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Timestamp: 2016-12-03 11:40:12+00:00

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T5_espectrometria_masas
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TEMA 5. ESPECTROMETRIA DE MASAS
5.0. CARACTERÍSTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES 5.0.1. Características más importantes 5.0.2. Equipos disponibles en los Servicios Técnicos de Investigación de la Universidad de Alicante 5.1. EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS 5.1.1. Sistemas de entrada de muestra 5.1.1.1. Entrada por sonda directa 5.1.1.2. Sistemas de entrada cromatográficos 5.1.2. Fuentes de iones 5.1.2.1. Fuentes de impacto de electrones (EI) 5.1.2.2. Fuentes de ionización química (CI = Chemical ionisation) 5.1.2.3. Fuentes de ionización a presión atmosférica (API)5.1.2.3. 5.1.2.4. Fuentes de ionización de campo (FI = Field ionisation) 5.1.2.5. Fuentes de desorción de campo (FD = Field desorption) 5.1.2.6. Fuentes de bombardeo por átomos rápidos (FAB=Fast Atom Bombardment) o iones (SIMS = Secondary ion MS) 5.1.3. Sistemas de vacío 5.1.4. Analizadores de masa 5.1.4.1. Analizadores de sector magnético 5.1.4.2. Filtros de masas de cuadrupolo 5.1.4.3. Analizador de trampa de iones (IT-MS, ion-trap MS o ITD ion trap detector) 5.1.4.4. Analizador de tiempo de vuelo (TOF, time of flight) 5.1.4.5. Resonancia ciclotrónica por transformada de Fourier (FTICRMS Fourier transform ion cyclotron resonance MS) 5.1.5. Detectores 5.1.5.1. Detector de copa de Faraday 5.1.5.2. Multiplicador de electrones secundarios 5.1.5.3. Detector "Channeltron" 5.1.5.4. Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de centelleo) 5.1.5.5. Detectores multicanal 5.1.6. Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas 5.2. ESPECTROS MOLECULARES DE VARIAS FUENTES DE IONES 5.2.1. Espectros de impacto de electrones 5.2.2. Espectros de ionización química 5.2.3. Espectros usando otras técnicas de ionización blandas 5.3. APLICACIONES 5.3.1. Análisis cualitativo: identificación de compuestos puros 5.3.1.1. Determinación del peso molecular 5.3.1.2. Determinación de fórmulas moleculares 5.3.2. Análisis cuantitativo: determinación de concentraciones moleculares
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5. Espectrometría de masas
5.0. CARACTERISTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES 5.0.1. Características más importantes Aplicaciones principales: Determinación de la estructura e identidad de compuestos orgánicos. Fenómeno molecular: Ionización y rompimiento de la molécula en fragmentos de iones. Ventajas en el análisis cualitativo: Peso molecular preciso, masas de partes integrantes de la molécula, muy alta sensibilidad, detección de impurezas. Ventajas en el análisis cuantitativo: Alta sensibilidad. Muestra promedio deseable: <1 mg Limitaciones del método: No siempre puede diferenciar entre estructuras isómeras. Limitaciones para la muestra: Ninguna 5.0.2. Equipos disponibles en los Servicios Técnicos de Investigación de la Universidad de Alicante Espectrómetro de masas de alta resolución Finnigan modelo MAT95S (Figura 1) de sector magnético para la medida de masas exactas. Esta medida de la masa se puede realizar mediante calibración magnética o eléctrica ("peak-matching"). La introducción de la muestra puede llevarse a cabo mediante sonda de introducción directa (DIP) a la fuente de iones o bien a través de un cromatógrafo de gases modelo HP6890 que a su vez posee un inyector split/splitless. La ionización se puede realizar por impacto electrónico así como por ionización química positiva y negativa. Además de las técnicas de ionización citadas anteriormente, que son las más comunes, se dispone de "FAB" (Fast Atom Bombardment) y de la posibilidad de detección de iones metaestables.
Figura 1. Espectrómetro de masas de alta resolución. Finnigan MAT95S Espectrómetro de masas de alta resolución, MICROMASS AUTOSPEC – ULTIMA NT (Figura 2), para el análisis de trazas de dioxinas. Sector Magnético Trisector con geometría EBE, de alta resolución y alta sensibilidad, incluyendo cromatógrafo de gases de alta resolución (HP6890) y muestreador automático de
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líquidos (HP 7683). El sistema de inyección del cromatógrafo de gases además de split/splitless dispone de PTV (programación variable de la temperatura) que permite trabajar con más cantidad de muestra y por tanto aumentar la sensibilidad. Se detectan concentraciones de dioxinas y furanos del orden de 20 fg/ml (ppt).
Figura 2. Espectrómetro de masas de alta resolución. MICROMASS AUTOSPEC-ULTIMA NT Sistema acoplado Desorbedor Térmico o Purga-Trampa – Cromatógrafo de Gases – Espectrómetro de Masas (Figura 3): Cromatógrafo de gases modelo HP/AGILENT TECHNOLOGIES 6890N con inyector para columnas capilares split/splitless e inyector adicional GERSTEL cis 4+(PTV) y sistema de Desorción Térmica Horizontal GERSTEL TDS-2 o sistema de Purga-Trampa TEKMAR DOHRMANN, 3100 Sample Concentrator. Todo el conjunto lleva como detector selectivo un Espectrómetro de Masas modelo AGILENT TECNOLOGIES 5973N con fuente de ionización por impacto de electrones (EI) y analizador de cuadrupolo (baja resolución). El equipo permite realizar la comparación de nuestro espectro problema con una colección de espectros almacenados en la memoria (librería). Con esta técnica se pueden analizar compuestos volátiles y semivolátiles orgánicos de muestras sólidas, líquidas o gaseosas.
Figura 3. Sistema acoplado Desorción Térmica o Purga Trampa – Cromatógrafo de Gases – Espectrómetro de Masas.
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Fisons Instruments modelo MD800 incorporando también de serie un cromatógrafo de gases (split/splitless) modelo GC8000, la fragmentación se produce bien por impacto electrónico o por ionización química positiva o negativa, analizador de cuadrupolo (baja resolución) y también dispone de librería para la identificación de los compuestos. Dispone de un automuestreador AS2000 con capacidad para 90 muestras. Espectrómetro de masas Agilent, modelo 5973 Network, Mass Selective con introducción directa de la muestra a la fuente iónica por medio de la sonda SIS (Scientific Instrument Services) Direct Insertion Probe. (73DIP-1) (Figura 4). El Espectrómetro de Masas está previsto de una única fuente de impacto electrónico así como de un analizador cuadrupolar. Este es un método universalmente empleado en Espectrometría de Masas para analizar compuestos puros.
Figura 4. Espectrómetro de Masas con sonda Espectrómetro de masas Agilent 5973N de baja resolución con analizador de cuadrupolo acoplado a un cromatógrafo de gases (Agilent 6890N) para columnas capilares con dos inyectores, uno split/splitless y otro PTV (inyector de temperatura variable). La ionización de las muestras se puede realizar tanto en impacto electrónico como en ionización química positiva o negativa. El equipo incorpora un inyector automático (Agilen 7683) con bandeja muestradora con capacidad para 100 viales. Para la identificación de compuestos se dispone de una librería Wiley. Sistema de espectrometría de masas con analizador de tiempo de vuelo y desorción mediante láser asistida por matriz (MALDI-TOF), BRUKER Daltonics modelo Autoflex (Figura 5). Se utiliza para el análisis de moléculas de peso molecular elevado y termolábiles. El equipo se utiliza para el análisis de macromoléculas y polímeros en general, drogas, metabolitos, péptidos y proteínas
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análisis forense. metabolismo de fármacos..5. Este equipo dispone también de automuestreador para 100 muestras. que muestra el desarrollo de la técnica desde 1920. Es interesante obsevar que todas las aplicaciones que se indican todavía se utilizan en los laboratorios modernos. Espectrómetro de Masas MALDI-TOF Un cromatógrafo líquido de alto rendimiento de Agilent modelo 1100 Series acoplado simultáneamente a un detector de longitud de onda variable visible-UV y a un espectrómetro de masas con analizador de trampa de iones (Agilent modelo 1100 Series LC/MSD Trap SL) con posibilidad de realizar MS/MS y rango de masas de 50 a 3000 umas. La ubicuidad de la espectrometría de masas (MS = Mass spectroscospy) se ilustra en la Tabla . (3) las relaciones isotópicas de los átomos en las muestras y (4) la estructura y composición de superficies sólidas. elucidación de productos naturales.. Esta técnica LC/MS es ideal en estudios de alimentos. proteínas y aminoácidos. el proceso de ionización tiene lugar en la fase gaseosa) dependiendo fundamentalmente de la polaridad del analito y de su peso molecular.
. (2) las estructuras de una amplia variedad de especies moleculares complejas.
Figura 5. La interfase es intercambiable a elegir entre ionización por electroespray (ESI. Los espectros de masas se obtienen por conversión de los componentes de una muestra en iones gaseosos que se mueven rápidamente y se separan en función de su relación masa-carga. lípidos... La espectrometría de masas es probablemente de entre todas las herramientas analíticas al alcance del científico la de aplicación más general en el sentido que la técnica es capaz de suministrar información sobre (1) la composición cualitativa y cuantitativa tanto de analitos orgánicos como inorgánicos en muestras complejas.así como en la determinación del peso molecular y la estructura molecular de compuestos orgánicos e inorgánicos no volátiles o de elevado peso molecular. vitaminas. estabilidad de productos.5 -
.1. el proceso de ionización tiene lugar en la fase líquida) o ionización química a presión atmosférica (APCI.
0221 x 1023 átomos 12C/mol 12C = 1. Por tanto. debe señalarse que los pesos atómicos y moleculares utilizados en la bibliografia de espectrometría de masas. Así.9688 dalton Debido a que 1 mol de 12C pesa 12. el uma se define como 1/12 de la masa de un átomo neutro de 12C. Los espectroscopistas de masas también llaman al uma dalton. a diferencia de lo que ocurre normalmente en química. se puede tener la necesidad de distinguir entre las masas de compuestos tales como
5.9688 g/mol.0000 dalton x 2.66054 x 10-27 kg/átom 12C El peso atómico de un isótopo. Evolución de la espectrometría de masas En primer lugar. Así. mientras que otros instrumentos analíticos generalmente no lo hacen. Así. Los pesos atómicos y moleculares se expresan generalmente en términos de unidades atómicas de masa (uma).6 -
. o 1 dalton. la masa atómica del isótopo del cloro es masa atómica 35Cl = 12. ya que los espectrómetros de masas discriminan entre la masa de los isótopos.66054 x 10-24 g/átom 12C = 1. se está a menudo interesado en la masa exacta m de los isótopos de un elemento o en la masa exacta de los compuestos que contienen un grupo particular de isótopos. el peso atómico del 35Cl es 34. y en este capítulo..5. Estas definiciones nos llevan a que 1 uma. Espectrometría de masas
Tabla 1. de carbono sea igual a 1 uma = 1 dalton = 1/12 · ( 12 g 12C/mol 12C/ 6.91407 veces mayor que la masa del isótopo del carbono. se puede relacionar con el átomo de referencia 12C por comparación de las masas de los dos isótopos. En espectrometría de masas. Esta comparación revela que el isótopo cloro 35 tiene una masa que es 2.0000 g. La unidad atómica de masa se basa en una escala relativa en la que la referencia es el isótopo del carbono 12C. tal como el 35Cl.91407 = 34. difieren de los utilizados en la mayoría de los otros métodos analíticos. al cual se le asigna una masa de exactamente 12 umas. se revisarán brevemente algunos términos relacionados con los pesos atómicos y moleculares.
El diagrama de bloques de la Figura 6 muestra los componentes principales de los espectrómetros de masas.. En algunos contextos.007825 x 4 = 16.035. Debido a que la mayoría de los iones en espectrometría de masas tienen una carga unidad. Así. pn son las abundancias de estos isótopos en la naturaleza. El peso molecular promedio o químico de un compuesto es por tanto la suma de los pesos atómicos químicos para los átomos que aparecen en la fórmula del compuesto.5. respectivamente. para 12C1H4+.007825 x 3+ 2. m/z = 16.035/1 = 16. el peso molecular químico de CH4 es 12.518.035/2 = 8.. .000 x 1 + 1. Así.
5. donde sus componentes se convierten en iones gaseosos. esta simplicidad no se extiende a la instrumentación. se usa el término masa nominal.007825 x 4 = 17. aunque desafortunadamente. naturalmente.
5.. A2. An son las masas atómicas en daltons de los n isótopos de un elemento y pl. el peso que interesa a los químicos en la mayoría de las ocasiones. las masas nominales de los tres isómeros antes citados son 16. que implica una precisión de un número entero en una medida de masa.. Así.0140 x 1= 17. las masas exactas se expresan con tres o cuatro decimales.. Estrictamente hablando. en espectrometría de masas. Un espectrómetro de masas de alta resolución típico es un montaje electrónico y mecánico complejo que es caro (de 60 000 a 500 000 euros o más) tanto en términos de adquisición inicial como en operación y mantenimiento.. Otro término que se utiliza a lo largo de este capítulo es la relación masa/carga de un ion atómico o molecular. El objetivo del sistema de entrada es de introducir una pequeña cantidad de muestra (un micromol o menos) en el espectrómetro de masas.1.037 dalton
Normalmente.031 dalton m = 13.. Este término se obtiene dividiendo la masa atómica o molecular de un ion m por el número de cargas z que tiene el ion.. Para 13C1H42+.01115 + 4 x 1. p2. Espectrometría de masas
C 1H4 C 1H4 C 1H3 2H1
m = 12. el sistema de entrada contiene un medio para la volatilización de muestras sólidas o líquidas. . m/z = 17. el término masa/carga a menudo se reduce al término más adecuado de masa. A menudo.00335 x 1 + 1. El peso atómico químico es.7 -
.0434 daltons. ya que los espectrómetros de masas de alta resolución tienen esta precisión. + Anpn donde Al. EL ESPECTRÓMETRO DE MASAS Los fundamentos de las medidas espectrales de masas son sencillos y fácilmente comprensibles.00797 = 16. esta abreviatura no es correcta pero se utiliza ampliamente en la bibliografía de espectrometría de masas.035 dalton m = 12. El peso atómico o el peso atómico promedio (A) de un elemento en la naturaleza viene dada por la ecuación A = Alpl + A2p2 + . 17 y 17 daltons..000 x 1 + 1.
almacenada en la memoria de un ordenador y mostrada o registrada de varias maneras.
.. En la discusión que sigue. A1 igual que en un espectrómetro óptico.1. La función del analizador de masas es parecida a la de la rejilla de un espectrómetro óptico. un espectrómetro de masas contiene un detector (para iones) que convierte el haz de iones en una señal eléctrica que puede ser entonces procesada. Los
5.5. Sistemas de entrada de muestra La finalidad del sistema de entrada es la de permitir la introducción de una muestra representativa en la fuente de iones con la mínima pérdida de vacío. Componentes de un espectrómetro de masas La fuente de iones de un espectrómetro de masas convierte los componentes de una muestra en iones por bombardeo con electrones. Un hecho característico de los espectrómetros de masas. se describen primero los sistemas de entrada. dependiendo de la naturaleza del analizador de masas. moléculas o fotones. Finalmente se describen los diferentes espectros producidos según el tipo de fuente de iones así como las aplicaciones de la espectrometría de masas. la ionización se lleva a cabo por energía térmica o eléctrica. iones. Espectrometría de masas
Figura 6. que no es común con los instrumentos ópticos (pero que se encuentra en los espectrómetros de electrones). los sistemas de vacio y los diferentes tipos de fuentes de iones. lo que se obtiene es un haz de iones positivos o negativos (frecuentemente positivos) que es entonces acelerado en el analizador de masas. A continuación se verán los diferentes tipos de analizadores de masas que dan lugar a diferentes tipos de espectrómetros de masas así como detectores. la dispersión está basada en las relaciones carga/masa de los iones del analito en vez de en la longitud de onda de los fotones. es la necesidad de un sistema de vacio adecuado para mantener bajas presiones (10-4 a 10-5 torr) en todos los componentes del instrumento excepto el procesador de señal y dispositivo de lectura. En ambos casos.1. sin embargo. En el primero. Alternativamente. En muchos casos el sistema de entrada y la fuente de iones están combinadas en un único componente. Existen diversos tipos de espectrómetros de masas.
La cámara intermedia está diseñada para limitar el volumen de aire que puede entrar en la región de ionización durante la inserción de la sonda. un alambre fino o una copa pequeña y la sonda se coloca a unos pocos milimetros de la fuente de ionización y de la rendija que conduce al espectrómetro.5. que incluyen sistemas de entrada. la sonda permite el estudio de materiales no volátiles tales como carbohidratos. de modo que. Sistemas de entrada cromatográficos
5. la muestra se pone generalmente en la superficie de un vidrio o en un tubo capilar de aluminio. esteroides. La baja presión proporciona también una mayor concentración de compuestos relativamente no volátiles en el área de ionización.1.9 -
. La baja presión del área de ionización y la proximidad de la muestra a la fuente de ionización a menudo hace posible la obtención de espectros de compuestos inestables térmicamente antes que se descompongan.1. especies organometálicas y sustancias poliméricas de bajo peso molecular. En una sonda.1. El requisito principal de la muestra es que alcance una presión parcial de al menos 10-8 torr antes que empiece a descomponerse.
5.2. los espectros de masas se pueden obtener a menudo con una cantidad de muestra tan pequeña como unos pocos nanogramos.1. el cual se inserta a través de una camara intermedia de vacío (véase Figura 7). Por tanto. Esquema de un sistema de introducción de muestra por sonda para introducir una muestra en la fuente de iones (DIP). Espectrometría de masas
espectrómetros de masas más modernos están equipados con dos tipos de entradas capaces de acomodar diversos tipos de muestras..1.
Figura 7. Las sondas se utilizan también cuando la cantidad de muestra es limitada. Entrada por sonda directa Los líquidos y sólidos no volátiles se pueden introducir en la región de ionización mediante un soporte de muestra o sonda.
5. de sonda directa y entradas cromatográficas.
Algunas de las técnicas de acoplamiento se utilizaron durante un tiempo y hoy están en desuso. Espectrometría de masas
Los espectrómetros de masas a menudo están acoplados con sistemas cromatográficos de gases o de líquidos de alta resolución que permiten la separación y determinación de los componentes de mezclas complejas. El acoplamiento de una columna cromatográfica a un espectrómetro de masas requiere la utilización de sistemas de entrada especiales. algunos de los cuales se describen a continuación. Desde finales de los años setenta han aparecido en el mercado diversos espectrómetros de masas diseñados específicamente como detectores para cromatografía de gases. Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen equipos de cromatografía de gases que pueden acoplarse directamente con distintos tipos de espectrómetros de masas de barrido rápido. Particle Beam) y las que además consiguen la ionización de la misma (TSP = Thermospray o termonebulización. En la Tabla 2 se muestran algunas de las ventajas e inconvenientes de cada una de ellas.. LC-FAB = Liquid chromatography .5. Cromatografía HPLC / Espectrometría de masas.10 -
. Para resolver este problema se han desarrollado diversas interfaces. Un problema fundamental del acoplamiento de la cromatografia de líquidos con la espectrometría de masas es el enorme contraste que existe entre los volúmenes relativamente grandes de disolvente de la primera y los requerimientos de vacío de la última. ESI= Electrospray Ionization). como la DLI =Direct Liquid Inlet o la Moving Belt (cinta móvil) Las técnicas que se usan rutinariamente en la actualidad para la introducción y análisis de muestras líquidas por espectrometría de masas pueden clasificarse en dos grupos: las que solo introducen la muestra líquida en la fuente iónica del instrumento tales como las de haz de partículas (PB. El caudal de las columnas capilares en general es suficientemente bajo como para que la salida de la columna pueda introducirse directamente en la cámara de ionización de un espectrómetro de masas.
5. Cromatografía de gases / Espectrometría de masas.Fast Atom Bombardment.
Tipo Límite de detección Rango de flujo del LC Tipos de disolventes Muestras semivolátiles Muestras no volátiles / termolábiles Rango pesos molec..
DLI Cinta TSP LC/FAB PB ESI
** ** **(**) **(**) ** ****(*)
* ***** ***** * ***(*) *
*** ***** **** *** **** **(*)
**** ***** ***** **** ***** ****
** * ***(*) ***** *(*) *****
** *(*) ***(*) **** *(*) *****
5. los iones para análisis de masas se producían por bombardeo de los componentes de muestras gaseosas con electrones de elevada energía. La Tabla 3 da un listado de estas nuevas fuentes y de las fechas aproximadas en las que empezaron a utilizarse. durante las dos últimas décadas se han desarrollado varias nuevas fuentes de iones que ofrecen ciertas ventajas sobre la clásica fuente de haz de electrones. Espectrometría de masas
Tabla 2. Sin embargo. A pesar de ciertas desventajas.1.5.2. Tabla 3. Fuentes de espectrometría de masas
5. esta técnica todavía tiene una gran importancia y es en la que se basan la mayor parte de las bibliotecas de espectros.11 -
. Ventajas e inconvenientes de las interfaces LC/MS. Normalmente. la mayoría de los espectrómetros de masas comerciales están equipados con accesorios que permiten el uso de varias de estas fuentes intercambiables. Fuentes de iones Históricamente. Entre paréntesis se indica el rango de la respuesta. Mayor número de estrellas indica mayor rendimiento.
esta técnica requiere siempre la utilización de una sonda de muestra. Las fuentes duras comunican energías elevadas a los iones formados de manera que se encuentran en estados vibracionales y rotacionales excitados.. tales como las fuentes de ionización química y la de desorción. Los electrones son emitidos por un filamento caliente de tungsteno o renio y son acelerados por un potencial de aproximadamente 70 V que se aplica entre el filamento y el ánodo. Como se muestra en la Figura 8. La relajación de estos iones produce una gran cantidad de fragmentación y resultan espectros de masas complejos.5. las fuentes gaseosas están limitadas a compuestos con pesos moleculares menores de aproximadamente 103 daltons. el ion molecular es un ion radical que tiene el mismo peso molecular que la molécula. las fuentes de fase gas tan sólo se pueden usar para compuestos estables térmicamente que tengan puntos de ebullición menores de aproximadamente 500 °C.+ es su ion molecular. La fuente dura más importante es la fuente de impacto de electrones. En la mayoría de los casos. Ambos tipos de espectros son útiles.1. El producto primario son iones de una única carga positiva que se forman cuando los electrones de elevada energía se acercan suficientemente a las moléculas como para causarles la pérdida de electrones por repulsiones electrostáticas La ionización por impacto de electrones no es muy eficaz y sólo alrededor de una molécula entre un millón experimenta la reacción primaria: M + e. Fuentes de impacto de electrones (EI ) Las tres primeras fuentes que se indican en la Tabla 3 requieren la volatilización de la muestra antes de la ionización. producen relativamente poca excitación de los iones. La segunda categoría de fuentes es la de fuentes de desorción en la que se prescinde de la vaporización de la muestra y en consecuencia. de modo que. A continuación se hace una pequeña descripción de las fuentes más utilizadas actualmente.→ M. las fuentes blandas. que se discute a continuación. La primera corresponde a las fuentes de fase gas en las que la muestra es primero volatilizada y a continuación los componentes gaseosos son ionizados de diversas maneras. donde colisionan y tiene lugar la ionización.1. la energía se transmite a la muestra sólida o líquida. y los espectros son sencillos. de maneras muy diversas produciendo la ionización y la transferencia directa de iones de la fase condensada al estado gaseoso iónico. Las fuentes de iones se clasifican a menudo en duras o blandas. 5. En este caso. las trayectorias de los electrones y las moléculas están en ángulo recto y se cruzan en el centro de la fuente. tiene lugar poca fragmentación.12 -
.+ + 2edonde M representa la molécula de analito y M. La mayor ventaja de la ionización por desorción es que permite el examen de moléculas no volátiles y térmicamente inestables tales como las que se encuentran normalmente en bioquímica. La Figura 8 muestra el diagrama de una fuente de iones de impacto de electrones sencilla.2. Como indica el punto. Los iones positivos producidos en un impacto de electrones son atraídos a través de la rendija hacia la primera placa de aceleración mediante una pequeña diferencia de potencial (normalmente 5 V) que se aplica entre esta placa y los
5. Por el contrario. Por tanto. Los espectros sencillos de las fuentes blandas permiten la determinación exacta del peso molecular del analito. mientras que los modelos espectrales más complejos de las fuentes duras a menudo permiten una identificación inequívoca del mismo. Espectrometría de masas
Nótese que las fuentes que se indican en la Tabla 3 pertenecen a dos categorías.
. Sin embargo. Espectrometría de masas
repulsores que se muestran en la Figura 8 En los instrumentos de sector magnético. que da lugar a un gran número de iones positivos de varias masas que son menores que (y en ocasiones mayores que) la del ion molecular. La pequeña masa y la alta energía cinética de los electrones resultantes produce aumentos muy pequeños en la energía traslacional de las moléculas con las que chocan. estas moléculas adquieren estados vibracionales y rotacionales excitados. es necesario que los electrones generados por el filamento de la fuente sean acelerados por un potencial mayor de unos 50 V. La subsecuente relajación tiene lugar normalmente mediante una elevada fragmentación. Tabla 4. se aplican potenciales elevados (103 a 104 V) a las placas aceleradoras. Algunas reacciones típicas en una fuente de impacto electrónico
5. Fuente de impacto electrónico. Con el objeto de formar un número significativo de iones gaseosos en una proporción reproducible.5.13 -
. Estos iones se llaman iones descendientes o hijos. La Tabla 4 muestra algunas reacciones de fragmentación típicas que se producen después de la formación por impacto de electrones de un ion progenitor de una molécula ABCD. que permiten a los iones adquirir sus velocidades finales antes que entren en el analizador de masas.
momento en que los iones escapan a la fase gaseosa denominándose a este proceso evaporación iónica.. En la figura 9 se muestra el mecanismo de evaporación iónica para técnicas a presión atmosférica. Como interfase para HPLC. ionizan la muestra a presión atmosférica. se utilizan para la ionización química y cada uno de ellos produce un espectro diferente con un analito dado. CH3+ y CH2+ . lo que incide favorablemente sobre la sensibilidad del proceso LC-MS.3. las moléculas gaseosas de la muestra (tanto de un sistema discreto como de una sonda caliente) son ionizados por colisión con los iones producidos por el bombardeo con electrones de un exceso de un gas reactivo. pero la ionización química de iones negativos se utiliza ocasionalmente con analitos que contienen átomos muy electronegativos.1. Para llevar a cabo experimentos de ionización química. hasta 1 a 4 mL/min. En ionización química. y la “Ionización Química a Presión Atmosférica. isobutano y amoníaco.2. Estas medidas permiten mantener unas presiones de gas reactivo de alrededor de 1 torr en el área de ionización mientras se mantiene la presión en el analizador por debajo de 10-5 torr. tales como propano. En general. se introduce un reactivo gaseoso en la región de ionización en una cantidad tal que la relación de concentración entre el reactivo y la muestra sea de 103 a 104. 5. el haz de electrones reacciona casi exclusivamente con las moléculas de reactivo. APcI”. que adquieren una carga eléctrica muy elevada. llega un momento en que su tamaño es tan pequeño. se ioniza el analito y se traslada los iones al MS.5. Los dos primeros predominan y representan alrededor del 90% de los productos de reacción. Con estos cambios. Una gran variedad de reactivos. y no en alto vacío como es lo habitual en otras técnicas.. Normalmente se utilizan iones positivos. Al avanzar estas gotas por la cámara de desolvatación. que las fuerzas culombianas de repulsión entre los iones con múltiple carga generados en su interior son capaces de vencer la tensión superficial. que reacciona con electrones de elevada energía para dar varios iones como CH4+ . la muestra emerge del capilar de entrada en forma de un aerosol de pequeñas gotas.2. consigue un altísimo rendimiento. al actuar a presión atmosférica.14 -
. Las dos ionizaciones API más comúnmente utilizadas son el “Electrospray. Uno de los reactivos más comunes es el metano. tiene la virtud de aceptar todo el flujo procedente de un cromatógrafo líquido de alta presión convencional. En la ionización ESI se aplica una tensión de 3-6 KV entre el capilar de entrada de la muestra y el contraelectrodo. Espectrometría de masas
5. eliminan el disolvente. Por efecto del intenso gradiente de campo eléctrico presente. Debido a esta elevada diferencia de concentraciones. es necesario modificar el área de ionización del haz de electrones que se muestra en la Figura 8 poniendo una bomba de vacío y reduciendo la anchura de la rendija que conduce al analizador de masas. Estos iones reaccionan rápidamente con moléculas de metano adicionales siguiendo un esquema de reacciones que dan el ion (M + 1)+ o el ion (M -1)+ de la muestra.2. Fuentes de ionización a presión atmosférica (API) La Ionización a Presión Atmosférica (API) es una técnica de ionización blanda que. La ionización química es probablemente el segundo de los procedimientos más comunes para la producción de iones en espectrometría de masas. Fuentes de ionización química (CI = Chemical ionisation) Los espectrómetros de masas más modernos están diseñados para poder intercambiar esta fuente con la de impacto de electrones. (ESI)”. Una característica
En la ionización APcI el procedimiento de formación del spray es el mismo pero ahora lo que se produce es una fuerte descarga en la fuente que produce un plasma de iones reactivos del disolvente que origina el mecanismo de ionización de la muestra por ionización química (CI). por lo que tiene lugar poca fragmentación. produce abundantes iones (M+H)+ positivos. 5.negativos.2. En este caso el analito adquiere poca energía vibracional y rotacional.5 a 2 mm del cátodo. La muestra gaseosa de un sistema de entrada discreto puede difundirse en el área de campo elevado alrededor de las micropuntas del ánodo. Espectrometría de masas
de esta técnica es que al producir una enorme abundancia de iones con carga múltiple. El resultado de este tratamiento es la aparición de centenares de micropuntas de carbón que emergen desde la superficie del hilo Los emisores de ionización de campo se montan a una distancia de 0. normalmente por adición o cesión de un protón. pueden determinarse masas moleculares de moléculas muy grandes como proteínas..1.
5. el cual a menudo también sirve de rendija. Mecanismo de evaporación iónica para técnicas API.5. Estos emisores a menudo adquieren la forma de un fino hilo de tungsteno (10 µm de diámetro) en el cual se han hecho crecer agujas o pinchos microscópicos de carbón por pirólisis de benzonitrilo en un campo eléctrico elevado. El campo eléctrico se concentra en las puntas emisoras y tiene lugar la ionización vía un mecanismo de mecánica cuántica de túnel en el que los electrones del analito son extraídos por las micropuntas del ánodo.4. los iones se forman bajo la influencia de un campo eléctrico elevado (108 V/cm). Fuentes de ionización de campo (FI = Field ionisation) En las fuentes de ionización de campo. que coexiste con el de evaporación iónica.15 -
. y (M-H). Este mecanismo. Tales campos se producen al aplicar altos voltajes (10 a 20 kV) a emisores especialmente construidos que consisten en numerosas puntas finas que tienen diámetros menores que 1 µm.
2. etc. a través de una cámara que contiene
5.5. la cual debe ser vencida para que se desorba un ion de la fase condensada y proporcione una manera de eliminar el efecto producido por el bombardeo. el electrodo se monta sobre una sonda que puede separarse del compartimento de muestra y mojarse con una solución de la muestra. Como consecuencia. Como consecuencia puede ocurrir una degradación antes de completarse la ionización. el bombardeo produce iones moleculares positivos y negativos de la muestra. Con este tipo de fuentes. Esta técnica de bombardeo. Los haces de átomos rápidos se obtienen haciendo pasar iones acelerados de argón o xenón de una fuente de iones. se denomina FAB o bombardeo con átomos rápidos. Se han desarrollado en las dos últimas décadas un número de métodos de ionización de desorción para tratar este tipo de muestras (véase Tabla 3). Con algunas muestras es necesario calentar el emisor haciendo pasar una corriente. a menudo en una matriz de una disolución de glicerol. En este caso. El análisis de estos iones secundarios por medio de un espectrómetro de masas constituye la técnica SIMS muy utilizada para analizar superficies sólidas metálicas.1.2. 5. la ionización tiene lugar por la aplicación de un potencial elevado a este electrodo. que es en realidad una variante de la SIMS. Si se disuelve una muestra en un disolvente. Fuentes de bombardeo por átomos rápidos (FAB=Fast Atom Bombardment) o iones (SIMS = Secondary ion MS) Al bombardear la superficie de una muestra sólida con un haz de iones primarios se origina la emisión de iones secundarios característicos de la muestra. las muestras en un estado condensado..5. En este apartado y en el siguiente se describen algunos de estos métodos. Los métodos de desorción prescinden de la volatilización y de la subsecuente ionización. actualmente se puede obtener información sobre espectros de masas de especies bioquímicas delicadas y especies que tienen pesos moleculares superiores a 10 000 daltons. Al bombardear la superficie de un líquido con un haz de átomos rápidos se produce la desorción continua de iones característicos del líquido. Tales métodos no son aplicables a muestras no volátiles o térmicamente inestables. En su lugar.1. En la desorción de campo. Sin embargo la técnica SIMS no ha sido muy utilizada para analizar muestras orgánicas por razones tales como su carácter destructivo. Fuentes de desorción de campo (FD = Field desorption) Los métodos de ionización descritos requieren que los agentes de ionización actúen sobre muestras gaseosas. se utiliza un emisor con múltiples puntas similar al descrito en la sección anterior. Tanto los iones positivos como negativos del analito son expulsados de la superficie de la muestra por un proceso de desorción. Después la sonda se reinserta en el compartimento de la muestra. La matriz líquida ayuda a reducir la energía reticular.6. lo que reduce su fragmentación. Como consecuencia. o una sonda. se suministra energía a la muestra sólida o líquida de diversas maneras de modo que se provoca la formación directa de iones gaseosos.16 -
. la aparición de cargas superficiales al ser muestras eléctricamente aislantes. Este tratamiento permite un calentamiento muy rápido de la muestra. Las fuentes de bombardeo por átomos rápidos (FAB) han adquirido un papel importante en la producción de iones para el estudio por espectrometría de masas de especies de elevado peso molecular. se ionizan por bombardeo con átomos de elevada energía (varios keV) de xenón o argón. los espectros aparecen muy simplificados y a menudo consisten sólo en el ion molecular o el ion molecular protonado. Espectrometría de masas
mientras que la fracción más pesada y pura del aceite se va concentrando en la zona interior.3 Sistemas de vacío Para que el proceso descrito. En otras palabras. Los componentes ligeros que quedan en la zona exterior son fácilmente eliminados por la bomba rotativa de apoyo. los vapores de aceite suben por las “chimeneas” concéntricas hasta encontrarse con una salida lateral escapando en forma de chorro supersónico.1. yendo a chocar contra las paredes laterales refrigeradas por un circuito de agua. Los iones de baja energía resultado del intercambio se eliminan rápidamente al ser desviados electrostáticamente. el interior del espectrómetro por donde debe volar el ión debe estar evacuado a un vacío suficiente para asegurar la ausencia de colisiones en su camino. Los principales tipos de bombas que se utilizan para conseguir el alto vacío en espectrometría de masas son las difusoras y las turbomoleculares sin olvidar las mecánicas o rotatorias que son las que se necesitan para hacer los vacíos preliminares que requieren las difusoras y las turbomoleculares para empezar a trabajar. donde el recorrido libre medio de las moléculas y de los iones formados sea consistente con la longitud de la trayectoria que deben recorrer en su camino hasta el detector. El aceite depositado en la parte inferior de la bomba es calentado por una placa calefactora .
5. y la más pesada en el interior. Los iones con elevada velocidad experimentan una reacción de intercambio de electrones en resonancia con los átomos sin que se produzca una pérdida sustancial de energía traslacional.5. En su camino hacía la pared atraparán moléculas de aire o cualquier gas presente en el ambiente a evacuar. que se verifica en el interior del espectrómetro de masas. volviendo a caer al depósito inferior. quedando la parte más ligera o volátil en la zona exterior. si un ión formado en la fuente de ionización debe recorrer una trayectoria de un metro para alcanzar el detector.
5. donde condensarán. reduciendo poco a poco la presión.17 -
. Espectrometría de masas
átomos de argón o de xenón a una presión de aproximadamente 10-5 torr.. de modo que se forma un haz de átomos de alta energía. El bombardeo de compuestos orgánicos o bioquímicos por átomos rápidos normalmente produce cantidades significantes de iones moleculares (al igual que fragmentos) incluso para muestras de elevado peso molecular y térmicamente inestables. pueda realizarse con éxito. debe hacerse en un ambiente de alto vacío. Al producirse la ebullición. el aceite se va fraccionando. El principio de funcionamiento de las bombas difusoras de fraccionamiento se muestra en la figura 10. En ciclos sucesivos.
. procedentes de la cámara que se está evacuando a alto vacío. Si la velocidad de las astas del rotor es del mismo orden que la velocidad de agitación térmica de las moléculas a evacuar. figura 11. reciben un componente adicional de velocidad en dirección a la cámara inferior. el proceso será muy eficiente. esta cámara está a su vez evacuada por una bomba rotativa mecánica. y se conseguirá una buena relación de compresión entre la zona de prevacío y la de alto vacío. chocan con las aspas. Espectrometría de masas
Figura 10.5. Cuando las moléculas gaseosas.
5.. las aspas del rotor de la bomba están girando a gran velocidad. Bombas difusoras de fraccionamiento En cuanto al funcionamiento de las bombas turbomoleculares.
Bombas turbomoleculares En la figura 12 podemos ver un resumen de las principales ventajas e inconvenientes de estos dos sistemas de bombeo. Ventajas e inconvenientes del uso de bombas turbomoleculares o difusoras
5. o fallos del circuito de refrigeración. hacen de este sistema de bombeo un método muy seguro.5.19 -
Figura 12. En cuanto al peligro potencial de contaminación por el aceite de vacío de las bombas difusoras.. suministro de corriente eléctrica. ya que la utilización de aceites especiales y de sistemas de protección automática contra accidentes de vacío. Espectrometría de masas
Figura 11. hoy en día no es un factor a tener muy en cuenta.
CH2N+. Idealmente. del primer pico (a veces se utiliza en su lugar la masa media de los dos picos). un analizador debería ser capaz de distinguir entre diferencias muy pequeñas de masa.
5. La exactitud de la masa mide la proximidad del valor registrado de m/z a su verdadero valor.0061 y 27. los iones de bajo peso molecular que difieren en una unidad de masa o más [por ejemplo. La capacidad de un espectrómetro de masas de distinguir entre masas se expresa normalmente en términos de su resolución R. estas dos propiedades no son totalmente compatibles y siempre se debe llegar a un compromiso en el diseño. masa sin decimales.1 (o 40. ppm) La resolución que se necesita en un espectrómetro de masas depende en gran parte de su aplicación. Espectrometría de masas
Otro tipo de bombas menos utilizadas son las iónicas. Así. las de sublimación de titanio y las criogénicas todas ellas utilizadas para conseguir condiciones de ultra-alto vacío. Dos picos se consideran que están separados si la altura del valle entre ellos no es más que un porcentaje de su altura (a menudo un 10%). 28. Los espectrómetros comerciales son asequibles con resoluciones que van desde aproximadamente 500 a 500 000.4. Sin embargo. Además. Por otro lado. respectivamente) se necesita un instrumento con una resolución de varios miles. que se define como R = m/∆m donde ∆m es la diferencia entre dos picos adyacentes que están resueltos y m es la masa nominal.00 y 40.0 y 400. En todos los equipos de masas de estos servicos los vacíos están en torno a 10-6 torr.20 -
.0187.1. N2+ y CO+ (todos ellos con 28 daltons de masa nominal pero con masas exactas de 28.01). un espectrómetro con una resolución de 4000 podrá resolver picos que tengan valores de m/z de 400.
5. ∆mexact = mverdadera – mmedida (miliunidades de masa. los analizadores deberían permitir el paso del suficiente número de iones para dar lugar a corrientes de iones fácilmente medibles.0313. 28.5.. NH3+ (m = 17) y CH4+ (m = 16)] pueden distinguirse con un instrumento que tenga una resolución inferior a 50. Por ejemplo para diferenciar entre iones de la misma masa nominal tales como C2H4+ .9949 daltons.106 (partes por millón. mmu) ppmexact = (∆mexact/mmedida). Analizadores de masa Para la separación de iones con diversas relaciones masa/carga son posibles varios métodos.
Los analizadores de sector magnético utilizan un imán permanente o un electroimán para hacer que el haz de iones de la fuente se mueva en una trayectoria circular de 180.21 -
5. 90 o 60 grados. KE de un ion de masa m y carga z en la rendija de salida B viene dada por KE = zeV = 1/2 mv2 donde V es el potencial entre A y B.4. barridos eléctricos. La Figura 13 muestra un instrumento de sector de 90 grados en el que los iones. o el potencial de aceleración entre las rendijas A y B.
Figura 13. Los iones que pasan a través de la rendija de salida se recogen en un electrodo colector y dan lugar a una corriente de iones que es amplificada y registrada. o cinética. Esquema de un espectrómetro de sector magnético La capacidad de discriminación de m/z se basa en la variación de la trayectoria de un ión en función del campo magnético de su entorno. Analizadores de sector magnético Principio de funcionamiento.1. barridos magnéticos. Se puede llevar a cabo un barrido de los iones de diferente masa a través de la rendija de salida variando la fuerza del campo del imán.5. formados por impacto de electrones.60 · 10-19 C). Nótese que todos los iones que tienen la misma carga z se supone que tienen la misma energía cinética después de la
5..1. son acelerados a través de la rendija B hacia el tubo analizador metálico. v es la velocidad del ion después de la aceleración y e es la carga del ion (e = 1. La energía traslacional. que se mantiene a una presión interna de alrededor de 10-7 torr.
los iones más pesados deben viajar a través del sector magnético a velocidades menores. y r y variando el potencial V(voltaje de aceleración). Dicha ecuación revela que los espectros de masas pueden obtenerse variando una de las tres variable (B. Espectrometría de masas
aceleración independientemente de su masa.22 -
5. V o r) mientras se mantienen las otras dos constantes.5. los iones poseen una distribución estadística de velocidades (rapidez y dirección). La trayectoria descrita en el sector por los iones de una masa y carga dadas representa un balance entre las dos fuerzas que actúan sobre ellos. Para que un ion atraviese la trayectoria circular hasta el colector. es necesario que FM y Fc. La fuerza centrípeta resultante Fc. Los instrumentos de sector magnético discutidos en la sección anterior se llaman a menudo espectrómetros de enfoque simple (figura 14). Esta terminología se utiliza porque un conjunto de iones que salen de la fuente con la misma relación masa/carga pero con una distribución direccional algo divergente estarán afectados por el campo magnético de tal manera que se produce una distribución direccional convergente cuando los iones dejan el campo. barridos eléctricos. Debido a que todos los iones que dejan la rendija tienen aproximadamente la misma energía cinética. Geometrías especiales. Así. viene dada por Fc = mv2/r donde r es el radio de curvatura del sector magnético. resulta Bzev = mv2/r la cual reordenando y sustituyendo se obtiene v = Bzer/m m/z= B2r2e/(2V)
Está es la ecuación fundamental de la separación magnética. sean iguales. B. Las limitaciones de esta suposición se discuten en la sección siguiente. Esta suposición sólo es aproximadamente cierta. Los espectrómetros de masas de sector más modernos contienen un electroimán en el que los iones se separan manteniendo V y r constantes mientras se varía la corriente en el imán y por tanto B. La habilidad de un campo magnético para conducir iones con orientaciones direccionales diferentes hacia el foco significa que la distribución de energías traslacionales de los iones que dejan la fuente es el factor responsable que limita la resolución de los instrumentos de sector magnético (R < 2000).. barridos magnéticos o manteniendo constante la corriente del imán. La fuerza magnética FM viene dada por la relación FM = Bzev donde B es la fuerza del campo magnético. que trata de instrumentos de doble enfoque. que se reflejará en una distribución similar para los iones acelerados.
mientras que los iones de energía diferente seguirán trayectorias de menor o mayor radio. El doble enfoque se consigue utilizando combinaciones seleccionadas cuidadosamente de campos magnéticos (deflectores magnéticos) y electrostáticos (sectores electrostáticos). El término doble enfoque (Figura 15) se aplica a los espectrómetros de masas en los cuales las aberraciones direccionales y las aberraciones de energía de una población de iones se minimizan simultáneamente. En la geometría de doble enfoque convencional. es necesario diseñar instrumentos que corrijan tanto las distribuciones direccionales como las de energía de los iones que dejan la fuente. antes del analizador magnético. Normalmente para conseguir alta resolución se coloca antes o después del sector magnético un analizador electrostático que enfoca a la rendija de salida sólo los iones portadores de una energía translacional en un margen muy cercano a V y rechaza los iones cuyas energías son distintas a V. Analizador magnético de simple enfoque La distribución de energías traslacionales de los iones que dejan la fuente proviene de la distribución de Boltzmann de energías de las moléculas a partir de las que se han formado los iones y de las heterogeneidades en la fuente. En el caso contrario. Espectrometría de masas
Figura 14. Con el objeto de medir las masas atómicas y moleculares con una precisión de unas pocas partes por millón.. Los iones de energía correcta describirán una trayectoria de radio “r” que les permite atravesar la rendija de salida. La distribución de energías cinéticas produce un ensanchamiento del haz que llega al detector y por tanto una pérdida de resolución.23 -
. la geometría se denomina “geometría inversa”.5. Cada una de estas geometrías tiene sus ventajas por lo
5. por lo que serán rechazados. el analizador electrostático se sitúa en primer lugar.
Figura 15.. A menudo se utilizan como detectores para columnas cromatográficas.24 -
. Analizador magnético de doble enfoque Una amplia variedad de espectrómetros de doble enfoque son asequibles comercialmente. También se pueden adquirir instrumentos de doble enfoque más compactos (y más baratos).5. Espectrometría de masas
que se han desarrollado geometrías de triple sector (figura 16) que permiten reunir en un solo equipo las virtudes de ambas.
5. El más sofisticado de estos es capaz de una resolución del orden de 105. En estos instrumentos son usuales resoluciones de 2500.
ya que en unas determinadas condiciones de operación transmite sólo iones de un pequeño intervalo de relaciones m/z.
5. La parte más importante del instrumento es el conjunto de cuatro barras cilíndricas de metal que sirven de electrodos del filtro de masas. Debido a que los cuadrupolos funcionan por eliminación selectiva de iones. un cuadrupolo es parecido a un filtro de banda estrecha variable. menos caros y más robustos que los de sector magnético. La Figura 17 muestra un diagrama simplificado de un espectrómetro de masas de cuadrupolo.25 -
. Todos los otros iones son neutralizados y eliminados como moléculas sin carga.4.1. de la misma manera que una red de difracción dispersa simultáneamente un espectro de radiación electromagnética en función de la longitud de onda.5.. Espectrometría de masas
Figura 16. lo que es particularmente útil para realizar barridos de picos cromatográficos a tiempo real. En contraste. Un instrumento de sector magnético dispersa simultáneamente todos los iones en función de la relación m/z. Los iones de la fuente son acelerados por un potencial de 5 a 15 V e introducidos en el espacio entre las barras. Filtros de masas de cuadrupolo Los espectrómetros de masa de cuadrupolo son normalmente más compactos. < 100 ms). Los analizadores de cuadrupolo son actualmente los de utilización más frecuente. Analizador magnético trisector 5.2. También ofrecen la ventaja de emplear tiempos de barrido bajos (esto es. Variando las señales eléctricas de un cuadrupolo es posible variar el intervalo de valores m/z transmitidos. haciendo así posible el barrido espectral. se llaman a menudo filtros de masas. en vez de analizadores de masas.
Espectrómetro de masas de cuadrupolo La aplicación a cada par de barras opuestas de un voltaje y una radiofrecuencia posibilita un control de la trayectoria de los iones. es necesario considerar el efecto de los potenciales de corriente continua y de corriente alterna sobre la trayectoria de los iones cuando pasan a través del canal entre las barras. se aplican a cada par de barras potenciales variables de corriente alterna de radiofrecuencia. Están sujetas rígidamente sobre soportes cerámicos construidos con precisión que proporcionan una buena estabilidad mecánica aunque cambie la temperatura.5. Las ecuaciones diferenciales que se necesitan para describir el comportamiento de los iones de distinta masa en un cuadrupolo son complejas y dificiles de tratar analíticamente y están fuera del alcance de este texto. mientras que las demás masas. El ión debe de ser suficientemente pesado para no ser eliminado por el filtro de paso de masa elevada en uno de los planos y suficientemente ligero para no ser eliminado por el filtro de masa baja en el otro plano. Diversas casas comerciales fabrican los espectrómetros de masas de cuadrupolo. Además. Estos instrumentos resuelven fácilmente iones que tienen una diferencia de masas de la unidad. al ser inestables sus trayectorias. un par al polo positivo de una fuente variable de corriente continua y el otro par a la terminal negativa. Las barras cilíndricas son normalmente de 6 mm de diámetro y raramente tienen más de 15 cm de longitud. Para entender la capacidad de filtración de un cuadrupolo. debe tener una trayectoria estable en los dos planos formados por cada par de electrodos opuesto.26 -
. Por ello debe bastar entender que para que un ion atraviese el cuadrupolo hasta el detector. Las ventajas de los espectrómetros con analizador de cuadrupolo respecto a los
5. Esto permitirá al ión m/z seguir una trayectoria rectilínea y cruzar el túnel alcanzando el detector. Espectrometría de masas
Las barras opuestas se conectan eléctricamente. que están desfasados 180 grados. no alcanzan el detector. siendo desviadas fuera del conjunto de barras..
Figura 17. El centro de esta banda puede variarse ajustando los potenciales de corriente alterna y continua. El cuadrupolo total transmite una banda de iones que tienen un intervalo limitado de valores de m/z.
3.. Espectrómetro de masas de trampa de iones
5.5. Sin embargo sufre de limitaciones en cuanto a su capacidad de resolución y otras relacionadas con la alta probabilidad de que puedan producirse interacciones ión molécula durante el prolongado tiempo de residencia de los iones en la cavidad. La Figura 18 muestra la sección longitudinal de una trampa de iones sencilla asequible comercialmente. Consiste en un electrodo anular y un par de electrodos colectores. Analizador de trampa de iones (IT-MS. Se han desarrollado varios tipos de trampas de iones que en general son cuadrupolos pero en el espacio que lo que hacen es manipular iones y permitir hacer masas/masas. las órbitas de los iones más pesados llegan a estabilizarse. ion trap detector) Una trampa de iones es un dispositivo en el que los cationes o aniones gaseosos pueden ser formados y confinados durante largos períodos de tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos.4. Sus desventajas son su menor sensibilidad y resolución.
Figura 18.4. Los iones con un valor apropiado de m/z circulan en una órbita estable dentro de la cavidad que está rodeada por el anillo.4. Analizador de tiempo de vuelo (TOF.1. 5. lo que causa colisiones con la pared del electrodo anular. mientras que las de los iones más ligeros se desestabilizan. Espectrometría de masas
de sector magnético son su menor coste.27 -
. time of flight)
5. Cuando este dispositivo funciona como un espectrómetro de masas los iones quedan atrapados en el interior de la trampa mediante la aplicación de los voltajes y radiofrecuencias adecuados. Se sacan los iones que no interesan de la trampa y dejamos el que nos interesa estudiar que chocaría con el He y así se haría el masas/masas. pudiéndose de esta forma hacer experimentos con ellos. Cuando el potencial de radiofrecuencia se aumenta. Se aplica al electrodo anular un potencial de radiofrecuencia variable mientras que los dos electrodos colectores están conectados con tierra. ion-trap MS o ITD. facilidad de uso y barrido rápido. compactos y más económicos que los instrumentos de sector o de cuadrupolo.1. Los espectrómetros de trampa de iones son robustos.
que el impulso de ionización. Desde el punto de vista de la resolución y reproducibilidad.. los iones positivos se producen periódicamente por bombardeo de la muestra con impulsos de electrones. los instrumentos que utilizan separadores de tiempo de vuelo no son tan satisfactorios como los magnéticos y de cuadrupolo. pero retrasada. sus velocidades en el tubo deberán variar de modo inverso a sus masas.28 -
. algunas ventajas compensan parcialmente estas limitaciones como son la simplicidad y la robustez. el fácil acceso a la fuente de iones y el virtualmente ilimitado intervalo de masas. hasta proteínas de más de 300KDa.25 µs. Los tiempos de vuelo típicos están entre 1 y 30 µs. Varios fabricantes de instrumentos ofrecen actualmente instrumentos de tiempo de vuelo que en la actualidad se emplea rutinariamente en el campo del análisis de biomoléculas. Esquema del MALDI-TOF
5. desde azúcares de menos de 1000 Da. Los iones producidos de esta manera son acelerados por un impulso de campo eléctrico de 103 a 104 V que tiene la misma frecuencia. (Figura 19). Espectrometría de masas
En los instrumentos de tiempo de vuelo (TOF). de iones secundarios o de fotones generados por láser. Estos impulsos tienen normalmente una frecuencia de 10 a 50 kHz y un tiempo de vida de 0. Debido a que todos los iones que entran en el tubo tienen idealmente la misma energía cinética.
Figura 19.5. y por tanto las partículas ligeras llegarán antes al detector que las pesadas. empleando técnicas de ionización por deserción con láser tipo MALDI-TOF (Matriz Assisted Laser Desorption IonisationTime of Flight). Las partículas aceleradas pasan entonces a un tubo analizador de un metro de longitud sobre el que no actúa ningún campo. Sin embargo.
5. La parte esencial de un instrumento de transformada de Fourier es una trampa de iones en la cual los iones circulan en órbitas bien definidas durante largos períodos. la frecuencia del ciclotrón depende sólo de la inversa del valor m/z. Tales cavidades se construyen aprovechando el fenómeno de resonancia de ion ciclotrón. Espectrometría de masas
5. Los espectrómetros de masas de transformada de Fourier comerciales aparecieron en el mercado a principios de 1980 y actualmente los ofrecen diversos fabricantes. su movimiento llega a ser circular en un plano que es perpendicular a la dirección del campo. La energía absorbida aumenta entonces la velocidad del ión (y por tanto su radio de giro).5.29 -
. La resolución en espectrometría de masas de transformada de Fourier está limitada por la precisión en la medida de la frecuencia mas que en las rendijas o en las medidas de campo. En los primeros años predominaban los multiplicadores de electrones de detección puntual situados en el ambiente de alto vacío del espectrómetro.5.
5. sensibles y duraderos..5. Cuando un ión gaseoso es arrastrado o se forma en un campo magnético fuerte. Mas tarde fueron apareciendo nuevos desarrollos para detección puntual. cuya aportación a los nuevos desarrollos instrumentales en Espectrometría de Masas ha sido importante. combinadas normalmente con posterior centelleo o conversión fotónica. tales como baterías de micromultiplicadores multicanal (Microchannel Plate o Multichannel Multiplier Array Detector).4. La frecuencia angular de este movimiento se llama frecuencia del ciclotrón. velocidades mayores y sensibilidad y resolución elevadas. Un ión atrapado en una trayectoria circular en un campo magnético es capaz de absorber energía de un campo eléctrico de corriente alterna siempre que la frecuencia de campo sea igual a la frecuencia del ciclotrón. Los espectrómetros de transforma de Fourier son instrumentos caros.1.1. es posible una resolución extremadamente elevada (superior a 106). Ya que las medidas de la frecuencia se pueden hacer con elevada precisión. y los sistemas de conversión fotónica mas sofisticados. Detectores Comercialmente son asequibles varios tipos de detectores para espectrómetros de masas. También han aparecido sistemas de detección simultánea. como los detectores "Channeltron" de bajo coste y uso general. ωc.
ωc= v/r = zeB/m
Nótese que en un campo fijo. Los aumentos en la velocidad de un ion irán acompañados por el correspondiente aumento en el radio de rotación del ion. Resonancia ciclotrónica por transformada de Fourier (FT-ICRMS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer) Los espectrómetros de masas de transformada de Fourier proporcionan relaciones señal/ruido superiores. El movimiento circular coherente de los iones resonantes crea una llamada corriente imagen que puede ser observada convenientemente al finalizar la señal de frecuencia.
5. lo que permite mayores velocidades de barrido en el espectrómetro de masas. El cátodo y los sucesivos dínodos tienen superficies de Cu/Be de las que se emiten ráfagas de electrones al ser alcanzadas por iones o electrones de elevada energía. La mínima corriente detectable es del orden de 10-14 A. usándose uno u otro según la sensibilidad requerida y el vacío disponible. Es un detector de vida limitada.. Los iones se neutralizan por transferencia de electrones. etc. es mucho más rápida que la del detector Faraday. pudiendo destruirse prácticamente si se produce una ruptura o accidente de vacío. cuyo interior está recubierto por un óxido de plomo semiconductor de composición y características especiales. El proceso de multiplicación se repite sucesivamente en los demás dínodos. Es muy sensible a subidas de presión. normalmente combinado con un SEM (Multiplicador de Electrones Secundarios = Secondary Electron Multiplier).3. que recibe el impacto de los iones a detectar. es el multiplicador de electrones de dínodos. Se utiliza principalmente en sistemas para análisis de gases permanentes. del orden de 10-4 mbar.1. en muestras ambientales. Detector "Channeltron" Este detector es uno de los más utilizados hoy en día en espectrometría de masas para uso general. Es similar al multiplicador de electrones clásico.5. que van a incidir sobre el segundo dínodo. y la señal se mide como una corriente analógica igual o superior a la corriente iónica original.1. Su funcionamiento puede verse en la figura 20a. 5. También tiene aplicación en los espectrómetros de masas para medida de Relaciones Isotópicas (IRMS = Isotopic Ratio Mass Spectrometer). Puede trabajar a presiones relativamente altas. a veces terminado en forma de espiral o caracol (figura 20b). cada una de las cuales se dedica a la detección de una única masa.5. con la principal diferencia de que no tiene múltiples dínodos discretos. 5. del orden de 10-6 mbar o mejor. dependiendo de la forma del electrodo.5. reactores.1. Detector de copa de Faraday Consiste en un simple electrodo. gases residuales. formados por una batería de copas de Faraday.5. Es un detector de baja sensibilidad y gran sencillez.2. La velocidad de respuesta del multiplicador de electrones. obteniéndose al final del sistema una amplificación de señal del orden de 106 a 108. y posee una gran linealidad de respuesta. sino que está formado por un tubo de vidrio en forma de corneta. Es un detector mucho más sensible que el de copa de Faraday. con una señal mínima detectable del orden de 10-18 A.30 -
. Multiplicador de electrones secundarios Uno de los detectores que han sido más utilizados en espectrometría de masas. normalmente en forma de copa o caja.. por lo que su ganancia va cambiando con el tiempo y requiere calibración frecuente. El ión a detectar choca con el primer dínodo. provocando la emisión de un elevado número de electrones. Requiere alta tensión y un mayor vacío para operar. pues se va desgastando con el uso. típicamente inferior a 50 ns.1. En estos equipos se utilizan colectores múltiples.
(b) Channeltron Si se desea detectar iones positivos. como es la de evitar que alcancen el detector partículas o radiaciones no deseadas. en cada uno de los cuales se multiplicará el numero de electrones. con lo que existirá un gradiente contínuo de potencial desde la boca al fondo del detector. A1 final del recorrido del tubo multiplicador se encuentran un cono colector con la electrónica de preamplificación y amplificación asociada. produciendo la emisión de un cierto número de electrones. desviados de su trayectoria por una placa repulsora con potencial positivo sean atraídos a su interior y choquen con la cara interna. hacia potencial cero. este detector es susceptible de ser empleado tanto para detectar iones positivos como negativos. Debido a esto. Por tanto.31 -
. produciéndose una gran cantidad de impactos en el camino. El hecho de situar el detector fuera del "eje óptico" del espectrómetro. además de permitir la detección selectiva de iones positivos o negativos. produce una ventaja importante.
5. se aplica un potencial negativo en la boca del detector para que los iones procedentes del espectrómetro de masas. El final del tubo del detector se sitúa a un potencial cercano a tierra. con lo que se puede conseguir un efecto multiplicador del orden de 108.5. los electrones arrancados en el impacto inicial del ion volarán en la dirección de los potenciales menos negativos. (a) Multiplicador de electrones de dínodos discreto. que podrían incrementar el ruido de fondo y originar señales parásitas. Espectrometría de masas
Figura 20.. en principio basta con cambiar el signo de los potenciales aplicados a la placa repulsora y a la boca del channeltron. tales como fragmentos neutros o fotones procedentes del filamento de la fuente. Si se desean detectar iones negativos.
El voltaje aplicado es de signo contrario a la carga de los iones que se quieran detectar. aunque superior a la de los multiplicadores de dínodos discretos. estabilidad. es su extraordinaria duración. aparte de su mayor sensibilidad y estabilidad.4. Este tipo de detectores reúnen la ventaja de los antiguos sistemas de fotoplacas. de los modernos sistemas multiplicadores. la pantalla de centelleo emite un gran número de fotones.5. seguidas de un sistema de detección mas o menos sofisticado y eficiente. capacidad de amplificación. por un voltaje más positivo que el del dínodo. Requieren un vacío mínimo de trabajo del orden de 5 x 10-5 torr. para provocar su atracción y choque sobre el dínodo inicial. Los iones procedentes del tubo de vuelo del espectrómetro de masas son desviados de su trayectoria mediante un potencial eléctrico. que sufre en todo caso menos deterioro. Ello conduce a una sensibilidad aumentada en muchos órdenes de magnitud. La señal es detectada al final de su recorrido por el interior del tubo fotomultiplicador. la sustitución del multiplicador no es nada costosa. Detectores multicanal Existen varios tipos de detectores que pueden incluirse en esta denominación de multicanales. Este choque produce múltiples electrones que son atraídos.. siendo posteriormente de nuevo amplificada. lo que aumenta enormemente el tiempo de observación de cada ion. sensibles y de más larga vida disponibles para detección puntual. siempre que el alto voltaje haya sido desconectado.. Además.Multichannel Photo Diode Array
5.5.5. Espectrometría de masas
Otra ventaja de los "Channeltron" es que pueden exponerse a presión atmosférica sin ningún problema. etc. A medida que la superficie interior se va agotando. A1 recibir el impacto de los electrones. con la mayor sensibilidad. Detector de conversión fotónica (Detector "Daly" o de centelleo) Este detector es uno de los más eficientes. digitalizada y elaborada mediante circuitos electrónicos. 5. encargado de detectar simultáneamente todas las señales. para su manipulación por el sistema de tratamiento de datos del espectrómetro de masas. Existen distintas denominaciones de este tipo de detectores tales como: Multiple Channel Detector o Multiple Channel Detector/Multiplier Array Detector/Microchannel Multipliers . ya que el elemento que envejece principalmente es el fotomultiplicador. de ser capaces de detectar simultáneamente una amplia zona espectral. Cuando este fenómeno se acelera. es también limitada y depende de la carga total acumulada. a su vez. ya que se trata de un componente normal. 5. es síntoma evidente de que el final de la vida útil del detector se acerca.1. se va haciendo necesario incrementar el alto voltaje aplicado para conseguir una señal adecuada.1. disponible en el mercado a bajo precio. produciéndose la consiguiente cascada de electrones que multiplica la señal.5. lo que no debe ser problema en espectroscopía de masas donde es habitual trabajar con vacíos mejores que 10-1 torr en el analizador. Una ventaja de este detector sobre los clásicos "Channeltron". es decir. pues recibe el impacto de fotones y electrones que causan menor daño que el impacto directo de los iones. los cuales se dirigen a un fotomultiplicador convencional sellado a vacío. La vida de un detector "Channeltron".32 -
. del voltaje aplicado y del número de iones detectados. y aplicado sobre una pantalla fosforescente. lo que permite romper vacío en el sistema sin complicaciones. Se basan en la utilización de una o dos capas de baterías de micromultiplicadores.
la fragmentación es tan efectiva que no queda ningún ion molecular y por tanto la información más importante para la determinación del peso molecular del analito se pierde. En cada caso los picos del ion molecular aparecen a la masa correspondiente al peso molecular del analito.. asignar masas precisas a los picos de interés
5. que tiene una masa significativamente menor que el peso
5. ESPECTROS MOLECULARES DE VARIAS FUENTES DE IONES 5.1. de espectro bastante complejo pero muy bien conocido. utilizando PFK. Espectros de impacto de electrones El aspecto de los espectros de masas para una especie molecular dada depende en gran parte del método utilizado para la formación de los iones. Nótese que en cada espectro de la Figura 21.6 Sintonía y calibración de los espectrómetros de masas Con el fin de disponer de picos de masas conocidas se utilizan sustancias de referencia. el pico más grande en un espectro de masas se llama pico base. debido a que su masa proporciona el peso molecular del analito. el procedimiento es parecido. pero además en todo momento está entrando esta referencia a la fuente incluso a la vez que la muestra problema a analizar. La Figura 21 muestra los espectros de impacto de electrones de tres moléculas orgánicas sencillas: el etilbenceno. En los espectrómetros de masas de baja resolución conviene hacer un tune a la semana para asegurarse del buen funcionamiento del mismo. mediante la comparación de los picos respectivos. A este proceso se le denomina “TUNE” (sintonía).5. Desafortunadamente.2. Así. Lógicamente cuando se acaba la calibración se cierra la válvula. para realizar la calibración de la escala de masas del espectrómetro. 84 para el cloruro de metileno y 88 para 1-pentanol. ciertas moléculas no dan pico de ion molecular (vease Figura 22b). Espectrometría de masas
5.2. no es siempre posible identificar el pico del ion molecular. El pico del ion molecular es. En los espectrómetros de masas de alta resolución. Las sustancias de referencia más utilizadas son heptacosa (perfluorterbutilamina) para la calibración de las masas en equipos de baja resolución y el PFK (perfluorkeroseno) para los de alta. para cierto tipo de moléculas.1. de gran importancia en las determinaciones estructurales. el cloruro de metileno y el 1-pentanol. Como se ha dicho antes. Normalmente lo que se hace es abrir la válvula de fuga para conseguir un flujo de heptacosa hacia la fuente iónica que provoca la presencia permanente del espectro de esta sustancia con lo que el equipo compara el espectro de masas detectado con el que tiene almacenado en la memoria del ordenador. Además. El ordenador es capaz de separar el espectro de la muestra del de la sustancia de referencia y. se observan picos de iones moleculares a 106 para el etilbenceno. Lo que se hace es ajustar las distintas lentes y rendijas de la fuente para conseguir los valores óptimos de los iones fragmento del compuesto de referencia de los cuales se conoce su masa exacta así como las abundancias relativas de cada uno. Los complejos espectros de masas que se obtienen en la ionización por impacto de electrones son útiles para la identificación de compuestos.33 -
. con ionización por impacto de electrones. naturalmente. el pico base corresponde a un fragmento de la molécula. dado que.
12 1 C H235Cl37Cl (m = 86). Es interesante señalar en los espectros mostrados en la Figura 21 que aparecen picos a masas que son mayores que la del ion molecular. Estos picos se pueden atribuir a iones que tienen la misma fórmula química. La Tabla 5 da un listado de los isótopos más comunes de los átomos que aparecen normalmente en los compuestos orgánicos. que corresponde al ion formado por la pérdida de un grupo CH3. Espectrometría de masas
molecular del compuesto original. que corresponde a la pérdida de un átomo de 35C1 y para el 1-pentanol. el iodo y el sodio aparecen sólo como un único isótopo. los picos de los isótopos a menudo proporcionan un medio útil para la determinación de la fórmula de un compuesto. Normalmente. el fósforo. Las intensidades de los picos debidos a la incorporación de uno o más átomos de 13C en el etilbenceno se puede pronosticar con una buena precisión pero son tan pequeños que no son detectables debido a la poca probabilidad de que haya más de un átomo de 13C en una molécula de pequeño tamaño.5.
5. Para el etil benceno. Hay que señalar que el flúor. 13C1H235Cl2 (m = 85).34 -
.. para el cloruro de metileno. los picos base en espectros de impacto de electrones corresponden a fragmentos como estos y no al ion molecular. Picos de isótopos. Por ejemplo. el pico base se encuentra a una m/z de 44. Los picos de cada una de estas especies se pueden ver en la Figura 21b. Como se verá posteriormente. el pico base aparece a una masa de 91. pero diferentes composiciones isotópicas. El tamaño de los diferentes picos depende de la abundancia natural relativa de los isótopos. El pequeño pico del etilbenceno a la masa 107 en la Figura 21a se debe a la presencia de 13C en alguna de las moléculas. 13C1H235Cl37Cl (m = 87) y 12C1H237Cl2 (m = 88). el pico base aparece a la masa 49. De forma similar. que es la del ion hijo CH2CHOH+. para el cloruro de metileno. las especies isotópicas más importantes son 12C1H235Cl2 (m = 84).
Figura 21. b) cloruro de metileno y c) 1-pentanol.
. Espectros de masas de impacto electrónico de a) etilbenceno.
Abundancia natural de los isótopos de algunos elementos comunes
Picos de productos resultantes de colisiones. A la menor presión del área de la fuente. Como se ha comentado previamente. Esta transferencia es una reacción de segundo orden y la cantidad de producto depende en gran parte de la concentración de reactivo.Espectrometría de masas
Tabla 5. Otra limitación de la fuente de impacto de electrones es la necesidad de volatilizar la muestra. Como consecuencia. Los efectos de la descomposición térmica se pueden a veces minimizar llevando a cabo la volatilización en una sonda caliente que se sitúa cerca de la rendija de entrada del espectrómetro. la volatilización tiene lugar a baja temperatura y además. Las colisiones ion-molécula. lo cual puede dar lugar a una degradación térmica de algunos analitos antes de tener lugar la ionización. pueden producir picos a masas más elevadas que la del ion molecular. sin embargo. esta fragmentación puede ser también una desventaja cuando da lugar a la desaparición del pico del ion molecular por lo que no se puede establecer el peso molecular del analito. por lo que. tales como las que muestra la última ecuación de la Tabla 4. Las fuentes de impacto de electrones para el uso y producción de corrientes de iones elevadas.36 -
. las fuentes de impacto de electrones son sólo aplicables para aquellos analitos que tienen pesos moleculares más pequeños de aproximadamente 103 daltons. la altura de un pico (M + 1)+ debido a esta reacción aumenta mucho más rápidamente al aumentar la presión de la muestra que las alturas de otros picos. La extensa fragmentación y consecuentemente el elevado número de picos es también una ventaja debido a que a menudo permite identificaciones inequívocas de los posibles analitos. A presiones de muestra ordinarias.
. el resultado es un pico intenso (M + 1)+. Sin embargo. la única reacción importante de este tipo es una en la que las colisiones transfieren un átomo de hidrógeno al ion para dar un ion molecular protonado. dan buenas sensibilidades. Ventajas y desventajas de las fuentes de impacto de electrones. no se dispone de tanto tiempo para que tenga lugar la descomposición térmica. la detección de esta reacción es normalmente posible.
5.37 -
. El espectro de impacto de electrones (Figura 22b) pone de manifiesto la fragmentación elevada y rápida del ion molecular. estos picos surgen de los iones formados por rotura de enlaces carbono-carbono adyacentes. El pico base lo proporciona el ion C3H5+ a la masa 41 y otros picos para varias especies C3 se agrupan alrededor del pico base.2. el espectro de ionización química que se muestra en la Figura 22a es muy simple y consiste en el (M . no se observan picos detectables por encima de la masa 112. Espectros de ionización química La Figura 22 compara los espectros de ionización química y de impacto de electrones para el 1-decanol.
. Unas series similares de picos a 14. un pico base correspondiente al ion molecular que ha perdido un grupo OH y una serie de picos que difieren uno de otro en 14 unidades de masa.1)+.2. los espectros de ionización química generalmente contienen picos (M + 1)+ o (M -1)+ bien definidos que resultan de la adición o substracción de un protón en presencia del ion reactivo. Comparado con el espectro de impacto de electrones. Espectros de masas del 1-decanol: a) ionización química con isobutano como reactivo gaseoso. que corresponde al ion C8H16+. dos y tres grupos CH2 adicionales.
Figura 22. b) impacto de electrones a 70 eV. Como ya se ha dicho. corresponden a los iones con uno. Así. 28 y 42 unidades de masa superiores. Como en el espectro de impacto de electrones.
Figura 23. Por el contrario. y consiste en una serie de señales discretas a lo largo de todo el dominio espectral. con un pico fácilmente distinguible (M + 1)+ a la masa 148. El pico de masa más elevada observable (masa 129) se debe a la pérdida de agua del ion molecular y el pico base a una masa 48 se obtiene a partir de la pérdida de agua más un grupo -COOH. Estos espectros son totalmente diferentes a los conseguidos por otras técnicas de ionización.38 -
. En el espectro de impacto de electrones. Otros numerosos fragmentos se encuentran también a masas más bajas. b) ionización de campo y c) desorción de campo
. el espectro de ionización de campo es relativamente simple. La Figura 23c muestra un espectro de desorción de campo del ácido glutámico. La Figura 23 muestra los espectros para el ácido glutámico obtenidos por (a) ionización de impacto de electrones y (b) ionización de campo. Es incluso más simple que el espectro de ionización de campo y se observa tan sólo el pico del ion molecular protonado a la masa 148 y el de un isótopo a la masa 149. A modo de ejemplo en la figura 24 se muestra el espectro de masas del poliestireno. que corresponden. y con un cierto número de protones añadidos.3. a una molécula intacta cargada con diferente número de cargas. Espectros usando otras técnicas de ionización blandas.
Como se ha mencionado anteriormente cabe destacar también en este apartado los espectros de masas obtenidos por ionización API o MALDI-TOF. Espectros de masas del ácido glutámico: a) ionización de impacto de electrones. cada una de ellas.Espectrometría de masas
5. Una limitación de la ionización de campo es su sensibilidad. que es al menos un orden de magnitud inferior que la de las fuentes de impacto de electrones. el pico del ion progenitor a 147 no es detectable.
1. Además.1. del pico (M + 1)+ o (M .600 obtenido por MALDI-TOF
5.39 -
. el espectrómetro de masas es una herramienta insuperable para la determinación del peso molecular. Análisis cualitativo: identificación de compuestos puros El espectro de masas de un compuesto puro proporciona diversos tipos de datos que son útiles para su identificación. Determinación del peso molecular Para aquellos compuestos que pueden ionizarse por uno de los métodos descritos anteriormente. 5. El primero es el peso molecular del compuesto y el segundo es su fórmula. donde el pico del ion molecular puede estar ausente o ser pequeño en relación con los picos
Figura 24. naturalmente. dando el ion molecular o un ion molecular protonado. la identidad real de un compuesto puede establecerse a menudo por comparación de su espectro de masas con los de compuestos conocidos hasta llegar a una total coincidencia.3.3.1)+. Esta determinación. o en algunos casos. Espectro de masas del poliestireno 7. APLICACIONES 5.3. Finalmente. requiere la identificación del pico del ion molecular. el estudio de los modelos de fragmentación que se pone de manifiesto en el espectro de masas a menudo proporciona información sobre la presencia de varios grupos funcionales. Una determinación del peso molecular por espectrometría de masas requiere conocer con seguridad la identidad del pico del ion molecular. La localización del pico en la abscisa da entonces el peso molecular con una precisión que no puede alcanzarse por ningún otro método. en particular con fuentes de impacto de electrones. Por esta razón es siempre aconsejable ser precavido.1.
con tal que sólo el pico del ion molecular sea suficientemente intenso para que su altura y las alturas de los picos de los isótopos (M + 1)+ y (M + 2)+ puedan determinarse con precisión. requiere instrumentos de alta resolución capaces de detectar diferencias de masas de unas pocas milésimas de unidad de masa.044).3% de M+ sugiere un compuesto que tenga la fórmula C5H8O.058). En la última. C5H4N4 (m = 120.40 -
. las relaciones masa/carga de los siguientes compuestos: purina. etiltolueno. se puede determinar fácilmente una fórmula probable. N y O para un peso molecular que varía en la tercera o cuarta cifra decimal. entonces todos menos C7H8N2 deben excluirse como fórmulas posibles. C7H8N2 (m = 120. Si se puede llevar a cabo una determinación experimental con una precisión razonable. Fórmulas a partir de instrumentos de alta resolución.2. Han sido compiladas tablas que listan todas las combinaciones razonables de C. C8H80 (m = 120.096) y acetofenona. O y N para los números de masa 83 y 84 (las tablas originales se extienden hasta el número de masa 500). benzamidina. Considérese. Los datos de un instrumento de baja resolución que puede sólo discriminar entre iones que difieren en masa por un número entero de masa pueden dar información útil sobre la fórmula de un compuesto.Espectrometría de masas
debidos a impurezas.005). sin embargo. C9Hl2 (m = 120. se da un listado de todas las combinaciones razonables de C. una pequeña parte de las cuales se muestra en la Tabla 6. por ejemplo. Si la masa medida del pico del ion molecular es 120. Fórmulas a partir de relaciones isotópicas. H. 5. A menudo puede asignarse una única fórmula para un compuesto a partir de la masa exacta del pico del ion molecular. Esta aplicación. En la Tabla 6 se muestra una pequeña porción de una compilación de este tipo.3. El uso de las alturas relativas de los picos de isótopos para la determinación de fórmulas moleculares se facilita mucho con tablas.6 y 0.069). Por ejemplo. Están tabuladas las alturas de los picos (M+1)+ y (M + 2)+ dadas como porcentajes de la altura del pico M+.1. Determinación de fórmulas moleculares Las fórmulas moleculares se pueden determinar a partir del espectro de masas de un compuesto. son particularmente útiles los espectros adicionales usando otras técnicas blandas de ionización. siempre que el pico del ion molecular pueda ser identificado y su masa exacta determinada.
. un pico de ion molecular a la masa 84 con valores de (M + 1)+ y (M + 2)+ de 5. H. Cuando existen dudas.070 (±0.
cloro y bromo en una molécula debido a la gran contribución que tienen sobre el (M + 2)+ (vease Tabla 6). por otro lado.33x1=0.33x0. Veamos un ejemplo de cómo calcular la relación isotópica para el cloroformo (Cl3CH) cuyo peso molecular es 35x3+12+1=118 umas.33x1x0. es del 100% y la del isótopo 37Cl. Por ejemplo.Espectrometría de masas
Tabla 6. Sabemos que la abundancia relativa del isótopo de 35Cl. al que llamaremos A. H.41 -
.33x1x1=0. OyN
La relación isotópica es particularmente útil para la detección y estimación del número de átomos de azufre. es del 33%.33=0. la presencia de un (M + 2)+ que es alrededor del 65% del pico M+ indica que la molécula tiene dos átomos de cloro.09 B A B 0.99 100% B B A 0.33 Total de 2 átomos de A y 1 de B = 0. Abundancia isotópica y pesos moleculares para varias combinaciones de C.33 A B A 1x0.33 B A A 0.33=0. un pico (M + 2)+ del 4% sugeriría la presencia de un átomo de azufre.09
. Las distintas posibilidades serían: A A A 1x1x1=1 Total de 3 átomos de A=1 100% A A B 1x1x0. al que llamaremos B.33x1=0.
Las bibliotecas de espectros de masas más extensas (> 150 000 espectros) son asequibles comercialmente. después de la determinación del peso molecular del analito y del estudio de su distribución isotópica y de la aplicación de los modelos de fragmentación. Las bibliotecas pequeñas normalmente contienen de unos pocos cientos a unos pocos miles de espectros para aplicación a una determinada área. la identificación final se basa entonces en una comparación de los espectros de masas del analito con los espectros de muestras patrón de los compuestos esperados. Desafortunadamente. tal
A B B 1x0. las alturas de los picos de los espectros de masas dependen en gran parte de variables tales como la energía del haz de electrones. A pesar que las bibliotecas de datos espectrales de masas son asequibles en forma de textos.33=0. los espectrómetros de masas más modernos están equipados con sistemas de búsqueda en biblioteca computarizados muy eficaces. Sin embargo. Los estudios sistemáticos de modelos de fragmentación para sustancias puras han desembocado en el establecimiento de ciertas guías que permiten predecir los mecanismos de fragmentación y una serie de reglas generales que son una ayuda en la interpretación de espectros. ha sido posible en un número remarcablemente elevado de casos identificar analitos a partir de espectros de biblioteca obtenidos con diversos instrumentos y condiciones de trabajo. Sistemas de búsqueda en bibliotecas computarizados. En consecuencia.03 Total de 3 átomos de B= 3% 118 M+ 100% 120 M++2 100% 122 M++4 27% 124 M++6 3%
Información estructural a partir de modelos de fragmentación.33x0. se observan variaciones significantes en la abundancia relativa para espectros obtenidos en diferentes laboratorios y con diferentes instrumentos. la localización de la muestra con respecto al haz.33x0.42 -
. Sin embargo. la presión de la muestra y la temperatura. Identificación de compuestos por comparación de espectros. a un espectroscopista de masas experimentado le es posible reducir las posibles estructuras a unas pocas.33x0. es deseable confirmar la identidad de un compuesto por comparación de su espectro con el espectro de un compuesto auténtico obtenido con el mismo instrumento y bajo idénticas condiciones. sin embargo.09 Total de 2 átomos de B y 1 de A=0. Normalmente se encuentran dos tipos de bibliotecas: unas muy extensas y otras más pequeñas pero específicas. El procedimiento se basa en suponer que (1) los modelos de fragmentación son únicos y (2) que las condiciones experimentales se pueden controlar lo suficiente como para producir espectros reproducibles. si que se utilizan los modelos característicos de fragmentación.27 27% B B B 0. Cuando son asequibles compuestos de referencia.33=0. la ionización por impacto de electrones es el método elegido para comparar espectros. Rara vez es posible (o deseable) explicar todos los picos del espectro. Generalmente. Generalmente. La probabilidad que tienen compuestos diferentes de dar el mismo espectro se hace cada vez menor a medida que aumentan los picos espectrales. Por esta razón.
es a veces posible encontrar para cada componente picos a un valor m/z único. La relación de la intensidad de pico de las especies de analito y los estándares internos se representa entonces en función de la concentración de analito. Normalmente.2. llamada cromatograma de masas. el ordenador del instrumento puede adaptarse para que lleve a cabo una búsqueda en biblioteca en todos. farmacéutica y en estudios de problemas ambientales. o en cualquier subgrupo. Los resultados se muestran al usuario y. se pueden preparar curvas de calibrado de las alturas de los picos frente a la concentración y utilizarlas para el análisis cuantitativo.Espectrometría de masas
como residuos de pesticidas. drogas o muestras forenses.
. 5. Esta técnica se llama registro selectivo de iones. Con las pequeñas cantidades de muestra que se necesitan en espectrometría de masas. La gráfica de los datos. las áreas bajo los picos son directamente proporcionales a las concentraciones del componente y por tanto sirven como parámetro analítico. En estas circunstancias. Para mezclas simples. Generalmente. En este tipo de procedimiento. Análisis cuantitativo: determinación de concentraciones moleculares La espectrometría de masas ha sido ampliamente utilizada en la determinación cuantitativa de uno o más componentes en sistemas complejos orgánicos (y a veces inorgánicos) tal como los que se encuentran en las industrias del petróleo. los espectros de referencia se pueden visualizar en un monitor o se pueden imprimir para una comparación visual. Con el espectrómetro se obtiene un valor adecuado de m/z. como los obtenidos cuando un espectrómetro de masas se acopla con un cromatógrafo para la identificación de los compuestos de una mezcla. Sin embargo. de los espectros de masas que se obtienen con una muestra particular. se pueden obtener resultados más precisos incorporando una cantidad fija de una sustancia estándar interno tanto en las muestras como en los patrones. entonces se registra la corriente de iones en función del tiempo. el espectrómetro de masa simplemente sirve como un detector selectivo sofisticado para el análisis cromatográfico cuantitativo. El estándar interno tiende a reducir las imprecisiones que surgen de la preparación y en la introducción de la muestra.3. Las bibliotecas pequeñas forman parte a menudo del grupo de paquetes ofrecidos por los fabricantes de instrumentos y es casi siempre posible para el usuario del instrumento generar una biblioteca o hacer adiciones sobre una biblioteca existente. las concentraciones de analito se obtienen directamente de las alturas de los picos espectrales de masas.43 -
. En el segundo tipo de espectrometría de masas cuantitativa para especies moleculares. si lo desea. tales análisis se llevan a cabo pasando la muestra a través de una columna cromatográfica y por el espectrómetro. consiste en una serie de picos cromatográficos apareciendo cada pico a un tiempo que es característico de uno de los diversos componentes de la muestra que da iones del valor o valores elegidos para m/z. En el caso de un gran número de espectros. estas incertidumbres son a menudo la mayor fuente de errores indeterminados.
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