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Timestamp: 2019-09-23 18:49:55+00:00

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ES2231460T3 - Method and device for the determination of temperature-dependent parameters, such as parameters of association / dissociation and / or the equilibrium constant constituted by at least two complex components. - Google Patents
Method and device for the determination of temperature-dependent parameters, such as parameters of association / dissociation and / or the equilibrium constant constituted by at least two complex components.
ES2231460T3
ES2231460T3 ES01915154T ES01915154T ES2231460T3 ES 2231460 T3 ES2231460 T3 ES 2231460T3 ES 01915154 T ES01915154 T ES 01915154T ES 01915154 T ES01915154 T ES 01915154T ES 2231460 T3 ES2231460 T3 ES 2231460T3
ES01915154T
Meike Reimann-Zawadzki
2000-01-21 Priority to DE10002566 priority Critical
2000-01-21 Priority to DE10002566A priority patent/DE10002566A1/en
2001-01-22 Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
2005-05-16 Publication of ES2231460T3 publication Critical patent/ES2231460T3/en
Procedimiento para la determinación paralela de parámetros dependientes de la temperatura, como los parámetros de asociación / disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes (12), que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición (10) en un medio de reacción excitable ópticamente y formado por segundos componentes (11) que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes (12), y ello mediante la puesta en contacto de la fase líquida y del medio de reacción (1) en condiciones de síntesis de complejos (13) y la excitación de colorantes fluorescentes próximos a la superficie, enlazados a los primeros componentes (12) y/o segundos componentes (11), para la emisión de luz fluorescente (7) mediante luz de excitación (4) irradiada y detección de la luz fluorescente emitida en un espectro de temperatu Method for parallel determination of parameters dependent on the temperature, as parameters association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes that comprise at least two components, wherein the first components (12) which are in a liquid phase , are contacted with a large number of measurement points (10) in a medium of excitable optically reaction and formed by second components (11) are coupled to the solid reaction and bind specifically to the first components (12), and this by contacting the liquid phase and the reaction medium (1) in terms of synthesis of complexes (13) and the excitation next fluorescent dyes to the surface bonded to the first components (12) and / or second components (11), for emitting fluorescent light (7) by excitation light (4) and detecting emitted fluorescent light emitted in a spectrum of temperatu ras variable, y la síntesis o la disgregación de los complejos, que incluyen primeros componentes (12) y segundos componentes (11), se observa como función de la temperatura. ras variable, and the synthesis or breakdown of the complex, which include first components (12) and second components (11), is observed as a function of temperature.
Procedimiento y dispositivo para la determinación de parámetos dependientes de la temperatura, tales como los parámetos de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos constituidos por al menos dos componentes. Method and device for determining parámetos temperature dependent, such as parámetos association / dissociation and / or the equilibrium constant constituted by at least two complex components.
La invención se refiere a un procedimiento y un dispositivo para determinar parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes, que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición en un medio de reacción excitable ópticamente mediante segundos componentes que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes, y bajo irradiación de luz de excitación, en particular luz de láser, se produce una luz fluorescente que se evalúa mediante un dispositivo de registro. The invention relates to a method and a device for determining parameters dependent on the temperature, as the parameter association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes formed by at least two components, where the first components, which are in a liquid phase, are contacted with a large number of measuring points in a medium excitable reaction optically by second components that are coupled to the solid reaction and bind specifically to the first components, and under irradiation of excitation light, in particular laser light, a fluorescent light is evaluated by a recording device occurs.
En los sistemas químicos y biológicos la síntesis (asociación) y la disgregación (disociación) de complejos tiene gran importancia. In chemical and biological systems synthesis (association) and disintegration (dissociation) complex it is of great importance. Por ejemplo, el nivel de azúcar en la sangre está regulado por el enlace de insulina en su receptor celular, esto es, mediante la síntesis de un complejo insulina/receptor. For example, the level of blood sugar is regulated by the insulin binding its cellular receptor, that is, by synthesizing a complex insulin / receiver. El complejo sintetizado efectúa en este caso una reducción del nivel de azúcar en la sangre. The synthesized complex made in this case a reduction in the level of blood sugar. Otros ejemplos de complejos en sistemas biológicos son, por ejemplo, los complejos antígeno/anticuerpo y enzima/sustrato. Other examples of complex biological systems are, for example, the antigen / antibody and enzyme / substrate.
Para la actividad biológica y química del complejo son relevantes aquí tanto los parámetros cinéticos, esto es, la constante de asociación y de disociación, como también los parámetros termodinámicos, esto es, la constante de equilibrio. For biological and chemical activity of the complex are relevant here both kinetic parameters, that is, the association constant and dissociation, as the thermodynamic parameters, namely the equilibrium constant. La dependencia respecto a la temperatura de las magnitudes mencionadas es conocida. The dependence on the temperature of the above dimensions is known.
El ácido desoxirribonucleico (ADN) producido de forma natural se encuentra por lo general como cadena doble, esto es, como complejo formado por dos hebras separadas complementarias de ácidos nucleicos. Deoxyribonucleic acid (DNA) produced naturally is usually as double-stranded, that is as complex consisting of two separated complementary strands of nucleic acids. La velocidad de los procesos de replicación y de trascripción depende mucho en este contexto de la distribución entre el complejo y las hebras separadas. The process speed of replication and transcription in this context depends heavily distribution between the complex and the separated strands.
La disociación del complejo en dos hebras individuales separadas entre sí se denomina generalmente "fusión" y la temperatura, a la que se disocia un 50% aprox. Dissociation of the complex into two separate single strands together is generally called "melt" and temperature, which dissociates to 50% approx. del complejo en las hebras individuales separadas se denomina "temperatura de fusión". complex in the separated single strands is called "melting". En general la tendencia a la fusión del complejo aumenta a medida que aumenta la temperatura. In general the trend fusion complex increases with increasing temperature.
Para determinar sustancias en muestras, en particular para comprobar determinadas secuencias de ADN en una muestra, se conoce la utilización de biochips. To determine substances in samples, in particular to check certain DNA sequences in a sample, the use of biochips are known. Éstos forman vehículos planares en cuya superficie quedan inmovilizados un gran número de puntos de medición, por ejemplo, formados por ácidos nucleicos (hebras individuales complementarias de ADN), donde esta superficie del chip se pone en contacto con una muestra que contiene las secuencias de ADN como sustancias que se pretende analizar y la muestra contiene los ácidos nucleicos que se pretende analizar. These form planar carriers on whose surface are immobilized a large number of measuring points, for example, formed by nucleic acids (complementary single strands of DNA), where this chip surface is contacted with a sample containing DNA sequences as substances to be analyzed and the sample containing nucleic acids to be analyzed. Dado que cada hebra individual de una molécula de ácido nucleico establece un enlace con su hebra complementaria, que se denomina hibridación, después de examinar los diferentes puntos de medición en relación con el enlace de moléculas de la muestra, obtenemos una información sobre las secuencias de ADN contenidas en la muestra. Since each individual strand of a nucleic acid molecule establishes a link with its complementary strand, called hybridization, after examining the different measuring points in relation to the binding molecules of the sample, we obtain information about sequences DNA contained in the sample. Una de las ventajas de la analítica del biochip consiste en que en un biochip se pueden efectuar y detectar en paralelo hasta varios miles de procesos de hibridación. One of the advantages of biochip analytics is that in a biochip can be made and detected in parallel to several thousand hybridization processes.
En correspondencia con el paralelismo de los procesos de hibridación se necesita un analizador para la evaluación del biochip, el cual, con una resolución local elevada, consigue una sensibilidad de detección igualmente elevada. Correspondingly parallelism hybridization processes an analyzer for evaluating the biochip, which, with a high local resolution, achieves a high detection sensitivity also needed. Como se debe perseguir un gasto lo más reducido posible en el tratamiento previo de la muestra, interesa la posibilidad de reconocer de modo fiable un número también limitado de moléculas hibridizadas en los diferentes puntos de medición. You should be pursued as an expense as low as possible in the pretreatment of the sample, interested in the possibility of reliably recognize an equally limited number of hybridized molecules at different measuring points number.
Los lectores de biochips disponibles actualmente en el comercio trabajan según el principio del escaneado. Biochip readers currently available commercially work on the principle of scanning. La luz para la excitación de la fluorescencia explora la superficie en forma secuencial. Light for fluorescence excitation scans the surface sequentially. El biochip se mueve rápidamente con un rayo de luz fijo, o bien se utiliza, al menos para una dirección de movimiento, un escáner galvánico con el que se desvía el rayo de luz. The biochip moves quickly with a ray of light fixed or used, at least for one direction of movement, a galvanic scanner with which the light beam is deflected.
La luz emitida por los fluorocromos se detecta a continuación con un fotodetector sensible (por ejemplo, un fotomultiplicador). The light emitted by the fluorochromes is then detected with a sensitive photodetector (eg, a photomultiplier). Los aparatos están diseñados como sistemas de medición en laboratorio para aplicaciones en la investigación de biología molecular. The devices are designed as laboratory measurement systems for applications in molecular biology research. El límite de detección se sitúa en el intervalo entre unas pocas moléculas por \mum^{2} hasta unas 100 por \mum^{2}. The detection limit is in the range of a few molecules by \ ^ {2} mum to about 100 \ ^ {2} mum. Los tiempos de escaneado se sitúan entre 2 y 4 minutos aproximadamente. Scan times are between about 2 and 4 minutes. Los precios de los aparatos de este tipo oscilan entre unos 50.000 dólares USA para un aparato de gama económica hasta unos 350.000 dólares para aparatos de mayor calidad. Prices of such devices range from about $ 50,000 US for economic apparatus range up to $ 350,000 for higher quality appliances.
A modo de ejemplo se comentan aquí en detalle los dos aparatos que tienen supuestamente en la actualidad la mayor difusión. As an example discussed here in detail the two devices that are supposedly currently the most widespread. Se trata aquí del GeneArray Scanner de Hewlett-Packard, distribuido por la empresa norteamericana Affymetrix, y del ScanArray 3000 de GSI Lumonics. It is here the GeneArray Scanner Hewlett-Packard, distributed by the American company Affymetrix, and ScanArray 3000 GSI Lumonics. El GeneArray Scanner explora ópticamente la superficie del chip efectuando un desvío rápido del rayo de luz en una dirección del espacio. The GeneArray Scanner optically scans the surface of the chip making a quick detour light beam in a direction of space. En la otra dirección el chip se mueve de forma gradual. In the other direction the chip moves gradually. Las dimensiones del aparato son de 66 cm \times 78 cm \times 42 cm. The apparatus dimensions are 66 cm \ times 78 cm \ times 42 cm. La fuente de luz es un láser de iones de argón (longitud de onda 488 nm). The light source is a laser Argon ion (488 nm wavelength). La detección se efectúa con un fotomultiplicador de rango entre 550 y 600 nm. Detection is effected by a photomultiplier range between 550 and 600 nm. El ScanArray 3000 tiene una óptica fija. The ScanArray 3000 has a fixed optics. El proceso de escaneado tiene lugar mediante un movimiento rápido del chip en una dirección del espacio y un desplazamiento gradual en la otra dirección. The scanning process takes place by flicking the chip in one spatial direction and a gradual shift in the other direction. Se ofrecen hasta tres longitudes de onda de excitación diferentes para la excitación de fluorocromos diferentes. They offered up to three wavelengths different excitation the excitation of different fluorochromes. La detección se efectúa también en este caso con un fotomultiplicador. The detection is also carried out in this case with a photomultiplier. Todos los aparatos de medición evalúan el biochip una vez concluida la hibridación. All measuring devices evaluate the biochip after completion of hybridization.
Todos estos aparatos tienen en común su incapacidad de registrar la dependencia respecto de la temperatura de los parámetros cinéticos y termodinámicos relevantes, como por ejemplo, la constante de asociación y disociación y la constante de equilibrio. All these devices have in common their inability to record the dependence on the temperature of the kinetic parameters and relevant thermodynamic, such as the association constant and dissociation and the equilibrium constant.
Además estos aparatos presentan problemas con la medición paralela del punto de fusión de un híbrido de ácido nucleico del que se inmoviliza una hebra en una fase sólida. Furthermore, these apparatuses have problems with parallel measurement of the melting point of a nucleic acid hybrid of a strand is immobilized on a solid phase. El punto de fusión de ácidos nucleicos parcialmente complementarios sólo se puede calcular matemáticamente con gran imprecisión, en particular si los reactivos asociados a la fase sólida limitan el grado de libertad de la reacción. The melting point of partially complementary nucleic acids can be mathematically calculated only with great inaccuracy, particularly if the reagents to the solid phase limit the degree of freedom of the reaction.
Otra problemática inherente a estos aparatos consiste en la determinación de la cinética de hibridación de muestras complejas para el análisis y en la determinación de la concentración de varios ácidos nucleicos en una muestra analizada. Another problem inherent to these devices consists in determining hybridization kinetics of complex samples for analysis and determination of the concentration of various nucleic acids in a sample. La detección de ácidos nucleicos múltiples mediante hibridación está limitada por la problemática del punto de fusión de los híbridos. Detection of multiple nucleic acids by hybridization is limited by the problem of melting of the hybrids. Si los puntos de fusión reales de los híbridos, a menudo diferentes de los puntos de fusión calculados, no se encuentran en un intervalo de temperaturas estrecho, una medición podrá ser, en términos cualitativos, erróneamente negativa o erróneamente positiva, y también cuantitativamente podrá presentar interferencias. If the actual points of fusion hybrids, often different melting points calculated, not in a range of narrow temperature measurement may be qualitatively erroneously negative or erroneously positive, and also quantitatively may present interference.
La patente EP-A-0 245 206 da a conocer un procedimiento y un dispositivo para la determinación de la temperatura de fusión de un ADN de doble cadena asociado a una superficie de guía de ondas de luz y marcado con un tinte fluorescente. EP-A-0245206 discloses a method and a device for determining the melting temperature of a double stranded DNA associated with a surface light waveguide and labeled with a fluorescent dye. El medio de reacción incluye un único punto de medición. The reaction medium comprises a single measuring point. DI Stimpson & J. Gordon (1996), Gen. Anal. DI & Stimpson J. Gordon (1996), Gen. Anal. Biomol. Biomol. Engineer. Engineer. 13, 73-80 y la patente US-A-5.599.668 dan a conocer un procedimiento y un dispositivo para el estudio de las reacciones de asociación/disociación, dependientes de la temperatura, de complejos de ADN de doble cadena. 13, 73-80 and US-A-5599668 patent discloses a method and a device for studying reactions association / dissociation temperature dependent, complex of double stranded DNA. Los oligonucleótidos de cadena sencilla se inmovilizan como una pluralidad de puntos de medición en la superficie de un guiaondas de luz y se hibridizan con oligonucleótidos marcados (no fluorescentes). The single-stranded oligonucleotides are immobilized as a plurality of measurement points on the surface of an optical waveguide and hybridized with labeled oligonucleotides (nonfluorescent). La luz de excitación se dispersa por las marcaciones, donde la luz dispersada se registra por medio de un aparato óptico de reproducción. The excitation light is scattered by the marks, where the scattered light is recorded by an optical reproducing apparatus.
Por ello la invención se basa en el objetivo de mejorar un procedimiento y un dispositivo del tipo mencionado al principio, de manera que de una forma sencilla y sin plantear requisitos elevados al tratamiento previo de las muestras se consiga una determinación precisa de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro asociación/disociación y/o la constante de equilibrio. Thus the invention is based on the object of improving a method and a device of the initially mentioned type, so that in a simple way and without posing high requirements to the pretreatment of samples a determination is achieved accurate dependent parameters temperature as the parameter association / dissociation and / or the equilibrium constant.
Este objetivo se resuelve según la invención mediante un procedimiento para la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes, que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición en un medio de reacción excitable ópticamente, formado por segundos componentes acoplados al medio de reacción sólido, que se enlazan específicamente con los primeros componentes, y ello tiene lugar mediante la puesta en contacto de la fase líquida y del medio de reacción en condiciones de síntesis de complejos y mediante la excitación de colorantes fluorescentes próximos a la superficie, enlazados con los primeros y/o segundos componentes, para la emisión de luz fluorescente mediante luz de excitación irradiada y detección de la luz fluorescente emitida en un espectro de te This object is achieved according to the invention by a method for the determination of parameters depending on the temperature, as the parameter association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes formed by at least two components, where the first components, which are in a liquid phase, are contacted with a large number of measuring points in a medium of excitable optically reaction, formed by second components coupled to the solid reaction which specifically bind to the first components, and this takes place by contacting the liquid phase and the reaction medium under conditions of synthesis of complex and by exciting next fluorescent dyes to the surface bonded to the first and / or second components, for the emission of fluorescent light by light irradiated excitation and detection of the emitted fluorescent light in a spectrum of I mperaturas variable, y donde la síntesis o la disgregación de complejos, que incluyen primeros y segundos componentes, se observa como función de la temperatura. mperaturas variable, and in which the synthesis or the disruption of complexes, including first and second components is observed as a function of temperature.
En una forma de realización preferida del procedimiento según la invención los primeros y/o segundos componentes son receptores y/o ligandos. In a preferred embodiment of the process of the invention the first and / or second components are receptors and / or ligands.
En este contexto la expresión "ligando" significa una molécula que enlaza con un receptor determinado. In this context the expression "ligand" means a molecule that binds to a given receptor. Los ligandos incluyen, entre otros, agonistas y antagonistas de receptores de la membrana celular, toxinas, toxinas biológicas, epítopos virales, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides), receptores hormonales, péptidos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores, medicamentos, lectinas, azúcares, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos, proteínas y anticuerpos. Ligands include, agonists and antagonists of cell membrane, toxins, biological toxins, viral epitopes, hormones (e.g., opiates, steroids), hormone receptors, peptides, enzymes, enzyme substrates, cofactors, drugs, lectins, sugars, oligonucleotides, nucleic acids, oligosaccharides, proteins and antibodies.
En este contexto la expresión "receptor" significa una molécula que presenta una afinidad para un ligando. In this context the term "receptor" means a molecule that has an affinity for a ligand. Los receptores pueden ser receptores producidos de forma natural o fabricados de forma sintética. Receptors can be naturally produced or manufactured receptors form synthetically. Los receptores se pueden utilizar como monómeros o como heteromultímeros en forma de agregado junto con otros receptores. Receptors can be used as monomers or as heteromultimers as added with other receptors. A modo de ejemplo, los receptores incluyen agonistas y antagonistas de receptores de la membrana celular, toxinas, toxinas biológicas, epítopos virales, hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides), receptores hormonales, péptidos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores, medicamentos, lectinas, azúcares, oligonucleótidos, ácidos nucleicos, oligosacáridos, células, fragmentos de células, fragmentos de tejidos, proteínas y anticuerpos. For example, the receptors include agonists and antagonists of cell membrane, toxins, biological toxins, viral epitopes, hormones (e.g., opiates, steroids), hormone receptors, peptides, enzymes, enzyme substrates, cofactors, drugs , lectins, sugars, oligonucleotides, nucleic acids, oligosaccharides, cells, cell fragments, tissue fragments, proteins and antibodies.
Los ligandos y/o receptores pueden estar enlazados de forma covalente o no covalente con el medio de reacción. Ligands and / or receptors may be linked covalently or noncovalently with the reaction medium. El enlace puede efectuarse aquí de forma conocida para el especialista. The link can be made here for the specialist a known manner.
En otra forma de realización preferida los primeros y/o segundos componentes son hebras separadas de ácidos nucleicos. In another preferred embodiment the first and / or second components are separate nucleic acid strands. Son especialmente preferidas las hebras separadas de ácidos nucleicos complementarias entre sí al menos parcialmente. Especially preferred are the separate strands of complementary nucleic acids to each other at least partially. Las hebras separadas de ácidos nucleicos complementarias al menos parcialmente forman en condiciones apropiadas un híbrido de ácidos nucleicos. The separate strands of complementary nucleic acid at least partially formed under appropriate conditions a hybrid nucleic acid. El procedimiento según la invención puede determinar tanto la síntesis dependiente de la temperatura como la disgregación (fusión) del híbrido de ácidos nucleicos. The inventive method can determine both the temperature dependent synthesis such as breakdown (melting) of the hybrid nucleic acid.
El conocimiento exacto de los puntos de fusión de los complejos de ácidos nucleicos permite mejorar sustancialmente el análisis de mutaciones en biochips. Accurate knowledge of the melting points of the nucleic acid complexes can substantially improve the analysis of mutations in biochips. De esta forma se pueden desarrollar datos de medición para un diseño racional de sondas para la analítica de ácidos nucleicos. This way you can develop measurement data for a rational design of probes for nucleic acid analytics. De esta forma se pueden utilizar especialmente sondas para el análisis isotérmico paralelo. Thus probes can be used especially for parallel isothermal analysis.
En este sentido supone una ventaja el hecho de que la luz de excitación se acople en los guiaondas de luz por medio de un dispositivo óptico, por ejemplo, un prisma. In this connection an advantage that the excitation light is coupled into the optical waveguide through an optical device, for example, a prism.
Además la luz de excitación puede producir, mediante reflexión total (ATR) o reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) de los rayos de luz, en una superficie de separación entre dos medios con distinta densidad óptica, un campo electromagnético en el medio ópticamente menos denso, donde el medio ópticamente más denso es una fase sólida y el medio ópticamente menos denso es una fase líquida, para la medición de la secuencia temporal de la reacción. Furthermore the excitation light can produce, by total reflection (ATR) or total internal reflection fluorescence (TIRF) of the light rays in a surface between two media with different optical density, an electromagnetic field in the medium optically less dense, where the optically denser medium is a solid phase and the optically less dense medium is a liquid phase, for measurement of the time sequence of the reaction.
Un producto de este tipo permite una construcción muy sencilla del medio de reacción (biochip), preferiblemente mediante revestimiento de un cuerpo transparente con una capa guiaondas planar de alta refracción, y permite un dispositivo de análisis sencillo, en el cual, por ejemplo, una celda de flujo que contiene la muestra (o una cubeta o un cuerpo de ensayo fijo de otro tipo) se pone en contacto hermético con el medio de reacción, en particular un biochip, cuya superficie está configurada, al menos en su mayor parte, como guiaondas planar y conduce la luz de excitación que en un extremo del guiaondas planar se acopla en éste, donde la luz fluorescente excitada por el campo evanescente de la luz de excitación es registrada, a través del cuerpo transparente del medio, en el lado del medio de reacción o biochip opuesto al guiaondas planar ya la celda de flujo, por un aparato óptico de reproducción que contiene preferiblemente un filtro y es derivada hacia un detector corre A product of this type allows a very simple construction of the reaction medium (biochip), preferably by coating a transparent body with a planar waveguide high-refraction layer, and allows a device simple analysis, in which, for example, a flow cell containing the sample (or a cuvette or a body fixed test otherwise) is placed in sealing contact with the reaction medium, in particular a biochip, the surface is configured at least for the most part, as waveguides planar and leads the excitation light at one end of the planar waveguide is coupled into it, where the fluorescent light excited by the evanescent field of the excitation light is recorded through the transparent body of the medium, the medium side reaction or opposite planar waveguide and flow cell for an optical reproduction apparatus preferably contains a filter and is derived to a biochip detector runs spondiente de alta resolución local, por ejemplo, un fotomultiplicador o una cámara CCD para la lectura del medio de reacción, en particular del biochip. sponding high local resolution, for example, a photomultiplier or a CCD camera for reading the reaction medium, particularly the biochip.
Para ello todos los puntos de medición situados en el lado superior del guiaondas planar del medio de reacción o biochip son excitados al mismo tiempo por el campo evanescente de la luz de excitación que se acopla en el guiaondas planar para la emisión de luz fluorescente, en combinación con una reacción entre los agentes inmovilizados en la superficie del chip, como por ejemplo, hebras separadas de ADN y las sustancias que se pretende detectar en el ensayo, como por ejemplo, hebras separadas de ADN. To do all measuring points on the upper side of the planar waveguide of the reaction medium or biochip are excited simultaneously by the evanescent field of the excitation light is coupled into the waveguide planar for fluorescent light emission in combination with a reaction between immobilized on the chip surface agents, such as DNA strands separated and the substances to be detected in the assay, such as DNA strands separate.
Otros ejemplos de realización preferidos del procedimiento según la invención se describen en las demás subreivindicaciones. Other preferred embodiments of the method according to the invention are described in the other subclaims.
El objetivo antes mencionado se resuelve además, por lo que respecta al dispositivo, mediante un dispositivo para la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, con un medio de reacción cuya superficie excitable ópticamente presenta segundos componentes que forman los puntos de medición en el medio de reacción y que enlazan de forma específica con los primeros componentes, con un dispositivo para poner en contacto los primeros componentes que se encuentran en la fase líquida y los segundos componentes, acoplados al medio reactor y enlazados de forma específica a los primeros componentes, con un dispositivo para controlar la temperatura de los puntos de medición, con una fuente de luz para acoplar la luz de excitación para la excitación de la emisión de luz fluorescente dependiendo del enlace de los primeros componentes a los seg The above object of at least two components is also achieved, with respect to the device by a device for determination of parameters dependent on the temperature, as the parameter association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes formed with a reaction medium which excitable surface optically has second components forming the measurement points in the reaction medium and linking specifically with the first component, with a device for contacting the first components found in liquid phase and the second components coupled to the reactor means and linked specifically to the first components, with a device for controlling the temperature of the measurement points, with a light source for coupling excitation light for exciting the fluorescent light emission depending on the link to the first components sec undos componentes del medio de reacción, y con un detector para registrar la luz fluorescente emitida para determinar el enlace de los primeros componentes a los segundos componentes como función de la temperatura. undos components of the reaction medium, and with a detector for recording the fluorescent light emitted to determine bonding of the first components to the second components as a function of temperature.
Además de la determinación exacta de los puntos de fusión antes mencionados, un dispositivo de este tipo puede medir la cinética de disociación/asociación de ácidos nucleicos mediante un gradiente de temperatura y ofrece, mediante las constantes de equilibrio calculables, una información clara sobre la entalpía de reacción y por tanto una determinación de la concentración de las muestras analizadas. In addition to the accurate determination of the points aforementioned fusion, one such device can measure the kinetics of dissociation / association of nucleic acids by a temperature gradient and provides, by constants calculable balance, clear information on enthalpy reaction and therefore a determination of the concentration of the samples analyzed. Incluso resultan evaluables, mediante análisis matemático de la curva de hibridación, curvas de hibridación más complejas, por ejemplo, varios participantes en la hibridación en una sonda, esto es, ácidos nucleicos enlazados en la fase sólida, de modo que este método de análisis permite ahora registrar parámetros que hasta ahora no eran adecuados para el chip. Even are evaluable by mathematical curve analysis hybridization, curves more complex hybridization, for example, several participants in the hybridization probe, that is, nucleic acids bound to the solid phase, so that this method of analysis allows now register parameters that were previously unsuitable for the chip.
Además de la selección de reacciones bioquímicas, el dispositivo según la invención resulta apropiado también para la detección de sustancias inorgánicas. Besides the selection of biochemical reactions, the device according to the invention is also suitable for the detection of inorganic substances. Un ejemplo de ello es la sensórica de gases. One example is the sensoric gases.
En el pasado se propusieron diferentes sensores de gases que utilizan los llamados revestimientos sensibles. In the past different gas sensors using so-called sensitive coatings they were proposed. Éstos pueden ser, por ejemplo, películas de polímeros o capas de sol-gel que adsorben determinados gases. These may be, for example, polymer films or layers of sol-gel adsorb certain gases. Si en esta capa se agregan sustancias y/o indicadores que reaccionan de forma específica con los analitos se puede detectar una modificación de una propiedad de la capa en presencia de gases determinados. If substances and / or indicators that react specifically with the analytes can detect a change in a property of the layer in the presence of certain gases are added in this layer. Las características en cuestión de la capa pueden referirse, por ejemplo, a un cambio de color, una alteración de la densidad o del índice de refracción o una modificación de las características dieléctricas. The features within the layer can refer to, for example, a color change, a change in the density or refractive index or a change of the dielectric characteristics.
El dispositivo según la invención se puede utilizar de forma similar para la detección de gases cuando el analito emite luz fluorescente o bien cuando se desactiva ("quenching" de la fluorescencia) una fluorescencia del revestimiento por absorción del analito. The device according to the invention can be used similarly for the detection of gases when the analyte or fluoresce when deactivated ( "quenching" of fluorescence) of the fluorescence of the analyte absorption coating. La disposición óptica según la invención permite en estos casos la detección de un gran número de analitos utilizando varios revestimientos diferentes, que se encuentran estructurados sobre la superficie del guiaondas o del prisma. The optical arrangement of the invention can in these cases the detection of a large number of analytes using several different coatings, which are structured on the surface of the waveguide or prism. Además se detecta la secuencia temporal de la reacción. Also the timing of the reaction is detected.
Una información adicional importante la proporciona la dependencia de la temperatura de la absorción de gas del revestimiento, pues los gases que se pretende detectar por lo general se desorben de nuevo al aumentar la temperatura. An important additional information is provided by the temperature dependence of the absorption of the coating gas, for gases to be detected usually desorbed again with increasing temperature. El conocimiento de la temperatura a la que se encuentra en la película un componente determinado, que se pretende determinar, de la concentración de gases incrementa la especificidad del sensor. Knowledge of the temperature at which the film is in a particular component, which attempts to determine gas concentration sensor increases specificity. Esta información puede también aclarar el estado de la capa (por ejemplo, el envejecimiento de la capa). This information can also clarify the state of the layer (for example, aging of the layer). De este modo aumenta la fiabilidad de los datos de medición. This increases the reliability of measurement data. En especial se pueden registrar los datos del sensor con independencia de las intensidades de fluorescencia absolutas. Especially you can be recorded sensor data regardless of absolute fluorescence intensities. Y en relación al aumento de la temperatura es importante también, en el caso de una medición continua o casi continua, la posibilidad de expulsar de la capa a aquellos gases que no se desorben por sí mismos con un descenso de la concentración del entorno. And in regard to increasing the temperature it is also important in the case of a continuous or quasi-continuous measurement, the possibility of expelling the layer not those gases are desorbed by themselves with a decrease in concentration of the environment. La medición simultánea de la fluorescencia nos facilita información sobre si se ha producido o no la desorción del gas. The simultaneous measurement of fluorescence provides us with information on whether or not there has been desorption gas.
La esencia de la invención consiste en la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes, que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con puntos de medición situados en un medio de reacción excitable ópticamente y formados por segundos componentes que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes, y se observa la síntesis o la disgregación de los complejos como función de la temperatura. The essence of the invention is the determination of parameters depending on the temperature, as the parameter association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes formed by at least two components, where the first components, which are in a phase liquid, brought into contact with measuring points on a medium excitable optically and formed by second components that are coupled to the solid reaction and specifically bind to the first component reaction, and the synthesis or breakdown of the complex is observed as a function of temperature.
Otras configuraciones preferidas del dispositivo según la invención se describen en las restantes subreivindicaciones. Further preferred embodiments of the device according to the invention are described in the remaining subclaims.
A continuación se explica la invención con mayor detalle, sirviéndose de los ejemplos de realización y de los correspondientes dibujos. The invention is explained in more detail, using the embodiments and the corresponding drawings. Éstos muestran: These show:
Figura 1a un biochip en una representación esquemática en perspectiva; Figure 1a a biochip in a schematic representation in perspective;
Figura 1b un detalle de un biochip según la figura 1a para un punto de medición de una superficie con hebras separadas de ADN inmovilizadas; Figure 1b a detail of a biochip according to Figure 1a for a measurement point of a surface with immobilized DNA strands separate;
Figura 1c una representación esquemática de la incorporación al punto de medición, según la figura 1a, de la muestra con las hebras separadas de ADN que se pretende analizar, y una representación de la interacción complementaria entre las hebras separadas de ADN inmovilizadas según la figura 1b y las hebras separadas de ADN contenidas en la muestra (hibridación); Figure 1c shows a schematic representation of the incorporation to the measurement point, according to Figure 1a, the sample with the separate strands of DNA to be analyzed, and a representation of complementary interaction between the separate strands immobilized DNA according 1b and the separate strands of DNA in the sample (annealing);
Figura 2 una representación de la separación de fase enlazada y líquida según el principio de la ATR (reflexión total atenuada); 2 shows a representation of the separation of bound and liquid phases according to the principle of the ATR (attenuated total reflection);
Figura 3 una representación esquemática del dispositivo para la lectura de un prisma de ATR mediante reflexión simple; Figure 3 a schematic representation of the device for reading an ATR prism by simple reflection;
Figura 4 una representación esquemática para la lectura de un prisma de ATR mediante reflexión múltiple; Figure 4 a schematic representation for reading an ATR prism by multiple reflection;
Figura 5 una representación esquemática del dispositivo aplicando el principio de una reflexión múltiple "homogeneizada" (iluminación completa de las superficies); Figure 5 a schematic representation of the device using the principle of multiple reflection "homogenized" (complete illumination of surfaces);
Figura 6 una representación esquemática del dispositivo con aplicación de un guiaondas de luz planar; Figure 6 a schematic representation of the device by applying a planar optical waveguide;
Figura 7 gráficas para la representación de la distribución de la fluorescencia y su derivada en función del tiempo; Figure 7 graphs for representing the distribution of fluorescence and its derivative with respect to time; y Y
Figura 8 una estructura esquemática de una celda de flujo con control de temperatura. Figure 8 a schematic structure of a flow cell temperature control.
Como primer ejemplo de realización del procedimiento y del dispositivo que constituyen el objeto de la presente solicitud de patente se elige la configuración y la lectura de un biochip tal como se utiliza para el análisis de secuencias de ADN que se encuentran en una muestra y que se ponen en contacto con una superficie de un biochip para el análisis de los ácidos nucleicos. As a first embodiment of the method and the device forming the subject of the present patent application settings and reading a biochip is chosen as used for the analysis of DNA sequences found in a sample and that contacted with a surface of a biochip for the analysis of nucleic acids.
Por supuesto se trata solo de un ejemplo de realización, y aquí se pueden detectar también otras sustancias biológicas moleculares, biológicas y/o químicas, como por ejemplo, genes y anticuerpos. Of course this is only one embodiment, and here may also detect other molecular biological, biological and / or chemical substances, such as genes and antibodies.
En la figura 1a se muestra una representación esquemática de un biochip 1 de este tipo, que forma una pequeña placa en cuya superficie están inmovilizados un gran número de ácidos nucleicos 11 en puntos de medición aislados 10. En cada punto de medición aislado 10 se encuentra un oligonucleótido con una secuencia de bases definida. Figure 1a shows a schematic representation of a biochip 1 of this type, which forms a small plate whose surface shown are immobilized a large number of nucleic acids 11 measurement points isolated 10. In each measurement isolated 10 is an oligonucleotide having a base sequence defined. Esto está representado en la figura 1b. This is shown in Figure 1b. En la figura 1c los ácidos nucleicos objeto del análisis de la muestra sometida a estudio están designados con la cifra 12, y con una flecha se indica que éstos se ponen en contacto con los ácidos nucleicos complementarios 11 que se encuentran en el punto de medición 10. Dado que cada hebra aislada de una molécula de ácido nucleico 11 establece un enlace (hibridación) con su hebra complementaria 12 (véase la figura 1), después del examen de los diferentes puntos de medición 10 en relación con el enlace de moléculas 12 de la muestra se obtiene una información útil sobre las secuencias 12 de ADN existentes en la muestra. In Figure 1c the object of analysis of the sample under study nucleic acids they are designated by the number 12, and an arrow indicates that they are contacted with the complementary nucleic acids 11 which are in the measuring point 10 . Since each isolated strand of a nucleic acid molecule 11 establishes a link (hybridization) with its complementary strand 12 (see figure 1), upon examination of the different measuring points 10 relative to binding molecules 12 sample a useful sequence information 12 existing DNA in the sample is obtained. Las hebras separadas de ADN hibridadas se señalan en la figura 1c con la cifra 13. The hybridized DNA single strands are indicated in Figure 1c with the figure 13.
Los siguientes ejemplos de realización utilizan la reflexión total atenuada (ATR) o bien la reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) Con la reflexión total de un rayo de luz en la superficie de separación entre dos medios de diferente densidad óptica se genera un campo electromagnético en el medio ópticamente menos denso. The following embodiments utilize attenuated total reflection (ATR) or total internal reflection fluorescence (TIRF) With the total reflection of a ray of light on the interface between two media of different optical density an electromagnetic field is generated in the optically less dense medium. El medio ópticamente más denso puede ser aquí una fase sólida y el medio ópticamente menos denso una fase líquida. The optically denser medium can be here a solid phase and the average optically lighter liquid phase. Este llamado campo evanescente sólo penetra algunos cientos de nm desde la superficie de separación en el medio del entorno líquido. This so-called evanescent field penetrates only a few hundred nm from the interface in the medium of the liquid environment. De esta manera se detectan casi exclusivamente los tintes fluorescentes enlazados en la superficie. Thus they are detected almost exclusively linked fluorescent dyes on the surface. Los tintes disueltos en el medio del entorno contribuyen sólo en escasa medida a la señal de medición, como se puede ver en la figura 2. Esto permite la medición de la secuencia temporal de las reacciones. The dyes dissolved in the medium of the environment contribute only little to the measurement signal, as seen in Figure 2. This allows measurement of the time sequence of reactions.
En la figura 2 se puede ver claramente que los perfiles de intensidad de los campos evanescentes descienden muy marcadamente. In Figure 2, you can clearly see that the intensity profiles of the evanescent fields down very sharply.
Aquí una celda de flujo calentable pone en contacto la fase líquida con la fase sólida y permite el control de la temperatura de los reactivos. Here a cell heatable flow contacts the liquid phase with the solid phase and allows control of the temperature of the reactants. Una celda de flujo 6 está acoplada con un sistema fluídico para la manipulación de la fase líquida. A flow cell 6 is coupled with a fluidic system for handling the liquid phase. Debido al contacto permanente de la sonda, esto es, de los ácidos nucleicos enlazados a la fase sólida con la fase líquida existe la posibilidad de regeneración del biochip. Through continuous contact of the probe, that is, of the nucleic acids bound to the solid phase with the liquid phase is possible regeneration biochip. Como chip de medición se utiliza un prisma Measuring chip as a prism is used
transparente 5. transparent 5.
En la disposición según la figura 3 el lado del prisma 5 se ilumina de forma plana. In the arrangement according to Figure 3 the side of the prism 5 is illuminated flat. Una reflexión total simple en el lado de la base del prisma basta para mantener una superficie de medición de tamaño suficiente. A simple total reflection on the side of the prism base sufficient to maintain a measuring surface of sufficient size.
La figura 3 muestra además en representación esquemática un dispositivo para la lectura del biochip 1, que presenta una configuración como se ha descrito ya anteriormente. Figure 3 also shows in schematic representation a device for reading the biochip 1 having a configuration as already described above. El biochip 1 está formado a su vez por un sustrato transparente y preferiblemente por un revestimiento de alta refracción agregado sobre el sustrato como guiaondas de luz planar. The biochip 1 is formed in turn by a transparent substrate and a coating preferably high refractive added onto the substrate as planar optical waveguide. El guiaondas de luz lleva un campo de puntos de medición 10, y una luz de excitación 4 se acopla en el guiaondas de luz a través del prisma 5 y se conduce hacia el interior de éste. The optical waveguide carries a field measurement points 10, and an excitation light 4 is coupled into the optical waveguide through the prism 5 and leads into it. La sonda de medición está configurada en la forma ya explicada con ayuda de la figura 1b. The probe is configured in the manner explained using Figure 1b.
Para el análisis de los ácidos nucleicos de ADN en una muestra se lleva dicha muestra a la celda de flujo 6 y se pasa a través de ésta, como se indica con las flechas de flujo 6a y 6b. For the analysis of nucleic acids of DNA in a sample the sample is taken to the flow cell 6 and is passed through it, as indicated by the flow arrows 6a and 6b. La celda de flujo 6 se coloca impermeabilizada sobre el guiaondas de luz y rodea en forma de marco e impermeable a los líquidos, el campo de medición con los puntos de medición 10, de modo que la muestra puede interactuar con todos los puntos de medición 10 para la posible hibridación. The flow cell 6 is placed waterproofed on the optical waveguide and surrounding frame-shaped and liquid impermeable, the field of measurement with the measuring points 10 so that the sample can interact with all the measurement points 10 for possible hybridization. La detección de la radiación fluorescente 7 excitada por el campo evanescente de la luz de excitación 4 tiene lugar, por ejemplo, por medio de un aparato óptico de reproducción 8 en combinación con un filtro, no representado aquí, y de un detector 9 de alta resolución local, por ejemplo, una cámara CCD o un fotomultiplicador. Detecting fluorescent radiation 7 excited by the evanescent field of the excitation light 4 takes place, for example by means of an optical reproducing apparatus 8 in combination with a filter, not shown here, and a detector 9 High local resolution, for example, a CCD camera or a photomultiplier.
De esta manera se puede efectuar al mismo tiempo un registro de la hibridación y una lectura paralela del biochip 1 con todos los puntos de medición 10. Al mismo tiempo se produce una excitación selectiva de los fluorocromos enlazados en los puntos de medición 10. Así pues, este principio de medición permite, sin una preparación especial de las muestras, una evaluación y una detección del biochip 1 de gran exactitud y rapidez por lo que respecta a la resolución local y también por lo que respecta a la presencia de ácidos nucleicos hibridados. In this way you can be effected at the same time a record of the hybridization and a parallel reading the biochip 1 with all measuring points 10. Simultaneously a selective excitation of the fluorochromes bound to the measurement points 10. Thus occurs this measuring principle allows without special sample preparation, evaluation and screening biochip 1 high accuracy and speed with respect to the local resolution and also with regard to the presence of hybridized nucleic acids.
En la disposición según la figura 4 se ilumina con un sistema óptico lineal un lado de un prisma 5a sustancialmente más delgado, con un espesor de 1 mm aproximadamente. In the arrangement according to Figure 4 it is illuminated with a linear optical system side of a substantially thinner the 5th prism, with a thickness of about 1 mm. Para ello están dispuestos varios prismas 5a unos junto a otros. For this purpose several prisms are arranged next to one another on the 5th. Mediante reflexión múltiple en los lados superiores e inferiores de los prismas 5a se consigue una iluminación plana del campo de medición. By multiple reflection on the upper and lower sides of prisms 5a a flat field illumination measurement is achieved.
La detección de la radiación fluorescente emitida tiene lugar con un detector 9 de resolución local. Detecting fluorescent radiation emitted takes place with a local resolution detector 9. En este caso actúa como fuente de luz un diodo de láser 3. In this case it acts as a light source a laser diode 3.
La medición en línea de la hibridación por medio de un analizador de ATR con fluídica calentable tiene lugar de la forma siguiente. Online measurement of hybridization by an analyzer ATR with heatable fluid takes place as follows.
En primer lugar se describe la determinación del punto de fusión de un ADN. First determining the melting point of DNA is described. Aquí se pueden hibridar sondas con muestras sintéticas, esto es, oligonucleótidos, o naturales, esto es, ADNc. Here probes can hybridize with synthetic samples, ie, oligonucleotides, or natural, ie cDNA. El registro de la intensidad de la señal a diferentes temperaturas permite determinar el punto de fusión Tm del ADN. Registering the signal strength at different temperatures to determine the melting point Tm of DNA. Éste es la temperatura a la que se consigue el 50% de la intensidad máxima de señal. This is the temperature at which 50% of the maximum signal strength is achieved. Esta prueba se puede efectuar con un gran número de sondas. This test can be performed with a large number of probes.
A continuación se describe la determinación de la constante de equilibrio. Following the determination of the equilibrium constant is described. Con una concentración conocida de moléculas de la muestra analizada se puede medir la constante de velocidad de una reacción según la ley de acción de masas. With known molecules the tested concentration can be measured the rate constant of a reaction according to the law of mass action. Esto puede ocurrir en el chip con un gran número de puntos de análisis. This can occur on the chip with a large number of analysis points.
Si se conocen el punto de fusión y la constante de síntesis, la concentración de una o varias muestras analizadas en una muestra compleja se puede determinar mediante el registro de la curva de hibridación. If the melting point and constant synthesis are known, the concentration of one or more samples analyzed in a complex sample can be determined by recording the annealing curve.
La figura 5 muestra, en cada una de las figuras 5a y 5b, las condiciones de irradiación hacia un prisma como medio de reacción, representando el rayo láser con reflexión múltiple en el prisma 5 de ATR (figura 5a) bajo irradiación debida a un diodo láser 3a, y en la figura 5b la posibilidad de conseguir en la práctica una irradiación total de la superficie del prisma 5 conduciendo la irradiación de la luz, debida a la fuente de luz 3c, hacia el prisma 5 a través de una lente cilíndrica 14. 5 shows, in each of Figures 5a and 5b, the irradiation conditions to a prism as the reaction medium, representing the laser beam with multiple reflection in the prism 5 of ATR (Figure 5a) under irradiation from a diode laser 3a, and figure 5b the possibility of obtaining in practice a complete irradiation of the prism surface 5 leading the light irradiation, due to the light source 3c toward the prism 5 through a cylindrical lens 14 .
Como se puede ver, de esta manera se consigue una iluminación básicamente en toda la superficie del prisma, mientras que con la iluminación del borde del prisma 5 con un rayo láser colimado ocurre que los lados superior e inferior del prisma 5 sólo se iluminan selectivamente en puntos determinados, y no se pueden evaluar puntos de medición que no se encuentran en las zonas iluminadas. As can be seen, thus lighting is achieved basically throughout the prism surface, while the edge lighting prism 5 with a collimated laser beam occurs that the upper and lower sides of the prism 5 only selectively illuminate certain points and can not be evaluated measuring points that are not found in the illuminated areas. En cambio, si se focaliza el rayo de luz con una lente cilíndrica 14 sobre el lado del prisma 5 se consigue que el rayo de luz continúe su recorrido dentro del prisma 5 en un sentido divergente. However, if the light beam with a cylindrical lens 14 on the side of the prism 5 is achieved that the light beam continues its travel within the prism 5 in a divergent direction is focused. Después de un cierto trayecto el rayo se ha ensanchado tanto que en la práctica tenemos una iluminación homogénea de la superficie del biochip. After a certain distance the beam has widened both in practice we have a uniform illumination of the surface of the biochip.
La figura 6 muestra en representación esquemática un dispositivo para la lectura de un biochip 1, que presenta una configuración como se ha descrito en la figura 2. El biochip 1 está formado a su vez por el sustrato transparente 1a y el revestimiento de alta refracción agregado sobre el sustrato como guiaondas de luz planar 1b. Figure 6 shows in schematic representation a device for reading a biochip 1 having a configuration as described in Figure 2. The biochip 1 is formed in turn by the transparent substrate 1a and the high refractive coating added on the substrate as planar optical waveguide 1b. Los bordes 1c del biochip 1 quedan fuera de la estructura del guiaondas. The edges of the biochip 1 1c are outside the waveguide structure. El guiaondas de luz lleva un campo de puntos de medición 10 y la luz de excitación 4 se acopla en el guiaondas de luz a través de un retículo de acoplamiento 5 y se conduce en el interior de dicho guiaondas. The optical waveguide carries a field of measurement points 10 and the excitation light 4 is coupled to the optical waveguide through a grating coupler 5 and is driven in the interior of said waveguides. Los puntos de medición 10 están configurados en la forma ya explicada con ayuda de la figura 1b y de la figura 2. Para el análisis de los ácidos nucleicos del ADN en una muestra se lleva, por ejemplo, dicha muestra a la celda de flujo 6 y se pasa a través de ésta, como se indica con las flechas de flujo 6a, 6b. The measuring points 10 are configured in the manner already explained using Figure 1b and Figure 2. For the analysis of nucleic acids of DNA in a sample is, for example, said sample to the flow cell 6 and it passed through it, as indicated by the flow arrows 6a, 6b. La celda de flujo 6 se coloca impermeabilizada sobre el guiaondas de luz 1b y rodea en forma de marco, e impermeable a los líquidos, el campo de medición con los puntos de medición 10, de modo que la muestra puede interactuar con todos los puntos de medición 10 para la posible hibridación. The flow cell 6 is placed waterproofed on the optical waveguide 1b and surrounds shaped frame, and impermeable to liquids, the measurement field with the measuring points 10 so that the sample can interact with all points 10 for measuring the possible hybridization. La detección de la radiación fluorescente 7 excitada por el campo evanescente de la luz de excitación 4 tiene lugar, por ejemplo, por medio de un aparato óptico de reproducción 8 en combinación con un filtro (no representado aquí) y de un detector 9 de alta resolución local, por ejemplo, una cámara CCD o un fotomultiplicador. Detecting fluorescent radiation 7 excited by the evanescent field of the excitation light 4 takes place, for example by means of an optical reproducing apparatus 8 in combination with a filter (not shown here) and a detector 9 High local resolution, for example, a CCD camera or a photomultiplier. No obstante, la detección puede efectuarse también mediante radiación de la luz fluorescente hacia arriba, por encima del guiaondas 1b. However, detection may also be effected by radiation of the fluorescent light upwards above the waveguide 1b.
De esta manera se puede efectuar al mismo tiempo un registro " in situ " de la hibridación y una lectura paralela del biochip 1 con todos los puntos de medición 10. Al mismo tiempo se produce una excitación selectiva de los fluorocromos enlazados en los puntos de medición. In this way you can be effected at the same time a record "in situ" hybridization and parallel reading the biochip 1 with all measuring points 10. Simultaneously a selective excitation of the fluorochromes linked to the measuring points occurs . Así pues, este principio de medición permite, sin una preparación especial de las muestras, una evaluación y una detección del biochip 1 de gran exactitud y rapidez por lo que respecta a la resolución local y también por lo que respecta a la presencia de ácidos nucleicos hibridados. Thus, this measuring principle enables, without special sample preparation, evaluation and screening biochip 1 high accuracy and speed with respect to the local resolution and also with regard to the presence of nucleic acids hybridised.
Es evidente que con una disposición del análisis según la figura 6 se deberá realizar un esfuerzo adicional para el acoplamiento de la luz de excitación 4 en el guiaondas 1b (aquí a través de un retículo 5). Clearly, with a provision of analysis according to Figure 6 must make additional efforts for coupling excitation light into the waveguide 1b 4 (here through a reticle 5). De esta manera se necesitan, por una parte, pasos de preparación adicionales en la fabricación del biochip 1 y, por otra parte, dispositivos de ajuste en el posicionamiento óptico entre la fuente luminosa de excitación (fuente láser) y el biochip. Thus needed, on the one hand, additional steps in manufacturing the biochip 1 preparation and, moreover, adjustment devices in optical positioning between the excitation light source (laser source) and the biochip. El consiguiente incremento de los costes del biochip, que como material de consumo resulta problemático, se puede evitar utilizando un posicionamiento de medición y de análisis de acuerdo con la representación esquemática según la figura 4, en la cual se produce una excitación de la fluorescencia en el lado superior del guiaondas de luz 1b, por ejemplo, desde el reverso del biochip 1, y por tanto desde el lado opuesto en relación con la celda de flujo 6, pero se prevé una detección de la luz fluorescente emitida por el fluorocromo enlazado mediante acoplamiento del mismo en el guiaondas planar 1b. The resulting increase in costs biochip that consumption materials is problematic, can be avoided by using a positioning measurement and analysis according to the schematic representation according to Figure 4, in which a fluorescence excitation occurs in the upper side of the optical waveguide 1b, for example, from the back of the biochip 1, and therefore from the opposite side relative to the flow cell 6, but a detection of fluorescent light emitted by the fluorochrome bound expected by coupling thereof into the planar waveguide 1b.
Como solución alternativa, la luz de excitación emitida por una fuente de rayo láser se conduce preferiblemente a través de una unidad deflectora 14 hacia un espejo deflector 15 y desde allí hacia el guiaondas 1b en la zona del campo de medición de los puntos de medición 10, en el cual se encuentra, por ejemplo, la celda de flujo 6. Aquí tiene lugar, con un dispositivo de escáner, un movimiento relativo en dos ejes entre el rayo de luz de excitación y el biochip. As an alternative solution, the excitation light emitted from a laser beam source is preferably conducted through a deflection unit 14 to a deflecting mirror 15 and thence waveguides 1b in the measuring range of the measuring points 10 where is, for example, the flow cell 6. Here takes place with a scanner device, a relative motion in two axes between excitation light beam and the biochip. También en este caso el guiaondas planar 1b consigue una separación de fluorocromos enlazados y sueltos, pues sólo se acopla en el guiaondas planar 1b, ya continuación se detecta la luz fluorescente 7 emitida en la zona del campo evanescente de la luz de excitación 4. Los fluorocromos sueltos no producen intensidad de fondo alguna, pues esta luz no se aproxima al dispositivo de registro, sino solamente la luz fluorescente de los fluorocromos enlazados conducida en el guiaondas planar 1b. Also in this case the planar waveguide 1b achieves a separation of bound and loose fluorochromes, since only engages the planar waveguide 1b, and then the fluorescent light 7 emitted in the area of ​​the evanescent field of the excitation light is detected 4. The loose fluorochromes not produce any background intensity, as this light is not close to the recording device, only the fluorescent light of the linked fluorochromes conducted in the planar waveguide 1b. Las flechas de flujo 6a, 6b indican a su vez el flujo de muestras a través de la celda de flujo 6, mientras que el aparato óptico de reproducción 8 con filtro se representa conectado al guiaondas planar 1b, donde como detector de resolución local se utiliza un fotomultiplicador. The flow arrows 6a, 6b indicate in turn the flow of sample through the flow cell 6, while the optical reproducing apparatus 8 filter is shown connected to the planar waveguide 1b, where as detector local resolution is used a photomultiplier.
Dado que en este ejemplo de realización se tiene que realizar una lectura por filas, el biochip 1 se mueve en correspondencia en la dirección de la flecha A, tal como se indica. Since in this embodiment has to perform a read by rows, the biochip 1 moves correspondingly in the direction of arrow A, as shown.
Dado el caso también puede estar previsto, en el otro lado del guiaondas, un dispositivo de registro con equipo óptico de evaluación, filtro y fotomultiplicador para registrar la luz fluorescente que sale del guiaondas de luz 1b por el otro lado, o bien el detector puede estar acoplado directamente al borde del guiaondas de luz 1b. If necessary it can also be provided, on the other side of the waveguide, a recording device with optical equipment evaluation, filter and photomultiplier to record the fluorescent light exiting the optical waveguide 1b on the other side, or the detector can be coupled directly to the edge of the optical waveguide 1b.
Como guiaondas de luz se puede utilizar, también directamente, una placa de vidrio que forma ella misma el medio de reacción y al mismo tiempo el guiaondas de luz planar. As optical waveguide can be used, also directly, a glass plate which itself forms the reaction medium while the planar optical waveguide. En este caso se puede prescindir de un revestimiento separado de un sustrato para formar el guiaondas de luz. In this case one can do without a separate coating a substrate to form the optical waveguide.
La solución conforme a la invención permite la medición en tiempo real y la evaluación de biochips o también de otros medios de reacción en cuyo lado superior revestido de un guiaondas planar se efectúan, mediante reacción, análisis de sustancias en muestras. The solution according to the invention enables real time measurement and evaluation of biochips or also other reaction media in the top side of a planar waveguide clad are made by reaction, analysis of substances in samples.
Haciendo referencia a la figura 7 se describe a continuación otro ejemplo de realización. Referring to Figure 7 described below another embodiment.
Variando la temperatura se pueden determinar los puntos de fusión de oligonucleótidos inmovilizados, dado que se puede observar una separación o un enlace de las muestras al aumentar o reducir la temperatura, ya partir de la curva de fusión que se puede trazar con estos datos se puede determinar numéricamente el punto de fusión. Varying the temperature can be determined melting points of immobilized oligonucleotides, as can be observed a separation or link samples to increase or decrease the temperature, and from the melting curve can be drawn with this data can be numerically determine the melting point. La determinación del punto de fusión puede efectuarse al mismo tiempo para muchos oligonucleótidos en un planteamiento paralelizado en el chip. Determining the melting point can be effected simultaneously for many oligonucleotides on a parallelized approach the chip.
Para la determinación de las curvas de fusión se utilizaron, por ejemplo, oligonucleótidos cuya secuencia se corresponde con un segmento del gen de la hemocromatosis. For determining melting curves were used, for example, oligonucleotides whose sequence corresponds to a segment of the hemochromatosis gene. En este caso se probaron oligonucleótidos de diferentes longitudes y también varias sustituciones de bases en puntos diferentes. In this case oligonucleotides of different lengths and multiple base substitutions were tested at different points. Cada uno de los oligonucleótidos fabricados de forma sintética estaba provisto aquí, en el extremo 5', de un espaciador de 10 bases de timina y un enlace amino C6. Each of the oligonucleotides produced synthetically was provided here at the 5 'end, a spacer 10 thymine bases and amino bond C6. A través del grupo amino en el enlace los oligonucleótidos se acoplaron de forma covalente a portaobjetos de vidrio silanizado. Through the amino group in the link oligonucleotides they are covalently coupled to slide silanized glass. Para la detección se hibridó con un oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia (Cy5), o bien con un producto de PCR [Polymerase Chain Reaction] de pacientes de hemocromatosis, y se midió la cinética de la disociación en el lector de ATR con aumento de temperatura. For detection hybridized with an oligonucleotide complementary fluorescently labeled (Cy5), or a PCR product [Polymerase Chain Reaction] of patients with hemochromatosis, and kinetics of dissociation measured in the reader ATR temperature raising . En este caso los resultados obtenidos eran, por ejemplo, para oligonucleótidos con una longitud de 17 bases, que habían sido inmovilizados en un chip de vidrio, en una concentración de 2 \muM, y que tenían en posición central o bien la base G correspondiente al tipo salvaje In this case the results obtained were, for example, oligonucleotides with a length of 17 bases, which had been immobilized on a glass chip in a concentration of 2 \ uM, and having on central or position while the base G corresponding the wild type
(5' ATATACGTGCCAGGTGG 3'; SEQ ID NO:1), que se corresponde con la curva 1 de la figura 5, o bien la base A correspondiente al mutante (5' ATATACGTACCAGGTGG 3'; SEQ ID NO:2), que se corresponde con la curva 2 de la figura 5, fueron los siguientes puntos de fusión con hibridación con un oligonucleótido equimolar complementario con una longitud de 31 bases, a temperatura ambiente y después de un aumento de la temperatura: el oligonucleótido complementario se disociaba antes (Tm 43º) de los oligonucleótidos que contenían una base sin sentido [missense] que del oligonucleótido correspondiente al tipo salvaje (Tm 46º). (5 'ATATACGTGCCAGGTGG 3'; SEQ ID NO: 1), corresponding to the curve 1 of Figure 5, or the base A corresponding mutant (5'ATATACGTACCAGGTGG 3 '; SEQ ID NO: 2), which corresponds to the curve 2 in figure 5 were the following melting points hybridized with a complementary equimolar oligonucleotide with a length of 31 bases, at room temperature and after a temperature rise: the complementary oligonucleotide dissociated before (Tm 43º) of oligonucleotides containing a base nonsense [missense] that of the corresponding wild type oligonucleotide (Tm 46º).
La fluorescencia disminuye porque el oligonucleótido complementario marcado con fluorescencia se separa de la sonda de oligonucleótidos al aumentar la temperatura. Fluorescence decreases because the fluorescently labeled complementary oligonucleotide is separated from the oligonucleotide probe with increasing temperature.
Esto se representa en la gráfica superior de la figura 5 con la curva 1 para el oligonucleótido inmovilizado de tipo salvaje, mientras que la curva 2 muestra el oligonucleótido inmovilizado que contiene la base sin sentido y que se corresponde con el mutante. This is represented in the upper graph of Figure 5 with the curve 1 for the immobilized oligonucleotide of wild-type, while the curve 2 shows the immobilized oligonucleotide containing the base nonsense and corresponding to the mutant.
La curva 3 sirve para la medición de control y muestra la hibridación sin oligonucleótido. Curve 3 is for measuring and control sample hybridization without oligonucleotide.
La gráfica inferior de la figura 5 muestra la derivada de la fluorescencia en función del tiempo. The lower graph of Figure 5 shows the derivative of fluorescence versus time. En este caso, para una mejor visualización, se traza la derivada después del cambio de signo. In this case, for better visualization, the resulting after the change of sign is drawn.
A continuación se describe un ejemplo de realización para la determinación de la dependencia respecto de la temperatura de la constante de equilibrio de complejos proteína/proteína o proteína/ligando. An example of embodiment for determining the dependence on the temperature of the equilibrium constant for protein / protein or protein / ligand described.
El prisma se silanizó por ambos lados con un grupo aminosilano según un procedimiento conocido. The prism is silanized on both sides with an aminosilane group by a known process. Las proteínas y los ligandos que se pretendía acoplar fueron activados utilizando el procedimiento de carbodiimida-NHS, que produce grupos carboxi activados de las proteínas y los ligandos. Proteins and ligands intended coupling were activated using the carbodiimide method-NHS, producing activated carboxy groups of proteins and ligands.
Las proteínas y ligandos activados fueron aplicados sobre el prisma en disposición de alineamiento con una impresora matricial (pinprinter). Activated proteins and ligands were applied to the prism arrangement of alignment with a dot matrix printer (pinprinter). Después de la aplicación el prisma se incubó en una cámara húmeda a 37ºC durante dos horas. After application the prism incubated in a humid chamber at 37 ° C for two hours. A continuación el prisma se incubó 30 minutos a temperatura ambiente en tampón de borato de 9,5 de pH para la hidrólisis de los grupos éster que permanecían activos, ya continuación 1 hora a temperatura ambiente en 1% de BSA (w/v) en 100 mM de PBS, pH 7,4 para el bloqueo de la superficie del prisma frente al enlace no específico. Then the prism was incubated 30 minutes at room temperature in borate buffer pH 9.5 for the hydrolysis of ester groups remained active, then 1 hour at room temperature in 1% BSA (w / v) in 100 mM PBS, pH 7.4 for blocking the prism surface against nonspecific binding.
El analito (proteínas y ligandos) fue marcado con fluorescencia con el kit de marcado Cy5 (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. The analyte (proteins and ligands) was fluorescently labeled with Cy5 Labeling Kit (Pharmacia) according to the manufacturer's instructions.
A continuación se montó el prisma en el elemento detector de ATR y se lavó la celda de flujo con PBS para su posterior llenado con 1 mM de analito marcado con fluorescencia. Then the prism was mounted on the detector element and ATR flow cell was washed with PBS for subsequent filling with 1mM fluorescently labeled analyte. Una vez alcanzado el estado de equilibrio se efectuó una absorción de 30 s. After reaching steady state 30 s absorption it was made. La temperatura de la celda de flujo se elevó gradualmente a XºC por minuto. The temperature of the flow cell was gradually raised to XºC per minute. Cada X minutos se efectuaron absorciones de 30 s. Every X minutes absorptions of 30 s were made. Una vez alcanzada la temperatura deseada se cuantificaron los diferentes puntos de medición en la disposición con el software SignalseDemo (GeneScan) Para determinar la dependencia respecto de la temperatura de la constante de equilibrio se estimó en los datos de medición una función de regresión apropiada con ayuda del programa Grafit (Erithacus Software). Once reached the desired temperature different measurement points were measured in the arrangement with SignalseDemo (GeneScan) software to determine the dependence on the temperature of the equilibrium constant was estimated in the measurement data a function appropriate regression using the Grafit (Erithacus Software) program.
La figura 8 muestra el control de la temperatura de la celda de flujo. 8 shows the temperature control of the flow cell.
Para el trazado de curvas de fusión de ADN se necesita un control homogéneo de la temperatura de los híbridos sondas-muestras en la celda de flujo. For contouring DNA melting a homogeneous temperature control probes-hybrids samples in the flow cell it is needed. La unidad de control de la temperatura deberá cubrir un intervalo de temperaturas amplio, para poder medir el punto de fusión de cadenas de nucleótidos muy cortas y muy largas. The control unit temperature must cover a wide temperature range, to measure the melting point of chains very short and very long nucleotides. El intervalo de temperaturas entre 0ºC y 100ºC se puede conseguir fácilmente con una célula Peltier. The temperature range between 0 and 100 can be easily achieved with a Peltier cell. La utilización de un elemento Peltier 24 permite además una estructura muy compacta. The use of a Peltier element 24 also allows a very compact structure. La figura 8 muestra la estructura esquemática de la celda de flujo con control de temperatura. 8 shows the schematic structure of the flow cell temperature control. El biochip 20 se presiona contra la celda de flujo con un portachip 21. Una cavidad en la celda de flujo forma el volumen de reacción 25, que se impermeabiliza mediante una junta tórica 22. La cara posterior 23 de la celda de flujo se pone en contacto con un elemento Peltier 24 para el control de la temperatura. The biochip 20 is pressed against a flow cell 21. A cavity portachip in the flow cell forming the reaction volume 25, which is sealed by an O-ring 22. The rear face 23 of the flow cell is placed in contact with a Peltier element 24 for temperature control. El intercambio de calor con el entorno se efectúa mediante un bloque de cobre 26 con ventilador 27. Para la medición de la temperatura se utiliza un termómetro de resistencia 28 incorporado a la celda de flujo, y forma un circuito regulador junto con un regulador PID y el elemento Peltier 24. Heat exchange with the environment is effected by a copper block 26 with fan 27. For the temperature measurement resistance thermometer 28 incorporated in the flow cell is used, and forms a control circuit with a PID controller and the Peltier element 24.
<110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eV et al . <110> Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der Forschung eV angewandten et al.
<120> Procedimiento y dispositivo para determinar los parámetros de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes como función de la temperatura. <120> Method and device for determining the parameters of association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes formed by at least two components as a function of temperature.
<130> PCT1310-031 <130> PCT1310-031
<150> DE 100 02 566.8 <150> DE 100 02 566.8
<151> 2000-01-21 <151> 2000-01-21
<160> 2 <160> 2
<223> Descripción de la secuencia artificial: artificial sequence <223> Description of Artificial Sequence: artificial sequence
\hskip-.1em\dddseqskip \ Hskip-.1em \ dddseqskip
atatacgtgc caggtgg atatacgtgc caggtgg
\hfill \ hfill
atatacgtac caggtgg atatacgtac caggtgg
1. Procedimiento para la determinación paralela de parámetros dependientes de la temperatura, como los parámetros de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, donde los primeros componentes (12), que se encuentran en una fase líquida, se ponen en contacto con un gran número de puntos de medición (10) en un medio de reacción excitable ópticamente y formado por segundos componentes (11) que se acoplan al medio de reacción sólido y enlazan específicamente con los primeros componentes (12), y ello mediante la puesta en contacto de la fase líquida y del medio de reacción (1) en condiciones de síntesis de complejos (13) y la excitación de colorantes fluorescentes próximos a la superficie, enlazados a los primeros componentes (12) y/o segundos componentes (11), para la emisión de luz fluorescente (7) mediante luz de excitación (4) irradiada y detección de la luz fluorescente emitida en un espectro de temperat 1. Method for the parallel determination of temperature-dependent parameters, the parameters of association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes that comprise at least two components, wherein the first components (12) which are in a liquid phase, are contacted with a large number of measurement points (10) in a medium of excitable optically reaction and formed by second components (11) are coupled to the solid reaction and bind specifically to the first components (12 ), and this by contacting the liquid phase and the reaction medium (1) in terms of synthesis of complexes (13) and the excitation of near-surface fluorescent dyes bound to the first components (12) and / or second components (11), for emitting fluorescent light (7) by excitation light (4) and detecting emitted fluorescent light emitted in a spectrum of temperat uras variable, y la síntesis o la disgregación de los complejos, que incluyen primeros componentes (12) y segundos componentes (11), se observa como función de la temperatura. uras variable, and the synthesis or breakdown of the complex, which include first components (12) and second components (11), is observed as a function of temperature.
2. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los primeros y/o segundos componentes son oligopéptidos o polipéptidos. 2. Process according to one of the preceding claims, characterized in that the first and / or second components are oligopeptides or polypeptides.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los primeros y/o segundos componentes son hebras separadas de ácidos nucleicos. 3. Process according to one of the preceding claims, characterized in that the first and / or second components are nucleic acid strands separate.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la luz de excitación (4) se acopla en un guiaondas, preferiblemente de luz, por medio de un dispositivo óptico, como por ejemplo, uno o varios prismas (5; 5a). 4. Process according to one of the preceding claims, wherein the excitation light (4) is coupled into a waveguide, preferably light, through an optical device, such as one or more prisms (5; 5a).
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la luz de excitación (4) produce, mediante reflexión total (ATR) o reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) de los rayos de luz en una superficie de separación entre dos medios con distinta densidad óptica, un campo electromagnético en el medio ópticamente menos denso, donde el medio ópticamente más denso es una fase sólida y el medio ópticamente menos denso es una fase líquida, para la medición de la secuencia temporal de la reacción. 5. Process according to one of the preceding claims, wherein the excitation light (4) produced by total reflection (ATR) or total internal reflection fluorescence (TIRF) of the light rays on a surface between two media with different optical density, an electromagnetic field in the optically less dense medium, wherein the optically denser medium is a solid phase and the optically less dense medium is a liquid phase, for measurement of the time sequence of the reaction.
6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque están previstos prismas (5a) que por reflexión múltiple en los lados superior e inferior de los prismas 5a producen, por medio de un sistema óptico lineal, una iluminación plana del campo de medición. 6. Method according to claim 4 or 5, characterized in that there are provided prisms (5a) by multiple reflection on the upper and lower sides of the prisms on the 5th produce, by means of a linear optical system, a flat illumination of the measuring field.
7. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque con ayuda de la luz de excitación (4) acoplada en el guiaondas planar se produce una excitación simultánea de todos los puntos de medición (10). 7. Process according to one of the preceding claims 1 to 6, characterized in that with the aid of the excitation light (4) coupled to the planar waveguide a simultaneous excitation of all the measurement points (10) occurs.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque la luz fluorescente (7) de los segundos componentes (11), que enlazan de forma específica con los primeros componentes, (12) se conduce, por medio de un aparato óptico de reproducción que contiene preferiblemente un filtro (8a), hacia un detector (9) de resolución local, situado por encima o por debajo del biochip (o en el lado) para la lectura del biochip (1). 8. Process according to claim 5, wherein the fluorescent light (7) of the second components (11), that link specifically with the first component (12) is driven by means of an optical reproduction apparatus comprising preferably a filter (8a) to a detector (9) of local resolution, above or below the biochip (or on the side) for reading the biochip (1).
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la fase líquida se desgasifica. 9. Process according to one of the preceding claims, wherein the liquid phase is degassed.
10. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la luz fluorescente es producida por el campo evanescente de la luz de excitación, en particular luz de láser, acoplada en un guiaondas planar. 10. Method according to one of claims 1 to 9, characterized in that the fluorescent light is produced by the evanescent field of the excitation light, in particular laser light, coupled into a planar waveguide.
11. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque la luz fluorescente es producida mediante luz de excitación, en particular luz de láser, desde el entorno de un elemento óptico que soporta los puntos de medición. 11. Process according to one of the preceding claims 1 to 9, characterized in that the fluorescent light is produced by excitation light, in particular laser light, from the surroundings of an optical element which carries the measurement points.
12. Dispositivo para la determinación de parámetros dependientes de la temperatura, como el parámetro de asociación/disociación y/o la constante de equilibrio de complejos formados por al menos dos componentes, con un medio de reacción (1) cuya superficie excitable ópticamente presenta segundos componentes (11) que enlazan de forma específica con los primeros componentes (12) y que forman un gran número de puntos de medición (10) en un medio de reacción, con un dispositivo (6) para poner en contacto los primeros componentes (12) que se encuentran en la fase líquida y los segundos componentes (11), acoplados al medio reactor y enlazados de forma específica a los primeros componentes, con un dispositivo para controlar la temperatura de los puntos de medición, con una fuente de luz (3) para acoplar la luz de excitación (4) para la excitación de la emisión de luz fluorescente (7) dependiendo del enlace de los primeros componentes (12) con los segundos componentes (11) del 12. Device for determining the temperature-dependent parameters, such as parameter association / dissociation and / or the equilibrium constant of complexes formed by at least two components, with a reaction medium (1) whose optically excitable surface has second components (11) that link specifically with the first components (12) and forming a large number of measurement points (10) in a reaction medium, with a device (6) for contacting the first components (12 ) found in the liquid phase and the second components (11), coupled to the reactor means and linked specifically to the first components, with a device for controlling the temperature of the measurement points, with a light source (3 ) for coupling excitation light (4) for excitation of the fluorescent light emission (7) depending on the link of the first components (12) with the second components (11) medio de reacción (1), y con un detector (9) para registrar la luz fluorescente (7) emitida para determinar el enlace de los primeros componentes (12) con los segundos componentes (11) como función de la temperatura. reaction medium (1), and a detector (9) for recording the fluorescent light (7) emitted for determining the binding of the first component (12) with the second components (11) as a function of temperature.
13. Dispositivo según la reivindicación 12, caracterizado por dispositivos ópticos para el acoplamiento de la luz de excitación (4) en un guiaondas de luz, en particular planar. 13. Device according to claim 12, characterized by optical devices for coupling the exciting light (4) in an optical waveguide, in particular planar.
14. Dispositivo según la reivindicación 13, caracterizado porque los dispositivos ópticos son uno o varios prismas (5; 5a). 14. Device according to claim 13, wherein the optical devices are one or more prisms (5; 5a).
15. Dispositivo según la reivindicación 14, caracterizado porque el prisma o los prismas (5; 5a) están diseñados para producir una reflexión simple o múltiple de la luz. 15. Device according to claim 14, wherein the prism or the prisms (5; 5a) are designed to produce a single or multiple reflection of light.
16. Dispositivo según la reivindicación 12 ó 15, caracterizada porque la fase sólida está formada por vidrio o plástico transparente. 16. Device according to claim 12 or 15, wherein the solid phase is formed of transparent glass or plastic.
17. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 16, caracterizado por una unidad de desgasificación integrada en el dispositivo para la desgasificación de la fase líquida. 17. Device according to one of the preceding claims 12 to 16, characterized by a degassing unit integrated in the device for degassing the liquid phase.
18. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 15, caracterizado porque la temperatura del dispositivo para la puesta en contacto de los primeros componentes y segundos componentes se puede controlar, en particular calentar. 18. Device according to one of the preceding claims 12 to 15, wherein the temperature of the device for contacting the first components and second components can be controlled, in particular heat.
19. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 16, caracterizado porque el dispositivo (6) para la puesta en contacto de los primeros componentes (12) con los segundos componentes (11) es una celda de flujo, una cubeta o un recipiente de ensayo en unión hermética en la zona de los puntos de medición situada en la superficie del guiaondas planar (1b) del medio de reacción (1). 19. Device according to one of the preceding claims 12 to 16, wherein the device (6) for contacting the first components (12) with the second components (11) is a flow cell, a cuvette or a test vessel in sealed engagement in the measuring points located on the surface of the planar waveguide (1b) of the reaction medium (1).
20. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 19, caracterizado porque el medio de reacción es un biochip (1) con un guiaondas de luz planar en su lado superior, que soporta los puntos de medición (10). 20. Device according to one of the preceding claims 12 to 19, wherein the reaction medium is a biochip (1) with a planar light waveguide on its upper side, which carries the measurement points (10).
21. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 20, caracterizado porque el medio de reacción (1) es una placa de vidrio que forma ella misma el guiaondas de luz planar. 21. Device according to one of the preceding claims 12 to 20, wherein the reaction medium (1) is a glass plate which itself forms the planar optical waveguide.
22. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 21, caracterizado porque la luz de excitación (4) incide sobre el medio de reacción desde uno de sus lados, y porque la luz fluorescente (7) emitida por los fluorocromos enlazados en la superficie del guiaondas planar se acopla en la zona del campo evanescente de la luz de excitación (4) en el guiaondas planar, es conducida dentro de éste y puede ser registrada por el dispositivo de registro (8; 9) dispuesto en al menos una superficie final del guiaondas de luz planar (1). 22. Device according to one of the preceding claims 12 to 21, wherein the excitation light (4) incident on the reaction medium from one side, and in that fluorescent light (7) emitted by the fluorochromes bonded in the surface of the planar waveguide is coupled in the area of ​​the evanescent field of the excitation light (4) in the planar waveguide, is conducted within it and can be recorded by the recording device (8, 9) arranged in at least one end surface of the planar optical waveguide (1).
23. Dispositivo según la reivindicación 22, caracterizado porque el dispositivo de registro presenta un sistema óptico de reproducción (8) con un filtro (8b) así como un detector (9). 23. Device according to claim 22, wherein the recording device comprises an optical reproduction system (8) with a filter (8b) and a detector (9).
24. Dispositivo según la reivindicación 23, caracterizado porque el detector (9) es un fotomultiplicador o una cámara CCD. 24. Device according to claim 23, wherein the detector (9) is a photomultiplier or a CCD camera.
25. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 24, caracterizado porque está previsto un dispositivo de escáner para la lectura del medio de reacción (1) y porque el medio de reacción y/o la luz de excitación procedente del entorno del medio de reacción (1) se pueden mover en relación con éste en al menos un plano. 25. Device according to one of the preceding claims 12 to 24, characterized in that a scanner device for reading the reaction medium (1) and that the reaction and / or the excitation light from the environment reaction medium (1) can be moved in relation to it in at least one plane.
26. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones 12 a 25, caracterizado porque el dispositivo para la puesta en contacto de los primeros y segundos componentes se puede calentar. 26. Device according to one of claims 12 to 25, wherein the device for contacting the first and second components can be heated.
27. Dispositivo según al menos una de las reivindicaciones anteriores 12 a 26, caracterizado porque el medio de reacción soporta un guiaondas de luz, en particular planar, en cuya superficie se encuentran los puntos de medi- 27. Device according to one of the preceding claims 12 to 26, wherein the reaction medium supports an optical waveguide, in particular planar, on whose surface are measurements points
28. Dispositivo según una de las reivindicaciones 12 a 27, caracterizado porque un biochip (20) se aprieta contra una celda de flujo y porque un volumen de reacción (25), formado entre la celda de flujo y el biochip, está estanqueizado mediante una junta tórica. 28. Device according to one of claims 12 to 27, characterized in that a biochip (20) is pressed against a flow cell and because a reaction volume (25) formed between the flow cell and biochip is sealed by a O-ring.
29. Dispositivo según la reivindicación 28, caracterizado porque un elemento de control de la temperatura para el volumen de reacción está formado por un elemento Peltier (24). 29. Device according to claim 28, characterized in that a control temperature for the reaction volume is formed by a Peltier element (24).
30. Dispositivo según la reivindicación 29, caracterizado porque el elemento Peltier está en contacto con un lado posterior de la celda de flujo. 30. Device according to claim 29, characterized in that the Peltier element is in contact with a rear side of the flow cell.
31. Dispositivo según una de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizado porque unido al elemento Peltier se encuentra un cuerpo metálico conductor del calor, en particular un bloque de cobre, cuyo intercambio de calor con el entorno se puede ver influido ventajosamente mediante un elemento ventilador (27) incorporado en un momento posterior. 31. Device according to one of claims 28 to 30, characterized in that attached to the Peltier element is a conductive metal body heat, in particular a copper block, which heat exchange with the environment can be seen influenced advantageously by an element fan (27) incorporated at a later time.
32. Dispositivo según una de las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque la celda de flujo presenta un sensor de temperatura, en particular un termómetro de resistencia, que unido a un regulador, en particular un regulador PID y al elemento Peltier forma un circuito regulador. 32. Device according to one of claims 29 to 31 wherein the flow cell comprises a temperature sensor, in particular a resistance thermometer, which together with a regulator, in particular a PID controller and the Peltier element forms a regulating circuit .
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