.Vasos	plásticos	(enjuague)	.	En	el	tubo	de	15ml	depositar	aproximadamente	5mL	de	Saliva.	tomar	750μL	de	saliva	y	depositarlos	en	el	tubo	de	microcentrífuga	de	2mL.	Rescatar	sobrenadante	en	un	nuevo	tubo	de	microcentrífuga	teniendo	sumo	cuidado	en	no	tomar	nada	del	precipitado	(debris	celular). Extracción	de	proteínas	1.Gradillas	(para	tubos	eppendorf	1.Parafilm	.	Los	cambios	bruscos	de	pH.	Pueden	utilizarse	como	tales.02M.Mortero	.	Con	la	ayuda	de	una	micropipeta.Microcentrifuga	METODOLOGÍA	I.	Tritón	X-100	0.	Determinar	la	concentración	de	proteínas	en	una	muestra	biológica	es	una	técnica	de	rutina	básica	cuando	se	aborda	un	esquema	de	purificación	de	una	proteína	concreta.5ml	.Papel	absorbente	.Tubos	falcon	15ml	.	Métodos	para	la	cuantificación	de	proteínas:	ventajas	e	inconvenientes.	del	precipitado	que	además	de	restos	celulares	también	contienen	proteínas	asociadas	a	membranas	y	que	para	solubilizarlas	requiere	un	tratamiento	adicional	con	detergentes.Vortex	.Tubos	eppendorf	1.	ácidos	y	bases	fuertes.	el	sobrenadante.	5.000	rpm)	para	eliminar	los	restos	celulares	y	separar.	Centrifugar	a	13.	usando	su	lengua.Lápiz	marcador	.
La	intensidad	de	coloración	es	directamente	proporcional	a	la	cantidad	de	proteínas	(enlaces	peptídicos)	y	la	reacción	es	bastante	específica.	Método	de	Biuret	2+ Se	basa	en	la	formación	de	un	complejo	coloreado	entre	el	Cu y	los	grupos	NH	de	los	enlaces	peptídicos	en	medio	básico.	Entre	las	sustancias	que	interfieren	están	los	detergentes	y	las	soluciones	básicas.	El	colorante.	Este	método	es	sensible	(1-15	μg).	Comassie	Blue	G-250	(también	Serva	Blue)	a	las	proteínas.	existe	en	dos	formas	una	azul	y	otra	naranja.	Las	proteínas	se	unen	a	la	forma	azul	para	formar	un	complejo	proteína-colorante	con	un	coeficiente	de	extinción	mayor	que	el	colorante	libre.	Muchos	de	estos	métodos	se	basan	en:	a)	la	propiedad	intrínseca	de	las	proteínas	para	absorber	luz	en	el	UV.	barato	y	pocas	sustancias	interfieren	en	su	determinación.	de	manera	que	pocas	sustancias	interfieren.	b)	para	la	formación	de	derivados	químicos.	o	c)	la	capacidad	que	tienen	las	proteínas	de	unir	ciertos	colorantes.Existen	diferentes	métodos	para	la	cuantificación	de	proteínas.	las	principales	se	recogen	en	la	siguiente	Tabla.	rápido.	2+ 1Cu se	acompleja	con	4	NH.	Método	de	Bradford	Se	basa	en	la	unión	de	un	colorante.	simple.	.	Cada	uno	de	estos	métodos	tiene	sus	ventajas	e	inconvenientes.	en	solución	ácida.	La	sensibilidad	del	método	es	muy	baja	y	sólo	se	recomienda	para	la	cuantificación	de	proteínas	en	preparados	muy	concentrados	(por	ejemplo	en	suero).
5ml	y	falcon	15ml	.	rápido.Papel	absorbente	.Cubetas	(espectrofotómetro)	.	una	serie	de	patrones	en	concentración	creciente.Juego	micropipetas	.	.	Da	positiva	esta	reacción	en	todos	los	compuestos	que	tengan	dos	o	más	enlaces	peptídicos	consecutivos	en	sus	moléculas.	•	Se	preparan	100	μl	de	cada	dilución	de	acuerdo	a	la	siguiente	tabla.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	II	MATERIALES	.	es	decir.	•	Se	construye	una	regresión	lineal	graficando	Absorbancia	v/s	Concentración	de	BSA.Hielo	.Guantes	.BSA	.Tubos	falcon	15ml	.	Para	conferir	calidad	analítica	a	la	cuantificación	lo	que	se	realiza	es	una	curva	estándar.	El	resultado	es	una	recta.	una	especie	de	concentración	conocida.Método	de	BCA	1+ El	ácido	bicinconínico.Tubos	eppendorf	1.	cuya	ecuación	sigue	la	Ley	de	Lambert-Beer.Parafilm	.	se	homogeniza	la	solución	y	se	deja	reaccionar	por	3	minutos.Timer	.	muy	sensible.Gradillas	(para	tubos	eppendorf	1.	cada	cual	con	una	absorbancia	que	debiese	ser	igualmente	creciente.	y	que	muestra	una	gran	tolerancia	a	compuestos	que	afectan	a	otros	métodos.Reactivo	de	Bradford	.Puntas	10/200/1000	ul	.	Este	reactivo	forma	la	base	de	un	método	analítico	capaz	de	monitorizar	el	ion	cuproso	producido	en	una	2+ reacción	entre	las	proteínas	con	Cu en	medio	alcalino	(reacción	de	Biuret).	•	Se	mide	la	absorbancia	de	cada	cubeta	a	595	nm.	La	estabilidad	del	reactivo	y	el	cromóforo	proporciona	un	método	para	la	cuantificación	de	proteínas	que	es	sencillo.5ml	.	es	un	compuesto	capaz	de	formar	un	complejo	púrpura	intenso	con	iones	Cu en	medio	alcalino.Piscetas	con	agua	destilada	.	Para	cuantificar:	Para	correlacionar	la	señal	de	absorbancia	con	la	concentración	debemos	tener	una	referencia.	•	Se	agregan	1000	μl	de	reactivo	de	Bradford	a	cada	cubeta. Construcción	de	la	curva	de	calibrado	con	BSA.	patrón	o	estándar.	•	Se	transfieren	las	soluciones	a	cubetas	espectrofotométricas.	•	El	stock	de	BSA	utilizado	estará	a	1	μg/μl.	sal	sódica.	•	Se	sellan	las	cubetas	con	parafilm.Microcentrifuga	.Vortex	METODOLOGÍA	1.
BIBLIOGRAFÍA	• Abbas	K.	4º	Edición.	2.	pero	experimentalmente	siempre	hay	errores	aleatorios	que	resultan	en	que	la	recta	no	pase	por	el	origen	como	debiera.	• Kazanietz	M.	Facultad	de	Biología	Universidad	de	La	Habana.	5..	“Signal	Transduction”.7mL	agregar	795μL	de	agua	destilada.	Universidad	Nacional	de	Quilmes-Argentina.	ü Según	la	Ley	de	Lambert-Beer	no	debiese	existir	un	intercepto	“b”.	Biochemistry.. Finalmente	agregar	200μL	de	reactivo	de	Bradford.	2008.	&	Pober	J.	2000.	Second	edition.	Tomo	2.	España..	Ed.	• Kurjan	J.	3.	Madrid-España..	• Lodish	H.	Una	buena	recta	debiese	tener	el	intercepto	lo	más	cercano	a	cero.	Díaz	J.	&	Taylor	B. Luego	agregar	5μL	de	sus	proteínas	previamente	centrifugadas.	Berk	A.	• Albert	B.	Ed.	• Chávez	M.	&	Delfín	J.	..	3.	1993.	Zipursky	L.	“Biología	Celular	y	Molecular”..	Lichtman	A.	&	Darnerll	J.	Cuantificación	de	proteínas	por	Método	de	Bradford	1.	2008.	Temas	de	enzimología. Agregar	el	contenido	del	tubo	a	una	cubeta	espectrofotométrica	y	luego	medir	absorbancia	en	espectrofotómetro	a	595nm.	sabiendo	que:	Ud.	Editorial	Médica	Panamericana.	“Biología	Molecular	de	la	Célula.	Saunders	College	Publishing.	Barcelona. En	un	nuevo	tubo	de	microcentrifuga	de	1.	Bray	D.	Academic	Press	Inc.	4. Incubar	el	tubo	durante	10	minutos	a	temperatura	ambiente.	McGraw-Hill- Interamericana.	Matsudaira	P.Y.	Farmacología	Molecular:	Receptores.	Pérez	U.	“y”	es	la	Absorbancia.2.	&	Lewis	J.A.	obtiene	una	recta	con	su	ecuación	y	=	m	x	+	b	“m”.	la	pendiente	es	ε	x	l	“x”	es	[c]..	Madrid.	1995..	N.	• Campell	M..	Ediciones	Omega	S.	1990. Determinación	de	la	concentración	de	proteína	total	en	la	muestra	Calcule	la	concentración	de	proteína	total	interpolando	en	la	curva.	transducción	de	señales	y	activación	de	genes.	Baltimore	D.	Esto	significa	tomar	la	absorbancia	que	obtuvo	y	ocupar	la	ecuación	de	la	recta.	Inmunología	Celular	y	Molecular.	2009.
GUÍA	DE	LABORATORIO	Nº3:	ELECTROFORESIS	DE	GELES	EN	CONDICIONES	DENATURANTES	(SDS-PAGE)	OBJETIVOS	• Conocer	los	fundamentos	de	la	separación	de	proteínas	mediante	la	técnica	de	electroforesis	en	poliacrilamida.	en	el	que	se	separan	biomoléculas.	relativamente	no	iónicos	y	que	permiten	buena	visualización	de	las	bandas	durante	tiempo	prolongado.	de	su	carga	bajo	la	acción	de	un	campo	eléctrico.	es	útil	para	determinar	otros	parámetros	como.-	Ensamble	de	sistema	discontinuo	de	geles	de	poliacrilamida.	tiene	la	ventaja	de	que	variando	la	concentración	de	polímeros.	entre	otros	factores.	Figura	2.	Figura	1.8	con	tal	de	tener	el	porcentaje	deseado	de	acrilamida	(5-30%)	y	al	final	se	añaden	Persulfato	de	Amonio	(APS)	y	Tetrametiletilendiamina	(TEMED)	que	dan	inicio	a	la	reacción	de	polimerización.	Es	útil	además	para	determinar	peso	molecular.	peso	molecular	y	estructura	tridimensional.	La	poliacrilamida	es	un	soporte	empleado	frecuentemente	en	electroforesis	en	gel.	lo	que	da	la	información	necesaria	si	se	pretende	realizar	una	separación	cromatográfica	basada	en	diferencias	de	carga.	de	acuerdo	al	tipo	de	muestra.	es	la	migración	de	solutos	iónicos	bajo	la	influencia	de	un	campo	eléctrico.	y	sirven	como	método	de	separación	de	mezclas	complejas	de	ácidos	nucleicos.	Se	pueden	conocer	también	mediante	estas	técnicas.	INTRODUCCIÓN	La	electroforesis	es	un	método	analítico-semipreparativo.	.	• Aprender	la	preparación	de	los	geles	en	condiciones	denaturantes	(SDS-PAGE).	• Determinar	con	criterios	bioquímicos	las	condiciones	electroforéticas.	dependiendo.	poder	de	resolución	y	versatilidad.	A	escala	analítica.	La	electroforesis.	Utilidad	de	la	Electroforesis	de	Proteínas:	Se	pueden	conocer	las	características	ácido-básicas	de	las	proteínas.	Asimismo.	es	químicamente	inerte.	lo	que	da	la	información	necesaria	si	se	pretende	realizar	una	separación	cromatográfica	basada	en	diferencias	de	carga.	las	características	ácido-básicas	de	las	proteínas	presentes	en	un	extracto	crudo.	se	puede	modificar	de	manera	controlada	el	tamaño	del	poro.	Además.	así	como	la	preparación	de	muestras	y	la	interpretación	de	resultados.	insolubles	en	agua.	los	métodos	electroforéticos	son	de	alta	sensibilidad.	punto	isoeléctrico	y	número	de	cadenas	polipeptídicas	de	las	proteínas.	punto	isoeléctrico	y	número	de	cadenas	polipeptídicas	de	las	proteínas.	estas	partículas	migran	hacia	el	cátodo	o	ánodo	(electrodos	+	y	-).	acrilamida	y	un	tampón	Tris	a	pH=8.	El	gel	se	ensambla	mezclando	agua.	peso	molecular.	Forma	geles	transparentes	con	estabilidad	mecánica.	capaz	de	ser	preparado	de	forma	rápida	y	reproducible.	junto	con	el	equipamiento	requerido	para	la	corrida	electroforética.	dependiendo	en	combinación	de	su	carga.-	Ilustración	de	las	fuerzas	que	se	ejercen	sobre	una	partícula	cargadas	que	determina	su	movilidad	en	la	electroforesis.	proteínas	y	otras	biomoléculas.	de	propiedades	uniformes.
porque	causan	la	formación	de	radicales	libres	del	persulfato.	Los	grupos	alifáticos	dodecil	se	colocan	en	el	interior.8	+	4%	(p/v)	SDS	+	0.	Por	lo	que	el	complejo	SDS-proteína	tiene	generalmente	mayor	densidad	de	carga	y	menor	tamaño	que	las	proteínas	nativas.	una	vez	corridas	las	muestras.	que	se	producen	por	radicales	libres	de	oxígeno.	como	son	la	temperatura	durante	la	polimerización	y	la	corrida	del	gel.	.Puntas	(10.	N.	mientras	que	los	grupos	sulfato	dan	a	los	complejos	SDS-proteína	carga	neta	negativa	(que	excede	la	carga	intrínseca	de	las	cadenas	de	aminoácidos).	también	se	emplea	para	la	determinación	del	peso	molecular	de	las	subunidades	de	proteínas.	para	denaturar	las	proteínas	rompiendo	las	interacciones	no	covalentes	que	determinan	la	estructura	terciaria	y	cuaternaria.	determinando	el	peso	molecular	de	las	mismas.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	I	MATERIALES	.	el	Sodio-Dodecil-Sulfato	(SDS).Buffer	de	carga	5x	.5	mL.	la	preparación	de	las	muestras	y	la	tinción.	la	velocidad	de	la	polimerización	y	los	niveles	de	catalizador.025	M	Tris	+	0.Gel	de	Poliacrilamida.	ocupa	un	detergente.	El	tratamiento	de	las	muestras	con	un	agente	reductor	de	puentes	disulfuro.	.	SDS-PAGE:	La	variante	más	usada	de	la	electroforesis	en	geles	de	poliacrilamida.	por	causa	de	la	acción	de	iones	persulfato.25%	(w/v)	+	Glicerina	en	agua	30%	(v/v)	.	La	polimerización	se	lleva	a	cabo	con	la	utilización	de	sistemas	catalíticos	redox	y	se	inicia	con	la	formación	de	radicales	del	monómero.Fuente	de	poder.Buffer	de	carga.Buffer	de	corrida.	.	la	pureza	de	los	reactivos.	.	Soluciones:	Running	Buffer:	0.	como	el	β-mercaptoetanol	(β-ME)	o	el	Ditiotreitol	(DTT)	ayuda	a	la	linealización	de	la	estructura	tridimensional	de	las	proteínas.	SDS)	son	añadidos	a	la	muestra	mediante	una	solución	cargadora	(ver	soluciones).02%	(p/v)	Azul	de	Bromofenol	+	8%	(v/v)	β-ME	Tinción:	0.	200	y	1000	µL)	.	mientras	que	los	grupos	sulfato	en	la	superficie	y	todos	los	complejos	SDS-proteína	toman	carga	neta	negativa	(que	excede	la	carga	intrínseca	de	las	cadenas	de	aminoácido).192	M	Glicina	+	0.	Estos	patrones	deben	ser	tratados	de	manera	similar	a	la	muestra.	P200	y	P10	.	Finalmente.	se	tiñe	el	gel	con	Coomassie	Brilliant	Blue	para	visualizar	las	bandas	que	adquieren	un	color	azul.05%(p/v)	Coomassie	Brilliant	Blue	disuelto	en	45%	Metanol	+	45%	Agua	+	10%	Ácido	Acético	Destinción:	45%	Metanol	+	45%	Agua	+	10%	Ácido	Acético	6x	Amortiguador	de	carga:	Azul	de	bromofenol	0.	El	peso	molecular	(PM)	de	las	proteínas	puede	determinarse	en	electroforesis	al	comparar	las	movilidades	electroforéticas	de	varios	marcadores	de	peso	molecular	conocido.01%	(p/v)	SDS	Solución	Cargadora:	50%	(v/v)	Glicerol	+	0.	.125	M	Tris	pH	=	6.	por	nombrar	algunas.	El	Rf	es	una	medida	convencional	de	la	movilidad	de	la	proteína	relativa	al	frente	de	migración	y	se	define	como	la	distancia	desde	el	inicio	del	gel	separador	hasta	el	centro	de	cada	banda	dividida	entre	la	distancia	a	la	que	ha	migrado	el	ión	líder.Agua	desionizada	.	se	debe	aplicar	el	que	abarque	el	peso	molecular	esperado	para	la	proteína	que	se	quiere	determinar.	Existen	patrones	(mezclas	de	proteínas	de	peso	molecular	conocido	y	que	se	tiñen	uniformemente)	de	varios	rangos	de	peso	molecular.	N	́-tetrametilen-diamina	(TEMED)	se	emplean	como	catalizadores	de	esta	reacción.Tubos	Eppendorf	de	1.Juego	de	micropipetas	P10.	se	obtiene	un	gráfico	ligeramente	sigmoideo.	La	electroforesis	con	SDS	es	un	excelente	método	para	identificar	y	monitorear	las	proteínas	durante	un	proceso	de	purificación.	El	SDS-PAGE	se	emplea	normalmente	para	estimar	el	peso	molecular	de	las	proteínas	y	se	compara	con	un	patrón.Heat	block.	N'-metilen-bis-acrilamida	CH2	=	CH-CO	-NH	-CH2	-NH	-CO	-CH	=	CH2.	La	electroforesis	con	dodecil	sulfato	de	sodio	(SDS)	es	un	excelente	método	para	identificar	y	monitorear	las	proteínas	durante	un	proceso	de	purificación.	Las	aminas	terciarias	como	el	N.Agua	ultra	pura	.	Todos	estos	componentes	(DTT.	La	electroforesis	es	una	técnica	muy	sensible	y	puede	ser	afectada	por	muchos	errores	experimentales.	el	tiempo	de	corrida.	Al	realizar	un	ploteo	del	log	PM	de	la	proteína	patrón	como	función	del	valor	de	Rf.Cámara	electroforética.Marcador	de	Peso	Molecular	.Los	geles	de	poliacrilamida	se	forman	por	la	polimerización	vinílica	del	monómero	acrilamida	CH2=CH-CO-NH2	y	del	monómero	entrecruzador	N.	N.	.	Con	esto	se	eliminan	2	de	las	3	variables	que	determinan	la	movilidad	electroforética	y	deja	sólo	la	separación	por	peso	molecular.	El	peso	molecular	desconocido	puede	estimarse	por	el	análisis	de	regresión	lineal	o	por	interpolación	en	la	curva	del	log	de	PM	contra	Rf.
2. Desteñir	con	solución	de	destinción	hasta	que	se	visualicen	las	bandas. Añadir	2μl	de	solución	cargadora	4X. Centrifugar	(spin).05	mL	0.	Saunders	College	Publishing.	2.	Aires.	Hib	J.	• Campell	MK.	Second	edition.	7.05	mL	APS	10%	0.	por	10	minutos	en	agitación.5	M	(pH	8.	Biología	Molecular	de	la	Célula.	3.	• De	Robertis	E.05	mL	SDS	10%	0.	Ediciones	Omega	S. Homogenizar	con	vortex.	3.	4.	5.	Ed.	BIBLIOGRAFÍA	• Alberts	B.	2011.005	mL	TEMED	0.	México. Someter	3-5	minutos	a	100°C.	Biología	Celular	y	Molecular:	conceptos	y	experimentos. Montar	los	geles	en	las	cámaras	de	electroforesis.	Guardar	húmedos.	1.	y	teñir	con	Azul	de	Commasie. Agregar	Running	Buffer	en	ambos	electrodos.17	mL	Tris	1.	Ciudad	de	México.	.	• Karp.	Bray	D.8)	1.	Biochemistry.13	mL	SDS	10%	0.5	M	(pH	6. Tomar	la	cantidad	de	6μl	de	muestra	a	una	concentración	de	1μg/μl	de	proteína. Correr	los	geles	a	150V	x	30	minutos.	2010. Sacar	el	gel	de	los	vidrios.METODOLOGÍA	1.	en	los	pocillos.	1995.	G.01	mL	TEMED	0.3	mL	Tris	0.	A.005	mL	0.	Biología	Celular	y	Molecular.	Verificar	que	no	hayan	filtraciones.	5ª	Edición.	• Preparación	del	sistema	de	electroforesis. Hacer	los	geles	máximo	1	día	antes	de	utilizarlos.001	mL	• Preparación	de	las	muestras:	1.4	mL	30%	A/B	0.68	mL	30%	A/B	1.	o	hasta	que	el	frente	(color	azul)	llegue	casi	al	borde	del	gel.	2000.	McGraw-Hill.8)	0.	5.	4ª	Edición.01	mL	APS	10%	0.	4.6	mL	2.	6..3	mL	1.	Bs..	Barcelona.-	Preparación	de	los	geles	poliacrilamida	(6	ml)	(6	ml)	Separador	8%	12%	Concentrador	1	mL	(4%)	Agua	MQ	3.0	mL	3.8	mL	Agua	MQ	0.	El	Ateneo. Cargar	las	muestras	luego	de	denaturadas	(hervidas).	&	Ponzio	R.	&	Lewis	J.05	mL	0.
.	la	que	es	desplazada	por	un	carro	móvil.	las	aptitudes	del	microscopio	han	ido	en	ascenso.Tubo	o	Cañón:	en	su	extremo	superior	lleva	la	lente	ocular	y	en	el	inferior	la	lente	objetiva.	Si	bien	se	puede	observar	muestras	sin	adulterar.	tanto	en	mecánica	como	en	óptica.	INTRODUCCIÓN	La	microscopía	es	un	conjunto	de	técnicas	que	permiten	la	visualización	de	entidades	pequeñas	que.Tornillos	de	Focalización:	Macrométrico.	Luego.	El	microscopio	óptico	compuesto	se	compone	de	3	sistemas	principales.	construye	el	primer	microscopio	compuesto.	Actualmente.	destacándose	la	electrónica	y	de	fluorescencia.	de	otra	manera.	.	Consta	de	pinzas	para	sujetar	la	preparación.	Robert	Hooke.	la	microscopía	óptica	es	llamada	“clásica”	por	cuanto	han	surgido	numerosos	tipos	de	microscopía.	• Aplicar	las	normas	de	uso	y	cuidado	del	microscopio	óptico.	por	cuanto	las	células	son	incoloras	y	traslúcidas.	TAMAÑO	Y	VIABILIDAD	CELULAR	OBJETIVOS	• Conocer	la	estructura	y	el	funcionamiento	del	microscopio	de	luz.	lo	que	es	5	veces	menor	que	el	objeto	más	pequeño	observable	a	simple	vista.	Se	denomina	tubo	binocular	si	posee	dos	lentes	oculares.	Desde	entonces.Revólver:	Corresponde	a	una	pieza	giratoria	en	el	extremo	inferior	del	tubo.	platina	y	el	tubo	con	el	sistema	óptico	de	amplificación. GUÍA	LABORATORIO	Nº4:	MICROSCOPÍA:	FORMA.	• Utilización	de	la	cámara	de	Neubauer	y	microscopio	para	el	contaje	de	células.	el	condensador.	De	cualquier	manera.	Moviliza	por	rotación	los	diferentes	objetivos	de	que	dispone	el	microscopio.	ha	sido	la	base	del	desarrollo	de	la	Biología	desde	su	implementación.	El	continuo	progreso	en	el	sistema	de	lentes	ha	permitido	alcanzar	aumentos	de	hasta	2000	veces. Sistema	Mecánico	.	el	que	se	utiliza	para	un	enfoque	grueso.Platina:	plataforma	horizontal	con	un	orificio	central	que	permite	el	paso	de	los	rayos	luminosos	que	atravesarán	la	preparación.	cuando	Anton	van	Leeuwenhoek	fabrica	lentes	capaces	de	visualizar	bacterias.	y	micrométrico	que	completa	el	enfoque	de	precisión.	están	fuera	del	rango	de	resolución	del	ojo	humano.Pie:	Corresponde	a	la	base	de	sustentación	del	aparato.	• Conocer	los	diferentes	tipos	celulares	y	las	funciones	específicas	de	cada	uno.	conjunto	al	progreso	científico.	la	microscopía	tanto	clásica	como	instrumental	sigue	siendo	una	herramienta	poderosa	y	central	en	la	Biología	y	disciplinas	afines.	.	• Observar	distintos	tipos	de	muestras	para	comprender	su	funcionamiento.	protozoos	y	otros	microorganismos.	una	limitación	en	la	microscopía	óptica	es	que	se	necesitan	diversas	tinciones	para	evidenciar	estructuras	y	formas	celulares.	.Columna:	sostiene	el	espejo	o	el	sistema	de	iluminación.	La	microscopía	data	del	siglo	XVII.	• Diferenciar	células	vivas	y	muertas	mediante	el	uso	de	azúl	de	tripán.	1.	el	principal	gestor	de	la	Teoría	Celular.	.	MICROSCOPIO	ÓPTICO	COMPUESTO	La	microscopía	óptica	o	de	luz.	.	Las	bacterias	y	otros	procariotas	son	aún	más	pequeños.	La	célula	animal	típica	tiene	20	μm	de	tamaño.	El	tornillo	micrométrico	trae	una	escala	graduada	y	cada	marca	indica	un	avance	de	dos	micrómetros	(2μm).
Diafragma	Iris:	Por	debajo	del	condensador	se	dispone	un	diafragma	regulable	que	gradúa	la	cantidad	de	luz	que	llega	a	la	preparación.	Estas	lentes	dan	una	imagen	inicial	real.	Los	oculares	se	designan	por	su	aumento	(6X.	UV.	3.	Los	microscopios	modernos	no	usan	espejos	pues	su	fuente	de	luz	se	ubica	bajo	el	condensador.	.	IR.	azul.Condensador:	Está	formado	por	un	sistema	de	lentes	que	enfoca	la	luz	en	el	plano	superior	de	la	preparación.	.	n	=	1.Espejo:	Recibe	la	luz	de	la	fuente	luminosa	y	la	refleja	sobre	el	condensador.	2.515)	y	cuya	función	es	concentrar	los	rayos	que	se	habrían	perdido	por	refracción	en	el	portaobjetos	al	llegar	a	aumentos	altos.	puede	ser	una	lámpara	común	de	luz	visible.)	que	incide	sobre	la	muestra.	.Lentes	Objetivas:	Sistemas	de	lentes	ubicados	inmediatamente	encima	del	objeto	o	preparación.	seleccionando	la	longitud	de	onda	(roja.Lentes	Oculares:	Son	sistemas	ópticos	ubicados	en	la	parte	superior	del	tubo	del	microscopio.	8X. Sistema	de	Amplificación	.	Objetivos	de	inmersión:	El	medio	interpuesto	es	un	líquido	viscoso	transparente	(agua	o	aceite)	con	un	índice	de	refracción	mayor	que	el	del	aire	(comúnmente	aceite	de	cedro.	aumentada	e	invertida	de	la	imagen	dada	por	el	objetivo.Fuente:	Natural	o	artificial.	Objetivos	en	seco:	En	estas	lentes	el	medio	interpuesto	entre	la	lente	y	el	objeto	(preparación)	es	aire.	Pueden	ser	apocromáticos	o	corrientemente	acromáticos.	aumentada	e	invertida.	.	20X).	Forman	la	imagen	final	virtual.	verde.	etc.	15X.Anillo	porta	filtro:	Corresponde	a	un	anillo	de	metal	situado	bajo	el	condensador	en	el	cual	puede	colocarse	un	filtro	de	color.	.	10X.	Van	desde	el	5X	hasta	el	100X. Sistema	de	Iluminación	.	.
La	fórmula	de	Abbe	muestra	que	para	aumentar	la	resolución.PROPIEDADES	DEL	MICROSCOPIO	Además.	Y	es	principalmente	respecto	a	la	manipulación	de	la	longitud	de	onda	donde	se	han	hecho	la	mayoría	de	las	mejoras.	Las	células	vivas	o	viables	presentan	una	membrana	celular	intacta	lo	que	impide	que	se	incorpre	el	azúl	de	tripán.	es	más	refractada	y	forma	un	foco	más	cerca	de	la	lente	que	la	de	mayor	longitud	de	onda	(rojo).	Así	los	rayos	de	luz	son	desviados	con	mayor	intensidad	en	la	porción	prefractada	y	forma	erisférica	originando	dos	focos.	Este	límite	no	es	sino	la	distancia	mínima	entre	dos	puntos	para	que	al	microscopio	de	distingan	como	separados.	entre	las	que	tenemos	la	aberración	esférica	y	la	aberración	cromática.	creándose	diferentes	tipos	de	microscopía	qué	serán	analizados	más	adelante	en	los	laboratorios.	ü Poder	de	Penetración:	Capacidad	del	microscopio	de	mostrar	en	foco	dos	puntos	en	distintos	planos.	las	células	muertas	se	ven	de	color	azul	al	microscopio.	Debido	a	que	las	células	vivas	son	excluidas	de	la	tinción.	este	método	también	se	llama	método	de	tinción	por	exclusión.	podrá	apreciarse	que	la	AN	aumenta	con	el	aumento	de	cada	lente.	por	cuanto	se	enfoca	el	haz	de	luz	en	un	punto	cada	vez	más	limitado.	El	objeto	parece	estar	rodeado	de	halos	de	diferentes	colores.	Tinción	para	viabilidad	célular	y	conteo	en	Cámara	de	Neubauer:	Tinción	con	azul	de	tripán:	El	azul	de	tripán	es	un	colorante	azoico	que	se	utiliza	en	ensayos	de	viabilidad	celular	el	cual	permite	diferenciar	células	vivas	de	muertas.	b) Aberración	cromática:	Depende	de	la	longitud	de	onda	de	la	luz	ya	que	una	única	lente	no	enfoca	todos	los	colores	en	un	mismo	punto.	por	el	contrario.5	μm)	y	AN	es	la	Apertura	Numérica.25 ABERRACIONES	Las	lentes	de	un	microscopio	adolecen	de	imperfecciones	llamadas	aberraciones.	λ	es	la	longitud	de	onda	de	la	radiación	usada	(para	luz	blanca	es	0.	.61	para	el	microscopio	óptico).	Si	se	observan	los	valores	de	AN	de	las	diferentes	lentes	objetivas	de	un	microscopio	dado	(Tabla	1).	a) Aberración	esférica:	Se	produce	porque	los	lentes	con	curvación	esférica.	en	las	células	muertas	el	azúl	de	tripán	es	capaz	de	atravesar	la	membrana	celular.	Esto	se	define	porque	los	objetos	dispersan	la	luz.	por	ende	el	haz	de	luz	recto	que	viene	del	condensador	sufre	dispersión	al	pasar	por	la	muestra	y	llega	en	un	cierto	ángulo	(α)	a	la	lente	objetiva.	Tabla nº 1 Aumento Objetivo Apertura Numérica 4X 0.	se	pueden	manipular	sólo	un	pequeño	número	de	variables:	la	longitud	de	onda	de	la	luz	que	se	usa	(λ)	y	la	apertura	numérica	(AN)	del	objetivo	con	que	se	está	realizando	la	observación.	el	poder	de	penetración	disminuye.	es	decir	disminuir	el	límite	de	resolución.	no	hacen	foco	en	un	solo	punto	pues	los	bordes	producen	una	refracción	relativamente	mayor	que	la	del	centro.	Por	lo	tanto.	ü Poder	de	Definición:	Capacidad	del	microscopio	de	dar	imágenes	nítidas	de	contornos	precisos.	y	esto	depende	también	del	índice	de	refracción	del	medio	entre	la	muestra	y	lente	(n).	Donde	k	es	una	constante	que	depende	del	índice	de	refracción	del	medio	entre	el	objeto	y	la	lente	(0.	AN:	Es	una	medida	del	diámetro	de	apertura	de	la	luz	respecto	a	la	distancia	focal.	es	así	como	en	la	tabla	siguiente	se	muestran	los	aumentos	de	las	diferentes	lentes	objetivas	y	sus	respectivas	AN.	ü Poder	de	Resolución:	Capacidad	para	distinguir	como	separados	dos	puntos	extremadamente	cercanos.25 40X 0.	el	microscopio	tal	como	lo	conocemos	hoy	tiene	cuatro	características	fundamentales:	ü Poder	de	Aumento:	Capacidad	para	entregar	imágenes	aumentadas.	Matemáticamente	es	el	inverso	del	Límite	de	Resolución	(LR).1 10X 0.	ganando	resolución	en	un	plano	pero	perdiendo	el	foco	en	otros.65 100X 1.	A	medida	que	se	sube	el	aumento.	La	luz	de	longitud	de	onda	más	corta	(violeta).	Está	definido	por	el	producto	entre	el	aumento	del	ocular	y	el	aumento	del	objetivo.
y	sólo	las	células	de	los	borden	superior	y	derecho	se	consideran	que	están	dentro	del	cuadrante	y	se	cuentan.	para	calcular	el	número	de	células	que	hay	en	un	solo	cuadrante. AUTOR/ES: Campos.	Se	cuentan	las	células	que	hay	en	todo	el	cuadrante. C.1	mm	con	respecto	a	la	central.	desde	la	relativamente	simple	cámara	de	contaje	celular.	el	volumen	del	área	del	cuadrante	será:	3 -4 1mm	x	1	mm	x	0.1	mm =	0.	situando	la	punta	de	la	pipeta	de	tal	forma	que	toque	el	borde	superior	del	cubreobjetos	dejándola	penetrar	por	capilaridad.	que	a	su	vez	están	divididos	en	16	cuadraditos	iguales	y	que	se	utilizan	para	el	contaje	celular.1	ul	=	10 ml	Lectura	y	cálculo	de	la	concentración	celular:	Para	contar	las	células	viables	se	coloca	un	cubreobjetos	sobre	la	zona	de	la	cámara	que	contiene	la	cuadícula	y	clocamos	10	ul	de	la	mezcla	de	azúl	de	tripán	y	la	suspención	celular	entre	el	cubre	y	la	cámara	de	Neubauer.	cuya	porción	central	está	dividida	en	tres	bandas	perpendiculares	al	eje	longitudinal	de	la	cámara	(divididas	por	ranuras	transversales).	Como	la	longitud	de	cada	uno	de	los	lados	del	cuadrante	es	de	1	mm.	Este	valor	se	multiplica	por	4 la	dilución	realizada	con	azul	de	tripán	y	por	10 para	conocer	el	nº	final	de	células	por	ml	de	la	muestra:	Manual de prácticas de Inmunología.	subdividida	en	dos	semibandas	idénticas	y	separadas	por	una	ranura	perpendicular. A.	El	contaje	de	la	muestra	se	realiza	de	la	siguiente	forma:	Se	observa	un	cuadrante	en	un	aumento	al	40x.	La	banda	central	puede	estar.	La	cámara	de	Neubauer	consiste	en	una	placa	gruesa	de	cristal	en	forma	de	portaobjetos.1mm.	entre	ellas	la	cámara	de	Neubauer. / Rubio. .	-4 El	valor	obtenido	será	el	número	de	células	en	10 Bibliografía utilizada: ml	(volumen	del	área	del	cuadrante).	hasta	equipos	automáticos	de	contaje	celular.	Cuadrículas	de	conteo Cada	cuadrícula	de	recuento	consta	de	4	cuadros	grandes	idénticos.	y	se	divide	por	4	la	cifra	obtenida	en	el	recuento.Conteo	de	células	en	cámra	de	Neubauer:	El	contaje	de	células	en	cámaras	cuadrículadas	se	utiliza	con	bastante	frecuencia	para	determinar	la	densidad	de	células	como	el	porcentaje	de	éstas	células	que	son	viables.	y	la	altura	del	espacio	comprendido	entre	la	superficie	de	la	cámara	y	el	cubre	es	de	0.	Para	determinar	la	densidad	de	las	células	se	emplean	diferentes	técnicas.	Se	cuentan	las	células	presentes	en	los	4	cuadros	grandes	idénticos	de	la	cuadrícula	de	conteo.	a	su	vez.	El	contaje	con	cámaras	nos	proporciona	un	método	efectivo	y	de	bajo	costo.	(	en	la	siguiente	figura	se	muestra	con	líneas	verdes	los	bordes	a	contar)	mientras	que	las	células	de	los	bordes	inferiores	e	izquierdo	se	Fig 3: Tinción con azul tripán (1/10) excluyen.	En	cada	una	de	estas	dos	semibandas	hay	grabado	cuadrículas	de	recuento	idénticas. G. / Muñoz.1	mm=	0.	situados	en	las	cuatro	esquinas	(en	la	imágen	se	representan	con	una	L).	y	en	esta	última	hay	grabado	cuadrículas	de	recuento.	es	decir	en	los	16	cuadraditos	del	cuadrante.	De	ellas.	las	dos	laterales	se	hayan	sobre-elevadas	0.
La	especialización	funcional	en	organismos	superiores.Preparación	con	Hilo	de	dos	colores	(rojo.	Nº	de	células	vivas	/ml	=	nº	de	células	contadas	/4	x	factor	de	dilución	x	10	• Para	más	información	vease	Anexo	Nº	1.	Cada	uno	de	estos	se	subdivide	en	diferentes	grupos	de	acuerdo	a	su	especialización.2	μm	(Mycoplasma	genitalium)	y	tan	grandes	como	16	cm	(huevo	de	avestruz).Microscopio	óptico	.	se	agrupan.	cada	uno	con	una	morfología	específica.	etc.	.	azul)	METODOLOGÍA	Letras	y	papel	Enfocar	la	letra	con	el	objetivo	de	menor	aumento	(4x.	determine	el	diámetro	del	campo	observado.	que	lleva	a	la	diferenciación	celular.	siendo	el	tamaño	promedio	entre	10	a	60	μm.	encontrando	así	4	tipos	básicos:	epitelial.	éste	es	muy	variable.	• Usando	las	líneas	del	papel	milimetrado	determine	el	tamaño	de	la	letra.	Éstos	se	clasifican	de	acuerdo	a	las	características	que	presentan.	conectivo	o	conjuntivo.)	• Desplace	la	platina	a	la	derecha	y	a	la	izquierda	¿en	qué	dirección	se	mueve	la	letra?	• Usando	las	líneas	del	papel	milimetrado.Preparación	con	Papel	impreso	(hoja	de	periódico)	.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	I	MATERIALES	.	Con	respecto	al	tamaño	celular.	las	células	pueden	ser	tan	pequeñas	como	0.Líquido	para	limpiar	oculares	y	lentes	.	5x	u	otro	según	el	caso).	difusa.	invertida.	da	como	resultado	los	distintos	tipos	celulares.	muscular	y	nervioso.	Las	células	son	la	unidad	morfo-funcional	de	los	tejidos	los	cuales	se	forman	cuando	varios	tipos	celulares	que	cumplen	funciones	similares.	Pasar	al	objetivo	de	40x	y	responder	lo	siguiente:	¿La	iluminación	experimenta	cambio?	Hilos	de	colores	• Con	el	objetivo	de	5x	¿Cuántos	colores	de	hilos	distintos	distingue?	• Al	pasar	al	objetivo	de	10x	¿Qué	sucede?	¿y	al	de	40x?	• ¿Qué	explicación	le	da	usted	a	esto?	• ¿Para	observar	uno	de	los	hilos	sobre	el	otro	con	más	precisión?	¿qué	estructura	(parte)	del	microscopio	deber	mover?	¿Por	qué?	EJERCICIOS	Determinar	con	cuál	de	los	aumentos	se	obtiene:	•	Mayor	amplitud	de	campo	•	Menor	distancia	de	trabajo	•	Mayor	poder	de	resolución	FORMA	Y	TAMAÑO	CELULAR	Los	organismos	están	formados	por	una	gran	cantidad	de	distintos	tipos	celulares	con	funciones	específicas.	Por	ejemplo.	luego	el	radio	y	a	partir	de	éste	calcule	el	área	del	campo.	Realice	las	siguientes	actividades:	• Describa	cómo	se	ve	la	letra	(derecha.
Tejido	epitelial:	Es	el	tejido	que	recubre	y	protege	órganos	y	conductos.	caracterizado	por	su	gran	resistencia	tanto	a	la	tracción	como	a	la	compresión.	Tejidos	óseos:	formar	el	principal	tejido	de	soporte	del	organismo.	-Células	Gliales:	Es	el	conjunto	de	células	de	soporte	que	nutren	y	mantienen	a	las	neuronas.	5.	Se	clasifica	en	laxo	(células	en	disposición	irregular).	térmicas.	compuesto	por	plasma	sanguíneo	y	los	llamados	elementos	figurados:	los	glóbulos	rojos.	rodeadas	de	escaso	material	intercelular.	ya	sea	por	ellos	mismos	o	para	otros	tejidos	del	organismo.	sanguíneo.	Su	origen	en	común	es	el	mesénquima	embrionario	de	mesodermo.	.	convirtiéndolos	en	“puentes”	inter- compartimento	y	los	agentes	clave	de	la	integración	sistémica	del	organismo.	para	su	uso	posterior	como	fuente	de	energía.	Tejidos	adiposos:	almacenar	grasas.	médula	espinal)	o	llevar	las	respuestas	de	estos	centros	a	efectores	(músculos.	Tejidos	cartilaginosos:	formar	placas	o	láminas	relativamente	sólidas.	caracterizadas	por	una	gran	resistencia	a	la	compresión.	Su	organización	celular	es	bastante	más	dispersa	e	independiente	que	en	el	epitelio.	adaptados	a	funciones	específicas	tales	como:	1.	se	agrupa	en	una	lámina	basal.	6.	Tejidos	conjuntivos	densos:	contener	a	las	células	que	participan	en	los	procesos	de	defensa	ante	agente	extraños:	constituyendo	el	sitio	donde	se	inicia	la	reacción	inflamatoria.	4.	Poseen	una	matriz	extracelular	amplia	compuesta	de	colágeno.	Tejido	nervioso:	Se	origina	desde	el	ectodermo	embrionario	y	sus	principales	componentes	son	las	células.	los	glóbulos	blancos	y	las	plaquetas.	Existen	varios	tipos	de	tejidos	conjuntivos	localizados	en	diversos	sitios	del	organismo.	La	matriz	extracelular.	cavidades	internas	y	tamaño	de	órganos.	Las	células	son	de	dos	clases	diferentes:	-Neuronas	o	Células	Nerviosas:	Son	la	unidad	funcional	del	tejido	y	están	ultra-especializadas	en	la	recepción	y	transmisión	de	señales	químicas.	Gran	presencia	celular	pero	baja	proporción	de	fibras.	glándulas)	para	iniciar	la	acción	motora	y	hormonal.	Pueden	trasmitir	señales	sensitivas	mecánicas.	escasa.	2.	Provee	además	de	protección	ante	la	acción	mecánica	y	está	encargado	en	el	caso	de	glándulas	de	secreción	especializada.	Tejido	Conectivo:	Son	conjuntos	de	células	que	conectan	los	distintos	niveles	de	los	órganos.	Compone	una	barrera	selectiva	que	limita	el	movimiento	de	agua.	solutos	o	células	de	un	compartimento	a	otro	y	controlan	la	superficie	libre.	Tejidos	conjuntivos	laxos:	mantener	unidos	entre	sí	a	los	otros	tejidos	del	individuo.	cartilaginoso).	3.	Tejido	sanguíneo:	La	sangre	es	un	tejido	conectivo	especializado.	Todas	estas	funciones	se	cumplen	porque	las	células	están	adheridas	una	a	otra	por	uniones	especializadas	estrechas	que	“sellan”	los	espacios	intermedios.	elastina	y	diversos	proteoglucanos.	óseo.	químicas	hacia	un	centro	elaborador	de	respuestas	(cerebro.	denso	(conformación	celular	y	fibrosa	más	organizada)	y	especializado	(adiposo.	Alta	concentración	fibrilar.	formando	el	estroma	de	diversos	órganos.	Cumplen	además	funciones	de	mantenimiento	y	sostén	de	órganos.
Enfoque	la	muestra	con	la	lupa.	luego:	Observe	con	aumento	de	100x	y	responda:	a.	involuntario	y	sin	estrías.	estriado	e	involuntario.	Tejido	Muscular:	Este	tejido.	está	constituido	por	células	musculares	(miocitos)	los	cuales	son	células	diferenciadas	que	forman	fibras	capaces	de	generar	movimientos	al	contraerse	bajo	estímulos	adecuados	y	luego	relajarse.	de	origen	mesenquimático.	Reconozca	una	vellosidad	intestinal	¿A	qué	tipo	de	tejido	corresponde?.	Corte	transversal	de	intestino	delgado	Coloque	la	preparación	sobre	la	platina	siguiendo	las	instrucciones	de	uso	que	usted	ya	conoce.	y	Liso.	recibirá	distintas	preparaciones	con	las	cuales	deberá	realizar	una	serie	de	actividades:	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	II	1.	En	los	vertebrados.	¿Qué	aspecto	presenta	el	epitelio	intestinal?	¿Cómo	son	sus	células?.	que	es	estriado	y	voluntario.	b.	La	maquinaria	intracelular	contráctil	está	formada	por	proteínas	(actina	y	miosina)	que	se	orientan	paralelos	a	la	dirección	del	movimiento	y	ocupan	energía	química	(ATP)	y	la	transforman	en	energía	mecánica.	.	Musculo	cardiaco	Musculo	liso	Musculo	esquelético	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	Durante	el	laboratorio	Ud.	se	distinguen	3	tipos	de	músculo:	Esquelético.	Cardíaco.
Ediciones	Omega	S.	• Alberts	B.	1994.	Hib	J..	McGraw-Hill.Juego	de	micropipetas	P200	y	P20.	Lewis	J.	.	Scientific	American	Books.	• De	Robertis	E.-	Preparar	la	Cámara	de	Neubauer	con	un	cubre-objetos	y	colocar	10	ul	de	la	mezcla	(suspensión	celular/aul	de	tripán).Puntas	(P10	y	P200)	.	&	Pober	J.	¿Qué	diferencias	observa?	Observe	con	mayor	aumento.Tupos	eppendorf	de	1.	Ed.	Ubique	y	caracterice	el	epitelio	traqueal.	Ubique	y	caracterice	el	tejido	cartilaginoso.	la	forma	celular	y	la	disposición	de	las	fibras.	Indique	el	tipo	de	tejido	muscular.	ACTIVIDAD	PRACTICA	III:	MATERIALES:	.-	Hacer	una	tinción	con	Azul	de	Tripán	al	1/1	(suspensión	celular/azul	de	tripán):	agregar	100	ul	de	azúl	de	tripán	a	un	tubo	eppendor	de	1.	2.-	Aplicar	la	fórmula	de	la	cámara	para	saber	qué	cantidad	de	células	viables	se	hay.	Aires.	2000.	4ª	Edición.	• Alberts	B.	3ª	Edición.	2011.Azúl	de	tripán	.	3.	a.	Biología	Celular	y	Molecular..	Ciudad	de	México.	Mencione	en	qué	posición	se	encuentra	el	núcleo	dentro	de	la	célula.	4.	4º	Edición.	&	Walter	P..	• Lodish	H.	Identifique	la	localización	de	los	núcleos.	METODOLOGÍA:	1.	.Muestra	de	células	en	suspensión.	Molecular	Celll	Biology.	2010.	• Karp	G.Y..	Describa	la	forma	del	tejido.	b..	N.	luego	pase	a	100x	y	finalmente	a	400x.	España.	Identificar	Neuronas.	Bray	D.	Corte	longitudinal	de	músculo	esquelético	Recibirá	una	muestra	de	músculo	esquelético.	McGraw-Hill-Interamericana.	A.	b.	5º	Ed.	Corte	transversal	de	epitelio	traqueal	Enfoque	la	muestra	con	el	aumento	menor.	Raff	M.	c..	Identifique	la	túnica	adventicia.	Recórrala	con	aumento	menor.	f.	luego	cuidadosamente	agregar	100	ul	de	la	muestra	de	células	en	suspensión	y	mezclar	pipeteando	con	suavidad.	Barcelona.	Johnson	A.	BIBLIOGRAFÍA	• Abbas	A.	3.	• Darnell	J.	axones	y	células	gliales.	Ed.	¿Reconoce	diferencia	entre	sustancia	blanca	y	gris?	b.	a.	En	aumento	400x	Ubique	la	capa	muscular..-	Contar	las	células	al	microscopio:	-	Localizar	la	cuadrícula	(en	la	cámara	de	Neubauer)	y	las	células	con	el	objetivo	10x.	&	Ponzio	R.5	mL	.	Observe	la	organización	del	tejido	y	disposición	de	las	fibras.	2002..	a.	2002.	&	Baltimore.	Biología	Celular	y	Molecular:	conceptos	y	experimentos.	g.	Bs.	-	Pasar	al	objetivo	40x	para	el	contaje	y	visualización	de	células	vivas	y	muertas..Cámara	de	Neubauer	.	Corte	transversal	de	médula	espinal.	Inmunología	Celular	y	Molecular.	Médica	Panamericana.	5ª	Edición.	Identifique	astas	posteriores	y	anteriores.	Hopkin	K.	4.	¿Cuántos	tipos	celulares	reconoce	en	el	epitelio	en	base	a	su	forma?.	Madrid.	c.	Ciudad	de	México.5	mL.Microscopio	.	2011.	Biología	Molecular	de	la	Célula.	c.	Bray	D.	Observe	la	muestra	con	aumento	menor.	2.Observe	con	aumento	de	400x	y	responda:	c.	Ubique	la	chapa	estriada.	Molecular	Cell	Biology.	Introducción	a	la	Biología	Celular.	México..	Lichtman	A.	&	Lewis	J.	Roberts	K.Cubreobjeto	.	El	Ateneo.	d.	luego	con	aumentos	mayores.	México.
Facultad	de	Medicina.	.	• Van	Holde	M.	1999.	Madrid.• Spotorno	A.	Elementos	de	Biología	Celular	y	Genética.	Editado	por	el	Departamento	de	Biología	Celular	y	Genética.	&	Hoecker	G.	Mac	Graw	Hill-Interamericana.	1993.	Bioquímica.
Cultivo	de	células	adherentes	.	Podemos	teñir	entonces	con	componentes	coloreados	y	ver	al	microscopio	óptico	convencional	o	podemos	marcar	con	fluoróforos	y	visualizar	al	microscopio	de	fluorescencia.Etanol	100%	.Metanol:Peróxido	de	Hidrogeno	(9:1)	.Neoclear	.Streptavidina-avidina-HRP	.	sin	embargo	el	blanco	de	detección	es	un	conjunto	de	células	que	están	en	un	tejido.Microscopio	de	Epifluorescencia.Solución	de	bloqueo	.	se	puede	conocer	la	presencia	de	dicha	molécula	en	una	muestra	dada.	INTRODUCCIÓN	A	saber.	es	decir	se	quiere	detectarlas	en	las	células	o	conjunto	de	células	(tejidos)	que	las	producen.	.Solución	de	revelado	.Neomount	.Anticuerpo	secundario	biotinilado	.	Las	técnicas	de	inmunocitoquímica	e	histoquímica	no	se	alejan	de	este	esquema	general.	Primero	se	debe	extraer	el	tejido.	un	anticuerpo	es	capaz	de	reconocer	una	molécula	específica	y	llevando	acoplado	un	sistema	de	detección	adecuado. GUÍA	LABORATORIO	Nº5:	TÉCNICAS	INMUNOLÓGICAS	“INMUNOFLUORESCENCIA”	OBJETIVOS	•	Reconocer	la	utilidad	de	los	anticuerpos	como	herramientas	analíticas.Anticuerpo	unido	a	fluoroforo	.	•	Comprender	la	utilidad	de	los	anticuerpos	para	Inmuno-ensayos	en	Muestras	Biológicas	Íntegras.	preparar	la	muestra	histológica	y	luego	se	procede	con	el	ensayo.	ACTIVIDAD	PRÁCTICA	I	MATERIALES	.Hematoxilina	.Improntas	de	Bazo	y	Riñón	de	rata	.PBS	1X	.	Los	sistemas	de	detección	pueden	ser	enzimáticos	o	fluorescentes.Etanol	70%	.	la	inmunohistoquímica	apunta	al	mismo	objetivo.	•	Visualizar	la	capacidad	de	detección	específica	de	una	molécula	presente	en	una	célula	o	tejido.	De	manera	general.DAPI	.	pero	apuntan	a	detectar	la	molécula	desde	su	fuente	original.Etanol	50%	.
Aires.	2..	• Campell	MK.	1995.	BIBLIOGRAFÍA	• Alberts	B.	&	Lewis	J.	70%.03%	Peróxido	de	Hidrógeno.	y	al	mismo	tiempo	ir	introduciendo	agua	a	las	células.	2011.	Hib	J. Desparafinado:	La	parafina	se	remueve	de	cortes	histológicos	disolviéndola	con	xilol	o	neoclear. Inhibición	de	la	enzima	endógena:	Si	se	va	a	ocupar	un	sistema	de	detección	enzimático.	Se	revela	con	Diaminobenzidina	+	Peróxido	de	Hidrógeno	si	es	HRP.	Con	este	paso	se	tiñen	los	núcleos	celulares.	tenemos	Fosfatasa	Alcalina	y	Peroxidasa	de	Rábano.	6.	2010.	con	DAB	1	mg/mL	+	0.	7.	4ª	Edición.	5. Tinción	de	contraste:	Se	añade	Hematoxilina	diluida	por	3	minutos	y	luego	se	lava	con	Agua	(2	veces	por	5	minutos).	G.	La	biotina	se	incuba	luego	con	un	complejo	streptavidina-avidina-HRP.	50%	y	Agua	destilada.	Colocar	Entellán	o	Neomount	en	la	muestra	y	cubrir	con	cubreobjetos.	Ed.	Second	edition.	&	Ponzio	R. Bloqueo	de	Sitios	Inespecíficos:	Se	hace	con	BSA	5%	x	30	minutos.	Debido	a	la	toxicidad	del	xilol.	Se	lava	con	Neoclear	2	veces	x	5	minutos	c/u.	Para	contrastar	los	núcleos	se	tiñen	con	Hoescht	o	DAPI. Hidratación:	Para	efectos	de	reacciones	debe	haber	agua	presente.	ANEXO	Nº	1	.	8.	Biología	Celular	y	Molecular:	conceptos	y	experimentos.	Las	células	se	visualizan	al	microscopio	óptico.	5ª	Edición.	A.	Ediciones	Omega	S.	Saunders	College	Publishing.	El	Ateneo.	Ciudad	de	México.	•	El	ensayo	implica	incubar	1	hora	en	cámara	húmeda	el	anticuerpo	primario	en	dilución	1:250	(se	verá	expresión	de	IL-4	y	IFN-γ	en	bazo	y	riñon	de	ratón)	y	luego	incubar	1	hora	con	anticuerpo	secundario	biotinilado.	b)	Detección	Fluorescente:	Si	el	anticuerpo	está	unido	a	un	fluoróforo.	•	Sumergir	sucesivamente	en	Etanol	100%.	• Karp.	Bray	D.	México.	2000. Deshidratación	y	Montaje:	Para	visualizar	finalmente	al	microscopio.	Bs.	se	debe	inhibir	primero	la	enzima	que	es	nativa	al	tejido..	se	utiliza	comúnmente	el	último	citado.	Biología	Molecular	de	la	Célula.	y	con	NaftolFosfato	si	es	AP.	pero	en	orden	inverso	y	luego	se	hacen	2	lavados	con	Neoclear.	McGraw-Hill.	Biología	Celular	y	Molecular. Incubación	con	Anticuerpo:	a)	Detección	Enzimática:	Si	el	detector	acoplado	a	un	anticuerpo	es	enzimático.	se	ve	por	microscopía	de	fluorescencia	con	filtro	de	excitación	y	emisión	según	el	fluoróforo	que	se	ocupe.	•	Para	inhibir	las	peroxidasas	endógenas	se	debe	lavar	con	Metanol:Peróxido	de	Hidrogeno	(9:1)	20	minutos	2	veces.	3.	Lavar	con	Tris-HCl	para	detener	la	reacción. Revelado:	Similar	a	otros	ensayos.METODOLOGÍA	1.	4.	por	ende	se	utilizan	alcoholes	en	porcentajes	decrecientes	para	eliminar	neoclear	y	trazas	de	parafina.	de	utiliza	la	batería	de	etanol	anterior.	Barcelona.	Cada	inmersión	se	hace	3	minutos.	Biochemistry.	• De	Robertis	E.
TIPOS	DE	MICROSCOPÍA	La	potencia	amplificadora	de	un	microscopio	óptico	está	limitada	por	la	longitud	de	onda	de	la	luz	visible.	Este	tipo	de	microscopio	es	muy	útil	a	la	hora	de	examinar	tejidos	vivos.	por	lo	tanto	su	uso	esta	mas	difundido	en	el	área	de	la	microbiologia.	Es	ideal	para	especimenes	delgados.	aumentando	el	contraste.	Cuando	las	modificaciones	de	estos	parámetros	no	fueron	suficientes.	solo	es	captada	la	luz	dispersada	por	el	objeto.	Este	anexo	resume	algunos	tipos	de	microscopía	que	existen	en	la	actualidad.	El	microscopio	de	contraste	de	fase	se	desarrolló	para	incrementar	las	diferencias	de	contraste	entre	células	y	el	medio	que	las	rodea.	por	lo	que	se	utiliza	con	frecuencia	en	biología	y	medicina.	que	contiene	un	dispositivo	en	forma	de	anillo	que	reduce	la	intensidad	de	la	luz	y	provoca	un	cambio	de	fase	de	un	cuarto	de	la	longitud	de	onda.	y	en	consecuencia.	En	general	no	es	un	tipo	de	microscopio	muy	usado	pero	se	debe	notar	que	con	él	se	pueden	observar	algunas	estructuras	que	son	invisibles	de	visualizar	en	la	microscopía	de	campo	claro	y	de	contraste	de	fases	como	por	ejemplo	los	penachos	de	los	flagelos	de	las	bacterias.	la	sombra	representa	más	una	diferencia	en	el	índice	de	refracción	que	una	diferencia	de	grosor.	como	en	el	microscopio	de	campo	oscuro.	Fue	diseñado	para	observar	relieves	de	especimenes	muy	difíciles	de	manejar.	Este	tipo	de	iluminación	provoca	variaciones	minúsculas	en	el	índice	de	refracción	de	un	espécimen	transparente.	Se	usa	principalmente	para	aumentar	el	contraste	entre	las	partes	claras	y	oscuras	de	las	células	sin	colorear.	El	material	a	observar	se	colorea	con	colorantes	específicos	que	aumentan	el	contraste	y	revelan	detalles	que	no	se	aprecian	de	otra	manera.	se	idearon	nuevamente	otras	tecnologías.	Sin	embargo.	esto	se	consigue	por	un	condensador	especial.	es	muy	utilizado	en	los	tratamientos	de	fertilización	in	vitro	actuales.	dado	que	también	en	este	caso	se	utilizan	las	diferencias	de	fase	producidas	por	la	luz	que	atraviesa	el	objeto.	Esta	microscopía	se	usa	cuando	el	espécimen	es	muy	grueso	para	usar	contraste	de	fase.	la	masa	de	los	elementos	celulares	individuales.	definiendo	sus	fundamentos.	Este	tipo	de	microscopía	está	construida	sobre	la	base	de	principios	similares	al	microscopio	de	contraste	de	fase.	La	luz	pasa	directamente	y	se	aprecian	detalles	que	estén	naturalmente	coloreados.	pudiendo	determinar	la	masa	por	unidad	de	superficie	del	preparado.	En	este	caso	la	muestra	se	ilumina	en	forma	oblicua.	así	se	puede	ver	el	objeto	brillante	sobre	un	fondo	oscuro.	luego	un	segundo	prisma	junta	los	dos	rayos	en	uno.	En	la	microscopia	de	campo	oscuro	se	ocupa	básicamente	el	mismo	principio	que	en	la	de	campo	claro.	Se	utiliza	habitualmente	en	investigación	porque	permite	la	observación	en	montajes	húmedos	(en	los	que	la	muestra	permanece	viable).	MICROSCOPÍA	DE	CONTRASTE	DE	FASE.	.	Esta	técnica	utiliza	luz	blanca	que	pasa	a	través	de	un	prisma	que	divide	el	rayo	de	la	luz	incidente	de	manera	que	una	parte	del	rayo	pasa	a	través	de	una	región	del	espécimen	mientras	que	la	otra	parte	pasa	a	través	de	una	región	adyacente.	El	microscopio	de	fase	ilumina	el	espécimen	con	un	cono	hueco	de	luz.	o	células	aisladas.	MICROSCOPÍA	DE	INTERFERENCIA.	haciéndolo	visible.	la	diferencia	reside	en	el	sistema	de	iluminación	y.	Es	por	esto	que	surgieron	nuevos	instrumentos	de	microscopía	que	modificaron	tanto	la	forma	de	iluminar	la	muestra	como	la	longitud	de	onda	con	la	cual	se	observa.	MICROSCOPÍA	DE	INTERFERENCIA	NOMARSKI	(microscopía	diferencial	de	contraste	de	interferencia).	por	lo	tanto.	mediante	este	microscopio	es	posible	obtener	datos	cuantitativos.	en	el	microscopio	de	fase	el	cono	de	luz	es	más	estrecho	y	entra	en	el	campo	de	visión	del	objetivo.	lo	que	permite	su	visualización	sin	necesidad	de	tinción.	Es	una	variante	especial	de	la	microscopía	de	interferencia	cuya	base	radica	en	que	utiliza	dos	rayos	de	haces	luminosos	separados	con	polaridad	opuesta	y	las	imágenes	combinadas	aparecen	como	si	la	célula	estuviera	proyectando	sombras	hacia	un	lado.	modo	de	operación	y	resultados	visibles	que	cada	uno	de	ellos	entrega.	Mientras	que	el	microscopio	de	contraste	de	fase	es	solo	un	instrumento	cualitativo.	MICROSCOPÍA	ÓPTICA	NORMAL	(de	campo	brillante	coloreado).	MICROSCOPÍA	DE	CAMPO	OSCURO.	MICROSCOPÍA	DE	CAMPO	BRILLANTE.	Genera	una	imagen	en	la	que	parece	que	el	espécimen	proyecta	una	sombra	hacia	un	lado.	en	la	imagen	recibida.	El	material	se	observa	sin	coloración.
epon)	para	luego	ser	cortadas	y	obtener	secciones	ultrafinas	(50-100	nm	de	espesor).	lo	cual	descarta	investigaciones	en	células	vivas.	cuyo	sistema	suele	estar	construido	en	cuarzo.	La	longitud	de	onda	más	corta	de	la	luz	visible	es	de	alrededor	de	4.	Lo	que	en	teoría	permite	obtener	un	poder	de	resolución	muy	elevado.	glutaraldehido	seguido	de	tetróxido	de	osmio).000X	y	2.	La	longitud	de	onda	de	los	electrones	que	se	utilizan	en	los	microscopios	electrónicos	es	de	alrededor	de	0.	Los	MET	utilizan	electrones	acelerados	con	voltajes	de	30	a	100	kV	y	su	longitud	de	onda	es	aproximadamente	100.	que	utiliza	luz	visible.	El	principio	que	utiliza	este	tipo	de	microscopía	es	que	la	luz	UV	duplica	el	poder	de	la	resolución	del	microscopio	óptico.	por	lo	que	se	pueden	detectar	con	facilidad.	Así	mismo.	los	objetos	se	ven	brillantes	sobre	un	fondo	oscuro.	Además	permite	apreciar	y	es	útil	para	el	estudio	de	células	vivas.	Una	limitación	de	este	tipo	de	microscopia	es	el	requerimiento	de	utilizar	alto	vacío.	En	consecuencia.	Generalmente	usa	fluorescencia	y	es	iluminado	mediante	láser.	.	MICROSCOPÍA	DE	LUZ	ULTRAVIOLETA.	que	es	invisible.	ya	que	el	contraste	depende	del	número	de	electrones	dispersados	y	este	a	su	vez	depende	del	número	atómico	de	los	átomos	de	la	muestra.	Se	basa	en	un	sistema	de	barrido	por	planos	de	la	muestra	en	el	que	son	eliminados	todos	los	puntos	desenfocados	de	la	preparación	mediante	un	filtro	ubicado	con	alta	precisión	para	que	coincida	con	el	punto	iluminado.	permite	el	paso	de	la	luz	UV.	En	principio	se	debe	a	que	reemplaza	la	luz	visible	por	un	haz	de	electrones.	Las	muestras	a	ser	estudiadas	deben	ser	fijadas	(ej.	La	construcción	del	microscopio	electrónico	representa	un	verdadero	logro	en	cuanto	a	incrementos	del	aumento	y	poder	de	resolución.	las	muestras	deben	ser	teñidas	con	sales	de	metales	pesados	(osmio.	Y	la	formación	de	la	imagen	se	registra	en	una	película	fotográfica.	debido	a	la	división	que	sufre	la	luz	polarizada	plana	al	traspasar	la	muestra.	deshidratadas	y	luego	incluidas	en	una	resina	monomérica	(ej.	El	microscopio	confocal	ha	permitido	solucionar	este	problema	eliminando	estas	áreas	borrosas	y	creando	una	imagen	tridimensional	computarizada	de	alta	precisión.	dejando	pasar	solo	la	luz	de	longitudes	de	onda	más	baja	y	el	segundo	filtra	la	luz	transmitida	dejando	pasar	solo	la	luz	de	longitudes	de	onda	mayores.	Uno	que	filtra	la	luz	incidente.	También	se	puede	visualizar	el	interior	de	las	membranas	celulares	realizando	técnicas	de	criofractura	y	grabado	por	congelación.	De	esta	forma	se	logra	que	los	diferentes	componentes	celulares	aparezcan	con	distintos	grados	de	contraste.	MICROSCOPÍA	DE	FLUORESCENCIA.	Este	microscopio	es	usado	en	la	detección	de	proteínas	intracelulares	como	la	tubulina.000.000X	con	una	resolución	de	10	Ao	y	1	Ao	respectivamente.	Dado	que	los	electrones	tienen	una	longitud	de	onda	mucho	menor	que	la	de	la	luz	pueden	mostrar	estructuras	mucho	más	pequeñas.000	veces	menor	que	la	longitud	de	la	luz	visible.	Las	moléculas	fluorescentes	absorben	luz	de	una	determinada	longitud	de	onda	y	emiten	luz	de	una	longitud	mayor.	Los	cortes	deben	ser	ultrafinos	debido	a	que	los	electrones	tienen	un	poder	de	penetración	muy	limitado.	Presenta	la	gran	ventaja	de	producir	imágenes	tridimensionales.	El	primero	es	que	el	preparado	debe	ser	extremadamente	fino	y	el	segundo	es	que	solo	ciertas	partes	se	observan	con	nitidez	mientras	que	las	otras	se	perciben	borrosas	y	poco	claras.	-	Microscopía	electrónica	de	Transmisión	(MET).	Esta	microscopía	se	caracteriza	por	utilizar	dos	filtros	polarizantes	que	permiten	observar	estructuras	anisótropas	o	birrefringentes.	Existen	diferentes	tipos	de	microscopia	electrónica	desarrolladas	hasta	este	momento.MICROSCOPÍA	DE	LUZ	POLARIZADA.	Este	tipo	de	microscopios	permiten	obtener	aumentos	mínimos	de	1000X	y	aumentos	máximos	que	pueden	oscilar	entre	200.	mediante	este	tipo	de	microscopia	es	posible	obtener	información	respecto	a	la	estructura	a	nivel	molecular.	a	través	de	microinyecciones	en	un	proceso	llamado	citoquímica	análoga	MICROSCOPÍA	DE	BARRIDO	CONFOCAL.5	angstroms.	como	ciertas	inclusiones	celulares	o	las	fibras	musculares.	Los	objetos	pueden	poseer	fluorescencia	natural	(autofluorescencia	como	la	vitamina	A)	o	fluorescencia	artificial	mediante	la	adición	de	colorantes	como	la	fluoresceína	o	la	rodamina.	El	microscopio	de	luz	ultravioleta.	La	birrefringencia	de	un	objeto	depende	de	una	estructura	regular	determinada.000	angstroms	(1	angstrom	es	1	x	10-10	metros).	uranio	o	plomo).	MICROSCOPÍA	ELECTRONICA.	así.	El	microscopio	de	fluorescencia	es	capaz	de	detectar	la	emisión	de	estas	sustancias	debido	a	que	posee	2	filtros.	Su	gran	poder	de	aumento	asociado	a	su	excelente	resolución	hacen	que	este	microscopio	sea	particularmente	útil	para	el	examen	de	organelos	celulares.	La	principal	importancia	de	éste	es	que	los	ácidos	nucleicos	absorben	luz	UV	a	260	nm.	Al	observar	una	muestra	con	microscopio	óptico	común	se	presentan	dos	problemas.
Esta	limitación	se	puede	superar	mediante	el	MAV	cuyo	haz	de	electrones	es	10	veces	mas	rico	en	energía	que	el	MET.	El	MET	está	limitado	por	escaso	poder	de	penetración	del	haz	de	electrones.	A	continuación	la	muestra	es	recorrida	por	un	haz	focalizado	de	electrones.	Sin	embargo.-	Microscopía	electrónica	de	Alto	Voltaje	(MAV).	Aquí	la	muestra	es	fijada.	La	gran	profundidad	de	foco	y	la	baja	resolución	lograda	por	este	microscopio	hacen	que	sea	particularmente	útil	en	el	estudio	de	los	detalles	superficiales	de	células	o	tejidos.	se	mantiene	constante	la	corriente	debido	al	movimiento	constante	de	la	sonda	hacia	arriba	y	hacia	abajo	por	las	irregularidades	de	la	superficie	del	preparado.	.	pero	no	de	organelos	celulares.	en	el	cual	la	profundidad	es	mayor	cuanto	mas	grueso	es	el	corte	de	tejido.	Al	chocar	los	electrones	contra	cada	punto	de	la	superficie	metálica	los	electrones	se	dispersan	y	se	emplean	para	controlar	la	intensidad	de	un	segundo	haz	que	se	mueve	sincrónicamente	con	el	haz	primario	y	forma	una	imagen	sobre	una	pantalla	de	televisión.	Por	debajo	de	la	superficie	del	preparado.	La	información	obtenida	durante	estos	movimientos	se	registra	en	una	computadora.	De	esta	forma	se	produce	una	imagen	completa	y	muy	aumentada	de	la	muestra.	Mientras	que	ésta	se	desplaza	por	sobre	el	preparado.	la	resolución	alcanzada	por	el	MEB	es	menor	que	la	obtenida	por	el	MET	(10nm	con	un	aumento	efectivo	de	20.	Con	este	instrumento	es	posible	captar	la	estructura	de	la	superficie	de	un	preparado	hasta	el	nivel	atómico.	Este	microscopio	proporciona	una	gran	profundidad	de	foco.	se	seca	y	se	cubre	con	una	fina	película	de	un	metal	pesado.000	veces).	Se	aplica	luego	un	contacto	eléctrico	en	el	extremo	de	la	sonda.	Este	microscopio	es	muy	semejante	al	MET	pero	presenta	dos	diferencias	fundamentales:	posee	un	haz	de	electrones	móvil	que	recorre	la	muestra	en	áreas	determinadas	y	utiliza	la	emisión	secundaria	de	electrones	para	la	formación	de	la	imagen.	que	al	mismo	tiempo	barre	por	sobre	la	superficie	del	preparado.	la	cual	produce	una	imagen	de	la	superficie	del	preparado.	El	principio	se	basa	en	colocar	una	sonda	delgada	a	una	distancia	de	hasta	1	nm.	La	MTB	permite	entre	otros	adelantos	obtener	la	imagen	de	la	molécula	del	ADN.	Si	después	se	analizan	las	fotografías	mediante	un	estereoscopio	se	obtiene	un	notable	efecto	tridimensional.	De	este	modo	se	crea	un	túnel	de	electrones	a	través	de	la	hendidura	formada	entre	el	preparado	y	la	sonda.	Este	tipo	de	microscopía	permite	observar	cortes	de	tejido	más	gruesos	ya	que	el	mismo	preparado	es	fotografiado	desde	dos	ángulos	diferentes.	lo	que	permite	obtener	excelentes	imágenes	tridimensionales.	-	Microscopía	electrónica	de	túnel	de	barrido	(MTB).	Su	utilización	esta	limitada	debido	a	que	el	preparado	debe	ser	un	conductor	eléctrico.	-	Microscopía	estereoelectrónica.	Esto	implica	la	necesidad	de	utilizar	cortes	de	tejidos	muy	delgados.	-	Microscopía	electrónica	de	barrido	(MEB).
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