Source: https://www.jove.com/video/54603/a-largo-plazo-de-alta-resolucin-microscopia-intravital-en-el-pulmn?language=Spanish
Timestamp: 2020-03-28 09:55:23+00:00

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Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window | Protocol (Translated to Spanish)
A largo plazo de alta resolución Microscopia intravital en el pulmón con una ventana de imagen vacío Estabilizado
La metástasis a sitios secundarios tales como el pulmón, el hígado y los huesos es un evento traumático con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 90% 1. De estos sitios, el pulmón es el más difícil de evaluar el uso de imágenes ópticas intravital debido a su posición cerrada dentro del cuerpo, la naturaleza delicada y papel vital en el mantenimiento de la fisiología adecuada. Mientras modalidades clínicas (tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética (MRI) y tomografía computarizada (TC)) son capaces de proporcionar imágenes no invasivas de este tejido, que carecen de la resolución necesaria para visualizar los eventos de siembra tempranas, con un solo píxel que consta de casi un millar de células. Los modelos actuales de pulmón metastásico postulado de siembra que los eventos justo después de la llegada de una célula tumoral son deterministas para la supervivencia y el crecimiento subsiguiente. Esto significa que se requieren herramientas de imágenes intravital en tiempo real con la resolución de una sola célula 2 con el fin de definir los fenotipos de la cel siembrals y poner a prueba estos modelos. Si bien las imágenes ópticas de alta resolución del pulmón se ha realizado utilizando diversas preparaciones ex vivo, estos experimentos son típicamente ensayos solo punto de tiempo y son susceptibles a artefactos y posibles conclusiones erróneas debido al ambiente dramáticamente alterado (temperatura, profusión, citoquinas, etc. ) como resultado de la eliminación de la cavidad torácica y el sistema circulatorio 3. Trabajos recientes han demostrado que las imágenes ópticas intravital-lapso de tiempo del pulmón intacta es posible utilizando un vacío estabiliza 2,4,5 ventana de imagen, sin embargo, los tiempos típicos de imagen se han limitado a aproximadamente 6 horas. Aquí se describe un protocolo para la realización de formación de imágenes intravital de lapso de tiempo a largo plazo del pulmón utilizando una ventana tal durante un período de 12 horas. Las secuencias de imágenes con lapso de tiempo obtenidos utilizando este método permiten la visualización y la cuantificación de las interacciones célula-célula, dinámica de la membrana y la perfusión vascular en el pulmón. más nos dESCRIBE una técnica de procesamiento de imágenes que proporciona una visión sin precedentes clara de la microvasculatura pulmonar.
Alta resolución de imagen óptica intravital ha demostrado ser crucial para la comprensión de muchos procesos biológicos, lo que permite de una sola célula y parámetros sub-celulares que han de medirse y cuantificarse. En la investigación del cáncer, intravital de imágenes de las células tumorales y estroma ha llevado al descubrimiento de muchas interacciones microambientales 6-11 que sólo están presentes en el animal intacto.
Descubrimientos sobre microambientes asociados con intravasación y diseminación de las células tumorales en el cáncer de mama utilizando imágenes ópticas resolución única célula in vivo, incluso ha dado lugar a nuevos marcadores de pronóstico y respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer de mama 12-16. Las mejores tecnologías de imagen disponibles para su visualización en lo profundo de los órganos vitales internos intactos son las modalidades clínicas (MRI, PET, CT) que ofrecen excelentes vistas de todo el órgano y pueden revelar patologías, incluso antes de que produzcan síntomas clínicos. Son incapaces, hin embargo, para revelar las primeras etapas de la metástasis y los mecanismos celulares de conducción progresión del tumor debido a su falta de resolución de una sola célula. En el momento en metástasis pulmonares son visibles en estas modalidades, que están bien establecidos y proliferando. Teniendo en cuenta la estimación de que el 90% de las células diseminadas de tumores que llegan al pulmón, o bien no sobreviven 17 o inicialmente permanecen en estado latente 18, y la observación de que llegan mucho antes de lo que esperaba 19, imágenes de los primeros pasos de la llegada y la supervivencia se convierte en crucial para la comprensión del proceso de la siembra metastásica y la recurrencia del crecimiento del tumor en sitios distantes.
La realización de estas observaciones en el pulmón ha demostrado sin embargo extremadamente difícil; la gran mayoría de los estudios de imagen han utilizado preparaciones ex vivo o de explantes 20-23, que sólo dan una visión en el pulmón en puntos de tiempo individuales. Mientras que estas preparaciones proporcionan información útilconfirmación, no dan una completa comprensión de las interacciones, las relaciones de causa y efecto, y las dinámicas que se producen entre los diferentes componentes del microambiente. La falta de un sistema adecuado circulatorio (y el desequilibrio de la homeostasis concomitante) y la desconexión del resto del sistema inmunológico del cuerpo hace que sea deseoso para validar las conclusiones que estas preparaciones generan en el tejido intacto in vivo.
Muchos grupos han realizado intravital de imágenes de los pulmones intactos 2,4,5,24-33 con Wearn y alemán siendo el primer quirúrgicamente exponer la capa pleural 24 y Terry los primeros en utilizar una ventana de imagen implantable 25.
De alta resolución de imagen en el pulmón se ve obstaculizado en gran medida por el movimiento constante del pulmón y varias técnicas se han desarrollado para superar esta limitación. Wagner y Filley 27 estudiaron el movimiento natural del pulmón caninoy diseñado su protocolo quirúrgico para localizar su ventana implantado sobre una región relativamente estacionario mientras Wagner utiliza vacío en su preparación quirúrgica ventana para inmovilizar el tejido 28. Desde entonces, una variedad de técnicas han sido utilizados para la imagen del pulmón incluyendo: sujeción bronquio, apnea secuencial y de formación de imágenes cerrada, la adquisición de sobremuestreado, de encolado del lóbulo de pulmón y de vacío 34. Cada uno de ellos tiene sus ventajas y desventajas, y ninguna técnica ha surgido como superior a otro 34. Por ejemplo, de sujeción bronquios y apnea secuencial alteran el intercambio normal de gases en el pulmón y pueden causar atelectasia. imágenes cerrada y la adquisición de sobremuestreo no sufren de estos inconvenientes, sino que requieren de alta velocidad o equipos de imágenes especializado no es ampliamente accesible. Por último, tanto el encolado del pulmón y de la técnica de vacío evitar tanto de los inconvenientes mencionados anteriormente, pero pueden mostrar lesiones fuerza inducida cizallamiento si no se tiene takes. En los últimos años, la ventana de vacío se ha miniaturizado y adaptado para su uso en ratones utilizando microscopía confocal y multifotónica 4,5,33 y excelentes imágenes de alta resolución se ha alcanzado 2. La Tabla 1 resume esta rica historia y destaca aquellos documentos que describen la novela los avances en el uso de las ventanas de imagen intravital de pulmón.
Este protocolo describe el uso de prolongado lapso de tiempo de microscopía multifotónica intravital a la imagen metástasis en el vivo, pulmón intacto con la resolución más alta posible subcelular. Las imágenes se adquieren durante un máximo de 12 horas usando un microscopio multifotónica equipado con una lente de objetivo de alta apertura numérica y detectores múltiples tubo fotomultiplicador (PMT). modelos de ratones transgénicos se utilizan para la etiqueta fluorescente macrófagos nativas junto con dextrano fluorescente de alto peso molecular y las células tumorales transfectadas proteínas fluorescentes (para etiquetar las células tumorales y la vasculatura respectively). Mientras que esta elección de las células marcadas con fluorescencia permite la visualización de las interacciones célula-célula endotelial macrófagos tumorales y la dinámica, este protocolo funcionará para cualquier cepa de ratón fluorescente o no fluorescente. Después de la adquisición, el movimiento de deriva residual (si lo hay) se elimina utilizando un plugin de Fiji 35,36 y personalizados macros tiempo promedio que el canal vascular para eliminar intermitente causada por las células sanguíneas que circulan sin etiqueta.
Mientras que este protocolo se centra en la metástasis de formación de imágenes, las técnicas son aplicables a muchos otros procesos biológicos observables con imágenes de alta resolución de una sola célula en el pulmón.
Todos los procedimientos descritos en este protocolo se han realizado de acuerdo con las directrices y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa del Albert Einstein College of Medicine Institucional Cuidado de Animales y el empleo.
1. Generación de modelos marcados con fluorescencia y el tumor de células de ratón
Preparar 100 ml de 0,1% (w / v) / solución salina tamponada con fosfato (BSA / PBS) Tampón de albúmina de suero bovino mediante la mezcla de 0,1 g de BSA con 100 ml de PBS.
Preparar las células tumorales marcadas con fluorescencia por transfección estable.
NOTA: Aquí se utiliza células E0771-LG, un derivado altamente metastásica de células de adenocarcinoma mamario de ratón E0771 37 que fueron aisladas de tumores metastásicos desarrollados en el pulmón de ratones C57BL / 6 de ratón inyectado por vía intravenosa con células parentales E0771 38.
24 horas antes de la transfección, placa 1 x 10 5 células EO771-LG en una placa de cultivo de tejidos de 60 mm en 2 ml de antibio10% de FBS (suero bovino fetal) DMEM libre de tic (de Eagle modificado por Dulbecco) y se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2.
En el momento de la transfección, se incuban 2 g del vector de la proteína fluorescente con 10 l de reactivo de transfección de 30 min antes de añadir 190 l de medio de suero reducido.
Lavar las células EO771-LG con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) una vez y agregar la mezcla de transfección con suavidad.
Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 6 horas.
Se lavan las células y la cultura transfectadas en 2 ml de DMEM completo (10% FBS, piruvato 1 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina) durante 2 días.
Lavar las células con 2 ml de PBS estéril, añadir 500 l de 0,25% de tripsina-EDTA y se incuba durante 2 min a 37 ° C.
Recoger suspensión celular y se mezcla con al menos 1 volumen de DMEM completo y centrifugar a 280 x g.
Resuspender las células en 1 ml de DMEM completo y expandir el cultivo de células enuna placa de 10 cm de cultivo de tejidos.
Inicio de la selección de las células transfectadas mediante la adición de 700 mg / ml de G418 antibiótico selectivo a 8 ml de DMEM y de cultivo completo para una semana, el cambio de medio cada tres días.
Enriquecer la población de fluorescencia de las células transfectadas que han estado bajo selección en G418 por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 39,40.
Lavar las células con 5 ml de PBS y añadir 1,5 ml de 0,25% de tripsina.
Incubar durante 2 min a 37 ° C y se mezcla con al menos un volumen de DMEM completo.
Recoger suspensión de células y centrifugar a 280 xg y células volver a suspender en 1 ml de agua estéril 0,1% (w / v) de tampón BSA / PBS.
Se filtra la suspensión celular a través de una malla de 40 micras y ajustar el volumen a 1 ml con tampón de 0,1% de BSA / PBS para la clasificación.
FACS-ordenar el 10% de la población más brillante basado en el espectro de fluorescencia utilizando el clasificador FACS 41.
Cultivar las células clasifican para la otra semana ula selección del visor (700 mg de G418 / ml en DMEM completo).
Vuelva a seleccionar las células marcadas con fluorescencia por citometría de flujo, repitiendo los pasos 1.3.1 a 1.3.6, una vez más.
Después de una segunda ronda de selección, trypsinize, el filtro y las células en 0,1% de BSA / PBS re-suspender como se ha descrito (pasos 1.3.1-1.3.4). Ajustar la concentración a 2 x 10 6 células / ml para una sola clasificación de células en placas de 96 pocillos utilizando el clasificador FACS.
Preparar 3-5 placas de 96 pocillos con 100 l de DMEM completo para la recolección. Para mejorar la supervivencia después de la clasificación, añadir 100 l de medio de cultivo filtrado de los platos en los que se cultivan las células EO771-LG 42.
Después de la clasificación de las células en las placas de 96 pocillos, las células volver a cultivo durante 2 días (37 ° C, 5% de CO 2).
Identificar los pocillos con clones únicos viables mediante un examen en un microscopio invertido con un aumento de 5x.
Trypsinize y ampliar los clones viables y congelar las células de copia de seguridad.
Lavar los pocillos con grdebido clones con 100 l de PBS estéril. Añadir 50 l de 0,25% w / v de tripsina y se incuba 2 min a 37 ° C. Añadir 50 l de DMEM completo y transferir a abajo placa de 96 pocillos de fondo en V o redondo estéril a girar hacia abajo a 280 xg durante 5 min.
Resuspender las células en 100 l de 700 mg / ml de G418 DMEM completo y la placa de cada clon en placas de 12 pocillos. Añadir 400 l de DMEM completo con G418 y de cultivo hasta la confluencia.
Lavar los pocillos con 500 l de PBS, añadir 100 l de 0,25% de tripsina y se incuba 2 min a 37 ° C. Añadir 100 ml de DMEM completo y centrifugar durante 5 minutos a 280 x g. Resuspender las células en 100 ul de DMEM completo con células G418 y de la placa en placas de 6 pocillos hasta confluencia.
Una vez confluentes, las células trypsinize, giran hacia abajo y se vuelve a suspender en 10% de DMSO en FBS se congelen las poblaciones celulares.
Mantenga un décimo de las suspensiones de células en cultivo en placas en placas de cultivo de tejidos de 100 mm para la evaluación de su potencial metastásico.
Probar el potencial metastásico de los clones seleccionados.
Trypsinize y volver a suspender las células en solución salina a una concentración de 2,5 x 10 6 células / ml y se inyectan 200 l en ratones C57BL / 6 por vía intravenosa a través de la vena de la cola.
Después de 2 semanas, recoger el tejido pulmonar como se ha descrito previamente 23 y cuantificar la carga tumoral mediante el recuento de superficie o método estereologico 43. Seleccionar clones con alto potencial metastásico de intravital de imágenes.
Elevar MacBlue (un promotor específico mieloide dirigir la expresión de la proteína fluorescente cian (CFP) (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) 44 reportero ratones.
NOTA: Por lo general, se utilizan ratones de entre 8 y 12 semanas, pero los ratones a los 7 y tan tarde hasta 20 semanas han sido probados para trabajar también.
2. Multifotónica Microscopio Set de imagen y Preparación
NOTA: Si bien este protocolo se puede realizar en cualquier multiphoton microscopio, el sistema utilizado para adquirir los datos que se muestran en este protocolo se ha descrito anteriormente en detalle 45.
Encienda todos los componentes del microscopio y láser, incluyendo láseres de dos fotones y los detectores de al menos una hora antes de la hora de imagen deseada.
Justo antes de la cirugía, medir la potencia de la entrada de luz al microscopio mediante la colocación de la cabeza del medidor de potencia óptica en la trayectoria del haz justo antes del microscopio y ajustar los mandos espejo cavidad final láser hasta que la intensidad de luz máxima a 880 nm se lee en el medidor de potencia óptica.
3. Sistema de vacío Puesta en funcionamiento
Pegar el cubreobjetos en la ventana de imagen (Adicional Figura 1) con cianoacrilato. Deje por lo menos 4 horas para que el pegamento se seque por completo.
NOTA: Este paso también se puede hacer antes de tiempo.
Cortar la punta de la pipeta 100 l en la primera línea de la pequeña abertura y conecte el extremo sin cortar a la v delgadaacuum manguera.
Conectar el sistema de vacío de acuerdo con la Figura 1 y la Figura 2 Suplementario.
Con el vacío y el extremo abierto bloqueado, ajustar el regulador de vacío de <3 inHg.
NOTA: El ajuste final del nivel de vacío se llevará a cabo mediante la observación de la vascularización in vivo.
Aplicar una fina capa de grasa de petróleo en la parte inferior de la placa de imagen para evitar que el medio de inmersión lente objetivo puede ser malo distancia por la placa de imagen.
Coloque la placa de imagen en la platina del microscopio.
NOTA: La placa de imagen personalizado (Adicional Figura 3) es una hoja de 1/8 "de espesor de aluminio mecanizado, tanto como para caber en el espacio escénico de inserción y con un orificio pasante en el centro para la celebración de la ventana de imagen.
Inserte la ventana de vacío en la placa de imagen con el cubreobjetos hacia abajo.
Esterilizar todas las superficies e instrumentos incluyendo la placa etapa de formación de imágenes, y la victoria de imágenesDow con un 70% de etanol.
Conecte el extremo cortado de la punta de la pipeta a la ventana de vacío y la cinta de la manguera hacia abajo a la placa de imagen.
Llevar el objetivo cerca de la ventana de imagen y colocar una gota grande de agua entre el objetivo y el cubreobjetos.
Asegúrese de que no hay fugas en el cubreobjetos mediante el bloqueo de la abertura central de la ventana de vacío y verificar que la gota de agua entre el objetivo y el cubreobjetos no quede aspirado.
NOTA: Una bola del ratón del ordenador del viejo estilo se coloca sobre la ventana es útil para bloquear la abertura central.
Preparar el área quirúrgica estéril.
Coloque todos los instrumentos a su alcance. Esterilizar todas las superficies e instrumentos que incluyen una zona quirúrgica, y las herramientas quirúrgicas, con un 70% de etanol.
Ate una longitud de 3 pulgadas de 2-0 sutura al catéter, ¼ de pulgada por encima del casquillo con un nudo doble.
Preparar la cola fol catéter en la venaLowing el protocolo publicado por Harney et al. 46.
El uso de una lámpara de calor infrarrojo (IR), calentar el animal en su jaula durante ~ 5 min para aumentar el flujo de sangre en la vena de la cola y para ayudar en la inserción del catéter. Se recomienda mantener al animal calentado a temperaturas fisiológicas durante todo el procedimiento quirúrgico utilizando una lámpara de calor o una almohadilla de calentamiento.
Anestesiar al animal con 5% de isoflurano y verifique que no hay respuesta a una pizca dedo del pie.
Aplicar pomada oftálmica para los ojos del animal.
Aplique la loción depilatoria de 10-30 segundos para eliminar el vello desde el lado izquierdo del animal; de la línea media del tórax para una cuarta parte de la espalda y de la axila hasta justo debajo de la caja torácica.
Limpiar cualquier exceso de loción y esterilizar la piel expuesta con alcohol al 70%.
Conecte una jeringa estéril lleno de PBS para el catéter de vena de la cola e inserte y cinta en su lugar siguiendo el protocolo publicado por Harney et al. 46. Asegúrese de que la cinta se adhiere firmemente a la aguja en sí y no es libre en la brecha entre la cola y la cinta.
Intubar el ratón siguiendo el protocolo sea publicado por Das et al. 47 o por DuPage et al. 48
Encienda el ventilador y configurarlo para abastecer a 135 respiraciones por minuto y 200 l de mezcla de isoflurano en oxígeno.
Conectar el catéter traqueal al ventilador.
Mover el ratón a la zona quirúrgica. Tenga mucho cuidado de no desplazar el catéter.
Atar la sutura 2-0 alrededor del hocico del ratón debajo de los dientes delanteros.
Tape el catéter hasta el hocico.
Cinta de la extremidad anterior izquierda al catéter para mantenerlo fuera del campo quirúrgico.
Bajar los anestesia con isoflurano a un nivel de mantenimiento de 2,5% y verifique que no hay respuesta a una pizca dedo del pie.
El uso de las tijeras afiladas, retire 1 cm2 de piel por encima de la pared torácica izquierda.
elevación de la tque mamaria almohadilla de grasa y cauterizar los vasos sanguíneos expuestos con la pluma cauterio.
Resección de la almohadilla de grasa mediante corte con las tijeras afiladas.
Eliminar la capa muscular hasta la caja torácica mediante corte con las tijeras afiladas. Tenga cuidado de no cortar la vena axilar en ejecución en la base de la extremidad anterior.
El uso de fórceps para agarrar y levantar la 6ª costilla. El uso de las tijeras afiladas mantenidas con un ángulo pequeño (~ 5 °) cortar el nervio cerca del borde de la abertura en la piel. Tenga mucho cuidado de no tocar el tejido pulmonar expuesto.
Ensanchar la abertura en la pared torácica para exponer todo el lóbulo de pulmón mediante la eliminación de cuatro nervios consecutivos.
Nota: Mantenga la apertura de al menos 5 mm de distancia desde el esternón para evitar el corazón.
Levante con cuidado el ratón sujetando el catéter de cola y traqueal y mueva el ratón a la etapa de formación de imágenes de microscopio.
Con el apagado de vacío, llenar la cámara de vacío de la ventana con PBS.
Invertir el ratón y la posición de los expuestospulmonar a través de la ventana de imagen vacío.
Abra lentamente el vacío a aproximadamente 3-5 pulgadas de mercurio utilizando la válvula de bola.
Colocar un arnés de retención hecha de papel de seda doblada por la mitad dos veces sobre el pecho del ratón y la cinta a la placa de fase como se muestra en la Figura 2 Suplementario.
Cuelgue el transmisor del muslo del oxímetro de pulso para parte superior del muslo del animal y ejecutar el software.
Coloque la cámara ambiental en el escenario y encender la calefacción para mantener el ratón a una temperatura fisiológica.
Reducir el nivel de isoflurano al 1-1,5% para mantener la anestesia y mantener el flujo de sangre.
5. intravital de imágenes
Llevar la lente objetivo 25 x 0,95 apertura numérica (NA) cerca del cubreobjetos y añadir una gota grande de agua entre ellos.
Uso del modo de epifluorescencia, ver el canal FITC y llevar el tejido pulmonar en el foco.
Si no se hace antes de la cirugía,nject células tumorales a través del catéter en la vena caudal.
Desconectar la jeringa PBS desde el catéter en la vena caudal.
Cargar una jeringa estéril con 100 l de suspensión de células tumorales (2 x 10 7 células / ml en PBS máximo).
Nota: Este paso se puede realizar con antelación para estudiar la llegada de células de cáncer en el pulmón a diferentes puntos de tiempo.
Conectar la jeringa con células tumorales en la vena de la cola catéter.
Lentamente inyectar las células tumorales en la vena de la cola.
Desconectar la jeringa con las células tumorales desde el catéter de vena de la cola.
Vuelva a conectar la jeringa PBS al catéter en la vena caudal.
NOTA: identificar las ubicaciones de todas las células tumorales antes de inyectar el dextrano como se hace difícil distinguir las células tumorales de la señal de dextrano a través del ocular después de la inyección.
Localizar las células tumorales a la imagen
Para obtener imágenes de las células tumorales individuales, localizar todas las células tumorales y registrar sus destinos con THPanel multipunto e del software.
Localiza todos los campos de visión de la imagen mediante la observación de las células tumorales en el ocular del microscopio.
En el software, cambiar al panel multipunto haciendo clic en el botón multi-punto y almacenar la ubicación de la celda haciendo clic en el botón Añadir Posición.
Para obtener imágenes de mosaico, localizar el origen del mosaico y establecer las coordenadas de imagen
Localizar una posición en la esquina superior izquierda de la estructura a ser capturado.
Poner a cero los x, y, z las coordenadas del escenario pulsando el botón "Zero" en el controlador de fase.
Capacidad de carga hasta la lista correspondiente de las coordenadas del mosaico haciendo clic en el botón "Load" y seleccionando la lista.
NOTA: una lista de ejemplo para un mosaico 2 x 2 con un solapamiento de 20% de un campo de 500 micras de vista sería: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0,400), Pos. 4 = (400,400).
Retire la jeringa wITH PBS en el catéter en la vena de la cola y reemplazar con la jeringa que contiene el dextrano.
Lentamente inyectar hasta 100 l de 20 mg / ml 155 kDa rodamina-dextrano disuelto en PBS en el ratón a través del catéter vena de la cola, seguido de la inyección de 50 l de PBS estéril para eliminar la línea. No introducir burbujas en la línea. Cuando sea necesario, inyectar dextrano al menos una hora después de la inyección de células de cáncer de manera que el volumen total administrado al ratón no exceda de 4 ml / kg / h.
Configurar los parámetros de imagen.
Conmutar el microscopio para el modo múltiple de fotones.
Ajuste el zoom a un factor de 2X haciendo clic en el botón de señales de temporización y actualizar el campo Factor de zoom.
Ajustar la potencia del láser para ~ 10% (~ 10-15 mW a la muestra) haciendo clic en el botón de láser y detectores y luego ajustando el deslizador tsunami de energía a 10.
Image cada lugar para verificar la presencia de células tumorales y visualizar el flujo y la integridad de la Vasculatura.
NOTA: Los buques deben aparecer totalmente perfundido con eritrocitos que fluyen y dextrano fluorescentes deben ser contenida dentro de los vasos sin fugas a los espacios extravasculares. Aproximadamente el 10 - 20 se espera que las células tumorales a estar dentro de la clara de apertura de la ventana de vacío.
Ajustar la profundidad de partida de cada lugar para formar una imagen.
Para cada ubicación, ajustar la posición z girando el botón de enfoque en el controlador de fase a la imagen del tramo superior de la célula tumoral.
Coloque la celda en el centro del campo de vista.
Haga clic en el botón de múltiples puntos, haga clic en la posición del campo de visión para resaltarlo y haga clic en la opción Agregar seguido por el botón Borrar para reemplazar posición almacenada de la celda en la lista multipunto.
observar visualmente el brillo relativo de la célula tumoral en cada posición.
Guardar la nueva ubicación de cada una de las células haciendo clic en el botón Guardar en el panel de múltiples puntos de unad especificar un nombre de archivo.
Para obtener imágenes de las células tumorales individuales, elegir tres células de brillo aproximadamente equivalente y eliminar todas las otras poblaciones de la lista haciendo clic multipunto de su ubicación en la lista y haga clic en el botón Borrar.
Haga clic en el botón Detectores y láser y ajustar los controles deslizantes para la PMT ganancia de los canales verde y rojo 45 para que las señales están por debajo de la saturación.
Ajuste el control deslizante para el canal azul 45 de manera que los macrófagos parecen cian.
NOTA: Cualquier segunda señal armónica sólo aparecerá en el canal azul y puede ser separado de los macrófagos cian, siguiendo el procedimiento de sustracción de canal 45 se ha descrito anteriormente.
Ajuste la profundidad inicial z-pila a 0 micras y la profundidad final a 24 micras moviendo la etapa Z a la ubicación y al hacer clic en Inicio y el extremo botones respectivamente.
NOTA: Las células dentro de esta profundidad se visualiza con la mejor señal parael ruido y la resolución.
Establecer el tamaño de paso para z 3 micras.
Establecen los parámetros de imagen siguientes parámetros anteriormente descritos 45,49.
Para obtener imágenes de las células tumorales individuales, haga clic en el botón de señales de temporización y luego introduzca 4 V en el campo factor de zoom (equivalente a un factor de zoom de 1,5X), introduzca 3 en el campo de las medias del marco y haga clic en el botón de intervalos de tiempo y escriba 10 en el campo de lapso de tiempo.
NOTA: Estos ajustes adquirirán 1 fotograma cada 3 s.
Para obtener imágenes de mosaico, haga clic en el botón de señales de tiempo e introduzca un factor de zoom de 1,5 V (equivalente a un factor de zoom de 4X), introduzca 3 en el número de promedios del marco y haga clic en el botón de intervalos de tiempo y escriba 10 en el tiempo- caducará campo de retardo de tiempo.
Habilitar el modos de imagen t-lapse multipunto, z-pila y haciendo clic en los botones.
Pulse el botón de grabación para adquirir imágenes.
NOE: El tejido pulmonar es muy delicada y susceptible a la foto-daño. Si después de un tiempo el flujo de sangre se detiene lapse de imágenes en el campo de captación de imagen, es más probable que el láser de imágenes demasiado alto y posterior de otros campos debe hacerse en una energía más baja.
Cada 30 a 45 min, inyectar lentamente 50 l de PBS o solución salina para mantener la hidratación del animal.
Aumentar el isoflurano al 5%.
Mantener al animal por debajo del 5% de isoflurano hasta 30 segundos después de que se deja de respirar y eliminar al animal de la etapa.
Realizar la dislocación cervical para asegurar la eutanasia completa.
Análisis 7. Imagen
Para los experimentos individuales de formación de imágenes de células:
Cargar imágenes en Fiji y darles formato como HyperStack.
Para cada z cortes en el HyperStack, reproducir la película de lapso de tiempo y buscarse un movimiento XY residual. Si se determina que el movimiento xy residual, aplicar el plugin llamado StackReg 36 a la pila deeliminar el movimiento.
Para los experimentos de imagen de mosaico:
Cargar imágenes en Fiji y unirlas mediante la apertura del mosaico de costura macro (archivo Suplementario código mosaico de costura) y la introducción de información acerca de las imágenes como el directorio, el nombre base del archivo, el número de campos X e Y en el mosaico y el número de las rebanadas y los puntos de tiempo.
NOTA: Debido a la forma en Java interpreta directorios, nombres de las carpetas deben tener dos barras invertidas como separadores de subcarpeta. Debido a las limitaciones en el plugin por parejas Costura incorporado, los nombres de archivo de base no deben contener ningún guión.
Para obtener una visión clara de los límites de la vasculatura, promediar juntos todos los puntos de tiempo para el canal de sangre en una sola imagen y luego replicar esta imagen como fondo para cada fotograma de la película de los otros canales.
NOTA: Esto se hace simplemente ejecutando el valor promedio Realizar Sangre macro (archivo de código suplementario Realizar valor promedio de la sangre).
Para demostrar el tipo de resultados que se pueden conseguir con este método, se inyectaron células tumorales E0771-LG etiquetados con el trébol de la proteína fluorescente en la vena caudal de los ratones MacBlue 44 en diferentes puntos de tiempo antes de la cirugía. Después de la cirugía, 155 kD rodamina dextrano marcado se inyectó IV para marcar se llevó a cabo la formación de imágenes vasculatura y de lapso de tiempo.
Cuando la formación de imágenes ratones después de la inyección de 24 horas, las células individuales son visibles en el interior de la vasculatura, la interacción con los macrófagos y monocitos. Un ejemplo de esto se muestra en la Figura 2A (Supplemental Película 1). Aquí una sección óptica única de una célula tumoral solitario (verde) 12 micras de profundidad presentado en la vasculatura pulmonar se forma la imagen sobre 5 hr y 20 min, ya que transitoriamente interactúa con un macrófago residente (cian). Vasculatura está etiquetado por dextrano de alto peso molecular. La estabilidad de laformación de imágenes es tal que secuencial de imágenes z-pila del campo puede ser adquirida y una reconstrucción en 3 dimensiones puede hacerse (Figura 2B, Suplementario película 2).
El uso de la configuración de microscopio descritos en el protocolo para obtener imágenes de mosaico permite obtener imágenes de estructuras más grandes que un solo campo de visión. Por ejemplo, la Figura 3 demuestra la adquisición de una sola lesión metastásica, 12 días después de la inyección. Este 5 x 5 mosaico muestra un campo de 890 micras de vista de 205 min a 15 (Figura 3A, panel izquierdo; Supplemental Película 3) y 25 micras (Figura 3A, panel derecho) por debajo de la superficie del pulmón. A pesar del amplio campo de visión, la alta resolución de las tramas subyacentes que componen el mosaico permite la captura de eventos subcelulares, tales como la mitosis de una sola célula como se evidencia por la separación cromosómica (Figura 3B, SuplementarioPelícula 4).
inyección intravascular de un alto peso molecular marcado con fluorescencia resultados de dextrano en el etiquetado de la luz vascular, sin embargo no marcados circulante eritrocitos y leucocitos ocluir el dextrano. En los pequeños capilares del pulmón, es la oclusión completa resultante en un parpadeo de la señal de dextrano y una pérdida de definición de los límites de la vasculatura (Figura 4, izquierda; Suplementario película 5). La estabilidad espacial de alta proporcionada por este protocolo permite a un promedio de tiempo del canal de sangre, sin desenfoque, restaurando así las oclusiones temporales. Los otros canales de señal pueden ser superpuestos sobre la vasculatura para proporcionar una visión clara de los límites de los vasos (Figura 4, a la derecha; Suplementario película 6).
Figura 1:. Disposición del sistema de vacío de la casa de vacío se utiliza y se puso a nivel definido con un regulador de vacío. Un matraz de captura impide la contaminación del sistema regulador y de vacío por los fluidos corporales. Un tubo delgado y flexible transmite el vacío a un corte de punta de pipeta para encajar en el puerto de vacío de la ventana de imagen. La ventana de imagen es apto en una ranura rebajada en la placa de imagen manteniendo su estabilidad posicional con respecto a la lente objetivo del microscopio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de las células del pulmón (A) fija de una película de lapso de tiempo de una sola célula tumoral en el lecho capilar del pulmón 24 horas después de la vena de la cola.inyección. (Vasos Rojo = sangre, células verdes = tumorales, cian = macrófagos) (B) formación de imagen estable permite tres reconstrucción dimensión de los datos de imagen con el tiempo. Los vasos sanguíneos se han promediado en el tiempo para una mayor claridad. (Vasos sanguíneos Rojo =, Verde = células tumorales, azul = macrófagos). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La estabilidad del pulmón Permite de alta resolución, de gran campo de visión de imágenes en el pulmón por el secuencial Adquisición y sutura de múltiple bajo aumento Campos (A) 5 x 5 mosaico que muestra un campo de visión de 890 micras. una lesión metastásica en el pulmón 12 días después de la inyección en la vena caudal de las células tumorales tomada en 15 m por debajo de la superficie del pulmón(Panel izquierdo). El panel derecho muestra la misma lesión metastásica en el momento de 25 micras por debajo de la superficie del pulmón. (B) Los campos de alta resolución individuales revelan procesos subcelulares como la alineación cromosómica (flechas amarillas) y separación (flechas rojas) durante la división celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La inyección intravascular de la etiqueta fluorescente de alto peso molecular de dextrano Marca el lumen de los vasos Excepto cuando no marcado eritrocitos y otras células circulantes ocluir el señal de fluorescencia resultados oclusión (A) en un etiquetado incompleto que se mueve en el tiempo que resulta en un efecto de oscurecimiento de parpadear. los límites de los vasos. (B) El altoestabilidad espacial de la ventana de vacío permite que el canal de sangre a ser promediado en el tiempo, rellenando los oclusiones temporales y definir claramente los límites de los vasos. Los otros canales están superpuestos y sin promediar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Año Primero Autor / Autor Último Animal Cirugía Tipo de Imagen notas
1926 Wearn y Alemán gatos pared torácica cortado a la capa pleural. Segunda abertura hecha a través del diafragma hacia abajo para pleura para la iluminación. La microscopía de campo claro. En primer lugar "ventana" a través de la pared pleural.
1939 Terry gatos Las costillas están separados, en 1. Ventana implantados, aire removido de tórax con vacío. microscopio binocular y la piel usando la iluminación polarizada. En primer lugar implantado ventana óptica. de vacío usada para dibujar el tejido a la ventana.
1963 de Alva y Rainer Conejos y perros Uno o dos nervios se resecan y 1 en. Ventana insertan y se suturan a la pared torácica. Piel se cerró sobre la ventana y animal se deja cicatrizar. Antes de formación de imágenes, la piel se diseccionó para exponer ventana. cinematografía estroboscópica de alta velocidad usada a través de un objetivo de baja mag (11X). Primera ventana supervivencia.
1965 Wagner & Filley Perros extremidad anterior derecha removidos, una corte de costilla y la ventana inserta y se sutura. microscopía de reflexión con el objetivo de 22X. Primera ventana relativamente libre movimiento sin vacío.
Wagner Perros Una costilla se reseca, 3 pulg. Ventana implantado. Tornillos de tapas roscadas en la ventana para formar el sello de la pared torácica. microscopía de campo claro con alta magnificación objetivo de inmersión en aceite de 100X. Primera ventana de usar vacío para estabilizar el movimiento del tejido.
1992 Groh y Goetz conejos Una costilla resecada, en 1.2. Ventana implantado. Tornillos de tapas roscadas en la ventana para formar el sello de la pared torácica. Vacío aplicado. La microscopía de epifluorescencia con el objetivo 25X. En primer lugar el uso de una ventana de vacío con epifluorescencia.
1994 Fingar y Wieman Las ratas 2 tallos se resecan, 1 pulg. Ventana implantan y se suturan a la pared torácica y la piel. La microscopía de epifluorescencia con el objetivo de 40X. ventana de la supervivencia por primera vez en ratas.
2000 Fuňákoshi y Mitsui Ratones Toda la pared del pecho retirado. anillo de succión de vacío unida al pulmón derecho. La microscopía confocal con un objetivo 20X. En primer lugar el uso de la ventana de vacío en ratones.
2005 Lamm y Glenny Las ratas Toda la pared torácica retirado, 1 pulg. ventana adjunta al pulmón. La reflexión y la microscopía de epifluorescencia con un objetivo 20X. En primer lugar el uso de la ventana de vacío en ratas.
2008 Tabuchi y Keubler Ratones 3 costillas se resecan, película plástica aplicada a la abertura para sellar el agujero en la pared torácica. Aire elimina a través del catéter intrapleural. La microscopía de epifluorescencia con el objetivo 20X. En primer lugar de usar película de plástico para sellar la abertura en la pared del pecho.
Tabla 1: Estudio Histórico de la Desarrollo de pulmón intravital de imágenes de Windows. Muchas nuevas ventanas de imagen intravital pulmonares se han desarrollado a lo largo de los años con el más reciente siendo miniaturizado para su uso en los ratones, que emplean el vacío para la estabilización del tejido y la consecución de una resolución lo suficientemente alta como para ser capaz de revelar el detalle subcelular.
Adicional Figura 1: Diseño Dibujo de la ventana de imagen vacío Por favor, haga clic aquí para descargar esta figura.
Adicional Figura 2: Fotografías del programa de instalación de vacío Por favor, haga clic aquí para descargar esta figura.
Adicional Figura 3: Diseño drawing de la etapa Plate de Inserción favor, haga clic aquí para descargar esta figura.
Película suplementario. 1: Película de imágenes fijas en la Figura 2A (Haga clic derecho para descargar).
Mover suplementario. 2: Película de la reconstrucción 3D se muestra en la Figura 2B muestra diferentes ángulos de visión y progresión en el tiempo (Haga clic derecho para descargar).
Película suplementario. 3: Película de mosaico de 5x5 se muestra en la Figura 3A a 15 m debajo de la superficie del pulmón (Haga clic derecho para descargar).
Película suplementario. 4: película de una sola célula se muestra en la Figura 3B mitosis en el pulmón (Haga clic derecho para descargar).
Película suplementario 5: Película de la Figura 4, panel izquierdo muestra oclusión yfamarre. (Haga clic derecho para descargar).
Película suplementario. 6: Película de la figura 4, panel derecho muestra la recuperación de la definición vascular después de un promedio de sangre (Haga clic derecho para descargar).
Archivo de código suplementario:. Mosaico de costura Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de código suplementario:. Realizar promediado Sangre Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
De alta resolución en imágenes ópticas vivo combinada con etiquetas funcionales marcados con fluorescencia, tales como proteínas y anticuerpos se ha incrementado dramáticamente nuestra comprensión de la cascada metastásica. Se ha habilitado la visualización directa y la cuantificación de una sola célula y los parámetros de sub-celulares en las células tumorales, las células huésped y su microambiente. Esta formación de imágenes en el tumor primario ha llevado, por ejemplo, al descubrimiento de microambientes discretos que son de apoyo de cualquiera de invasión crecimiento o 6,7 difusión. En el caso de invasión, formación de imágenes in vivo, ha revelado el papel preferencial de co-migratorio de streaming de macrófagos y células tumorales en intravasación 7,50.
En los sitios secundarios como el pulmón, la comprensión de la dinámica del comportamiento de las células tumorales en las primeras etapas de la metástasis, incluyendo la etapa de pre-siembra micrometástasis cuando los grupos individuales y pequeños de las células tumorales llegan yinteractuar con el endotelio de los vasos sanguíneos, sólo se puede lograr mediante formación de imágenes ópticas de alta resolución. modalidades de imágenes clínicas estándar no tienen la resolución necesaria para visualizar bien la estructura fina de la cama capilar o la morfología y la interacción de las células con una resolución de una sola célula. Las técnicas de imagen que se presentan en este protocolo realizar esta tarea desafiante.
Ventanas intravital de imágenes tales como los enumerados en la Tabla 1 ofrecen una ventaja significativa sobre las preparaciones pulmonares ex vivo mediante el mantenimiento de la fisiología pulmonar propiamente dicho, con la perfusión, la conexión al sistema inmunológico y que ofrece algo más que una visión estática de la dinámica celular. El vacío se estabilizó ventanas, en particular, ofrecen un nivel de estabilidad de los tejidos que permite la adquisición de imágenes altamente registrados, permitiendo reconstrucciones tridimensionales (Figura 2B) y la capacidad para el gran campo de la imagen vista en mosaico (Figure 3A). En conjunto, estos proporcionan una gama de puntos de vista de los pulmones, desde una vista baja magnificación tipo histológico que da a la morfología de los tejidos, a una vista subcelular que incluso puede revelar la separación cromosómica y discriminar las células tumorales latentes y división (Figura 3B). Múltiples canales de adquisición permiten varios tipos de células y sus interacciones para ser visualizadas simultáneamente (Figura 2A).
Mientras que el protocolo requiere algo de habilidad técnica, la práctica y la atención a algunos pasos críticos y puntos mejorará la tasa de éxito de los tiempos de procedimiento y de imagen de hasta 12 horas se puede esperar. Es muy importante asegurarse de que el tejido pulmonar está bien centrado sobre la ventana (etapa 4.25). Esto asegura que el vacío se aplica de manera uniforme y completamente a través del tejido pulmonar (paso 4,27). El fracaso para centrar el tejido resultará en el movimiento del tejido. El arnés de sujeción (Adicional Figura 2) se utiliza to reducir el movimiento inducido por la constricción de los músculos intercostales durante las respiraciones naturales del animal toma. Se debe ser ajustado sobre el ratón, pero no comprime el pecho. El exceso de compresión ejerce presión sobre todos los lóbulos de los pulmones, así como el corazón y da como resultado una reducción de la viabilidad del ratón. Si no se observa dextrano que fluye en la vasculatura pulmonar después de la inyección (etapa 5.8), el tejido pulmonar es o dañado de una manipulación incorrecta durante la cirugía o el nivel de vacío es demasiado alta. Bajando el vacío .5-1 pulgadas Hg se puede intentar para ver si se restablece el flujo. Si el flujo no se restablece, o si hay flujo, pero se observa dextrano extravascularmente, el tejido pulmonar se ha dañado en esa región y será necesario para una imagen de campo de vista diferente. Mantenimiento de flujo sanguíneo adecuado en la región de formación de imágenes es importante para asegurar que la fisiología adecuada se está midiendo. Puesto que el oxígeno se suministra al tejido del interior de los alvéolos y no a través de los conductosIlsma, hipoxia isquémica es poco probable. Aún así, la vasculatura no perfundido potencialmente puede conducir a la alteración de oxígeno / CO 2 niveles y también evitará que los leucocitos circulantes de alcanzar el tejido de interés. La visualización de los eritrocitos que fluyen se puede utilizar como un indicador de la función pulmonar adecuada. El tejido pulmonar es muy delicada y susceptible a la foto-daño. Si después de un tiempo el flujo de sangre se detiene lapse de imágenes en el campo de captación de imagen, es más probable que el láser de imágenes demasiado alto y posterior de otros campos debe hacerse en una energía más baja. Hemos encontrado ~ 10-15 mW en la muestra para producir imágenes suficientemente brillantes sin daño solar cuando se utiliza GFP o el trébol (que tiene cuatro veces el brillo medio) las células transfectadas. Los niveles mínimos de brillo para las proteínas fluorescentes son altamente dependientes de los parámetros de microscopio y los niveles de expresión en las células y deben ser probadas empíricamente.
En este protocolo, las células tumorales se etiquetan con un cytoplas brillantesproteína fluorescente micro que ofrece una visión clara del cuerpo celular y espacios intracelulares que excluyen la proteína (es decir, el núcleo). Los macrófagos se etiquetan mediante la utilización de un modelo de ratón transgénico singénico a las células tumorales. Etiquetado de ambos tipos de células permite la visualización de su interacción directa en tiempo real. La duración prolongada de formación de imágenes permite la cuantificación de la frecuencia, la duración y la extensión con la que las células cancerosas interactúan con los macrófagos en un contexto fisiológicamente relevante.
Cuando se realiza correctamente, este procedimiento permite a los canales múltiples, de alta resolución, imágenes de movimiento libre, de una sola célula en el pulmón intacta durante períodos de hasta 12 horas. El uso de una lente de objetivo de abertura numérica alta como la 25X 0.95NA y las capacidades de la multifotón de zoom electrónico permite la más alta resolución de imágenes ópticas en el pulmón visto hasta la fecha.
Inyectada por vía intravascular fluorescente, de alto peso molecular PE dextranorforms la doble función de marcar el espacio vascular y verificar su integridad. 155 kDa de dextrano se utiliza para evitar la difusión a través de los espacios interendoteliales. Cualquier señal de una falta de flujo vascular o de fuga vascular hacia el espacio extravascular indica daños en el tejido debido a un manejo inadecuado o excesivo de vacío.
Por último, las técnicas de procesamiento de imágenes únicas se pueden emplear que se aprovechan de la alta estabilidad espacial de este protocolo. Puesto que los eritrocitos no marcados y otros leucocitos no incluyen el dextrano fluorescente cuando pasan a través de los capilares, esta señal puede ser un promedio de más tiempo para eliminar el parpadeo que crean. Esto ofrece una vista bien definido de la vasculatura no posible de otro modo.
Las limitaciones de esta técnica incluyen tanto la naturaleza invasiva de la cirugía, lo que potencialmente complica su uso para el estudio de enfermedades que debilitan el animal (por ejemplo, cáncer metastásico etapa tardía,anemia aguda de células falciformes), y el hecho de que la cirugía es terminal que limita el uso a una sola, aunque largo (hasta 12 h), sesión de imágenes. Además, dada la larga duración de la sesión de imágenes y la reserva de glucógeno hepático baja de los ratones 51, la administración de suplementos de glucosa se puede dar para evitar posibles fuentes de sesgo en los experimentos.
Este protocolo podría potencialmente ser modificado con inyectables anticuerpos marcados con fluorescencia, ya sea en lugar de o además del dextrano con el fin de etiquetar otras estructuras o tipos de células en tiempo real. Esto ampliará las capacidades para el análisis y la disección de la microambiente tumoral mediante la visualización directamente las interacciones de células de células tumorales en host y la dinámica en tiempo real.

References: resolución 
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