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Timestamp: 2019-12-09 15:37:30+00:00

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Nuevas técnicas de superresolución óptica permiten la visualización de interacciones biomoleculares a escala nanométrica | Revista de la Sociedad Española de Bioquímia y Biología Molecular | SEEBM
Nuevas técnicas de superresolución óptica permiten la visualización de interacciones biomoleculares a escala nanométrica
Utilizando las antenas BNA hemos demostrado por primera vez la viabilidad de realizar antena-FCS en células vivas manteniendo de manera estable la antena cerca de la muestra y obteniendo fluctuaciones de distancia vertical por debajo de 1 nm
María Sanz Paz
ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, Barcelona, España
María F. García Parajo
ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, Barcelona, España. ICREA, Barcelona, España.
Uno de los retos actuales de la biología es entender la relación que existe entre estructura, función y dinámica de biomoléculas en su entorno natural: la célula. A pesar de grandes avances en los últimos años en el campo de la biología molecular, la visualización de interacciones moleculares en el entorno celular continúa suponiendo un desafío importante. Uno de los mejores ejemplos donde las interacciones entre distintas moléculas juegan un papel crucial es la membrana celular, un entorno altamente heterogéneo en composición, estructura y dinámica. En los últimos años se ha descubierto que los diferentes componentes de la membrana celular no funcionan de manera independiente, sino como parte de complejos altamente organizados y compuestos por una amplia variedad de moléculas. Diferentes estudios también indican la importancia de esta organización en la función celular. Sin embargo, los mecanismos moleculares que conducen a esta distribución no aleatoria de la membrana celular continúan siendo un misterio, ya que esta compartimentación se produce a escala nanométrica, un tamaño no accesible a técnicas de microscopía óptica estándar debido al límite de difracción de la luz. Este límite condiciona la microscopía óptica a una resolución espacial de alrededor de 300 nm.
MICROSCOPÍAS DE SUPERRESOLUCIÓN BASADAS EN FLUORESCENCIA
En la última década, la invención de técnicas ópticas capaces de superar el límite de difracción está revolucionando nuestra comprensión de la organización celular a escala molecular. Tanto es así que en 2014 el premio Nobel de Química le fue otorgado a los científicos que desarrollaron estas técnicas, haciendo factible su aplicación en el campo de la biología. Estas nuevas formas de microscopía de superresolución hacen uso de formas de iluminación adaptadas, en combinación con la manipulación de las propiedades fotofísicas de marcadores fluorescentes (también llamados fluoróforos).
Por ejemplo, la técnica de STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy) se basa en la desactivación de la fluorescencia utilizando el principio del agotamiento de emisión estimulada. Para ello, STED desactiva selectivamente fluoróforos en un área con forma de “donut” alrededor del foco, reduciendo efectivamente el área de iluminación y aumentando la resolución óptica hasta valores de 30 nm (Figura 1a). Alternativamente, otras técnicas basadas en la localización espacial de moléculas individuales (SMLM, Single Molecule Localization Microscopy) hacen uso de la intermitencia (on-off ) de la fluorescencia para activar de manera estocástica un subgrupo de fluoróforos. De esta manera, la distancia de separación entre fluoróforos es mayor que el límite de difracción, lo que permite su localización con una precisión de 10-30 nm. Tras miles de iteraciones de este procedimiento activando diferentes subpoblaciones de moléculas cada vez, la imagen se reconstruye utilizando algoritmos computacionales (Figura 1b). Dos técnicas destacan dentro de este grupo de microscopía de localización: STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) en el caso de que se utilicen fluoróforos para el marcado, y PALM (Photoactivated Localization Microscopy) cuando se usan proteínas autofluorescentes.
Un ejemplo de la extraordinaria resolución obtenida con este tipo de técnicas se muestra en la Figura 1c. Utilizando STORM hemos podido visualizar por primera vez la organización espacial de la cromatina en el núcleo de células intactas, y hemos descubierto que esta organización está directamente correlacionada con el nivel de diferenciación celular. Existen muchísimos otros ejemplos en la literatura y es razonable pensar que la microscopía de superresolución se convertirá muy pronto en una técnica de uso cotidiano en la gran mayoría de laboratorios de biología.
MICROSCOPÍAS DE SUPERRESOLUCIÓN BASADAS EN ANTENAS FOTÓNICAS
Una manera alternativa de reducir el volumen de iluminación y por tanto de incrementar la resolución espacial es haciendo uso de antenas fotónicas. Este tipo de nanoestructuras metálicas convierten la radiación óptica propagada en energía localizada, y viceversa, en analogía con las antenas de radio que todos conocemos, pero en el rango de frecuencias ópticas. Como tales, permiten el control y la manipulación de campos ópticos a escala nanométrica, teniendo enorme potencial para aplicaciones de detección e imagen.
Uno de los mejores ejemplos de una antena fotónica consiste básicamente en una nanoapertura (50–100 nm de diámetro) fabricada en el extremo de una fibra óptica cónica y recubierta de metal. De hecho, la microscopia óptica de campo cercano (NSOM, Near-field Scanning Optical Microscopy) hace uso de este tipo de antenas fotónicas. La sonda ilumina localmente la muestra utilizando un campo eléctrico evanescente. En el caso de que la muestra esté marcada fluorescentemente, los fluoróforos son iluminados por la nanoapertura y la emisión de la fluorescencia es recogida a través de un objetivo y llevada al detector. Finalmente, la imagen de superresolución es generada rastreando la muestra con respecto a la nanoapertura. La resolución lateral está esencialmente determinada por el tamaño de la apertura, en la práctica entre 70-100 nm. A pesar de proporcionar una resolución sensiblemente mayor a la de la microscopía de fluorescencia convencional, la luz emitida por estas nanoaperturas se reduce drásticamente con el diámetro de las mismas, por lo que en la práctica resoluciones ópticas superiores a 50 nm son difíciles de lograr.
En los últimos años, se han estado explorando diseños de antenas fotónicas más creativos que utilizan nanopartículas metálicas o nanoestructuras geométricas complejas para amplificar y localizar el campo óptico a dimensiones nanométricas y permitir ajustar sus propiedades a aplicaciones concretas. Estas nanoestructuras pueden ser fabricadas en el extremo de una fibra óptica (Figura 2a-c) o directamente sobre sustratos de vidrio (Figura 2d-e).
Las antenas fabricadas en el extremo de fibra ópticas son ideales para su aplicación en microscopía de superresolución ya que son compatibles con la técnica de NSOM. Por ejemplo, en nuestro grupo hemos utilizado antenas monopolo (Figura 2a) para estudiar la organización espacial de distintos receptores de la membrana celular. Con ello descubrimos que receptores de membrana involucrados en el proceso de adhesión celular forman nanodominios con tamaños de aproximadamente 50 nm en diámetro, y compuestos de 6-10 receptores/nanodominio. La organización de receptores en nanodominios permite a la célula incrementar la avidez para interaccionar con ligandos específicos y de esta manera regular eficientemente el proceso de adhesión o migración celular.
Otro tipo de antenas fotónicas incluye las denominadas “bowtie” (BNA, bowtie nanoaperture antenna), que proporcionan un diseño más robusto y alternativo a las antenas monopolo. Estas nano-estructuras consisten en dos aperturas triangulares orientadas de punta a punta y separadas por un pequeño espacio de apertura en donde el campo eléctrico se encuentra confinado. Pueden ser fabricadas directamente en el extremo de fibras ópticas (Figura 2b) o alternativamente en sustratos de vidrio (Figura 2d). Este tipo de antenas son especialmente interesantes para aplicaciones de fluorescencia multicolor pues tienen una respuesta de banda ancha, es decir, la localización del campo eléctrico es similar para diferentes longitudes de onda. Desafortunadamente, la amplificación de la señal óptica es relativamente modesta. Para solventar este inconveniente, y al mismo tiempo aprovechar las ventajas de las antenas BNA, recientemente hemos conseguido fabricar un tipo de antenas híbridas (Figura 2c) que combinan la ultra localización de las antenas monopolo con la banda ancha de las BNAs, y proporcionan una magnificación de la señal óptica de 100 veces. Haciendo uso de antenas híbridas hemos podido resolver moléculas individuales en dos colores simultáneamente, con una resolución óptica real de 20 nm y una precisión de localización extraordinaria de 0,2 nm (Figura 3a-b). Aunque su fabricación es elaborada y la técnica de NSOM continúa siendo compleja, este tipo de antenas híbridas podrían encontrar aplicaciones en el estudio de mecanismos moleculares en células intactas con un nivel de precisión muy superior a las técnicas de superresolución basadas en fluorescencia.
DETECCIÓN DE PROCESOS DINÁMICOS EN CÉLULAS VIVAS A ESCALA NANOMÉTRICA
Una de las grandes ventajas de la microscopía óptica es la posibilidad de obtener imágenes de células vivas y visualizar procesos dinámicos. Desafortunadamente, cuando pensamos por ejemplo en proteínas individuales o lípidos, su difusión y/o grado de interacción son muy rápidos y la microscopía de imagen no dispone de suficiente resolución temporal para visualizar estos eventos en tiempo real. Es por ello que en los últimos años se han desarrollado diferentes tipos de técnicas alternativas que permiten ganar mayor información sobre los procesos dinámicos en células y que no requieren la formación de imágenes. Una técnica que proporciona gran resolución temporal es la FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy), que se basa en mantener el punto de iluminación estacionario en una región específica de la muestra y registrar la fluorescencia detectada en función del tiempo. Las fluctuaciones de intensidad resultantes de la difusión de componentes individuales que transitan por el volumen de iluminación se registran y se autocorrelacionan temporalmente para proporcionar información sobre su difusión. Esta técnica es comúnmente implementada utilizando una iluminación que es confocal con la detección y proporciona una resolución temporal de microsegundos. Sin embargo, debido al limite de difracción de la luz, los valores de difusión obtenidos son el resultado de un promedio de numerosos eventos individuales que ocurren en el volumen de excitación. Recientemente, la STED se ha combinado con la FCS para detectar la difusión de moléculas en regiones nanoscópicas, como es el caso de lípidos o proteínas en la membrana de células vivas. Una de las principales ventajas de STED es que permite variar el área de iluminación efectiva al cambiar la potencia del láser, proporcionando un fácil acceso a los coeficientes de difusión para diferentes áreas de observación. Sin embargo, la STED-FCS posee varios inconvenientes, tales como la alta potencia del láser requerida, que produce fototoxicidad en las células, la dificultad de extender la técnica a múltiples colores y una resolución axial todavía limitada por difracción.
En principio, todas estas limitaciones pueden superarse mediante antenas fotónicas, ya sea fabricadas sobre sustratos de vidrio o en el extremo de las sondas NSOM. Uno de nuestros primeros diseños ha consistido en una plataforma 2D denominada “antenna-in-box” (Figura 2e). El diseño consiste en dímeros de oro separados por una pequeña distancia entre sí y colocados en el interior de nano-aperturas rectangulares. El efecto antena de amplificación y ultra enfoque se consigue en la zona de separación de los dímeros (también denominada la región “gap”). Al mismo tiempo, la nanoapertura rectangular favorece la discriminación de la señal óptica pues permite la detección de la fluorescencia exclusivamente en la zona donde el dímero esta posicionado y bloquea cualquier otra señal del entorno. Usando estas antenas, alcanzamos valores de aumento de fluorescencia de hasta 104 veces. Además, es posible variar el área de iluminación variando el tamaño del “gap”, por lo que podemos seguir un procedimiento similar al anteriormente descrito para STED-FCS a la hora de analizar el tipo de difusión de las moléculas. El gran aumento de la fluorescencia y el volumen de detección ultraconfinado hacen que este tipo de dispositivos de antenas fotónicas sean ideales para el análisis de biomoléculas individuales en concentraciones micromolares, comparado con las concentraciones del orden de nanomolar o picomolar que son necesarias utilizando la configuración confocal.
Recientemente, hemos utilizado este tipo de antenas para estudiar la difusión de distintos tipos de lípidos en la membrana de células vivas. Haciendo uso de antenas con diferentes tamaños de “gap”, hemos podido demostrar por primera vez la existencia de dominios lipídicos enriquecidos en colesterol con tamaños de tan solo 10 nm en diámetro y con un tiempo de vida del orden de cientos de microsegundos. La existencia de estos nanodominios en células vivas ha sido un punto de controversia durante mas de 20 años, pues nunca antes habían sido observados. Utilizando el ultra-confinamiento de la luz de nuestras antenas con dimensiones de 10 nm, hemos demostrado definitivamente la existencia de estos nanodominios enriquecidos en colesterol, no sólo en membranas miméticas, sino también en células vivas.
Uno de los inconvenientes potenciales de las antenas fotónicas fabricadas en sustratos es la posibilidad de inducir artefactos en la membrana celular debido a la proximidad con la antena. Una forma alternativa de solventar este problema es haciendo uso de antenas fotónicas fabricadas en el extremo de fibras ópticas. En esta configuración, la sonda se mantiene estacionaria sobre la superficie de la muestra, en lugar de rastrearla para producir una imagen, y las fluctuaciones de intensidad que surgen de las moléculas difusoras se registran en el campo lejano utilizando la óptica convencional. Utilizando las antenas BNA descritas en el apartado anterior, hemos demostrado por primera vez la viabilidad de realizar antena-FCS en células vivas manteniendo de manera estable la antena cerca de la muestra y obteniendo fluctuaciones de distancia vertical por debajo de 1 nm. Las aplicaciones de esta técnica son similares a las obtenidas con las antenas fabricadas sobre sustratos de vidrio, e incluyen el estudio de nanodominios en la membrana celular.
Tal y como comentamos en el apartado anterior, otra ventaja de las antenas BNA es su emisión de banda ancha, lo que permite la excitación multicolor y la espectroscopía de correlación cruzada (FCCS; Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy) de dos colores en volúmenes ultra pequeños. En este contexto, recientemente hemos demostrado la viabilidad de antena-FCCS en la detección de nanodominios de receptores captadores de patógenos. Este tipo de medidas demuestran la idoneidad de estas antenas para el estudio de procesos dinámicos y abren la puerta al estudio de interacciones moleculares dinámicas en el contexto heterogéneo y complejo de la membrana celular.
En este artículo, hemos destacado resultados en los que las antenas fotónicas se han utilizado en aplicaciones biológicas, tanto a nivel de imagen como en la detección de eventos dinámicos en células vivas. Combinando la resolución temporal de FCS con los volúmenes de iluminación ultra confinados proporcionados por las antenas fotónicas, hoy en día es posible realizar mediciones de dinámica ultra rápida a escala nanométrica en membranas de células vivas.
Las antenas fotónicas fabricadas en el extremo de fibras ópticas requieren un equipo específico (NSOM o AFM) para manipular y colocar la antena en proximidad con la muestra. Este método proporciona la flexibilidad de colocar la antena en la ubicación deseada, al contrario que en las geometrías 2D. Sin embargo, estas configuraciones de antena requieren altas habilidades técnicas para la manipulación de la sonda. Además, el control preciso de la separación entre la sonda y la muestra es imprescindible para evitar interacciones no deseadas entre las antenas y la membrana. Por otra parte, las antenas fotónicas 2D son mucho más fáciles de manejar y pueden fabricarse en diferentes tamaños en el mismo sustrato, permitiendo el acceso a regiones nanométricas de la célula.
En general, creemos que la combinación de nanoantenas con microscopía de fluorescencia tiene un gran potencial para investigar la organización, la dinámica y la interacción de proteínas y lípidos, así como para visualizar su reclutamiento en nanodominios en la membrana celular. Las técnicas propuestas son totalmente compatibles con estudios en células vivas y abren nuevas oportunidades de investigación en biofísica en las que se necesite una alta resolución tanto espacial como temporal.
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References: resolución 
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