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Evaluación del Solvente de Inyección en la Validación del Análisis Farmacéutico por HPLC - PDF
Evaluación del Solvente de Inyección en la Validación del Análisis Farmacéutico por HPLC
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Héctor Paz Ortiz de Zárate
1 Acta Farm. Bonaererzse 15 (1): (1996) Recibido el 2 de diciembre de 1995 Aceptado el 3 de enero de 1996 Metodología Evaluación del Solvente de Inyección en la Validación del Análisis Farmacéutico por HPLC Paula C. DABAS y Clyde N. CARDUCCI * Departamento de Química Analítica y Fisicoquímica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, (11 13) Buenos Aires, Argentina RESUMEN. El efecto del solvente empleado en la disolución de la muestra, así como fenómenos de adsorción en el sistema de inyección, fueron evaluados en el análisis por cromatografia líquida en fase reversa de un grupo seleccionado de 1,4-benzodiazepinas. La influencia de dichos factores sobre parámetros cromatográficos como tiempo de retención, forma del pico y respuesta de área fueron estudiados con el objeto de verificar si errores en la cuantificación se producen por el efecto de la naturaleza y volumen del solvente de inyección usado en la cromatografia líquida de las benzodiazepinas. SUMMARY. "Evaluation of the Injection Solvent in the Validation of Pharmaceutical Analysis by HPLC". Sample solvent interaction and adsorption effects onto the injector system in reverse phase liquid chromatography were investigated in a selected group of 1,4-benzodiazepines. Influence on the chromatographic parameters as retention time, peak shape and area response were studied in order to evaluate if quantitation errors were derived from the effect of the volume and nature of the solveiit used in the liquid chromatography of benzodiazepines. INTRODUCCION La validación de las nletodologías analíticas para la identificación y cuantificación de drogas en ~natrices complejas tales como fluídos biológicos y formas far- macéuticas merecen hoy especial atención. Los estudios de biodisponibilidad in vivo e in vitro requieren también el empleo de procedimientos validados. Teniendo en cuenta que la crornatografía liquida de alta resolución (HPLC) es de elección para el análisis biofarmacéutico, el solvente de inyección es una de las variables que se debe evaluar para conocer el efecto que tiene su>naturaleza, así como su volumen, sobre la forma, área de los picos y tiempos de retención. Por lo tailto, especial cuidado es necesario para determinaciones precisas y exactas por PALABRAS CLAVE: 14-benzodiazepinas, Solvente de inyección, Fenómenos de adsorción. KEY WORDS: 1,4-beiizodiazepiiies, Injectioii solvent, Adsorptioii effects. * Autor a quien dirigir la correspondencia. ISSN2 Dabas, P.C. & C.N. Carducci HPLC pues, con frecuencia, resultados inexactos que pasan inadvertidos son debidos al solvente de la rnuestra y/o a interpretaciones erróneas de resultados por anomalías producidas por el solvente atribuídos equívocamente a un mal comportamiento de la columna o a la muestra 1,2. Problemas de cuantificación al medir área o altura de pico pueden también surgir por fenómenos de adsorción del analito en el loop del inyector, particularmente, cuando el solvente de inyección utilizado en la cromatografía líquida de fase reversa (RP-HPLC) es agua o un solvente más débil que la fase móvil 3-7. También depende del solvente la asimetría de los picos, la eficiencia de la columna y la sensibilidad. Por ello, el efecto de la fuerza del solvente y el volumen de inyección, sobre la distorsión y aparición de dobles picos, así como sobre el área y/o altura de pico, han sido motivo de investigaciones ~ Frecuentemente, cuando por requerimientos del análisis se emplean solventes fuertes como metano1 o acetonitrilo y/o grandes volúmenes en la inyección de la muestra, no se cumple con las buenas prácticas de la cromatografía líquida. Este trabajo presenta un estudio de los efectos del volumen y la naturaleza del solvente de inyección en la cromatografía líquida en fase reversa de las 1,4- benzodiazepinas, así corno la evaluación de fenómenos de adsorción en el loop durante la inyección. Las drogas mencionadas constituyen un grupo de fármacos ampliamente empleados por sus propiedades farmacológicas y toxicológicas. MATERIAL Y &TODOS Reactivos Diazepan, oxazepan, lorazepan, nitrazepan, flunitrazepan, prazepan, triazolan y uracilo fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, MO, USA). Loflazepato de etilo y decarbetoxiloflazepato fueron gentilmente suministrados por Sanofi Recherche (Montpellier, Francia). Metano1 de calidad HPLC (Lichrosolv, Merck) y agua deionizada y bidestilada. Los solventes fueron filtrados a través de menbrana de nylon de 0,45 pm y desgasificados antes de usar. InstrumentacMn Se utilizó en el análisis cromatográfico un cromatógrafo líquido Varian 5020 equipado con detector Varian UV-100 (Varian, Palo Alto, CA, USA) con una válvula de inyección Rheodyne 7125 y loops de 20 y 50 pl. Una columna Micropack MCH -10, 300 x 4,6 mm ID, 10 pm se empleó para el análisis del oxazepan y flunitrazepan y una columna Micropack MCH - 5, 150 x 4,6 mrn ID, 5 pm (Varian, Palo Alto, CA, USA) para el resto de las benzodiazepinas estudiadas: La fase móvil consistió en una mezcla de rnetanol-agua ernpleada en distintas proporciones: de 75:25 para el prazepan, de 7030 para el diazepan, lorazepan, loflazepato de etilo y decarbetoxiloflazepato, de 6535 para el oxazepan y flunitrazepan y de 60:40 para el triazolan y nitrazepan. El flujo fue de 1,O ml/min y la temperatura de 32 OC. La detección se llevó a cabo entre 220 y 230 nrn de acuerdo con el niáximo de absorción de las drogas empleadas a una sensibilidad de 0,05 aufs. Para la determinación del t, se utilizó uracilo.3 acto forrriucéurica 6ortoe1-ertse -vol. 15 iig 1 - año 1996 Soluciones estándar Las soluciones estándar fueron obtenidas disolviendo las benzodiazepinas en metano1 para lograr una concentración de 400 pgíml. Por dilución de las rnismas en agua, metano1 y fase móvil se obtuvieron las soluciones de análisis de concentración final 2 pg/rnl. Las soluciones preparadas frescas cada día se inyectaron cinco veces. AdkorcMn & los anaiüos en el loop &l inyector Para la evaluación de los fenómenos de adsorción que pudieran producirse en la superficie del loop, soluciones acuosas de benzodiazepinas fueron inyectadas utilizando un loop de 50 pl con sobrellenados del mismo de 150,300 y 500 pl. And1tsL.s estadtstico Las medias de los parámetros cromatográficos para cada solvente de inyección estudiado fueron evaluadas por el test de Student (test TI. RESULTADOS Y DISCUSI~N Es importante en la cuantificación cromatográfica de las benzodiazepinas considerar el efecto de la inyección, pues como lo han señalado otros autores 2 ~ 9 hay un conlpromiso de compatibilidad entre la polaridad del solvente de inyección, la fase móvil utilizada y la solubilidad de la muestra. La elución del analito influye sobre los perfiles de los picos obtenidos al generarse probletnas en los equilibrios de sorción-desorción y líquido-líquido que se establecen en el proceso cromatográfico. Los solventes, al modificar temporariamente la fase estacionaria tomando parte en los equilibrios mencionados, modifican la elución de los analitos 19. El volumen inyectado también debe considerarse pues influiría en la asimetría del pico, y su ensanchamiento, produciendo, en consecuencia, pérdida de resolución. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto que la fuerza del solvente de inyección y el volumen inyectado ejercen sobre el tiempo de retención, área y perfil del pico de las 1,4-benzodiazepinas cuando se emplean corno solventes de inyección agua o metanol. Los resultados obtenidos, que son el promedio de cinco inyecciones consecutivas, fueron comparados con los obtenidos cuando las soluciones de las drogas se prepararon en fase móvil (Tabla 1). Para obtener valores de k' menores a 3,5 que corresponderían a los picos más sensibles a variaciones del sisterila croniatográfico debieron utilizarse distintas proporciones de los componentes de la fase móvil. Las relaciones de composición empleadas son las más comúnmente usadas en el análisis de las benzodiazepinas. Para examinar si durante la inyección se producían fendrnenos de adsorción de las drogas en el loop del inyector, se inyectaron soluciones acuosas de las 1,4- benzodiazepinas sobrecargando el loop en las condiciones descriptas en la parte experimental. Al no encontrarse diferencias significativas (p < 0,05) entre las respuestas de área obtenidas sobrellenando el loop con volú~nenes crecientes de las soluciones en agua o en fase móvil, se concluye que 110 se producen fenómenos de adsorción. En general se observó un aumento significativo (p < 0,051 del tieriipo de retención 16 con volú~nenes de inyección de 20 y 50 pl de soluciones acuosas. Sin4 Dabas, P.C. & C.N. Carducci 20 pl 50PL k' tr k' Área tr Área Lorazepan Decarbetoxiloflapato Diazepan Loflazepato de etilo FM 2,92 0, ,03 1,Ol Agua 2,98 0, ,lO 1,05 MeOH La 0, ,Ol 0,99 FM 3,51 1, ,39 1,25 Agua 354 1, ,44 1,28 MeOH 3,44 1, ,35 1,22 FM 3,92 1,a ,O4 1,67 Agua 3,95 1, ,O6 1,69 MeOH 3,87 1, ,96 1,62 FM 4,20 1, ,30 1,85 Agua 425 1, ,40 1,91 MeOH 4,18 1, ,28 1,83 Nitrazepan FM 4,50 1, ,28 1,83 Agua 4,47 1,% ,85 MeOH 4,34 1,87-4,26 1,82 Prazepan FM 5,17 2, ,12 2,39 Agua 523 2, ,19 2,43 MeOH 5,% ,06 2,35 FM 6,56 3, ,54 3,33 Agua 3, ,62 3,39 MeOH 6,61 3, ,64 3,40 Oxazepan FM 6,6i 1, ,62 1,77 Agua 6,70 1, ,66 1,79 MeOH 6,52 1, ,50 1,72 FM 6, ,85 i,86 Agua 688 1, ,92 1,90 MeOH 6,98 1, ,74 1,82 No hay áreas cuantificadas debido a la distorsión de los picos. Tabla 1. Parámetros cromatográficos de las benzodiazephas en las condiciones experimentales. embargo, dentro del grupo estudiado, el prazepan, una de las benzodiazepinas menos polares, presentó un comportamiento diferente al inyectar 20 y 50 pl de las soluciones acuosas, pues con el aumento significativo del tiempo de retención se produjo una dis~iiinución significativa (p < 0,051 del área del pico (Tabla 1). Este diferente comportamiento es consecuencia de los mecaqismos selectivos que se producen entre la fase estacionaria y la fase móvil por las distintas polaridades que presentan los analitos frente a la fase estacionaria y la fase móvil según el solvente de inyección empleado. Los picos obtenidos en solución acuosa son ligeramente más angostos y altos que en fase móvil y en ningún caso hubo distorsión de los picos, excepto para el decarbetoxiloflazepato. Se han señalado casos donde los picos son más angostos y su altura aumenta considerablemente cuando el solvente de inyección es agua, es decir que la fase móvil no necesariamente niaximiza la eficiencia de la columna 2; esto debe tenerse en cuenta si se eiiiplea altiira5 acra fa,nrocéurica bonaererise - vol. 15 no 1 - año 1996 Figura 1. Efecto del solvente de inyección sobre iiitrazepan a) agua. b:) frise ni6vil. C) metanol. Volumen inyectado 50 pl. de pico en la cuantificación y se cambia el solvente de inyección, lo cual determina que el estándar y la muestra deben estar disueltos en el mismo solvente En general, las soluciones metanólicas de las benzodiazepinas mostraron una disminución significativa (p < 0,051 del tiempo de retención como lo describió Snyder 20, pero no encontramos diferencias significativas para el flunitrazepan y nitrazepan. Una disminución significativa del área se produjo para el flunitrazepan, loflazepato de etilo, nitrazepan, triazolan y prazepan, ~ilientras que para las otras benzodiazepinas las variaciones estuvieron dentro del error experiiiiental 16. En todos los casos, la relación área/altura aumenta significativaiiiente, aumento que osciló entre 17,6% para el oxazepan y 68,4% para el lorazepan por la pronunciada disminución de la altura de pico y ensanchamiento del misiiio La mayor fuerza relativa del metano1 frente a la fase móvil puede llegar a producir desdoblamiento de los picos pues la distinta distribución del soluto en iin sistema donde se produciría una mezcla inhomogénea entre la fase móvil y el solvente de inyección originaría dos procesos de partición 13. En nuestro caso, la aparición de dobles picos se observó al inyectar 50 \il de las soluciones metanólicas de nitrazepan, prazepan y decarbetoxiloflazepato (Figuras 1 y 21, resultados que fueron observados6 Dabas, P.C. & C.N. Carducci Figura 2. Efecto del solveiite de uiyeccióii sobre prazepari a) agua, b) fase móvil, cj metanol. Volumen inyectado 50 )]L. para otros compuestos 14,'5. Como el solvente actúa también modificando la fase estacionaria 19, un solvente de inyección fuerte puede arrastrar al eluído con él si la fase móvil es moderadamente. débil o muy débil. Además, la forma del pico es riluy dependiente del solvente de inyección y no de la fase móvil 15. Conio conclusión, recornendamos el uso de fase móvil conio solvente para preparar tiiiiestras de benzodiazepinas. Si la solubilidad y estabilidad de las distintas drogas permiten el uso de solventes débiles, podrán inyectarse mayores volúmenes, pero si es necesario aumentar la solubilidad de la muestra mediante el agregado de solventes fuertes, nienores volúmenes de inyección deberán emplearse para lograr adecuados nlecanisrnos de retención y eficiencia. Por Últirno, en la cuantificación cromatográfica para obtener resultados confiables es importante considerar la coliiplejidad de la ~natriz y la naturaleza del solvente usado en la últiriia etapa de preparación de muestra. El solvente de inyección de la muestra no sólo debe ser apropiado para disolver los analitos sino que deberá ser el mismo, sie~ilpre que sea posible, con el de los estándares.7 acra famiacéirtica botinererise - vol. 15 no 1 - año 19% REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Wu, C. & J.J. Wittick (1975) Atzal. Cl?iii~. Acta 79: Williarns, K.J., A. Li Wan Po &J. Irwin (1980) J. Chtwnatogc 194: Sithole, B. B., B. Zvilichovshy, C. Lapoirite & L. H. Allen (1990) J. Assoc. Oj]: Aizal. Cbem. 73: Simonson, L., & K. Nelson (1992) LC. GC 10: Fernández Otero, G. C., S. E. Lucangioli & C. N. Carducci (1993 J. Chruri~ntogr. 654: MacLeod, S. K., D. T. Fagan & J. P. Scholl (190) J. C/??-oi?~atogr. 502: Dolan, J.W. (1991) LC. GC9: Tseng, P. K. & L.B. Rogers (1978) J. Cht-oinatogr. 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