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Timestamp: 2016-08-29 03:06:25+00:00

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Uni 07200
BrowseUploadSign inJoinBooksAudiobooksComicsSheet MusicWelcome to Scribd! Start your free trial and access books, documents and more.Find out more31 UNIV DIAG 2000;1(2):31-41LABORATORIOS BETERÁ
Dra.Hilda Marilín García Pérez1
RESUMEN Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas en dependencia fundamentalmente de su carga bajo la influencia de un campo eléctrico. Se dio una visión general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para proteínas en condiciones nativas o desnaturalizadas, se incorporaron nuevos conocimientos tomados de la literatura reciente a los conceptos tradicionales de este método, como son la adición de compuestos de restricción de la difusión y que aumentan la estabilidad de los geles. Se ejemplificó el comportamiento anómalo de algunas proteínas en la determinación del peso molecular por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizadas. Palabras clave: electroforesis, poliacrilamida, geles.
1. Fundamentos de la electroforesis La electroforesis es la migración de solutos iónicos bajo la influencia de un campo eléctrico; Estas partículas migran hacia el cátodo o ánodo (electrodos - y +), en dependencia de una
combinación de su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que a escala analítica, los métodos electroforéticos son de alta sensibilidad, poder de resolución y versatilidad, y sirven como método de separación de mezclas complejas de ácidos nucleicos, proteínas y otras biomoléculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se pueden conocer también mediante estas técnicas, las características ácido-básicas de las proteínas presentes en un extracto crudo, lo que da la información necesaria si se pretende realizar una separación cromatográfica basada en diferencias de carga. Es útil además para determinar otros parámetros como peso molecular, punto isoeléctrico y número de cadenas polipeptídicas de las proteínas. La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
Master en Ciencias Bioquímicas. Investigadora Agregada.
almidón. tiempo de corrida. acetato de celulosa. Forma. Electroforesis en gel de poliacrilamida La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel. mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la zona de aplicación. La naturaleza de la muestra sirve de guía para alcanzar las condiciones en la que se deben obtener los mejores resultados. esta no migra. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros. N. Con el desarrollo de la ciencia se han diseñado equipos automatizados de electroforesis como el PhastSystem. Métodos electroforéticos zonales Son útiles para lograr la separación de componentes de mezclas complejas. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder y cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). agarosa. Hay muchos factores que desempeñan una función importante en la separación electroforética. N. como son pH. etc. La carga neta de la partícula está dada por el pH del medio y puede ser modificada por la interacción con pequeñas moléculas de iones u otras macromoléculas. con el análisis de cómo influyen los diferentes factores en la electroforesis en cuestión. N´-metilen-bis-acrilamida CH2 = CH. Se aplican pequeñas cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido. De lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de migración de las moléculas. relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado.CH2 . N´-tetrametilen-diamina (TEMED) se emplean como catalizadores de esta reacción. concentraciones de acrilamida y bisacrilamida. fuerza iónica. En contraste.5 por lo que la solución debe ser desgasificada para lograr una formación de gel reproducible. Este método tiene gran poder resolutivo porque se aplica una cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha. que se producen por radicales libres de oxígeno. insolubles en agua.1 La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas. es químicamente inerte. etcétera.CO . por causa de la acción de iones persulfato.32
cuando se aplica un campo eléctrico de 1 V/cm. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de convección del solvente.CH = CH2. Por debajo del punto isoeléctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el cátodo.2.NH .1 Las aminas terciarias como el N. porque causan la formación de radicales libres del persulfato. se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro. del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de electroforesis.
. en la práctica se determinan experimentalmente.NH . Su signo es igual al de la carga de la partícula. El voltaje no se puede incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor. ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de disociarse.1.4 Esta reacción es fuertemente inhibida por altos niveles de oxígeno. que se impregna con una solución de tampón. pH al cual su carga neta es 0. poliacrilamida. además. La polimerización se inicia con la formación de radicales libres del monómero. por causa de la difusión por tiempo muy prolongado de la corrida electroforética. 2. 2 En el punto isoeléctrico de la biomolécula. Las condiciones óptimas de una buena separación. Como soportes han sido utilizados papel (celulosa).
2. geles transparentes con estabilidad mecánica.CO . la iniciación del control catalítico y el tiempo de elongación de la cadena comienzan a ser diferencialmente controlables. al aplicar bajo voltaje puede ocurrir una pobre separación.6 Bambeck 7 reporta que durante la polimerización del gel a temperaturas inferiores a 17 ºC. gradiente de potencial. La velocidad de migración electroforética depende de la densidad de carga de la molécula (relación carga / peso). de propiedades uniformes.3 2. capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. y por encima del punto isoeléctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el ánodo. Formación del gel de poliacrilamida Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización vinílica del monómero acrilamida CH2=CH-CO-NH2 y del monómero entrecruzador N.
4.bisacrililcistamina
(BAC) cuyo gel resultante se une por los grupos bisulfuro. Al aplicar muestras biológicas en un gel con gradiente de acrilamida. pero en general el tamaño del poro disminuye con el incremento del %T.9 Las proporciones en que ambas se encuentran determinan las propiedades físicas del gel como son densidad.10 Para separar moléculas por tamaño.10 plantearon que la bis-acrilamida puede actuar como terminador de la cadena en el proceso de polimerización y concentraciones altas pueden disminuir el tamaño de poro máximo de gel. En general se recomiendan valores de T de 5 a 15 % y de C de 2 a 4 %. Tipos de monómeros La bis-acrilamida es el agente entrecruzador más comúnmente empleado en este tipo de electroforesis.5.3. Catalizadores empleados en la formación del gel de poliacrilamida La polimerización se lleva a cabo con la utilización de sistemas catalíticos redox como por ejemplo:
• Persulfato de amonio (agente oxidante) y
TEMED como agente reductor. Se ha determinado que la movilidad de las partículas cargadas es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la fuerza iónica. resistencia mecánica y el tamaño del poro. O Gaal y otros en 1984. La concentración de bis-acrilamida (% C) representa el porcentaje de este monómero en el gel y determina el grado de entrecruzamiento.
Significación de % T y % C
La concentración de acrilamida (% T) representa el porcentaje en peso del monómero total empleado (acrilamida + entrecruzador en gramos por 100 mL) y determina la longitud promedio de la cadena del polímero. La fotopolimerización con riboflavina no es inhibida por el oxígeno. La estructura del gel comienza a ser evidente a 4 % T. sulfato de hierro y ácido ascórbico.33
2. NC.1 2. a baja m se eleva la velocidad de migración y es menor la difusión.N´-(1. 2.6. Las moléculas menores comienzan a tener alta fricción cuando los poros son más pequeños. La polimerización no ocurre a bajo pH. lo que hace que pueda disolverse en soluciones de reactivos tiólicos y el N. mientras que las grandes comienzan la fricción en los poros de mayor tamaño.2dihidroxietileno) bis-acrilamida o DHEBA forma geles de poros altamente hidrofílicos. en ambos casos el TEMED actúa como agente reductor suave y acelera la polimerización. sin embargo. Se han reportado otros agentes entrecruzadores como: la N. En la electroforesis. N´-diallitartar diamina (DATD) que da un tamaño de poro mayor que el obtenido con bis-acrilamida. • Persulfato de amonio y 3-dimetilamino propionitrilo (DMAPN). la N. ya que requiere radicales de monómeros libres formados por catálisis básica de radicales oxígeno del persulfato. es necesario tomar en cuenta la relación entre el poro efectivo del medio y el tamaño de la molécula que se pretende separar. elasticidad. Si el poro del medio es significativamente mayor que la molécula. no-homogeneidad del material. los efectos de absorción de agua.8 2. 0.1 Con el aumento de la m. • Peróxido de hidrógeno. de manera que la zona de separación es más ancha y mayor la resolución.2-5 % C. se incrementa el desprendimiento de calor y la evaporación. intercambio iónico con grupos cargados del soporte y electroendósmosis. la separación electroforética será sobre la base de diferencias de carga y el tamizaje molecular será mínimo. pueden influir sobre la movilidad y la calidad de la separación. La electroendósmosis generalmente ocurre porque grupos cargados del soporte se ionizan en
. Sistemas de tampón que se emplean en la electroforesis en geles de poliacrilamida La fuerza iónica (m) determina el potencial electrocinético ya que reduce la carga neta de los grupos con cargas efectivas.8 Los factores que gobiernan la talla del poro del gel son complicados. todas las macromoléculas comienzan su migración a bajo porcentaje y en la medida en que avanzan se encuentran con poros más pequeños que retardan su movimiento.
pero el pH de estas y el tampón de corrida empleado en los electrodos es diferente. generalmente de una menor altura (1/3 del gel separador).
. son separadas en geles con pH entre 8 y 9. se forma un gradiente de voltaje en esta región que acelera el movimiento de los iones rezagados. donde la migración está determinada por la carga y el tamaño molecular de las partículas. ocurren cambios en la movilidad de los constituyentes por causa del pH. efecto que se compensa con la mayor pendiente de este último.(iones conductores) y glicinato (iones rezagados) migran en la misma dirección que las moléculas de la muestra. La electroforesis en geles de poliacrilamida puede realizarse en el rango de pH de 2 a 11. especialmente de proteínas pequeñas. La principal desventaja del primero. los más empleados son gel uniforme y tampón homogéneo. y gel y tampón heterogéneo.5.15 Al aplicar esta teoría a un sistema con tris-HCl en ambos geles y tris-glicina como tampón de corrida. La mayoría de las proteínas con puntos isoeléctricos comprendidos entre pH 4 y 7. El proceso general en PAGE-SDS discontinuo consta de 3 etapas: concentración. Es usual utilizar concentraciones de tampón en un rango entre 0. los iones Cl. esto provoca un movimiento relativo del solvente respecto al soporte sólido y que las moléculas no cargadas sean transportadas hacia el cátodo a pesar de no tener grupos ionizados.1 mol/L.6. Encima de este gel se sitúa el gel concentrador. porque no hay efecto concentrador en la primera parte de la corrida. por lo que se puede concentrar la muestra. 14 Esto se fundamenta en
que los constituyentes iónicos de las soluciones tampones utilizadas en ambos geles son iguales. es que la resolución es menor que con los sistemas heterogéneos. separándose del resto de las especies iónicas y dejando tras de sí una zona de baja conductividad. entre los iones conductores y los rezagados (entre las regiones de alto y bajo gradiente de voltaje). Al comenzar la electroforesis. en el que la muestra se concentra en una zona muy estrecha.5 mol/L en sistemas fuertemente ácidos. Sistemas de electroforesis. de esta manera se forma el denominado límite de Kohlraush. Dependiendo de los componentes individuales de la muestra estos migran en bandas discretas. Las movilidades de los componentes de la muestra son intermedias entre las de los iones conductores y rezagados. La separación ocurre en el gel separador. sin embargo la desaminación de las proteínas o las reacciones hidrolíticas pueden ser severas a valores de pH inferiores a 3 y superiores de 10.34
soluciones tampón neutras o ácidas y los contraiones libres hidratados (H3O+) migran hacia el cátodo. La fuerza iónica del sistema tampón debe mantenerse a un nivel adecuado para garantizar la solubilidad de la muestra y suficiente capacidad amortiguadora. En el sistema discontinuo o heterogéneo se varían el poro del gel y los iones del tampón. pero pueden emplearse concentraciones sobre 0. lo que hace que estos migren en seguida detrás de los iones conductores y a la misma velocidad. son más anchas en el sistema homogéneo que en el heterogéneo.12 En la actualidad es común que la electroforesis discontinua se realice con 2 tipos de geles. La conductividad específica es inversamente proporcional a la fuerza del campo eléctrico. en capas de solo algunos micrones de grosor. pues a bajos valores de pH muchos ácidos débiles (que son los más empleados) están débilmente ionizados y es necesaria una alta concentración para obtener la adecuada capacidad amortiguadora.025 y 0.tienden a moverse rápidamente. La teoría de MZE fue formulada por Jovin. La principal ventaja de la teoría de MZE es la flexibilidad con que puede ser aplicada en el fraccionamiento analítico o preparativo. se observa que las 2 especies iónicas existentes Cl . Electroforesis de múltiples zonas (MZE)
El sistema de electroforesis a emplear depende de los objetivos a alcanzar.1 Cuando la muestra concentrada llega a la interfase entre el gel concentrador y separador. lo que determina la separación en bandas finas en el gel separador y alto poder de resolución. por lo que se encontrarán en la región límite. la fuerza iónica y el efecto de tamizaje del gel.13. los sistemas homogéneos tienen la ventaja de ser rápidos. un gel concentrador (de poros grandes) y un gel separador (de poros pequeños).1
2. sencillos. desconcentración y resolución.11 Cuando no es necesaria una gran resolución.1. Las bandas.
El tratamiento concomitante con un agente reductor de puentes bisulfuro. El anión se une a las proteínas por absorción no específica (aproximadamente una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos.025 % de SDS en el tampón superior es suficiente. Se ha determinado que con 5 min a 95-100 ºC es suficiente para la formación de enlaces estables SDS-proteína a una concentración de 1 % de SDS. Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior. lográndose así una alta resolución en corto tiempo. como el beta mercaptoetanol ( β ME) o el DTT desnaturaliza las proteínas y las rompe en las subunidades que la componen. El SDS desnaturaliza por completo las proteínas y rompe las interacciones no covalentes que determinan la estructura terciaria y cuaternaria.8. se emplea 1 % para lograr un margen de seguridad. el SDS y las proteínas se concentran en la misma zona. pero se ha demostrado que 0. lo que da la ventaja de asegurar las condiciones y la eficiencia de polimerización de los geles sin SDS.35
2. sin embargo se utiliza 0.4 g/g).7. El complejo SDS-proteína es estable durante 3 meses a 4 ºC. por lo que el SDS no es necesario adicionarlo en los geles si este está presente en la muestra y en el tampón superior. también se emplea para la determinación del peso molecular de las subunidades de proteínas. No obstante Bjellqvist 18 ha reportado que diferentes proteínas de igual talla pueden migrar como una banda única. Bajo iguales condiciones de pH y temperatura. varilla cilíndrica y lámina horizontal. Formatos de la PAGE Existen 3 formas diferentes de realizar electroforesis en geles de poliacrilamida: lámina vertical. Se ha demostrado que concentraciones en el rango de 0. El complejo SDS-proteína tiene forma de varilla con un diámetro aproximado de 18 Å y una longitud proporcional al peso molecular de la cadena polipeptídica. pero como la cantidad de SDS es muy grande comparada con la de proteínas y su concentración en el gel concentrador se puede regular. mientras que los grupos sulfato en la superficie y todos los complejos SDS-proteína toman carga neta negativa (que excede la carga intrínseca de las cadenas de aminoácidos).4 La estructura del detergente SDS empleado en esta variación de la electroforesis en gel de poliacrilamida es CH3 (CH2) 10 CH 2 = SO3 . Los tiempos de tinción y destinción son menores también porque la difusión es muy rápida.8 La migración de los derivados proteína .02 a 0.16 2. por lo tanto pueden ser corridos a mayor voltaje.8 Se ha planteado que la resolución de las moléculas generalmente aumenta con la disminución del grosor del gel. Los geles más finos son más económicos porque emplean menos reactivos y pueden ser eficientemente refrigerados durante la corrida. sin embargo. Comportamiento de las proteínas en la electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS) La electroforesis con SDS es un excelente método para identificar y monitorear las proteínas durante un proceso de purificación. La concentración apropiada de SDS en el tampón superior. sin embargo como el gel es tan fino es más propenso a perturbaciones y problemas en la polimerización.Na+ .03 % para obtener un margen de seguridad. Por lo que el complejo SDS-proteína tiene generalmente mayor densidad de carga y menor tamaño que las proteínas nativas.17 La relación carga/masa es aproximadamente igual para todas las proteínas de la muestra por lo que la talla de esta deviene en el factor determinante de la separación. Las proteínas reaccionan con SDS a relativamente alta concentración. con una relación SDS/proteína máximo de 1.8 El Rf es una medida convencional de la movilidad de la proteína relativa al frente de
migración y se define como la distancia desde el inicio del gel separador hasta el centro de cada banda dividida entre la distancia a la que ha migrado el ión líder. en presencia de EDTA y condiciones reductoras. El SDS-PAGE se emplea para estimar el peso molecular de las proteínas y se compara con un patrón.SDS hacia al ánodo es inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular (log PM). El SDS migra más rápido que el complejo proteína-SDS en un gel restrictivo.4 % de SDS es el nivel mínimo necesario para saturar los sitios de unión de la proteína. se determina incrementando la cantidad de SDS hasta que no exista variación en el Rf. se forma una zona de concentración amplia caracterizada
Adicionalmente las proteínas no reducidas. Schuhmacher M y otros 19 en estudios con la lisozima de huevo durante la electroforesis demostraron que el β ME y del DTT forman
aductos bisulfuro con las proteínas. Las condiciones pueden ajustarse dependiendo de como se necesite separar las proteínas (en estado completamente desnaturalizada.8 Estos autores demostraron que el ión glicinato no se concentra con el gel concentrador. La concentración de pequeñas proteínas es difícil en estas condiciones. se debe aplicar el que abarque el peso molecular esperado para la proteína que se quiere determinar. parcialmente desnaturalizada o nativa). Es necesario la existencia de patrones y proteínas conocidas de igual configuración para una comparación válida. pueden no estar del todo saturadas con SDS por lo que puede variar su relación peso/peso en su interacción con el detergente. la movilidad electroforética del complejo SDS proteína se altera bajo estas condiciones de disociación y durante la electroforesis la movilidad de los oligómeros SDS proteínas es menor que con los componentes SDS polipéptidos completamente desnaturalizados. lo que se determina por la intercepción de sus líneas a 0 % T. EL SDS-PAGE bajo condiciones reducidas y no reducidas es un método muy útil para el análisis de los puentes bisulfuro que contienen las proteínas. Los valores de Kr podrían minimizarse para todas las proteínas patrones por selección de valores bajos de C. Existen patrones (mezclas de proteínas de peso molecular conocido y que se tiñen uniformemente) de varios rangos de peso molecular. Determinación de peso molecular de proteínas.8 El coeficiente de retardación (Kr) da una medida de la influencia del tamizaje sobre la movilidad de las biomoléculas. porque se forman complejos de proteínas y detergentes de igual talla y carga que las micelas de SDS solas. Comportamiento anómalo de diferentes proteínas en electroforesis El peso molecular (PM) de las proteínas puede determinarse en electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Las asociaciones covalentes entre las unidades de proteínas pueden mantenerse omitiendo el βME del tampón de muestras. Al realizar un ploteo del log PM de la proteína patrón como función del valor de Rf.4 El ploteo de Ferguson del log de Rf contra el % T del gel separador para varias proteínas patrones chequea el error sistemático del método. cuando las proteínas tienen gran cantidad de carbohidratos en su composición o cuando están unidas a complejos de membrana migran de manera aberrante. se ha reportado que es función del peso molecular y existe inclusive para moléculas pequeñas. lo que se determina al comparar los geles corridos con β ME o sin este. lo que puede estar provocado por una interacción entre la glicina y el SDS. Jeannot MA y Zheng J 20 reportaron un método de preparación de la muestra en el que se elimina el SDS del gel.8
. Se obtiene un ploteo de Ferguson no lineal en el fraccionamiento de pequeñas proteínas a una alta concentración de gel o de proteínas muy grandes que dan valores de Rf muy pequeños. En general. Se aprecia una progresiva difusión del borde de migración en la medida en que aumenta la concentración de T.9. Estos patrones deben ser tratados de manera similar a la muestra. por lo que recomienda el empleo de una mínima cantidad de SDS.8 por lo que no son recomendadas como marcadores de peso molecular. el peso molecular y las formas de diferentes isómeros. El peso molecular desconocido puede estimarse por el análisis de regresión lineal o por interpolación en la curva del log de PM contra Rf. Las proteínas pueden mostrar una respuesta individual característica a la reducción. se obtiene un gráfico ligeramente sigmoideo. 2. En ausencia de este agente reductor los puentes bisulfuro intracatenarios e intercatenarios de la muestra de proteínas permanecen intactos. Con el empleo del ploteo de Ferguson se pueden discriminar las diferencias de carga. Esto hace que las determinaciones de peso molecular con estas características no tengan la misma confiabilidad que el análisis hecho con polipéptidos del todo desnaturalizados. para lo que es importante que estas proteínas muestren uniformidad en su densidad de carga.36
fundamentalmente por ser estable con el frente de corrida y que continuamente aumenta durante la electroforesis dependiendo de la cantidad de SDS introducido en el tampón.
lo que provoca inestabilidad en este y dificulta su comercialización. esto hace que las moléculas puedan migrar más rápido a lo largo del gel y disminuye la resolución. por lo que las moléculas localizadas en esta migran a través del gel más rapido que las que están en los extremos. por gel de filtración. Cuando estas proteínas se separan por filtración en gel. Puede observarse que en un tampón continuo a pH 7 da una banda con peso molecular de 20 000 y en SDS -PAGE con sistema de tampón discontinuo se aprecian 2 bandas de PM 19 889 y 22 200. de una proteína recombinante inhibidora de la proteína fosfatasa-1(denominada inhibidor-3). pero la tendencia se incrementa con el aumento del porcentaje de acrilamida. Pero como la absorción de agua no es uniforme en cada porción del gel. por lo que es necesario tener en cuenta su comportamiento característico. sin embargo se pueden encontrar dificultades técnicas cuando varios multímeros de proteínas se analizan. alcoholes poliméricos. lo que deforma y afecta la reproducibilidad de la electroforesis. lo que puede no ser por causa de un aumento de la resolución en la técnica. Cuando se mantiene en tampón. la diferencia de concentración entre los geles concentrador y separador crea un potencial osmótico entre los 2 geles. En el sistema de electroforesis con tampón y gel heterogéneos.
2. Todos los geles de poliacrilamida absorben agua durante el proceso de polimerización y durante la conservación. etc. A pesar de que existen otros métodos más recientes para la determinación del peso molecular de proteínas. casi siempre es mayor en la región central que en los extremos. se ha reportado19 el análisis por espectrometría de masa por ionización en electroatomización (ESI-MS) para proveer de una determinación exacta del peso molecular de proteínas aisladas y no resueltas por SDS-PAGE. 16 Por todo lo anterior se ha planteado la utilización de compuestos que restringen la difusión.37
así como determinar el peso molecular de estos. Esta proteína tiene un peso molecular aparente de 23 kD en SDS-PAGE. Existen casos de migraciones anómalas de proteínas como por ejemplo la ferritina y apoferritina de bazo de caballo. sus propiedades geométricas e hidrodinámicas hacen que su talla y características superficiales sean diferentes de otras proteínas globulares típicas. polisacáridos. el gel absorbe rápidamente agua de este hasta llegar al equilibrio. Este proceso es muy rápido y continúa hasta que se establezca un equilibrio entre ambos geles como resultado de la difusión del agua al gel separador. los que pueden ser polioles. agente reductor de bisulfato y 5 min a 100 ºC ó 5 h a 37 ºC). lo que provoca que el agua pase del gel concentrador (región de bajo % acrilamida) hacia el separador (región de alto % de acrilamida). la electroforesis en geles de poliacrilamida no ha perdido su utilidad.21 hacen un interesante análisis del comportamiento anómalo en cuanto a la determinación de peso molecular. lo que no afecta
. Un gel no tiene una calidad aceptable si presenta poros no uniformes como resultado de la difusión de agua entre el gel de alto porcentaje y la atmósfera. por lo que el porcentaje de acrilamida no es estable en el gel separador y es necesario emplear los geles en el día de su preparación. ya que la apoferritina es inusualmente resistente a la desnaturalización y disociación en subunidades. Para completar el estudio de peso molecular de proteínas. Las características de tamizaje del gel están fundamentalmente dirigidas por el tamaño del poro y cuando el medio absorbe agua. Zhang J y otros. que actúan sobre la proteína fosfatasa-1.10. un peso molecular relativo de 55 000 y su peso molecular calculado es de 14 kD. que es extremadamente hidrofílica y estable al calor. sino por diferencias en la concentración de SDS. Estabilidad de los geles de electroforesis El principal problema que afecta la estabilidad y la resolución en todos los medios de electroforesis es la absorción y desorción. Estos compuestos se adicionan en la parte del medio de electroforesis en que se quiere inmovilizar el agua.8 en que se recomienda su empleo para calibrar SDS-PAGE solo bajo adecuadas condiciones de desnaturalización (2 % SDS. por lo tanto el fenómeno puede ser explicado por diferencias ocasionales en la estimación del peso molecular de los 2 tipos de SDS-PAGE. en el caso de la electroforesis en poliacrilamida cuando está sintetizando el gel concentrador. el tamaño medio del poro se incrementa. Esta característica se ha descrito también para las proteínas inhibidor-1 e inhibidor-2.
3 se cargan negativamente y migran a través de la zona de concentración. El proceso de difusión de agua es dependiente de la temperatura. agarosa 2 %. SDS 0. electroforesis y revelar estas automatizadamente. Si se desea prevenir la difusión de agua desde el tampón hasta el gel.38
el proceso electroforético que se puede seguir según el método convencional.13. El tampón de electrodo se suministra en forma de tiras de 2 tipos. hechos con reactivos de alta calidad y agarosa de baja electroendósmosis. se necesita una menor concentración para un gel uniforme que la necesaria para un gel discontinuo.112 mol/L y tris 0. Estas crean durante la corrida un sistema de tampón discontinuo o continuo según se desee. Phastsystem El equipo PhastSystem consiste en un sistema de electroforesis computarizado. aunque preparados con idéntica cantidad de catalizadores es de 0. por lo que la reducción de la difusión en el medio aumenta también la estabilidad térmica de este. estos se reflejan a continuación.8 en agarosa 2 % (acetato como iones líderes y L alanina como rezagados).8 3. empleados en el equipo PhastSystem. tris 0. las proteínas con punto isoeléctrico menor que 8. dependiendo de la cantidad de monómero y agente entrecruzador que contenga el gel.88 mol/L y tris 0.1. la concentración de un compuesto particular de restricción de la difusión dependerá del desbalance de potencial osmótico que se desee contrarrestar.2 mol/L.11.112 mol/L a pH 6.2 mol/L. Como el pH del gel toma un valor de 8.45 mm. es necesario añadir estos compuestos al tampón. además se le puede añadir agarosa en concentración de 0. Esto está dado porque no es igual el porcentaje de conversión de monómero en polímero. Temperatura durante la polimerización y la corrida del gel La movilidad de las proteínas varía entre otras causas porque la viscosidad del agua aumenta a bajas temperaturas (la distancia recorrida es aproximadamente 20 % mayor en la región central que es más caliente). La viscosidad del gel puede controlarse con la adición de polímeros.1. tanto para sistema nativo como desnaturalizado emplean como tampón acetato 0.
2. Fuentes de error en la electroforesis La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales.
. que es en este caso de L-alanina 0. Las longitudes de los geles concentrador y separador son de 13 y 32 mm respectivamente y su grosor de 0.8 Un promedio de la desviación estándar de los Rf determinados por geles hechos con la misma mezcla de polimerización es de 0. 3.4 en ambas zonas. Los compuestos de restricción de la difusión reportados por CM Starr16 son moléculas no cargadas hidrofílicas que contrarrestan el potencial osmótico entre 2 geles de electroforesis con diferente potencial osmótico o entre el tampón y el gel. en el cual se puede ejecutar focalización isoeléctrica.2 a 2 % p/v. Este efecto puede atenuarse con el empleo de un tampón más diluido o manteniendo temperaturas bajas durante el desarrollo de la electroforesis.25 mol/L pH 8. La eficiencia de polimerización incrementa comparativamente a 0 ºC por lo que sus propiedades físicas son superiores (para SDS-PAGE) a las de geles polimerizados a 25 ºC.01. posiblemente por una disminución del promedio de la longitud de la cadena de estos últimos. El PAGE-nativo en equipo PhastSystem emplea los mismos geles que el desnaturalizado. uno para electroforesis nativa y otro para desnaturalizada. solo cambia el sistema de tampón en las tiras. Los geles de electroforesis denominados PhastGel. El polietilenglicol es el agente hidrofílico de restricción de la difusión más empleado en el gel concentrador en electroforesis de poliacrilamida. mientras que entre geles hechos de diferentes lotes de polimerización. En geles vertidos a 25 ºC ocurre mayor variabilidad de los Rf si se comparan con los vertidos a bajas temperaturas.55 % pH 8.8. Esta alta concentración de SDS en las tiras permite eliminar el SDS del gel.
En las tiras para SDS-PAGE se emplea tricina 0. Sin embargo como el potencial osmótico depende de la hidrofilicidad de los compuestos y de la concentración molar.
destinción y fijación son esenciales en el caso de las proteínas pequeñas para evitar su elusión.3. sin embargo la visualización de la mayoría de las proteínas requiere el uso de colorantes.24 Este efecto cromático se ha demostrado que está dado por la difracción de la luz en la plata. ferritina y citocromo C. El empleo de niveles bajos de catalizador provoca que la superficie del gel se torne desigual y tienda a romperse con facilidad.). 4. para evitar la aparición de bandas fantasmas en la electroforesis (bandas dobles por la concentración de β ME o por el tiempo de incubación). y provocar que una simple proteína forme múltiples bandas en el gel. en este caso debe reducirse el TEMED y el persulfato de amonio o adicionar ferricianuro de potasio. hemoglobina.12 Seichi y Chait23 reportaron que la alquilación de la cisteína antes de la electroforesis evita la formación accidental de aductos de acrilamida durante la electroforesis. sin embargo algunas proteínas tienen colores característicos como las lipoproteínas que tienden a colorearse de azul y algunas glicoproteínas que aparecen amarillas. Preparación de las muestras En el caso de la SDS-PAGE es necesario lograr una completa desnaturalización de las proteínas. la omisión del metanol de la solución de tinción es beneficiosa ya que se reduce el tiempo de tinción y disminuye el hinchamiento de los geles.4
. Los colorantes orgánicos fueron los que se emplearon primero para teñir proteínas en los geles (ejemplo de estos bromofenol azul. poliacrilamida lineal e iones.2. Tiempo de corrida La determinación del tiempo adecuado de corrida es muy importante. Niveles de catalizador Una polimerización muy rápida puede deformar las bandas. pues corridas muy cortas impiden que las muestras avancen el espacio necesario para su correcta separación. al poner una capa de alcohol isobutílico en lugar de agua (en geles de bajas concentraciones deben emplearse alcoholes de altas densidades). entre ellos la recristalización de la acrilamida. entre ellos la plata que es muy sensible y tiene la característica de producir generalmente coloraciones carmelita o negro. con el objetivo de hacer más lenta esta.12 Existen diferentes tipos de tinción. en varias glicoproteínas y lipoproteínas por causa de su composición inusual.
3. Una rápida tinción. azul de Coomassie.22 3. pueden ser observadas directamente en los geles. 3. Velocidad de la polimerización.4 O Gaal y otros10 plantearon que el ácido acrílico y otras impurezas pueden ser eliminados por diferentes métodos. pero el empleo de altas concentraciones provoca que los geles tiendan a cuartearse. pero también se ha probado que tiempos de corrida cortos minimizan la dispersión de la muestra y el ensanchamiento de la banda. ya que es el constituyente más abundante del gel y sus principales impurezas son ácido acrílico residual (que puede retardar la movilidad electroforética de algunas proteínas).39
La uniformidad de la temperatura a través del gel mientras ocurre la corrida electroforética generalmente elimina el efecto de la deformación de las bandas en forma de “sonrisa”. porque las proteínas pueden unirse a impurezas como alkil sulfato C10. en particular esto es muy importante para la acrilamida.Tinción Las proteínas coloreadas naturales como la mioglobina. Se han
3.5.4. etc. C14 y C16. porque ocurre una contracción no uniforme del gel. Con SDS puro ocurre una migración anómala en proteínas muy básicas o muy ácidas. carmelitas o rojas. Este problema puede solucionarse en geles de altas concentraciones. En SDS-PAGE la calidad del SDS es importante. Pureza de los reactivos El empleo de reactivos de alta calidad y agua desionizada es un prerrequisito para hacer geles reproducibles y de alta resolución.
lo que evita la ruptura de este. US patent 5. Some traditional concepts about this methods such as the addition of compounds limiting diffusion and that increase the gel stability are analyzed. assignee. Von Jagow G. Saunders: College Publishing. Garfin DE. Academic Press. 1990. 1999 march 23. 2 ed. Biochemistry. después se introduce este entre 2 filmes de celofán transparentes y semipermeables colocado en forma de sandwich a ambos lados del gel o en uno y en el otro una lámina plástica. Inzana TJ. 5. 15. III y IV. Discontinuous and nonsequential polymeric gel systems for separation of macromolecules. Campell MK. US patent 4. Keywords: electrophoresis.753. Vereczkey L. Examples are given about the abnormal behavior of some proteins in the determination of the molecular weight by electrophoresis in polyacrylamide gels under disnatured conditions. 7. Tricine-sodium dodecyl sulfatePolyacrylamide gel electrophoresis for separation of proteins in the range from 1 to 100kDa. 2. Se recomienda el empleo de un poliol como el glicerol como un agente «húmedo» cuya función es además de actuar como un agente de restricción de la difusión. Novel Experimental Technology. 6. De esta forma los componentes acuosos del gel son reemplazados por los de la solución. Electrophoresis 1999.1995. Gaal O. 1985 Sep 17. 166. pero no para la determinación de pureza de proteínas trazas. Alpenfels WF. alcoholes de más de 4 carbonos y polímeros solubles en agua. Esta unión es totalmente reversible en condiciones apropiadas. Becker RG. Hooper HH inventor. USA patent number. 1990. Plastic mold for electrophoresis gel. Soane Biosciences assignee. Esta tinción requiere un medio ácido para la generación de la atracción electrostática entre las moléculas del colorante y los grupos amino de las proteínas. One dimensional gel electrophoresis. Adaptación de geles de poliacrilamida a sistema PhastSystem. Chávez Planes MA. impedir que el gel se seque por la evaporación durante la conservación. Esto permite que el gel se seque. 1998 May 19. Electrophoresis in the separation of biological macromolecules. US patent 5 885 432. deformación. inventors. 368-79. que une a las proteínas y al colorante formando un complejo. 1999 Aug 17. Apicella MA. Yamane DK. No se han reportado variaciones en geles tratados con este método después de 2 años. (1996) 8. pérdida de la transparencia y sin necesidad de emplear calor o presión reducida ni ningún aparato especial. Conservación de los geles de electroforesis Notsu K y Shiratori M 25 reportaron sumergir el gel después de electroforesis en una solución de sacáridos. The use of micro preparative electrophoresis of protein/peptide isolations for primary structure determinations. Polyacrylamide cross-linked with a polysaccharide resin as electrophoretic gel medium. I. II.] Facultad de Biología UH. García HM. Facultad de Biología Universidad de La Habana. Sheer DG. 10. con el empleo de combinaciones de tinción. Chalmers KC. 13. modificación de los aminoácidos de las proteínas. Hawke DH. 4. US patent 5 968 332. inventors. azúcares.200. FMC Corporation. compuestos fluorogénicos. Jovin TM. Schägger H. Manis D inventor. Opplt JJ. 3. Bambeck SG. Engelhorn S. polyacrylamide. Pau-Miau Yuan. Temas de enzimología. Uscrosslinked polymeric media for electrophoresis. Electrophoresis separation gel and method for preparing an electrophoresis separation gel. C C IMEX assignee. US patent 5 938 906. vol 182. Horizontal gel electrophoresis casting cassette. Methods in enzymology. La atracción iónica es a través de las fuerzas de Van Der Walls. Medgyesi GA.
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5. 12. Multiphasic Zone Electrophoresis.
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