Source: https://www.jove.com/video/52267/tirfm-y-gfp-sondas-sensibles-al-ph-para-evaluar-neurotransmisor?language=Spanish
Timestamp: 2019-10-20 22:49:16+00:00

Document:
TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis | Protocol (Translated to Spanish)
Las vesículas sinápticas liberan neurotransmisores en las sinapsis químicas a través de un ciclo dinámico de la fusión y la recuperación. Supervisión de la actividad sináptica en tiempo real y la disección de los diferentes pasos de exo-endocitosis en el nivel de una sola vesícula son cruciales para la comprensión de las funciones sinápticas en salud y enfermedad.
Genéticamente codificados sondas sensibles al pH directamente dirigidos a las vesículas sinápticas y Reflexión Interna Total microscopía de fluorescencia (TIRFM) proporcionan la resolución espacio-temporal necesario seguir la dinámica de la vesícula. El campo evanescente generada por la reflexión interna total sólo puede excitar fluoróforos colocados en una capa delgada (<150 nm) por encima de la cubierta de vidrio sobre el cual las células se adhieren, exactamente donde los procesos de exo-endocitosis tienen lugar. Las imágenes de alto contraste resultantes son ideales para vesículas de seguimiento y análisis cuantitativo de los eventos de fusión.
En este protocolo, SH-SY5Y n humanaeuroblastoma células se proponen como un modelo valioso para el estudio de la liberación de neurotransmisores en el nivel de una sola vesícula por TIRFM, debido a su superficie plana y la presencia de vesículas dispersas. Los métodos para el cultivo de SH-SY5Y como células adherentes y para transfectar con synapto-pHluorin se proporcionan, así como la técnica para llevar a cabo TIRFM y de imagen. Por último, se presenta una estrategia con el objetivo de seleccionar, contar y analizar los eventos de fusión a nivel de células enteras y de una sola vesícula.
Para validar el método de análisis de procedimiento de imágenes y datos, la dinámica de las vesículas de etiquetado pHluorin se analizan bajo reposo y estimuladas (despolarizar las concentraciones de potasio) condiciones. Despolarización de la membrana aumenta la frecuencia de eventos de fusión y causa un aumento paralelo de la señal de fluorescencia neta registrada en células enteras. Análisis de una sola vesícula revela modificaciones del comportamiento de fusión-evento (altura máxima y una mayor anchura). Estos datos sugieren ésimoen la despolarización de potasio no sólo induce una liberación masiva neurotransmisor sino también modifica el mecanismo de la fusión de vesículas y reciclaje.
Con la sonda fluorescente apropiada, esta técnica se puede emplear en diferentes sistemas celulares para diseccionar los mecanismos de secreción constitutiva y estimulado.
La transmisión sináptica química entre las neuronas es un mecanismo principal de la comunicación en el sistema nervioso. Se basa en la liberación de neurotransmisores a través de un ciclo dinámico de la fusión de vesículas y la recuperación en el sitio presináptica. Muchas de las proteínas implicadas en la dinámica de vesículas han sido identificados; Sin embargo, su contribución específica al fenómeno queda por aclarar 1.
Nuestro entendimiento está parcialmente limitada por el hecho de que los ensayos más utilizados para exo / endocitosis no siempre son las más adecuadas. Varios estudios relacionados con la fusión de vesículas y la dinámica se basan en técnicas electrofisiológicas. Esta técnica proporciona una resolución temporal óptimo y es excelente para la investigación de la fusión inicial de vesículas a la membrana plasmática, pero es incapaz de detectar muchos de los eventos moleculares subyacentes que apoyan la función presináptica. La microscopía electrónica, en el otro lado, ofrece la mejor morphological descripción de cada paso singular, pero el aspecto dinámico del evento no puede ser capturado, ya que las muestras deben ser fijados con el fin de ser analizados.
El advenimiento de nuevas técnicas de grabación óptica de 2,3, en combinación con los avances en el desarrollo de sondas moleculares fluorescentes 4-6, permite la visualización de los procesos de exocytic en células vivas, proporcionando así nuevos niveles de información sobre la estructura y la función sináptica.
Los estudios iniciales explotadas tintes dependientes de la actividad de estirilo (FM1-43 y tintes orgánicos relacionados) 7,8. Estado-of-the-art técnicas de imagen emplean variantes sensibles al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) (pHluorin) atado a proteínas vesículas luminales 9. Estas sondas están normalmente desconectados cuando está presente en las vesículas debido al bajo pH luminal. Después de la fusión con la membrana plasmática, el interior de vesículas se expone al espacio extracelular neutral, el pH aumenta abruptamente, alivia la extinción de protones dependiente de pHluorin y la señal fluorescente aparece rápidamente. Como el cambio en pHluorin es más rápido que el evento de fusión, mediante el control de los incrementos de fluorescencia, la fusión de vesículas con la membrana se puede medir y analizar. Debido a que las moléculas de pHluorin-etiquetado de superficie se endocitosis, la señal de fluorescencia posteriormente vuelve al nivel basal, por lo tanto, la misma construcción puede utilizarse también para controlar la vesícula reciclaje 9.
Mientras que el sensor de pH de vesículas etiquetado asegura la visualización solamente de las vesículas que realmente se fusionan con la membrana plasmática, se requiere formación de imágenes en alta resolución espacial y temporal para describir en detalle los pasos implicados en los procesos de endocitosis exo /. La técnica óptica que proporciona la resolución espacio-temporal es necesario microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM), una aplicación de la microscopía de fluorescencia 10.
"> La reflexión interna total se produce en la interfase entre el cubre de vidrio y la muestra. Cuando la trayectoria de la luz alcanza el cubre de vidrio con un ángulo de incidencia mayor que el ángulo crítico, la luz de excitación no se transmite en la muestra, pero es completamente reflejada de nuevo. En estas condiciones, un evanescentes formas de onda de la luz en la interfase y se propaga en el medio con menos densidad óptica (la muestra). Como la intensidad del campo evanescente decae exponencialmente con la distancia desde la interfaz (con una profundidad de penetración de alrededor de 100 nm) sólo los fluoróforos en la proximidad más cercana a la hoja de la cubierta puede ser excitado mientras que aquellos más lejos de la frontera no lo son. En las células transfectadas con GFP-construcciones, esta profundidad corresponde a las proteínas expresadas en la membrana plasmática o en estructuras vesiculares acercarse a ella. Como fluoróforos en el interior de la célula no pueden ser excitados, la fluorescencia de fondo se reduce al mínimo, y una imagen con una señal de muy alta / fondo de rataio se forma 11.
Varias características hacen TIRFM la técnica de elección para el seguimiento de la dinámica de las vesículas. El contraste perfecto y la relación señal a ruido más alta relación de permiten la detección de señales muy bajas derivadas de vesículas individuales. Adquisición de imágenes basado en un chip en cada cuadro proporciona la resolución temporal necesaria para detectar procesos altamente dinámicos. Por último, la mínima exposición de las células a la luz en cualquier otro plano de la muestra reduce fuertemente la fototoxicidad y permite la grabación de largo lapso de tiempo duradero 12.
Análisis de los datos sigue siendo el aspecto más difícil y crucial de esta técnica. La manera más simple para monitorizar la fusión de vesículas es medir la acumulación de proteínas fluorescentes reportero en la superficie celular, con el tiempo 13. A medida que aumenta la fusión, neto aumenta señal de fluorescencia así. Sin embargo, este método puede subestimar el proceso, sobre todo en las células grandes y en condiciones de reposo,porque los procesos de endocitosis y fotoblanqueo compensar el aumento en la intensidad de fluorescencia debido a la exocitosis de vesículas. Un método alternativo es seguir cada evento de fusión única 14. Este último método es muy sensible y puede revelar detalles importantes sobre los mecanismos de fusión. Sin embargo, requiere la selección manual de los eventos individuales, porque los procedimientos completamente automatizados para seguir vesículas y registrar la fluctuación de sus señales fluorescentes no siempre están disponibles. Observación de la dinámica de vesículas requiere células de muestreo a alta frecuencia. Esto genera una gran cantidad de datos que difícilmente pueden ser analizados manualmente.
La propuesta de este trabajo es optimizar la técnica de imagen TIRFM para el seguimiento de la basal y estimulado la liberación de neurotransmisores en la línea celular de neuroblastoma SH-5YSY, y describir, paso a paso, un procedimiento desarrollado en el laboratorio para analizar los datos, tanto en los niveles de células enteras y de una sola vesícula.
1. Cultivo celular y transfección
Cultivo de células SH-SY5Y
NOTA: Los experimentos se han realizado utilizando el neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. Células SH-SY5Y crecen como una mezcla de grupos flotantes y las células adherentes. Siga las instrucciones indicadas en el protocolo (densidad celular, relación de división, etc.) Para tener células que crecen firmemente unidos a la cubierta de cristal, que es crucial para TIRFM.
Antes de comenzar, bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, hacer que el volumen oportuna de solución de fosfato estéril solución salina tamponada (PBS) y medio de cultivo.
Hacer 50 ml de PBS con concentraciones de NaCl 150 mM, tampón fosfato 24 mM, pH 7,4. Se filtra la solución.
Hacer 50 ml de medio de células de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 mg / ml), L-glutamina ( 2 mM), ypiruvato de sodio (1 mM). Se filtra la solución.
Retire medio de crecimiento completo y lavar las células con 3 ml de PBS.
Se incuban las células con 2 ml de ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA) (por 6 cm plato Petri) durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2 y separar las células con una pipeta.
Inactivar la tripsina mediante la adición de 2 ml de DMEM, y recoger las células por centrifugación a 300 xg durante 5 min.
Eliminar el sobrenadante, añadir 1 ml de DMEM al sedimento y la pipeta la solución arriba y hacia abajo suficientemente para dispersar las células en una sola suspensión celular.
Ellos dividieron 1: 4 en una nueva placa de Petri de diámetro 6 cm que contiene 3 ml de medio completo. Mantener las células en cultivo en placas de 6 cm de diámetro Petri, a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Sub-cultivo una vez a la semana o cuando se han cubierto 80 - 90% de la superficie.
Chapado de células SH-SY5Y para imágenes
Para los experimentos TIRFM, placacélulas sobre cubiertas de vidrio. Emplear vidrio cubre con 0,17 ± 0,005 mm de espesor y un índice de refracción 1,5255 ± 0,00015. Antes de empezar, prepare los cubreobjetos de vidrio de la siguiente manera:
Limpie el vidrio cubre con etanol al 90%, O / N.
Enjuague bien en agua destilada (tres cambios de agua destilada). Vidrio seco cubre en un horno de secado.
Lugar cubre en platos Petri de vidrio y esterilizar en un horno precalentado a 200 ° C durante 3 horas.
El día antes de la transfección, coloque cada cubreobjetos en una placa de Petri de 3,5 cm, agregar 1 ml de medio de cultivo y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
Tripsinizar las células como se describe en los pasos 1.1.3 - 1.1.5, suspender el sedimento celular en 1 ml de medio completo y contar. Calcular el volumen correcto de la suspensión celular para añadir a cada plato Petri para producir 3 x 10 5 células / pocillo. Se requiere esta densidad óptima para el crecimiento celular y transfección eficiente. Se incuba a 37 ° Cen un incubador de CO2 al 5% O / N.
NOTA: Para visualizar la dinámica de las vesículas sinápticas, se ha utilizado vector que contiene pCB6 synapto-pHluorin. El synapto-pHluorin ha sido generada por fusión en el marco de una variante sensible al pH de la proteína verde fluorescente (GFP) 16 y la proteína de membrana vesicular sinaptobrevina 2. La construcción se ha empleado ampliamente para investigar las propiedades de vesículas sinápticas dentro de las neuronas 9.
Antes de iniciar la transfección, hacer 10 ml de las siguientes soluciones. Mantenga las soluciones como máximo 1 mes.
Hacer una solución 150 mM de NaCl. Ajustar el pH a 5,5 con HCl 0,01 N.
Prepare una solución de PEI en el 10% de polietilenimina (PEI; 25 kDa lineal) en solución de NaCl 150 mM. El pH de la solución se eleva a 8,8. Ajustar el pH a 7,8 con HCl 0,01 N.
24 horas después de la siembra, se elimina el medio y refrescar con 1,5 ml demedio completo. Mantenga las células a 37 ° C, en un incubador de CO2 al 5%.
Bajo la cabina de bioseguridad de flujo laminar, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 3 g de ADN plásmido a 25 l de solución de NaCl 150 mM y 100 l de solución de PEI por 3,5 cm de placa de Petri.
Vortex durante 10 segundos, a continuación, incubar la mezcla de ADN / PEI durante 30 min a RT.
Añadir con cuidado la mezcla de ADN / PEI a la placa de Petri que contiene cubreobjetos con células y agitar suavemente para distribuir por igual el reactivo en la placa de Petri.
Después de 4 horas cambiar el medio y se incuban las células O / N a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Realizar experimentos de imagen 24 a 48 horas después de la transfección.
Imagen 2. Celular por reflexión interna total microscopía de fluorescencia (TIRFM)
Imaging configuración
Realizar imagen TIRF con la puesta a punto se describe en la Figura 1. Comprende un motorizado invertidamicroscopio (Figura 1, recuadro A), la fuente de láser (Figura 1, recuadro B) y el TIRF deslizante (Figura 1, recuadro C). Alcanzar la iluminación TIRFM a través de una alta apertura numérica (NA 1.45 Alfa Plan-Fluar) aceite de 100X, objetivo de inmersión.
Para la iluminación TIRFM, emplear una multilínea (458/488/514 nm) 100 mW láser de argón-ion. El uso de una fibra monomodo, introducir la luz láser polarizada linealmente en la trayectoria del rayo, mediante el control deslizante TIRF. Insertar el control deslizante TIRF en el plano diafragma de campo luminoso de la trayectoria del haz de luz incidente.
Por amplia iluminación de campo, conecte el microscopio a una lámpara de mercurio de arco corto convencional HBO luz blanca. Un doble prisma mantenedora de polarización en el control deslizante asegura la combinación simultánea de TIRF iluminación y luz blanca.
Se filtra la luz láser con un filtro de excitación (banda ancho de 488/10 nm) montado en una rueda de filtros, introducido en la trayectoria del láser. Emplearuna alta velocidad, controlado por software, obturador para permitir un control rápido de la iluminación láser. Para el análisis pHluorin, montar una banda paso 525/50 nm filtro de emisión. Captura imágenes digitales (512 x 512 píxeles) en una cámara CCD enfriado rápido con el software Image ProPlus.
El logro de la iluminación TIRF (Figura 2)
Encienda el láser, el ordenador, la cámara y la rueda de filtros, y los controladores de obturación; luego, esperar 20 minutos antes de comenzar el experimento como los láseres necesitan calentarse y estabilizarse.
Antes de formación de imágenes, hacer que el volumen oportuno de las siguientes soluciones.
Hacer 50 ml de solución de Krebs (KRH) en NaCl 125 mM, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico (HEPES) (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, y glucosa 6 mM.
Hacer 10 ml de solución de KCl-KRH (pH 7,4) en NaCl 80 mM, KCl 50 mM, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (tamponada a pH 7,4), 2 mM CaCl 2, y glucosa 6 mM.
Retire la cubierta de cristal con células transfectadas e insertarlo en la cámara de imagen apropiado. Montar la cámara y añadir 500 l de solución KRH en el centro del cristal.
Añadir el aceite sobre el objetivo. Coloque la cámara de imágenes en la platina del microscopio y la posición del objetivo bajo el cubreobjetos de vidrio. Colocar la tapa de seguridad sobre la muestra.
En el modo de epifluorescencia, se centran en el cubreobjetos (superficie superior) y elija células transfectadas colocados en el centro de la cámara. Seleccione las celdas cuya señal fluorescente puede grabarse claramente utilizando un tiempo de exposición por debajo de 80 ms.
Bajo el control del software, cambiar a la iluminación TIRF en modo directo.
Para establecer la configuración TIRF, compruebe la posición del haz que emerge del objetivo, en la portada de la muestra (Figura 2B). Cuando el haz se coloca en el centro de tél lente objetivo (Figura 2A, izquierda), un lugar es visible en el centro de la cubierta de la muestra TIRF (Figura 2B, a la izquierda) y la célula se forma la imagen en el modo de epifluorescencia (varios planos de enfoque, de alta fluorescencia de fondo; Figura 2C, izquierda) .
Para alcanzar el ángulo crítico, mover el punto enfocado en la dirección Y (hacia adelante o hacia atrás; Figura 2B, centro) con el tornillo de ajuste del ángulo en el control deslizante TIRF (Figura 1C). Cuando el haz converge en el plano de la muestra en un ángulo mayor que el ángulo crítico (Figura 2A, derecha), el punto desaparece y una, delgada, línea recta centrado es evidente en el medio de la cubierta de la muestra (Figura 2B, derecha).
Para ajustar el ángulo TIRF utilizar la muestra de células (Figura 2C). Ver la imagen de fluorescencia en el video, en esta etapa, una imagen-epifluorescencia como aún es visible. Con cuidado, mueva el tornillo hasta TIRF concondición se logra: un solo plano óptico de la celda está en el foco (es decir, la membrana plasmática en contacto con la hoja de la cubierta), esto resulta en una imagen plana con alto contraste (Figura 2C, derecha).
Ajuste el canal único experimento de lapso de tiempo. Para minimizar fotoblanqueo, capturar la imagen con bajo tiempo de exposición y de alta ganancia. Tiempos de exposición apropiados son entre 40 - 80 ms. Adquirir imágenes en 1 - 2 Hz de frecuencia de muestreo. La cinética de vesículas de muestreo pueden ser mejor apreciado en mayor frecuencia (10 Hz). El tiempo regular de observación es generalmente de 2 min.
Añadir 500 l de células de solución KRH y grabar en el modo de TIRFM. Esta es la condición de reposo. Guarde las imágenes secuenciales de tiempo.
Centrarse en la misma celda y registro en las mismas condiciones de reposo (potencia láser, tiempo de exposición, de número de fotograma). Después de cinco marcos, añadir 500 l de solución de KCl-KRH y mantener KCl en la cámara.Esta es la condición estimulada; guardar las imágenes secuenciales de tiempo.
Análisis 3. Imagen y Procesamiento de Datos
NOTA: Para analizar las imágenes, macros se han desarrollado en el laboratorio, basado en funciones existentes del software de análisis de imagen; macros similares están disponibles en línea (URL proporcionado en la Tabla de Materiales y Equipos).
Cuantificación intensidad de fluorescencia
Utilice una macro "intensidad de fluorescencia Sequence" para la cuantificación intensidad de fluorescencia en una región de interés (ROI) de la imagen, en el transcurso de la película.
Abra las imágenes en tiempo secuencial. Ir al menú de macro y seleccione 'intensidad de fluorescencia Secuencia'. En la ventana "Análisis" aparece "seleccione el retorno de la inversión".
Elija una de las herramientas de selección en el menú para crear el ROI. Coloque 3 ROIs en las regiones de la membrana celular sin manchas (fondo ROI). Emplear this "fondo ROI" para evaluar la photobleaching y para establecer el umbral para el análisis de actividad de fusión (Figura 3A).
Corrección Photobleaching y determinación del umbral (Figura 3B)
Para evaluar la fotoblanqueo, abra las filas de fluorescencia intensidad "ROI de fondo", (Figura 3ba). Normalizar los valores de intensidad de fluorescencia en cada marco para el valor de intensidad inicial (F0) (F / F0) (Figura 3BB). La media de los valores.
Resaltar los datos medios y crear un esquema lineal utilizando las opciones de menú gráfico.
Desde el menú de análisis de datos, seleccione "línea de tendencia" para abrir el diálogo de análisis de la representación. Seleccione el tipo de regresión. Ajuste de regresión "exponencial". A continuación, seleccione "ecuación de pantalla en la carta". En la ventana gráfica, la ecuación exponencial aparece y los valores de los parámetros se asignan automáticamente, (Figura 3bc
Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama de la siguiente manera:
Fn (corregido) = Fn / exp (-n * a)
Fn = intensidad de la fluorescencia experimental medido en la trama n; n = número de fotogramas; a = factor de blanqueo (constante que expresa la tasa de pérdida de intensidad debido a photobleaching; Figura 3Bd).
Para establecer el umbral, abrir un normalizado y corregido "fondo ROI", calcular la media de la señal de fluorescencia y su desviación estándar (SD). El valor promedio más 3 SD representa el umbral (Figura 3be). Utilice este umbral para el análisis de datos.
Selección de los eventos de fusión utilizando un procedimiento semiautomático
Abra las imágenes secuenciales en el tiempo con el software de análisis de imágenes. Aplicar un filtro de Gauss a la secuencia de imagen activa.
Analizar las imágenes con la función "contar objetos" o una macro que permite la selecciónde un objeto cuya píxeles tienen intensidad media de fluorescencia dentro de un rango definido. Ajuste el rango de intensidad de forma manual, utilizando la función de umbral (ir al menú de la barra, defina medida → umbral para resaltar el área de interés). Un umbral adecuado es 30% más que la señal de fondo fluorescente local.
Aplicar una macro "Filtros de objetos" para seleccionar sólo los objetos que cumplan los siguientes criterios:
Aplicar opción rangos (mínimo y máximo incluido) para los aspectos. Aspecto informa de la relación entre el eje mayor y el eje menor de la elipse equivalente al objeto. Aspect es siempre ≥1. Valores adecuados min = 1, max = 3.
Aplicar rangos de diámetro. Diámetro informa de la duración media de los diámetros medidos a intervalos de dos grados que une dos puntos de contorno y que pasa a través del centroide del objeto. Ajuste el rango de píxeles (o en micras, si se utiliza un sistema calibrado).
Defina el rango óptimo en preliminexperimentos ary: seleccionar manualmente los puntos de interés y luego medir su diámetro utilizando la función de perfil parcela.
Seleccione "objetos de visualización": los objetos seleccionados se presentarán superpuestas a la imagen TIRFM (Figura 4B).
Incluir en el análisis sólo aquellos puntos que muestran un corto (uno a tres marcos) aumento transitorio de la intensidad de fluorescencia, seguido inmediatamente por una marcada pérdida de señal (puntos transitorios). Emplear la selección circular para crear un retorno de la inversión de diámetro aproximadamente un punto radialmente alrededor de las vesículas seleccionados / spots (ROI experimental). Realice este paso manualmente.
Con las ROIs seleccionado, calcular la intensidad media de fluorescencia de cada ROI en el transcurso de la película.
Análisis de los datos (Figura 3C-D)
Exportar el curso de tiempo de los cambios de fluorescencia medidos en cada "ROI experimental" a una hoja de cálculo; (Figura 3DA). Normalizar el valor de intensidad en cada trama a la intensidad de fluorescencia inicial (F / F0), (Figura 3Db).
Aplicar la corrección exponencial a los valores de intensidad en cada trama como se informó en el paso 3.2.4 (Figura 3Dc).
Para calcular el número total de eventos de fusión (número de pico), el tiempo se produce cada fusión (anchura de pico) y la amplitud de pico fluorescente (altura del pico y AUC) aplicar funciones lógicas utilizando los paquetes de hojas de cálculo o matemáticas. Un ejemplo de análisis de eventos de fusión usando fórmulas lógicas se informó en la Figura 3Dd y 3De.
Suponga que el aumento de la intensidad de fluorescencia que excede el umbral (intensidad media de fluorescencia de fondo ± 3SD) como la fusión de vesículas a la membrana plasmática y el pico resultante como un evento de fusión.
Calcular la anchura de pico como diferencia entre el último y el primer valor de x de cada pico. Multiplique este valor por 1 / (frecuencia de muestreo). Considere este valor uns el momento de la fusión de vesículas y la adhesión a la membrana plasmática antes vesícula re-acidificación y reciclaje (Figura 3Dd).
Calcular el AUC de células enteras como una suma de los valores por encima del umbral. Considere este valor como el cambio neto fluorescente durante el tiempo de grabación debido a la espontánea (en reposo) o evocada (estimulado) la actividad sináptica.
Calcular la altura del pico como la diferencia entre el valor máximo y de cada pico y el umbral. Considere este valor como indicativo del tipo de fusión (fusión única vs. simultánea / secuencial o transitoria vs. fusión completa).
Los procedimientos de imágenes TIRF y datos de análisis descritos están diseñados para estudiar la dinámica de vesículas en los sistemas celulares. Esta técnica se puede utilizar para determinar los efectos de las moléculas de señalización y las drogas en los eventos de fusión y la dinámica de vesículas de neurotransmisores 17. El uso de proteínas de la membrana plasmática GFP-etiquetados, el análisis TIRFM se ha empleado para caracterizar el tráfico constitutiva de los transportadores de glutamato GFP-etiquetados en glial y células epiteliales 18,19.
Para validar la estrategia procedimiento de imágenes y análisis de los datos reportados, eventos de fusión se registran en condiciones basales y estimuladas (despolarización inducida por potasio), en células de neuroblastoma SH-SY5Y transfectadas con synapto-pHluorin. (Video 1, 2, respectivamente). Dos análisis se llevan a cabo diferentes: de células enteras (Figura 4) y los análisis de una sola vesícula (Figura 5).
Análisis de células enteras meaSures el número total de eventos de fusión en la célula y los cambios de fluorescencia netos resultantes inducidos por la estimulación. En la Figura 4, las células transfectadas synapto-pHluorin se registran en reposo y estimuladas condiciones (KCl estimulación), utilizando el mismo protocolo experimental (tiempo de exposición, la potencia del láser, etc). La Figura 4A muestra que synapto-pHluorin acumula en puntos lagrimales fluorescente dispersado en el membrana celular. Como se ha descrito en la literatura, una señal fluorescente débil también está presente en la membrana plasmática 9; esta señal es útil para identificar las células en ser fotografiado. En la figura 4B, puntos seleccionados por el procedimiento automático se describe en el documento (sección 3.3) se superponen a la imagen TIRFM reportado en la figura 4A. La Figura 4C muestra los perfiles de intensidad de fluorescencia normalizados de puntos seleccionados en condiciones de reposo. Estos perfiles revelan la presencia de picos individuales de int fluorescente similaresensity que salen en varios momentos durante la grabación y probablemente corresponden a vesículas que de vez en cuando se fusionan con la membrana. Figura 4D muestra los efectos de KCl estimulación. Como era de esperar, la despolarización con KCl 25 mM provoca una respuesta pronta y varios puntos lagrimales fluorescentes muy brillantes aparecen en la membrana celular (Video 2). Estos puntos lagrimales corresponden a la piscina 'fácilmente liberable' de las vesículas sinápticas presentes debajo de la membrana de plasma. El análisis del curso temporal de los cambios fluorescentes medidos en correspondencia de los puntos individuales indica la presencia de picos, de la intensidad de fluorescencia variables, que aparecen de repente después de la aplicación del estímulo de secreción (Figura 4D y 4F). Los resultados del análisis de células enteras durante el momento de la grabación se presentan en la Figura 4E-H. KCl estimulación provoca un rápido aumento marcado en el número de eventos de fusión (2,5 veces de incremento sobre condiciones de reposo) (Figura 4E-F) y en los cambios de intensidad de fluorescencia resultantes (9,3 veces de incremento sobre condiciones de reposo) (Figura 4G-H), indicando así la liberación masiva de neurotransmisores.
Análisis de un solo pico permite la caracterización de los eventos de fusión único (Figura 5). La Figura 5A muestra la secuencial imágenes de un representante "ROI experimental", grabado en condiciones de reposo. El particular, destaca un synapto-pHluorin etiquetada vesícula que se fusiona con la membrana bajo la zona TIRF. Después de dos marcos, la señal fluorescente desaparece, lo que indica recuperación de la vesícula probable y re-acidificación. El perfil de fluorescencia normalizada de la región de interés (Figura 5B) mide un aumento en la señal fluorescente en correspondencia con el punto de aparición en la zona TIRF. Por el contrario, la fluorescencia vuelve al nivel basal después de la desaparición punto (pico únicode anchura media 1,91 ± 0,32 s; altura del pico promedio 0,042 ± 0,005 intensidad de fluorescencia normalizada). Figura 5C y 5D muestran las imágenes secuenciales de un "retorno de la inversión experimental" registrado en KCl estimulación y el perfil de intensidad de fluorescencia normalizada correspondiente. Tenga en cuenta el aumento en el movimiento de vesículas dentro y fuera de la zona de TIRF después KCl despolarización.
40 eventos de fusión se seleccionan y analizan en reposo y estimulado condiciones. Los siguientes parámetros se miden: AUC media de pico, pico ancho y altura. Anchura del pico especifica el tiempo de la fusión de vesículas, el apego y la endocitosis antes de volver a la acidificación y el reciclaje, la figura 5G. Altura de pico mide los cambios de intensidad de fluorescencia inducida por la fusión de vesículas, la Figura 5F. Los cambios en estos parámetros son indicativos de diferentes mecanismos de exocitosis. Análisis de un solo pico revela que modifica la despolarización de KClel modo de fusión de vesículas a la membrana plasmática. De hecho, el aumento de la superficie media de pico (3,8 ± 0,2 veces mayor durante condiciones de reposo, P <0,01 por la prueba t pareada, Figura 5E), la altura del pico (2,75 ± 0,03 veces mayor, P <0,01 por pares de t-test, la figura 5F) y anchura (2,6 ± 0,5 veces mayor, P <0,05 mediante la prueba t pareada. Figura 5G) se detectan en condiciones estimuladas. Varias explicaciones pueden prever para estos resultados. Una posibilidad es que la despolarización de KCl hace que la fusión simultánea y / o secuencial de vesículas en una región limitada de las células. Una explicación alternativa es que la fuerte despolarización favorece la fusión completo con respecto a la fusión transitoria. En condiciones basales, el mecanismo predominante es una fusión transitoria: una fusión formas de poro, el pH en los aumentos de vesículas y aparece la señal fluorescente, pero el poro se cierra inmediatamente, permitiendo así una rápida re-acidificación y reciclaje. Bajocondiciones estimuladas, la vesícula se fusiona completamente con la membrana plasmática, la altura del pico y el aumento de anchura que la recaptura de los componentes de vesícula de membrana, volver a la acidificación y el reciclaje puede requerir un periodo más largo. Un resultado similar se ha obtenido recientemente el análisis-sináptica como microvesícula exocitosis en endocrinos β-células 20.
Figura 1. microscopio TIRF configurado. Vista esquemática y la imagen (recuadro) del sistema de microscopio TIRF. La configuración comprende el microscopio Axio Observador Z1 motorizados invertida (A), una multilínea 100 mW láser de argón-ion (B) y un control deslizante TIRF (C). La luz láser (línea verde) y la luz blanca (línea amarilla) se muestran. Las células son imágenes utilizando un objetivo de inmersión 100 × petróleo. Las imágenes digitales son capturados en una cámara CCD Fast RetigaSRV enfriado. El árbitromódulo lector, la emisión (488/10 nm) y la excitación (paso de banda 525/50 nm) filtros, el colimador (L1) y enfoque (L2) de la lente se indican. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Conseguir configuración TIRFM. (A) caricatura esquemática que ilustra el objetivo, el cubre, la muestra y la posición del rayo láser (línea azul). Izquierda, el haz de excitación se desplaza directamente a través de la interfaz del cubre-muestra . La muestra se excita como en el modo de epifluorescencia. Centro, las formas de haz de excitación con la muestra un ángulo de incidencia menor que el ángulo crítico, la luz ilumina la muestra en un ángulo variable. Derecha, el haz de excitación forma INCIDent ángulo mayor que el ángulo crítico, se completa la luz reflejada de nuevo en la lente del objetivo, y un campo evanescente se propaga en la muestra. (B) de dibujos animados que muestra la cubierta de la muestra y la posición del haz de excitación (círculo azul), que emerge del objetivo, durante la transición de epifluorescencia (izquierda) hacia TIRF iluminación (derecha). (C) epifluorescencia (izquierda) y TIRFM (derecha) imágenes de synapto-pHluorin fluorescencia en una célula SH-SY5Y en vivo. Barra de escala:. 10 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(A) Imagen TIRFM de synapto-pHluorin fluorescencia en un vivo SH-SY Figura 3. procesamiento y análisis de datos.5Y células. El cuadro verde indica un representante "fondo ROI". Barra de escala 10 micras. (B) de flujo de trabajo propuesto para el fondo ROI. De arriba a abajo:.... Un curso de tiempo de los cambios de intensidad de fluorescencia medidos en el ROI de fondo; b normalización de cambios de fluorescencia para el valor de fluorescencia inicial (F / F0); c aplicación de la regresión exponencial; d corrección para photobleaching, e. Evaluación umbral (cuadrado gris transparente). (C) TIRFM imagen de synapto-pHluorin fluorescencia en una célula SH-SY5Y en vivo. El cuadro blanco indica un representante "ROI experimental". Barra de escala 10 micras. (D) de flujo de trabajo propuesto para el retorno de la inversión experimental. De arriba a abajo:.. Un curso temporal de los cambios en la intensidad de fluorescencia; b normalización de datos para el valor de fluorescencia inicial (F / F0); c. photobleaching;. de aplicación de funciones lógicas para detectar el número máximo, AUC, anchura y altura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Análisis de células enteras. (A) Imagen TIRFM de synapto-pHluorin fluorescencia en una celda SH-SY5Y en vivo. Las células se registran en reposo y estimulado condiciones (25 mM KCl aplicación) (muestreadas a 1 Hz). Barra de escala: 10 micras. (B) los puntos identificados por el procedimiento automático se muestran superpuestas (color verde) en la imagen TIRFM. (C) perfiles normalizados intensidad de fluorescencia (F / F0) de los puntos seleccionados por el procedimiento automático en toda la célula bajo condiciones de reposo. (D) Normalizperfiles ed intensidad de fluorescencia (F / F0) de los puntos seleccionados en condiciones estimuladas. La barra sobre las huellas indica aplicación de KCl. (EH) Número de eventos y cambios de intensidad de fluorescencia registrados en toda la célula en reposo (azul) y (rojo) condiciones estimuladas. (E) histogramas que muestran el número total de eventos de fusión registrados en la célula. (F) La distribución temporal de los eventos de fusión. (G) Los histogramas que representan cambios en la intensidad de fluorescencia pHluorin que ocurren en el conjunto de células (AUC total). (H) Curvas que muestran los acumulativos pHluorin cambios de intensidad de fluorescencia como una función del tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
(A) las células SH-SY5Y sola vesícula expresan synapto-pHluorin se crean imágenes a 1 Hz, en condiciones de reposo. Imágenes secuenciales TIRFM Representante (cada 2 s) de un retorno de la inversión muestra una synapto-pHluorin etiquetados vesícula. ROI = 40 x 35 píxeles. (B) el perfil de fluorescencia normalizada (F / F0) del retorno de la inversión se muestra en A. El asterisco negro indica un evento de fusión, la línea de umbral se muestra. (C) La misma celda se registra en condiciones estimuladas (25 mM KCl), se muestran TIRFM representante imágenes secuenciales de un retorno de la inversión. Aplicación KCl se indica mediante el asterisco amarillo. (D) El perfil de fluorescencia normalizada de la región se muestra en C, se destacan la llegada (in) y desaparición (out) de las vesículas. Asteriscos negros indican los eventos de fusión, se muestra la línea de umbral. (EG) propiedades de los eventos de una sola vesícula registrados en reposo (barra azul) y estimuladas ( bar) condiciones rojos. n = 40 eventos de fusión. (E) Izquierda, área de pico (AUC) se indica con la luz azul; derecha, histogramas de superficies medias de pico; ** P <0,01. (F) Izquierda, pico de altura (h) se indica mediante una flecha de dos puntas, centro, histogramas de la altura media de pico; ** P <0,01; derecha, la altura del pico especifica el mecanismo de fusión. La estrella en la caricatura indica synapto-pHluorin. (G) Izquierda, anchura de pico se indica con una flecha de dos puntas, centro, histogramas de la anchura media de pico; * P <0,05; derecha, la anchura del pico especifica el tiempo de la exocitosis de vesículas, el apego y la endocitosis. El color estrella es verde cuando la fluorescencia synapto-pHluorin es visible y en gris cuando se desactiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
ent "> células video 1. SH-SY5Y que expresan synapto-pHluorin se registran en condiciones de reposo (muestreadas a 1 Hz). Haga clic aquí para ver el vídeo.
Vídeo 2. Las células SH-SY5Y que expresan synapto-pHluorin se registran en condiciones estimuladas (muestreadas a 1 Hz). KCl perfusión se indica. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
Este artículo presenta un protocolo para la imagen y analizar la dinámica de vesículas en las células secretoras, utilizando vectores cDNA codificada fluorescentes y TIRFM. Los elementos clave del éxito de formación de imágenes por TIRFM son la selección del modelo celular y transfección celular con indicadores ópticos genéticamente codificados de la liberación de vesículas y el reciclaje.
TIRFM es ideal para las células de crecimiento adherente a una cubierta de vidrio planas y suficientemente estable para permitir la visualización de las membranas y los eventos de fusión. Las vesículas ideal sería que se dispersa en la celda para que su tráfico, la fusión y la endocitosis se pueden obtener imágenes y cuantificados a nivel de una sola vesícula. Por desgracia, las neuronas no se cumple con estos criterios: tienen formas irregulares, neuritas que frecuentemente se cruzan entre sí, y las vesículas fusión se concentra predominantemente en regiones pequeñas (zonas activas). Para estas regiones es muy difícil de estudiar la dinámica de la vesícula por TIRFM en cultivos primarios de neuronas.
21,22. Las células son suficientemente plana para permitir la visualización estable de las membranas y los eventos de fusión en el modo TIRFM (particularmente en el cuerpo de la célula) y las vesículas están relativamente dispersos. Finalmente, las células pueden ser fácilmente transfectadas con GFP-etiquetados proteínas de codificación de plásmido o etiquetas de proteínas sensibles al pH usando diferentes reactivos de transfección. En este protocolo, PEI se ha utilizado para transfectarlas células. Este reactivo constituye la base de la mayoría de agentes de transfección disponibles comercialmente y solo actúa como un rentable vector de transfección muy. Se espera que un 20% de eficiencia de transfección utilizando el protocolo anterior reportado que es adecuada para formación de imágenes de células individuales.
Si bien la disponibilidad de diferentes reactivos y procedimientos de transfección transfección hace casi un procedimiento estándar en SH-SY5Y e incluso en cultivos primarios de neuronas, se debe tener cuidado al grabar, analizar e interpretar los datos TIRFM. TIRFM facilita la recopilación de información con respecto a los procesos que ocurren en o cerca de la membrana en las células vivas, y permite el análisis de los eventos moleculares individuales a través de la detección de cambios en la señal fluorescente derivados de proteínas etiquetadas que se mueven en o fuera de la evanescente presentada. Sin embargo, varios factores pueden modificar las señales fluorescentes en esta zona, sin que implique necesariamente exo / eventos endocíticas, y esto hay que tomarn en cuenta al registro y análisis de datos. Entre ellas se encuentran los cambios morfológicos en la célula, en particular las relativas al plano en el enfoque en virtud de las modificaciones de campo y fluoróforas evanescentes durante la grabación.
La alta resolución de la técnica TIRF se basa en la excitación de los fluoróforos en el campo evanescente, con la profundidad de 100 nm desde la interfaz de vidrio 11. Esta es una zona muy delgada y se espera que las modificaciones morfológicas imperceptibles para cambiar el plano de células en foco. Esto se aplica particularmente a las neuronas y las células que presentan varios procesos y exhiben fruncido pronunciado. En estas células, el área de la membrana en contacto con el cubreobjetos durante la grabación es irregular y puede cambiar rápidamente, causando así la evaluación inexacta de la exocitosis. Por esta razón, siempre que sea posible, es importante seleccionar el modelo celular de la investigación. Para limitar moveme celularnts pueden ser útiles para revestir vidrio cubiertas con proteínas de la matriz extracelular o poli-l-lisina. Sin embargo, hay que tener en cuenta que estos sustratos pueden modificar la dinámica de comportamiento celular y la vesícula.
Otras posibles fuentes de modificaciones morfológicas durante la grabación son la estimulación de células, la adición de las soluciones, y los cambios de temperatura. Los estímulos capaces de inducir la liberación de vesículas masiva (es decir, la despolarización de KCl) a menudo causan contracción de la célula que se modifica, evidentemente, la superficie de la célula debajo de la zona TIRF. Por tanto, es importante seleccionar con precisión el tiempo tipo, concentración, y la aplicación del estímulo en experimentos preliminares.
La simple introducción de soluciones en el baño con una pipeta, independientemente de la composición, puede provocar la modificación de la morfología celular por el estrés de cizallamiento. Para resolver este artefacto, se añade medio de preferiblemente usando un sistema de perfusión, posiblemente conectado con una bomba de vacío para reducir el ruido.
La alteración de las señales fluorescentes también puede ser debido a la modificación del fluoróforo durante la grabación. El más importante es fotoblanqueo 23. Photobleaching es la descomposición inducida por fotones de un fluoróforo. Por lo general, provoca una pérdida permanente de la fluorescencia y la regulación de la muestra observada en el tiempo. En TIRFM, sólo fluoróforos cerrado al origen del campo evanescente puede photobleached y proteínas de la membrana GFP-etiquetados son photobleached porque residen en este campo. La prevención de la decoloración de la intensidad de emisión de fluorescencia es muy importante para obtener imágenes de alta calidad, y obligatorio para la microscopía de fluorescencia cuantitativa. Con una aproximación razonable, para una molécula dada en un ambiente constante, photobleaching depende del tiempo y el ciclo de exposición a la fuente de excitación. En muchos casos, photobleaching sigue una sencilla función de decaimiento exponencial, lo que hace su evaluación y su corrección más fácil mediante la realización de registros de control 23. Diferentes fórmulas de corrección / macros están disponibles en línea (véase la Tabla de materiales y equipos); en el protocolo simple exponentifunción al se ha utilizado.
Hay varias estrategias para superar photobleaching. Una buena estrategia es evitar photobleaching en la fuente, por ejemplo, el uso de fluoróforos con alta fotoestabilidad. Desafortunadamente, en este momento, la elección de sondas de ADN codificado es aún limitada. En este caso, la pérdida de actividad causada por photobleaching puede ser minimizada durante la adquisición de imágenes, la optimización de lapso de tiempo de exposición a la luz, la energía del fotón de la luz de entrada y la frecuencia de muestreo.
Cuando se utilizan sondas sensibles al pH, una fuente adicional de modificación fluoróforo durante la grabación es el cambio de pH en el medio. El volumen de líquido de la cámara de registro es por lo general muy baja y la aplicación del fármaco, la actividad celular y el metabolismo pueden modificar el pH del medio, particularmente en el pequeño volumen entre la célula y la superficie del cubreobjetos. Esto a su vez, cambia la señal fluorescente pHluorin, causando así más / menos-estimación de la vesícula rearrendar. Por ejemplo, estimulaciones fuertes pueden conducir a una acidificación dependiente de calcio de la citosol y reflejado alcalinización en el espacio extracelular, lo que resulta en un aumento exagerado en la señal fluorescente 24.
Para evitar este problema, utilice siempre soluciones tamponadas y monitorear posibles modificaciones de pH introducidas por el protocolo establecido, en experimentos preliminares. Para una estimación más precisa de la liberación de vesículas evocada, al analizar los datos, controlar la señal de fluorescencia en una región de la superficie celular sin eventos de fusión, y el uso de modificaciones de la señal fluorescente dentro de esta región como factor de ajuste.
En conclusión, un método para el seguimiento y análisis de la fusión de vesículas y la dinámica ha sido descrita. Esta técnica se puede utilizar en diferentes tipos de células (neuronas y células endocrinas) para visualizar y diseccionar las diferentes etapas de exo / endocitosis, para revelar el papel de las proteínas y su pathogenimutantes c en la regulación de la dinámica de la vesícula y de descubrir los mecanismos de acción de fármacos dirigidos exocitosis constitutiva y regulada.
Los autores desean reconocer la Università degli Studi di Milano para el apoyo a Eliana Di Cairano (beca post-doctoral) y Stefania Moretti (beca de doctorado). Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de la Universidad de PUR CP
Nos gustaría dar las gracias al profesor Jeremy M. Henley, Facultad de Bioquímica de la Universidad de Bristol, Reino Unido, por el pHluorin construir y el Dr. Francesco Dotti para la asistencia en el análisis de datos, y Silvia Marsicano para la asistencia técnica.

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