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Timestamp: 2020-06-05 13:58:56+00:00

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Manual de Practicas Bioquimica Medica Laboratorio MED 261L | Hipótesis | Mole (Unidad)
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APUNTES DEL MODELO SISTEMICO.pptx
Ejercicios Resueltos de Moles Quimica 30jul17
El Método Científico es una serie ordenada de pasos a seguir para la resolución de un problema determinado
Versión Original: Martha C. Yépez 1era Edición (2008): Martha C. Yépez, Manuel E. Baldeon. 2da Edición (2010): Martha C, Yépez, Sara Cifuentes. 3ra Edición (2011), 4ta Edición (2013), 5ta Edición (2015): Martha C. Yépez 6ta Edición (2016): Martha C. Yépez 7ma Edición (2017): Martha C. Yepez
Misión del Colegio El Colegio de Ciencias de la Salud tiene como misión preparar a profesionales en las diferentes ramas de la salud con una educación formal en las Humanidades y Artes Liberales asociada a la excelencia en formación académica en Medicina, Veterinaria, Optometría y Odontología, con el objeto de entregar a la sociedad profesionales completos, íntegros y dotados de pensamiento crítico, moldeados por un grupo selecto de profesores de cuarto nivel y superior calidad y calidez humanas.
BIOQUÍMICA MÉDICA LABORATORIO (MED 0261L)
Semestre: 201620 – Segundo Semestre 2016-2017
Docente: Martha Yépez, B.S., MSc. Aula: HDLV-Laboratorio de Docencia
Lunes Grupo 1 (3522) Martes Grupo 2 (3523) Miércoles Grupo 3 (3524) Jueves Grupo 4 (3525) Lunes Grupo 5 (4168) Miercoles Grupo 6 (4169) Martes Grupo 7 (4170) Jueves Grupo 8 (4171)
14h30 – 15h50; 14h00 – 15h20; 14h30 – 15h50; 14h00 – 15h20; 13h00 - 14h20; 13h00 - 14h20; 15h30 - 16h50; 15h30 - 16h50
Créditos: MED261L 1 Requisitos: QUI 122; QUI 215 o MED 0123; MED 0217 Horas de oficina: previa con profesor. Oficina: HDLV 155 (Hospital de los Valles) Correo Electrónico: myepez@usfq.edu.ec
INTRODUCCIÓN: Indicaciones generales La clase de Bioquímica Médica, explica los procesos bioquímicos del metabolismo de los nutrientes a nivel celular y sistémico en el ser humano. Explicando detalladamente la clasificación, estructura, función, síntesis y degradación de macro y micromoléculas como grasa, carbohidratos, proteínas, minerales, vitaminas y agua.
El curso de Bioquímica Medica laboratorio, contiene una parte de práctica experimental donde se aborda la temática presentada en la clase teórica, se introduce al alumno en el trabajo del Laboratorio como una ayuda diagnóstica, terapéutica, como también de pronóstico o ayuda predictiva en pacientes determinados.
La clase se desarrolla en un ambiente cordial, de respeto a la individualidad de cada persona, manteniendo un apropiado nivel de comunicación entre alumnos y entre alumno y docente.
 Promover la obtención de los elementos que favorezcan la comprensión de los mecanismos en situaciones de salud y en los procesos patológicos.
 Facilitar la adquisición de destrezas y habilidades en los procesos de investigación y desarrollo.
 Introducir al alumno en el trabajo de Laboratorio como una ayuda diagnóstica.
OBJETIVOS ESPECIFICOS DEL CURSO De conocimiento
1. Obtener los conocimientos básicos para comprender los mecanismos bioquímicos
en los procesos de salud y enfermedad.
1. Estimular a los estudiantes a investigar con profundidad los temas a tratar.
1 Evaluar la formación de estudiantes con capacidad de autoformación promoviendo la pasión por aprender.
2 Desarrollar habilidades de comunicación, pensamiento crítico, y de resolución de problemas.
RESULTADOS DE APRENDIZAJE DE LA CARRERA A LOS QUE CONSTRIBUYE EL CURSO
 Análisis y Diagnóstico: Realizar el análisis y diagnóstico para brindar una atención centrada en el paciente, de calidad y de calidez, para la promoción de su salud, prevención de enfermedades y/o complicaciones de los eventos sanitarios emergentes y relevantes a lo largo de los ciclos de vida del ser humano, con un enfoque familiar y comunitario.
 Aplicación de ciencias básicas de la carrera: Aplicar en diferentes escenarios de atención, la integración del conocimiento mejor fundamentado y del conocimiento en continuo desarrollo de las ciencias biomédicas, clínicas y psicosociales para la resolución de problemas y cuidado de la salud del paciente, su familia y comunidad.
 Utilización de Herramientas especializadas: Desarrollar las destrezas y habilidades para manejar recursos físicos, financieros, equipo médico, electrónicos e informáticos como herramientas e instrumentos para el análisis, diagnóstico, formulación de propuestas, monitoreo y evaluación y comunicación efectiva que respondan al desarrollo de la práctica profesional.
RESULTADOS DE APRENDIZAJE ESPECÍFICOS DEL CURSO
Explicar el funcionamiento de equipos y reactivos para determinaciones bioquímicas mediante su utilización en las diferentes prácticas de laboratorio.
Relacionar los mecanismos bioquímicos de los procesos de salud con la enfermedad, aplicando las técnicas bioquímicas de diagnóstico en diferentes escenarios.
Demostrar destrezas en la práctica de la Bioquímica Médica examinando el manejo de los equipos, los protocolos de diagnóstico y el proceso de generación de informes científicos.
Desarrollar habilidades de investigación examinando los diferentes usos de las técnicas estudiadas.
Maximizar el autoaprendizaje mediante la resolución de problemas planteados con anticipación a cada uno de los laboratorios.
Demostrar un trabajo grupal responsable construyendo actitudes positivas que mejoren el desempeño del equipo de trabajo.
En medicina los descubrimientos en las ciencias básicas como fisiología, inmunología, microbiología, bioquímica permiten ahora una mejor comprensión de los procesos fisiológicos y también de los patológicos. Estos importantes avances nos permiten prevenir enfermedades y tratarlas de manera racional en caso de ocurrencia. Por tanto, los estudiantes en las ciencias médicas deben saber que para comprender los fenómenos patológicos y del funcionamiento normal de los organismos vivos, se requiere de un conocimiento profundo de las ciencias básicas.
La bioquímica – la ciencia que estudia las moléculas en los organismos vivos y sus reacciones químicas- está en el centro de desarrollo de las ciencias básicas. Así, podemos indicar que la bioquímica está encargada de describir y explicar en términos moleculares todos los procesos biológicos de los organismos vivos. Los nuevos avances en el campo médico se fundamentan en la mejor comprensión de los procesos bioquímicos del organismo.
Los países en vías de desarrollo se encuentran experimentando cambios en el perfil epidemiológico de las enfermedades más prevalentes. Hace menos de dos décadas la incidencia y prevalencia de enfermedades por infecciones y desnutrición constituían los problemas de salud más frecuentes en nuestro país. Sin embargo, en los últimos años, además de los problemas infecciosos y de desnutrición nuestros países están experimentando una alta incidencia de enfermedades asociadas con el exceso de peso. Así, las principales causas de morbilidad y mortalidad en el Ecuador y el mundo están asociadas con problemas de malnutrición. Como ejemplo podemos indicar que los problemas cardiovasculares, la diabetes tipo 2, el cáncer, las infecciones son primeras causas de enfermedad y de muerte. Es importante anotar por tanto que la malnutrición por déficit (desnutrición) así como por exceso (obesidad) son causa de las patologías más comunes. Los estudiantes de las ciencias médicas deben estudiar e investigar sobre estos problemas de salud a nivel comunitario, clínico individual, y básico celular y molecular.
La clase MED261, Bioquímica Medica, estudia los procesos bioquímicos del metabolismo de los nutrientes del ser humano a nivel celular y sistémico. Con este propósito se estudia la clasificación, estructura, función, síntesis, degradación, de las moléculas de grasa, carbohidratos, proteínas, minerales, vitaminas y agua. Además se estudian los mecanismos de control de estos fenómenos bioquímicos (bioquímica de las hormonas, neurotransmisores). Otros aspectos de la bioquímica como biología molecular, biología celular y transducción de señales se estudian en la clase BTC340, Biología Molecular.
Uno de los objetivos más importantes de esta clase es ser ejemplo de la actividad académica rigurosa. La clase está diseñada para estimular a los estudiantes a investigar los temas que se verán en clase con mayor profundidad. Con el trabajo en la clase los estudiantes desarrollaran habilidades de comunicación, pensamiento crítico, y de
resolución de problemas. Esta clase pretende además ayudar a los estudiantes a distinguir entre educación y entrenamiento, y dar valor a ambos. El éxito del curso se medirá en la motivación y en la formación de estudiantes críticos, con capacidad de auto formación en los que siempre exista la pasión por aprender.
En concordancia con los aspectos referidos anteriormente, este curso procura que el estudiante obtenga los elementos básicos para favorecer la comprensión de los mecanismos íntimos de procesos patológicos y situaciones de salud, centrando la educación en el estudiante, facilitando la adquisición de habilidades y destrezas de aprendizaje.
METODOLOGÍA Las actividades de la clase de laboratorio MED261L son obligatorias y están diseñadas para desarrollar en los estudiantes hábitos que les faciliten su auto formación. Estas actividades incluyen:
1 Clase de laboratorio, en la que se expondrán y discutirán los conceptos básicos
tratados en las clases teóricas de Bioquímica MED261. El estudiante debe llegar a la Práctica leyendo anticipadamente los temas a tratarse durante clase.
2 Prácticas de laboratorio, en las que experimentalmente se abordarán los temas
presentados en las clases teóricas. Estas prácticas permiten a los estudiantes utilizar el método científico en la realización de los procesos de experimentación, en la obtención de resultados y en la discusión e interpretación de los mismos. Por otro lado las prácticas de
laboratorio introducirán al estudiante en el trabajo del laboratorio clínico como ayuda diagnóstica.
3 Resolución de cuestionarios guías y consultas relacionados con las clases
magistrales y las prácticas de laboratorio. En lo posible se discutirá la literatura más reciente sobre el tema a tratarse (reporte de investigaciones originales o artículos de revisión). En la clase MED261L se seguirá estrictamente el Código de Honor de la USFQ. Por lo tanto, los estudiantes deberán honrar dicho Código durante las clases, prácticas de laboratorio, deberes y exámenes. La asistencia es obligatoria, en caso de falta se deberá
justificar en forma escrita. La falta no justificada se registrara como inasistencia que penalizara la nota semanal (evaluación, informe) y por tanto la nota final.
4 La evaluación constituye parte del aprendizaje, por tanto será uno de los pilares
fundamentales durante cada clase, la evaluación será constante tanto formal como informal, caracterizándose esta última por un apoyo constante con retroalimentación
continua entre los alumnos y el docente.
En las clases MED261 y MED261L se seguirá estrictamente el Código de Honor de la USFQ. Por lo tanto, los estudiantes deberán honrar dicho Código en las clases, deberes, laboratorios y exámenes. La asistencia es obligatoria, en caso de falta se deberá justificar en forma escrita. La falta no justificada se penalizará quitando puntos al examen final.
 Manual de Laboratorio. Bioquímica Médica. 2016-2017. Versión 2.
 Stryer, L. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. 7ma ed. W. Freeman and Company, 2012; Text Book of Biochemistry with clinical correlations 5 th edition by Thomas M. Devlin, 2002 ISBN: 0-471-41136-1 (www.wiley.com/devlin); Medical Biochemistry Course (http://web.indstate.edu/thcme/mwking/home.html)
 Nelson, David et al. Lehninger. Principios de Bioquímica. 6ta ed. Freeman and Company, 2013. ISBN: 978-84-282-1603-6
 Murray RK, et al. Harper. Bioquímica Ilustrada 28 va ed., Murray RK, et al., Manual Moderno, 2010. ISBN: 9781615023097
 Cursos CRASH. Lo esencial del Metabolismo. 4 ta ed, 2013. ISBN: 978-84-9022-416-8
 Yépez, R. Bonilla, A. Cuadernos Didácticos de Bioquímica. SECIAN 2013-2014
Además se cuenta con el recurso electrónico:
 King, Michael W. (ND) The Medical Biochemestry Page. Disponible en Internet desde: http://themedicalbiochemistrypage.org/
“El "CODIGO DE HONOR" como miembro de la USFQ, compromete a cada uno de los docentes y estudiantes a cumplirlo de manera estricta, cualquier infracción al mismo por parte de un miembro de la comunidad será sancionada por la autoridad correspondiente, los estudiantes tendrán derecho a que se analice y defienda su caso en la Corte de Honor.
El Código de Honor “Yo como miembro de la USFQ me comprometo a:
1. Conducirme de tal manera que no debilite en ninguna forma las oportunidades de realización personal y profesional de otras personas dentro de la Comunidad Universitaria. Entre otras acciones, evitaré la calumnia, la mentira, la codicia, la envidia, y promoveré la bondad, el reconocimiento, la felicidad, la amistad, la solidaridad y la verdad.
Ser honesto: no copiar, plagiar, mentir, ni robar en ninguna forma. Firmar todo trabajo académico como constancia de cumplimiento del Código de Honor, de que
no he recibido ayuda ni he copiado de fuentes no permitidas. Mantener en reserva pruebas, exámenes y toda información confidencial, sin divulgarla.
3. Respetar a todos los miembros de la comunidad universitaria y cuidar todo el campus, su infraestructura y equipamiento.
4. No difamar
5. Denunciar al Decanato de Estudiantes toda acción de irrespeto al Código de Honor por parte de cualquier miembro. Cooperar con la Corte de Honor para aclarar cualquier investigación y violación de este Código.
Cualquier infracción a este código por parte de un miembro de la comunidad USFQ será sancionada por la autoridad correspondiente. Los estudiantes tendrán derecho a que se analice y defienda su caso en la Corte de Honor.
El curso está dividido en Prácticas con los siguientes temas a tratarse:
Introducción al Método Científico, Diagnóstico por el Laboratorio, Técnicas de laboratorio GRUPOS 1, 2, 3, 4: 16 - 19 ENERO GRUPOS 5, 6, 7, 8: 23 - 26 ENERO
Determinación de Hemoglobina, manejo de medidas de tendencia central y de desviación GRUPOS 1, 2, 3, 4: 12 - 16 FEBRERO GRUPOS 5, 6, 7, 8: 20 - 23 FEBRERO
GRUPOS 1, 2, 3, 4: 30 ENE – 02 FEB GRUPOS 5, 6, 7, 8: 06 – 09 FEBRERO
Determinación de Glucosa. Cinética enzimática
Determinación de Proteínas / Albumina / PCR
GRUPOS 1, 2, 3, 4: 06 – 09 MARZO GRUPOS 5, 6, 7, 8: 13 – 16 MARZO
GRUPOS 1, 2, 3, 4: 20 – 23 MARZO GRUPOS 5, 6, 7, 8: 27 – 30 MARZO
GRUPOS 1, 2, 3, 4: 03 – 06 ABRIL GRUPOS 5, 6, 7, 8: 17 – 20 ABRIL
EVALUACIONES FINALES :
Determinación Transaminasas SGOT / SGPT
Teórica FINAL
GRUPOS 1, 2, 3, 4: 24 - 27 ABRIL GRUPOS 5, 6, 7, 8: 17 – 20 ABRIL
GRUPOS TODOS: 24 - 27 ABRIL
SABADO 06 MAY0
Fechas de exámenes y pruebas parciales de las prácticas de laboratorio Previo a cada Práctica de laboratorio se evaluara a través de la plataforma D2L, sobre el tema a tratarse en la práctica y/o sobre la consulta enviada como deber en la práctica anterior en caso de que lo hubiera. La evaluación final se realizará la última semana de clase e incluye la materia comprendida durante el semestre.
Importante: Los estudiantes deberán tomar en cuenta en su esquema de estudio regular que las fechas de pruebas y exámenes no pueden cambiarse.
PRECAUCIONES EN EL LABORATORIO Los análisis de laboratorio son una ayuda indispensable en la práctica clínica. El conocimiento sobre recolección de muestras, su análisis e interpretación de resultados permitirán a los estudiantes apreciar los beneficios y limitaciones de los datos del laboratorio. Enfatizamos que el laboratorio es una ayuda diagnostica que debe analizarse en el contexto de la sintomatología clínica.
En general el trabajo en el laboratorio no representa riesgos para la salud de las personas, siempre y cuando se siguen las normas de trabajo para evitar accidentes. Existen condiciones individuales como embarazo, enfermedades pulmonares, enfermedades hepáticas crónicas, estados de inmunosupresión, que pueden hacernos vulnerables cuando trabajamos en el laboratorio y debemos tomarlas en cuenta antes de iniciar nuestro trabajo. Si algún estudiante sospechara que tiene riesgo de trabajar en el laboratorio debe informar inmediatamente de su condición a la persona responsable del laboratorio. Debido a que en el trabajo de laboratorio se utilizan sustancias químicas y agentes infecciosos, es necesario conocer cómo manejarlos. El contacto de piel y mucosas con reactivos de laboratorio y con fluidos orgánicos debe en general ser evitada. Muchos compuestos son volátiles, aumentando así la posibilidad de exposición. Para utilizar en la mejor forma las prácticas de laboratorio en el aprendizaje de los temas de la clase de Bioquímica y disminuir al máximo los posibles riesgos se han establecido recomendaciones y normas de trabajo que se detallan a continuación.
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE BIOQUIMICA
1. Concurrir al laboratorio conociendo la guía de trabajo práctico pertinente y sus fundamentos teóricos. Observar si se presentan recomendaciones particulares para considerar durante el desarrollo del trabajo práctico.
2. Utilizar mandil.
3. Utilizar guantes de látex cada vez que se utilicen fluidos orgánicos (muestras de sangre, suero u orina). Al finalizar la práctica, higienizarse con agua y jabón e hipoclorito al 0.1%, desechar los guantes y lavarse las manos.
4. No utilizar pipetas con la boca para medir sustancias en el laboratorio.
5. No colocar sus pertenencias (ropa, libros, etc.) sobre las mesas de trabajo.
6. Mantener el lugar de trabajo limpio, ordenado y seco.
7. Seguir estrictamente las indicaciones del docente y de la guía de trabajo práctico al realizar el trabajo.
8. Trabajar con calma en su sitio, evitando movimientos bruscos.
9. Comunicar al docente cualquier anomalía o accidente que surja durante la práctica.
10. No retirar de la mesa los frascos de reactivos sin previa autorización.
11. Mantener los envases de reactivos tapados. Esta precaución es fundamental para sustancias inflamables, giroscópicas y carbonatables.
Utilizar una pipeta para cada reactivo y para cada muestra, así evitamos contaminaciones.
13. Durante el trabajo de laboratorio evitar llevarse las manos a la boca y/o a los ojos.
14. Al terminar la práctica, desechar el material utilizado según indique el docente.
15. Cuando se utilicen solventes inflamables verificar que no haya mecheros encendidos.
16. Identificar las salidas de la clase y del edificio. En caso de evacuación salir caminando, sin correr y seguir estrictamente las indicaciones de la persona responsable del laboratorio.
17. Ubicar los extinguidores de fuego y aprender a utilizarlos.
18. Ubicar las duchas para lavarse los ojos y mucosas y saber cómo utilizarlos.
19. No consumir alimentos de ningún tipo durante la práctica de laboratorio.
UNIVERSIDAD SAN FRANCISCO DE QUITO Laboratorio de Bioquímica Médica
Los Informes, Deberes y Consultas se recibirán únicamente en la página de D2L correspondiente a la clase de Bioquímica Medica Laboratorio, en la cual se indica la hora y fecha de entrega, se calificaran sobre 100 (10 puntos), se dará una segunda oportunidad de entrega como fecha máxima sobre 80 (8puntos) tomando en cuenta los siguientes criterios:
1. TEMA: Título de la práctica
2. OBJETIVOS (10 puntos): Indicar los objetivos propios que el estudiante que se obtendrán con la realización de la práctica.
3. INTRODUCCION (20 puntos): Describir en forma breve el tema tratado en la práctica, debe incluirse referencias bibliográficas actualizadas.
4. RESULTADOS (20 puntos): Los resultados obtenidos en la práctica deben ser reportados en tablas, incluyendo los cálculos ye información estadística y gráficos en caso de ser solicitado.
5. DISCUSIÓN (40 puntos): La discusión comprende el análisis de los resultados obtenidos en la práctica, relacionándolo con los valores de referencia, debe respaldarse con bibliografía actualizada; valores de referencia – 10 puntos.
6. BIBLIOGRAFÍA (10 puntos): La bibliografía utilizada debe de preferencia ser de libros, libros electrónicos, artículos científicos sujetos a edición especializada. El presente manual de la materia de Bioquímica Medica Laboratorio no debe ser considerado como parte de la bibliografía
7. El documento del informe debe tener una extensión no mayor a cuatro páginas (no manuscritas).
CONSULTAS (100 puntos). Se entrega cada semana en carpeta correspondiente, se tomara en cuenta bibliografía reciente de investigaciones originales o artículos de revisión.
PRÁCTICA N o 1
Objetivos Que el alumno pueda:
1. Realizar informes teóricos basados en el Método Científico
2. Realizar informes de laboratorio basados en el Método Científico.
A que se llama método científico? Cuál es su estructura? Cómo y en qué circunstancias los
científicos se valen de él? Son algunos de los interrogantes que desde la perspectiva epistemológica del positivismo lógico iremos respondiendo. Cabe plantearnos primeramente, una distinción que consideramos básica, a fin de evitar equívocos cuando utilicemos la palabra ¨método¨. Esta palabra proviene de las palabras griegas metá que significa hacia y odó cuyo significado es camino. Por lo tanto, podríamos decir que el método es el camino que nos conduce hacia un fin. Sin embargo, el riesgo de una traducción literal como la indicada puede darnos una idea errónea de lo que es un método general y en especial de la ciencia, confundiendo un procedimiento general (que en nuestro caso es el método científico) con los procedimiento particulares que se suelen seguir para resolver una situación concreta.
Ejemplo: Imagina que te encuentres en una ciudad, en un determinado lugar, y que quieres llegar a otro punto de ella, una cierta calle, y un determinado número de esa calle. Un amigo te dice lo que has de hacer exactamente, por ejemplo, tomar el autobús número tal en una determinada parada, bajar en tal sitio, andar tantas calles en tal dirección, etc. Este es indudablemente un procedimiento concreto para un caso concreto, que sólo vale para ese caso. En cambio un procedimiento general sería el siguiente: adquiere un plano de una ciudad, localiza en el plano el lugar donde te encuentras y el lugar donde quieres llegar y traza el itinerario.
Con este ejemplo esperamos que se entienda que para explicar científicamente un estado
de cosas del mundo físico no hay un método distinto, sino diferentes aplicaciones de un mismo instrumento de razonamiento, el método científico. Así la cultura no puede comprenderse sin hacer referencia al método científico. La ciencia no es un sector de la civilización que pueda separarse del resto de ella, sino un esfuerzo creativo con su propio sistema de valores que, poco a poco ha llegado a formar parte de los valores generales en
El objetivo de la ciencia es hacer teorías. Las teorías científicas explican los hechos y predicen con alto grado de probabilidad la ocurrencia de hechos similares. La secuencia del método científico es observar, plantear problemas, hacer hipótesis, experimentar y formular teorías. Cada uno de los procesos del método científico tomado aisladamente, forma parte de la actuación cotidiana de todos los seres humanos, pero en su conjunto,
utilizados sistemáticamente, constituyen la más poderosa herramienta que ha diseñado la humanidad para conocer y predecir a la naturaleza. A continuación se resumen los distintos procesos del método científico.
Observación El método científico se inicia con la observación. Lo que no puede observarse, directa o indirectamente por medio de instrumentos o de modificaciones de la conducta, no puede ser investigado por la ciencia. La observación debe ser repetida en forma independiente por diversos observadores. Las observaciones únicas que no se repiten no pueden ser objeto de estudio científico. La habilidad para observar los fenómenos se incrementa con el estudio y ejercicio constantes.
Plantear problemas Una consecuencia de la observación repetida de un fenómeno (infección respiratoria en Hong Kong) es el planteamiento del problema (inicio de epidemia), es decir, una vez hecha la observación, se hacen preguntas al respecto, ¿cómo es que los hechos ocurren de este modo? ¿Qué determina el tiempo y el desarrollo? Plantear un problema es hacer preguntas, pero deben ser buenas preguntas. Para que los problemas tengan valor científico estos deben ser significativos y potencialmente tener respuestas comprobables por técnicas apropiadas. En la relación médico – paciente diariamente se utiliza el método científico. Frente a un síntoma (observación) se buscan hechos causales (planteamiento del problema).
Hacer hipótesis Una vez que el problema está debidamente planteado, el científico procede al tercer tiempo del método, la formulación de hipótesis. Con la hipótesis el investigador plantea posibles explicaciones a los problemas observados (La epidemia del SARS se inició en Hong Kong por la transferencia del virus por medio de la vía respiratoria). Un problema puede tener varias explicaciones o hipótesis pero sólo una es la verdadera. Esto se puede comprobar con el cuarto paso del método científico.
Experimentación El objetivo de la experimentación es validar la hipótesis planteada. En general los experimentos conducen a soluciones parciales. Esto lleva a que el trabajo experimental pueda prolongarse por mucho tiempo, siendo este paso el más arduo en el trabajo de investigación. Si bien cada experimento es único, siempre el conocimiento y la experiencia previos ayudan técnicamente para decidir la forma en que una hipótesis puede comprobarse experimentalmente.
Formular teorías Cuando una hipótesis se sostiene con pruebas convincentes obtenidas en el laboratorio, se puede proponer en base a estos resultados una teoría que explique dicha hipótesis. La teoría es una afirmación con límites más amplios que los experimentos en que se basa y que expresa la probabilidad de que la hipótesis sea cierta y pueda aplicarse a
observaciones similares. Por ejemplo, en relación a la epidemia en Asia por SARS, la investigación sobre la epidemiología y clínica de la enfermedad permitió que se pueda identificar personas infectadas con el virus en otras latitudes como Canadá, Brasil y otras partes del mundo. Los experimentos y observaciones clínicas en Asia sirven entonces para formular teorías de transmisión y presentación clínica en general. Desde ese punto de vista, una teoría permite hacer predicciones, estas predicciones científicas tienen siempre un soporte experimental muy fuerte y aun cuando no afirman que un hecho ocurrirá con certidumbre, si plantean que existe una gran probabilidad de ocurrir. No obstante, otras teorías han probado su validez universal convirtiéndose en leyes naturales que orientan la investigación científica.
2. Diagnostico por el laboratorio
Al término de la Práctica, el alumno estará en la capacidad de:
1. Identificar la utilidad del laboratorio clínico en la ayuda diagnostica y
pronostica individual y poblacional
2. Familiarizarse con los procedimientos de solicitud de exámenes en el laboratorio clínico
De manera general, el laboratorio corresponde a un departamento intra o extra hospitalario y/o universitario, que pertenece al campo de servicios auxiliares de diagnóstico, uniendo por medio de procedimientos experimentales a las ciencias básicas con las ciencias clínicas.
Como resultado de este proceso, el laboratorio ayuda a:
 Confirmar una impresión diagnostica clínica
 Descartar un diagnostico
 Establecer un diagnostico
 Controlar un tratamiento (como guía de terapéutica)
 Realizar exploración selectiva o detección de una enfermedad individual o en la población.
El propósito por tanto, se relaciona con la atención primaria, procesamiento biológico, de investigación y de docencia, validación y producción de información.
La capacidad del laboratorio para satisfacer las necesidades del clínico se mide en función de la calidad, que exige una máxima contribución en lo que respecta al beneficio del paciente y a la ayuda del médico tratante, lo que debe llevarse a cabo con eficiencia y eficacia. Aunque la exactitud y la precisión son requisitos previos a toda practica de laboratorio, la prontitud en el informe de resultados es esencial.
La obtención de un resultado confiable se basa en los principios básicos del laboratorio clínico, que debe asegurar una recolección, manejo y procesamiento apropiado de las muestras previo al análisis, con una óptima manipulación del equipo, uso de reactivos de pureza específica y control ambiental.
Existen tres fases de trabajo en el laboratorio:
Fase pre-instrumental: En la que se realiza la recepción y clasificación de las solicitudes de examen, clasificación de especímenes biológicos, preparación de reactivos y material de trabajo. El clínico comienza con la petición de pruebas en un registro que debe contener los datos demográficos del paciente: nombre, sexo, edad, fecha de solicitud. Según el tipo de prueba que se solicita la recolección de muestras debe realizarse etiquetando las mismas con los datos demográficos del paciente. La vigilancia y la transcripción exactas de la solicitud de pruebas en el laboratorio deben ser componentes indispensables del programa de control de calidad, para que los resultados obtenidos sean precisos y oportunos. De acuerdo con la IUPAC (Unión Internacional de Química Pura y Aplicada) y la IFCC (Federación Internacional de Química Clínica), los resultados de un examen de laboratorio deben contener la siguiente información:
Nombre del componente investigado: ej. Glucosa
Resultado (valor numérico) con su unidad de expresión. ej. 80 mg/dl
Rango de referencia del método empleado: ej. 70-110 mg/dl
Fase instrumental: En la que se emplea determinada metodología para la ejecución de una prueba, la que se debe incluir el fundamento químico, los lineamientos acerca del procedimiento, los datos técnicos y los rangos de referencia. De manera general los métodos pueden ser cualitativos y cuantitativos. Los métodos cualitativos son aquellos que se describen mediante un producto, una propiedad del compuesto investigado, sin generar un dato numérico absoluto, por ejemplo, la investigación de la presencia de glucosa en una muestra por visualización del cambio de color en el producto final.
Los métodos cuantitativos identifican numéricamente un compuesto en una mezcla de elementos como es el suero o el plasma, son métodos exactos. Los métodos cuantitativos pueden ser de tres tipos:
Métodos colorimétricos: Sn aquellos que miden la concentración de un compuesto, tomando como base la intensidad de color que desarrolla
Métodos enzimáticos: miden la concentración de una sustancia, utilizando cambios oxido reductivos en reacciones catalizadas por enzimas y coenzimas específicas, como ejemplo el método de la hexocinasa para determinación de glucosa, método de uricasa para la determinación de ácido úrico, etc.
 Métodos volumétricos: en el cual concurren los dos anteriores. Se fundamentan en el volumen total que se emplea en la determinación, pudiendo ser macrométodo (volumen total 2 ml), semimicrométodo (1-2 ml de volumen total), micrométodo (0,1-1, ml como volumen total) y ultramicrométodo (volumen total 0,1 ml).
c) Fase post-instrumental: Los datos obtenidos en la Fase Instrumental son procesados, traduciéndose en información legible que es enviado como resultado al médico o entidad solicitante o formaran parte de una base de datos para archivo, estadística o investigación clínica.
La Sociedad Americana de Control de Calidad define la calidad como el conjunto de técnicas operativas y actividades necesarias para cumplir con los requisitos de calidad, concierne al monitoreo diario de los procedimientos realizados en el laboratorio.
Para la realización de las diferentes pruebas solicitadas por el médico clínico o el especialista, existen diversos fluidos corporales que pueden ser utilizados como los son:
sangre total (venosa o arterial), suero o plasma, líquido céfalo raquídeo, orina, heces.
El correcto manejo de los datos y variables permite comprender mejor el significado de los mismos, para lo que se utiliza las medidas estadísticas de tendencia central de la distribución y las medidas de dispersión.
3. Técnicas de Laboratorio
1. Identificar la presencia de soluciones en los sistemas biológicos.
2. Relacionar soluciones químicas con líquidos orgánicos.
3. Aprender la correcta utilización de micro pipetas
Una solución es una mezcla homogénea de por lo menos dos componentes, una fase dispersa que es el soluto y otra fase dispersante que es el solvente. Las soluciones más utilizadas en bioquímica son las que tienen agua como disolvente.
Las disoluciones constituyen las mezclas de dos o más compuestos diferentes, con un aspecto homogéneo, en las disoluciones se debe distinguir el soluto, que es el componente que se encuentra en menor proporción, y el disolvente, que se encuentra en mayor cantidad.
Según la concentración de las soluciones podemos decir que estas pueden ser hipotónicas, isotónicas, e hipertónicas. También podemos clasificar las soluciones en porcentuales, molares, normales, molales, osmolares, e isotónicas.
Las soluciones isotónicas son las que ejercen la misma presión osmótica, es decir que contienen la misma concentración de partículas osmóticamente activas. Por ejemplo, el plasma sanguíneo tiene una presión osmótica aproximada de 0.3 osmolar. Una solución es hipertónica con respecto a otra solución cuando ésta contiene una concentración de partículas más alta. Por otro lado una solución es hipotónica con respecto a otra cuando ésta contiene un número de partículas menor. El término isotónica en medicina es sinónimo de isosmótico y solo se emplean en relación a líquidos fisiológicos.
Considere que el ClNa se disocia en solución acuosa en los iones Na+ y Cl- por lo que la concentración iónica se duplica. Además tome en cuenta que la presión osmótica normal del plasma es de 290-310 mosm/L. del plasma es de 290-310 mosm/L.
Soluciones porcentuales: en éstas soluciones se indica la cantidad de soluto disuelto en 100 partes de solvente. En este tipo de soluciones debe especificarse si la relación es P*/P, P/V o V*/V. Las soluciones porcentuales más utilizadas son P/V. *P = peso; V = volumen
Soluciones molares: son las que llevan disuelto en la unidad de volumen 1 litro (L) y a la temperatura de referencia (20º C) 1 mol del soluto. Un mol es igual al peso atómico o molecular en gramos. Expresado de otro modo equivale a la concentración de 1 mol o múltiplo o fracción por litro de solución.
Soluciones normales: son las que llevan disuelto en la unidad de volumen 1 L y a la temperatura de referencia 1 eq del soluto. Un equivalente se obtiene dividiendo el peso molecular por el número de valencias neutralizadas. Las soluciones normales son las más usadas en la técnica analítica.
Soluciones molales: indican el número de moles en 1000 gr. de solvente.
Soluciones osmolares: una solución osmolar es aquella que contiene un mol del soluto en gramos en un litro de solución. La presión osmótica depende del número de partículas no de su carga, ni de su masa, la misma fuerza osmótica es ejercida por una sustancia grande, como una proteína, una molécula de glucosa o algún ión de sodio o de cloruro. La presión osmótica es proporcional a la molaridad (para sustancias no disociables) del soluto.
3.2. Normas para la utilización de micro pipetas (*)
Las micropipetas constituyen instrumentos indispensables para el trabajo dentro del laboratorio de Bioquímica Medica, están diseñadas para medir volúmenes en el rango de los microlitros (µl). Para su utilización se requieren de puntas desechables, minimizando el
Las partes de la micropipeta son:
A. Botón pulsador
B. Botón expulsador de puntas
C. Rueda de graduación
D. Cono de la pipeta
E. Palanca expulsadora de puntas
F. Punta descartable
Fig. 1. Esquema micropipeta
Rango de volumen en µl
Tabla 1. Relación entre color de punta y volumen a medir
Fig. 2. Procedimiento de utilización de micropipeta
El manejo de las micropipetas se realiza siguiendo las siguientes instrucciones:
1. Ajustar el volumen deseado girando la rueda de graduación de volumen, para un volumen mayor se gira en la dirección de las manecillas de reloj y si desea un volumen menor en contra de la dirección de las manecillas de reloj.
2. Colocar la punta (plástica correspondiente) sin tocarla con las manos, presionando sobre el dispensador.
3. Presionar el botón pulsador hasta el primer tope
4. Sumergir la punta de la micropipeta en la solución (reactivo o muestra), subir el botón pulsador lentamente para absorber la sustancia liquida, con cuidado de no generar burbujas
5. Colocar toda la solución en el recipiente correspondiente hasta el segundo tope del botón pulsador, la forma correcta de dispensar el líquido es de forma vertical
6. Volver el botón pulsador a la posición inicial
7. Expulsar la punta en el recipiente adecuado utilizando el botón expulsador de puntas
Precauciones a tomar en cuenta para el correcto cuidado de las micropipetas
1. No ajustar el
2. volumen fuera (superior o inferior) del rango de las micropipetas
3. Las soluciones no deben entrar en contacto con el cono de la micropipeta
4. No regule volumen mientras la micropipeta se encuentra con soluciones en la punta
5. No colocar la micropipeta de forma horizontal si la punta contiene soluciones
(*) Tomado de Manual de Biología Molecular. USFQ
NOTA: Para la Practica N°1, NO se requiere presentar informe, revisar el DEBER y/o CONSULTA correspondiente a esta práctica en D2L
PRÁCTICA N o 2
OBTENCION Y MANEJO DE MUESTRAS BIOLOGICAS:
OBJETIVOS Al término de la práctica, una vez cumplidas las experiencias de enseñanza-aprendizaje, el estudiante estará en la capacidad de:
 Obtener por punción venosa una muestra de sangre
 Manipular de manera adecuada la muestra sanguínea, para análisis y conservación
 Establecer diferencias básicas entre sangre total, plasma y suero
La sangre es un tejido que circula dentro de los vasos sanguíneos, se encuentra formada por elementos figurados y por el plasma, sus principales funciones están relacionadas con la respiración, la nutrición, la excreción, el mantenimiento acido-base, la regulación de la temperatura adicionalmente constituye un mecanismo de defensa del organismo y de transporte de metabolitos.
Las condiciones metabólicas de cada individuo varían de acuerdo a las condiciones fisiológicas y los estados patológicos, entre los que se mencionan el estado de actividad y reposo, la dieta, el estado anímico, la edad, entre otros.
Las determinaciones sanguíneas pueden ser de rutina o de emergencia, para las primeras se requiere que el individuo se encuentre en condiciones basales, es decir, en un periodo de ayuno de 10 a 12 horas, con reposo físico y mental, condiciones que no ocurren en caso de requerir un resultado de emergencia.
Recolección de muestras Sangre: La sangre constituye el líquido corporal más frecuentemente utilizado con finalidades analíticas. Los procedimientos generales para su obtención son:
1. punción arterial
2. punción cutánea y,
La técnica utilizada para la obtención de muestras de sangre es fundamental para mantener su integridad. Las sangres arterial y venosa se diferencian en algunos aspectos, que deben ser tomados en cuenta. La sangre arterial, oxigenada por el pulmón y bombeada por el corazón hacia todos los órganos y tejidos tiene una composición prácticamente uniforme en todo el organismo. Por el contrario, la sangre venosa varía según la actividad metabólica del órgano o tejido perfundido, por lo que el punto en donde se extrae la muestra puede influir en su composición. La sangre venosa tiene menos oxigeno que la arterial, también se diferencia por su pH, su concentración de dióxido de carbono y su hematocrito. En ocasiones también se encuentran variaciones en
los niveles de glucosa, ácido láctico, cloro y amonio. La sangre cutánea, es una sangre procedente de arteriolas, vénulas y capilares y, por lo tanto es en parte venosa y en parte arterial, también contiene líquidos intersticial e intracelular.
La sangre arterial se utiliza para medir la tensión de oxígeno y de dióxido de carbono y para medir el pH, siendo la determinación de gases en la sangre críticas para valorar problemas de oxigenación presente en algunas patologías.
La punción cutánea constituye el método de elección en pacientes pediátricos, especialmente lactante., siendo también útil en adultos con obesidad extrema, quemaduras graves o tendencia trombótica.
La sangre venosa, tiene relativa facilidad para su obtención, constituyendo el principal método de obtención sanguínea en los laboratorios clínicos, otra ventaja es que la mayoría de las sustancias analizadas se encuentran presente en forma soluble o dispersa de forma homogénea.
Los lugares de obtención de sangre venosa son: vena cefálica, vena mediana radial, vena basílica, vena mediana cubital, vena mediana del antebrazo, dorso de la mano o del pie (niños).
La venopunción se realiza directamente con tubos de ensayo al vacío (vacountainer), siendo la extracción de sangre venosa económica y eficaz, se dispone de tubos de diversos tamaños (2, 5, 7, 10 y 15 ml). Las agujas desechables eliminan el riesgo de contaminación y transmisión de diversas patologías, es por ello que la persona que realiza la extracción debe practicarla utilizando las mayores medidas de seguridad. Los tapones de caucho tienen un código de colores que permite distinguir si el tubo tiene determinado anticoagulante (heparina, oxalato, citrato) o si es un tubo simple.
1. Verificar los datos en los recipientes si coinciden con los de la solicitud.
2. Identificar al paciente en concordancia con los datos registrados en la solicitud de exámenes.
3. Si se solicita una muestra en ayunas debe comprobarse que efectivamente el paciente no haya ingerido alimentos.
4. Informar al paciente el procedimiento al cual va a ser sometido, eliminando su posible tensión.
5. El paciente debe estar colocado de forma adecuada para tener un acceso fácil y cómodo a la fosa ante cubital.
6. Preparar el material, incluidos los tubos para recolección de muestras que deben estar rotulados, el torniquete, objetos de limpieza de la piel, agujas, capsulas.
7. Solicitar al paciente que cierre el puño para que las venas resulten palpables.
Se selecciona la vena para la punción, se prefieren las venas de la fosa ante cubital, en particular la cubital interna y la cefálica. también pueden utilizarse las venas de la
muñeca, el tobillo y la mano. Si existiera un catéter intravenoso en un brazo, se utilizará el otro (así se evita variación de resultados por los fluidos del suero).
9. Se limpia la zona de la venopunción con una torunda de algodón embebida en solución de alcohol o yodo. Se comienza en el punto de la punción y se continúa hacia fuera siguiendo un movimiento espiral, se deja que la zona se seque sin contaminar con ningún objeto no esterilizado previamente.
10. Se aplica el torniquete varios centímetros por encima de la zona de punción, sin dejar el torniquete colocado por más de 1 minuto.
11. Se fija firmemente la vena con la ayuda de los dedos pulgar y medio, o índice y pulgar.
12. Se realiza la venopunción: a) se penetra a través de la piel con la aguja formando un ángulo de 15 a 45 grados con el brazo y con el bisel hacia arriba, b) Se introduce la aguja con suavidad pero con la suficiente rapidez para reducir las molestias al paciente c) En cuanto la aguja haya penetrado en la vena, se dirigirá el tubo al vacío hacia delante con el dispositivo de sujeción (capsula) sosteniéndolo firmemente. Una vez que el tubo se haya llenado, se lo retira cogiéndolo por su extremo y tirando suavemente de él.
13. Cuando la sangre comience a fluir se suelta el torniquete.
14. Una vez que se haya obtenido toda la muestra se indica al paciente que relaje el puño.
15. Se coloca suavemente sobre el punto de punción una torunda de algodón estéril, seco; se extrae la aguja y se ejerce presión sobre la zona.
16. Se coloca una tira de esparadrapo para detener la hemorragia.
17. Los tubos con anticoagulante se mezclan inmediatamente.
18. Se comprobara el estado del paciente, por ejemplo si ha sufrido mareo o si la hemorragia ha cedido.
19. Se elimina el material contaminado en el recipiente destinado para el propósito:
agujas, jeringas, algodones, etc.
Procesamiento de las muestras Se define como procesamiento de las muestras al periodo comprendido entre su recolección y su análisis real, lo que comprende de tres fases: precentrifugación, centrifugación y poscentrifugación.
La fase de precentrifugación depende del tipo de muestra, debe realizarse dentro de la primera hora de recolección, con excepción de la determinación de gases sanguíneos y amoniaco, que requieren de sangre completa. Generalmente para las determinaciones bioquímicas se requiere de suero y ocasionalmente de plasma. El suero es la muestra de elección ya que resulta fácil de obtener y procesar, no existe interferencia con anticoagulantes.
Lo ideal es centrifugar la muestra tan pronto se ha completado la formación del coagulo, una vez centrifugado se procede a la separación del suero en otro tubo estéril y debidamente rotulado con el cual se realizaran las determinaciones, en caso de no realizar las determinaciones en un tiempo considerablemente corto, es necesario refrigerarlas o
congelarlas ya que se produce contaminación como crecimiento bacteriano y la actividad enzimática puede alterar drásticamente el valor de los componentes sanguíneos.
Es preciso establecer criterios para el rechazo de las muestras, entre los que se pueden anotar una identificación incompleta de la muestra, un insuficiente volumen en la recogida, utilización de tubos inapropiados para la realización del examen, hemólisis, transporte inadecuado e interferencias.
Orina: Al recoger una muestra de orina para su estudio, debe darse al paciente las indicaciones necesarias para hacerlo, la muestra de orina debe ser recogida en un recipiente limpio, estéril y examinarse dentro de las dos primeras horas de evacuación. Si el análisis se retrasa la muestra puede ser refrigerada para su mejor conservación. Para el estudio químico y microscópico basta una muestra recogida por micción, es mejor una muestra concentrada por ello se solicita la primera orina de la mañana, para evitar contaminación con secreciones vaginales o uretrales se sugiere desechar el primer chorro, recoger la segunda porción y desechar el final.
ASEPSIA: Termino que proviene del griego a = sin; sepsis = putrefacción, constituye la esterilización de instrumentos y materiales por medio de calor para volverlos asépticos.
ANTISEPSIA: Es el conjunto de procedimientos y prácticas destinadas a destruir o impedir la proliferación de agentes patógenos, en especial se da por la acción de agentes químicos encargados de la desinfección.
Materiales y Métodos Agujas Vacountainer Tubos Vacuntainer tapa roja y tapa lila Algodón (torundas) Alcohol Torniquete Gradilla Marcador de tubos
NOTA: Para la Practica N°2, NO se requiere presentar informe. Revisar el DEBER y/o CONSULTA correspondiente a esta práctica en D2L.
PRÁCTICA N o 3
 Conocer la importancia de la hemoglobina en el transporte de oxígeno, y su papel como una proteína especializada
 Relacionar el conocimiento teórico sobre la hemoglobina con su determinación en el laboratorio y su uso en la práctica clínica.
 Interpretar los valores de referencia de la hemoglobina
La principal función de los glóbulos rojos (GR) de la sangre es la entrega de oxígeno a los tejidos y la eliminación de CO 2 e H + productos del metabolismo tisular. Los GR están formados por una membrana que contiene una solución de hemoglobina (Hb). Para los hombres el número normal de GR está entre 4.6-6.2 millones/mm de sangre y para la mujeres de 4.2-5.4 millones/mm. En cuanto a las concentraciones de Hb, el valor normal en hombres es 14-18 g/dL y de 12-16 g/dL para las mujeres. Los valores normales de hematocrito (el volumen de los GR en plasma) son de 42 a 52% para hombres y de 37 a 47% para mujeres. La deficiencia en el tamaño o en el número de GR o en la concentración de Hb se conoce como anemia. Esta condición limita el intercambio de O 2 y CO 2 de los tejidos. Existen muchas causas de anemia pero la más común es la anemia por deficiencia de hierro.
La hemoglobina es una hemoproteína formada por cuatro cadenas polipeptídicas [α (2): β (2)] que se encuentra en los glóbulos rojos y cuya función es unirse al O 2 en los pulmones y transportarlo a todo el organismo para que pueda ser usado en las vías metabólicas aeróbicas. Cada cadena α o β de la Hb tiene un grupo prostético hemo que se aloja en una hendidura hidrofóbica de la proteína. Cada residuo hemo contiene un átomo de hierro central coordinadamente unido y que normalmente está en su estado ferroso de oxidación, Fe 2+ . El O 2 transportado en la Hb se une directamente al Fe 2+ del hemo.
El hemo es sintetizado en la mayoría de las células del organismo, sin embargo, los sitios más importantes para su formación son los glóbulos rojos y el hígado. En las células eritrociticas todo el hemo que se sintetiza se incorpora a la Hb y su formación solamente ocurre una vez que las células se han diferenciados en glóbulos rojos. En los reticulocitos, glóbulos rojos inmaduros, el hemo estimula la síntesis proteica. La síntesis del grupo prostético hemo de la hemoglobina se inicia en la mitocondria con la condensación de una glicina y la succinil-CoA por medio de la enzima sintasa del ácido-δ-levulínico (ALA sintasa) para formar ácido-δ-levulínico, que se transporta al citoplasma en donde la enzima sintasa de porfobilinógeno forma dos moléculas de ALA para formar el compuesto pirrólico cíclico porfobilinógeno. Subsecuentemente 4 moléculas de porfobilinógeno se condensan para formar un intermediario lineal llamado hidroximetilbilano que dará lugar a la formación
de uroporfirinógeno III. El uroporfirinógeno III es entonces descarboxilado dando lugar al coproporfirinogeno III que es transportado al interior de la mitocondria en donde es posteriormente transformado secuencialmente a protoporfirinogeno IX, protoporfirina IX
y hemoglobina. Esta última reacción incluye la incorporación de Fe por la enzima ferroquetalasa.
Existen varios tipos de subunidades peptídicas (α, β, γ, δ) que dan origen a varios tipos de Hbs funcionales. Las diferencias en la secuencia de aminoácidos de estas subunidades confieren diferentes capacidades para el transporte de O 2 por la Hb. La estructura cuaternaria de la Hb refleja las interacciones alostéricas importantes entre las subunidades de la Hb. La configuración terciaria de baja afinidad, Hb desoxigenada se denomina T (Taut). Al contrario, la estructura cuaternaria de alta afinidad, Hb oxigenada se denomina R (Relaxed). La curva de unión del O 2 a la Hb es sigmoide, típica de una proteína alostérica en la que el substrato (O 2 ) es un efector homotrópico positivo. La forma alostérica de asociación del O 2 a la Hb permite un eficiente transporte y subsecuente liberación de O 2 desde los pulmones hacia los tejidos periféricos metabólicamente activos. Además de esta función importante, la Hb transporta CO 2 desde los tejidos periféricos hacia los pulmones. Los grupos amino terminales de la forma T de la Hb pueden reaccionar con el CO 2 y así, aproximadamente el 15% del CO 2 generado en los tejidos es transportado a los pulmones unido covalentemente a los N-terminales en forma de carbamato. En los pulmones, la presión alta de O 2 hace que la Hb adquiera la conformación R y con esto la reacción reversa del carbamato para la eliminación de CO 2 por medio de la expiración. El CO 2 de los tejidos también es transportado a los pulmones como gas disuelto y como bicarbonato que se forma espontáneamente y por acción de la enzima Anhidrasa Carbónica que convierte al CO 2 y al H 2 O en ácido carbónico. El ácido carbónico se ioniza espontáneamente en hidrógeno y en bicarbonato.
El 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) que se deriva del 1,3 difosfoglicerato de la glicólisis, es un
efector alostérico de las propiedades de la Hb para unirse al O 2 . En ausencia de 2,3-BPG la Hb puede unirse más fácilmente al O 2 . La Hb fetal se une al 2,3-BPG con menos avidez que
la Hb del adulto (HbA) por lo que durante la vida fetal la Hb del feto se une al oxigeno con
mayor afinidad que la Hb de la madre. Facilitando la transferencia de O 2 desde la HbA de
la madre a la HbF del feto.
Una vez que los glóbulos rojos (GR) han cumplido su ciclo normal de vida, aproximadamente 120 días, estos son fagocitados por células del sistema retículo endotelial (macrófagos). La Hb y el hemo de los GR entonces deben ser metabolizados, la globina (porción proteica) es reciclada o convertida en amino ácidos que pueden ser
reutilizados o catabolizados, el hierro debe conservarse para la síntesis de nuevo hemo, y
el anillo de porfirina debe ser solubilizado para que pueda excretarse.
La enzima oxigenasa del hemo rompe la molécula produciendo el tetrapirrol lineal biliverdina, Fe 3+ , y CO. La biliverdina es reducida entonces a bilirrubina (indirecta) que es transportada hacia el hígado unida a la albúmina. En el hígado la bilirrubina indirecta es conjugada con dos equivalentes de ácido glucorónico para producir el derivado
diglucorónido de bilirrubina (directa) que es soluble en agua y puede ser excretado en la bilis. Cualquier circunstancia que incremente los niveles de bilirrubina en la sangre (hiperbilirrubinemia) produce ictericia (coloración amarillenta de la piel). La destrucción anormal GR como en la malaria o daños en los hepatocitos llevan al incremento de bilirrubina. En el intestino, la bilirrubina excretada es metabolizada a urobilinógeno, urobilina, y estercobilina que dan la coloración a las heces. Fundamento La concentración de hemoglobina se determina utilizando una muestra de sangre total, con anticoagulante EDTA. En la práctica se utiliza el Método de la cianmetahemoglobina (HiCN).
El método está basado en la determinación de cianmetahemoglobina o cianuro de hemoglobina. Los derivados de la hemoglobina de la muestra son liberados de los eritrocitos y son oxidados por el ferricianuro de potasio, formando así metahemoglobina. Esta reacciona con el cianuro de potasio formando cianmetahemoglobina estable, cuya absorbancia a 540 nm es directamente proporcional a la concentración de hemoglobina en la muestra.
Materiales y Métodos Tubos de ensayo Pipeta automática (20 µl) Pipeta 5 ml Kit para determinación de hemoglobina. Espectrofotómetro Material para extracción de sangre (jeringas con agujas, algodón con alcohol, torniquete) Tubos para recolección de sangre con EDTA. Procedimiento
Pipetear en los tubos
Enjuagar la micropipeta varias veces con el reactivo de trabajo, mezclar bien y leer la absorbancia después de 5 min frente al blanco de reactivo.
Cálculos Concentración de hemoglobina (Hb) = Factor x Absorbancia de la muestra Resultados Reportar los datos obtenidos en la clase, separándolos de acuerdo a género. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de las muestras de la clase (hombres y mujeres) Discusión Discuta los datos obtenidos en la clase, comparándolos con valores de referencia. Consultar los valores de referencia para recién nacidos, niños, adolescentes, adultos y ancianos.
NOTA: Revisar la CONSULTA correspondiente a esta práctica en D2L
PRÁCTICA N o 4
DETERMINACION DE GLUCOSA SERICA. Cinética enzimática.
Al término de la práctica, una vez cumplidas las experiencias de enseñanza-aprendizaje, el estudiante estará en la capacidad de:
a) Relacionar el conocimiento teórico sobre el metabolismo de carbohidratos con la determinación de glucosa en sangre en el laboratorio y su uso en la práctica clínica.
b) Verificar la concentración de glucosa sanguínea en condiciones de salud y en procesos patológicos.
c) Explicar el efecto de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción enzimática.
d) Conocer aspectos básicos de la colorimetría.
El organismo utiliza los hidratos de carbono y las grasas como las fuentes más importantes de energía para mantener funciones básicas como funcionamiento del cerebro, temperatura corporal, respiración, circulación de la sangre, y aquella que nos permite realizar el trabajo físico de movernos. Alimentos ricos en carbohidratos son el trigo, arroz, maíz, fréjol, arveja, garbanzo, papas, yuca, plátano, frutas. Un grupo importante de carbohidratos en la dieta, los llamados polisacáridos fibrosos que no tienen valor nutritivo porque los seres humanos no podemos digerirlos, proporcionan la fibra dietética de las comidas.
El metabolismo de los carbohidratos se inicia con la digestión intestinal de almidones y glucógeno para convertirlos en azúcares simples como mono y disacáridos y que puedan ser absorbidos por las células epiteliales del intestino delgado. Las enzimas encargadas de la degradación de los carbohidratos son la amilasa lingual, α-amilasa, sucrasa, lactasa y tetralasa. Luego de su absorción, los azúcares simples son entonces llevados por el sistema portal del intestino al hígado en donde son almacenados en forma de glucógeno, convertidos a ácidos grasos o a aminoácidos, o si no, son oxidados en las vías catabólicas celulares.
La oxidación celular de la glucosa se denomina glucólisis, esta es la vía más importante de degradación. En condiciones aeróbicas la glucosa es oxidada a piruvato mientras que en condiciones anaerobias a lactato. En la primera etapa de la glucólisis aeróbica se requiere 2 equivalentes de ATP para activar el proceso y un mol de glucosa se convierte en dos moles de triosa fosfato. En una segunda etapa, los dos moles de triosa fosfato se convierten en dos moles de piruvato con la generación de cuatro moles de ATP y dos NADH. Así:
- Glucosa + 2 ADP + 2 NAD + + 2 Pi -----> 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H +
Cada NADH será subsecuentemente utilizado para la síntesis de más ATP (3 moles) por medio del fenómeno de fosforilación oxidativa. Por otro lado, la oxidación completa de dos moles de piruvato en el ciclo de Krebs produce 22 moles de ATP. En resumen la oxidación completa de un mol de glucosa a CO 2 y H 2 O produce 36 a 38 moles de ATP.
En la vía glucolítica existen tres reacciones irreversibles catalizadas por las enzimas hexocinasa, fosfofructocinasa y la piruvatocinasa. El paso limitante de esta vía es la reacción de la fosfofructocinasa. El control de esta enzima está dado por la presencia de un intermediario que no es parte de la glucólisis o de la gluconeogenesis, la fructosa 2,6- bisfosfato. La fructosa 2,6-bisfosfato activa la fosfofructocinasa facilitando la degradación de la glucosa a piruvato.
La otra vía importante en el metabolismo de la glucosa es la vía de la “Pentosa fosfato”. En esta vía se utilizan los seis carbonos de la glucosa para generar azucares de 5 carbonos (ribosa) y equivalentes reductores como NADH + , NADPH + , FADH + . Las funciones más importantes de esta vía son: 1. generar equivalentes reductores como NADPH + para las reacciones reductoras de biosíntesis como la síntesis de ácidos grasos. 2. proveer a la célula de ribosa-5-fosfato para la síntesis de nucleótidos y ácidos nucleicos.
El mantenimiento de niveles constantes de la glucosa (5 mM) en la sangre es de capital importancia para el normal funcionamiento orgánico. La elevación o disminución de la concentración de glucosa en la sangre causan alteraciones fisiológicas que pueden llevar a la pérdida de la conciencia y eventualmente a la muerte. Tejidos como el nervioso y sanguíneo utilizan glucosa como primera fuente de energía. La habilidad del organismo para utilizar la glucosa puede analizarse midiendo su concentración en la sangre u orina.
Existen varias formas de medir los niveles de glucosa en la sangre. La muestra puede obtenerse por punción capilar, extracción de sangre venosa o arterial. Los métodos de medición de glucosa son también variados, estos pueden ser con cintas reactivas que cambian de color de acuerdo con la concentración del azúcar. Existen también medidores electrónicos que determinan la concentración en sangre total (para uso en el hogar-- diabéticos). En el laboratorio, comúnmente se utiliza un método enzimático colorimétrico para medir glucosa en suero o plasma.
En clínica, se indica la medición de las concentraciones de glucosa en pacientes con diabetes mellitus, pacientes con glucosa alterada luego del ayuno (mayor de 110mg/dl), pacientes con síndrome de resistencia a la insulina y/o intolerancia a los carbohidratos (incremento excesivo de la glucosa sanguínea después de su consumo o del consumo de alimentos ricos en glucosa), en pacientes con problemas de hipoglucemia, y en pacientes con estados catabólicos y de desnutrición. Se podría también indicar la determinación de glucosa en pacientes con tuberculosis, infecciones crónicas o recurrentes, alcoholismo, enfermedad arterial coronaria, o alteraciones de la piel como infecciones de la piel, úlceras y gangrena sin causa aparente, pacientes en coma, epilepsia, confusión, ganancia
o pérdida de peso anormales y en pacientes con medicación que podría afectar el
metabolismo de glucosa (e.g. uso de corticoides). Muchas de estas condiciones pueden
deberse a niveles constantemente altos o bajos en los niveles de glucosa.
Dependiendo del estado fisiológico de los individuos, los niveles de glucosa sanguínea varían y por tanto deben conocerse para hacer una buena interpretación de los datos del laboratorio.
Antes de proceder con la metodología para medir glucosa sérica es pertinente revisar algunas nociones básicas de espectrofotometría.
 Prueba de glucosa sanguínea en ayunas: esta prueba se la realiza después de que el paciente haya ayunado por ocho horas (sin comer o beber líquidos excepto agua). El valor normal de glucosa sanguínea después del ayuno deber ser entre 70-110 mg/dl.
 Prueba de glucosa “aleatoria” tomada en cualquier momento: el rango normal de glucosa está entre aproximadamente 70 y 126 mg/dl.
 Prueba de tolerancia a la glucosa: en esta prueba la concentración de glucosa después de dos horas de ingerir una solución de agua con azúcar debe ser menor de 140 mg/dl, y cualquier medición dentro de estas dos horas debe ser menor a 200 mg/dl.
La velocidad de una reacción enzimática es proporcional a la concentración del sustrato;
cuando la concentración del sustrato es muy alta, la enzima se satura y alcanza su velocidad máxima. La enzima que sirve de modelo en esta práctica es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.
La glucosa sanguínea se oxida por acción de la glucosa oxidasa (GOD), formando acidoglucorónico y peróxido de hidrogeno. Por acción de la peroxidasa (POD), el H2O2 produce la oxidación del fenol con la 4 aminofenazona (4,AF) y la consiguiente formación de una sustancia coloreada o cromógeno de color rojo cereza que exhibe una absorción a una longitud de onda de 540-546 nm
La reacción se expresa:
Glucosa  O 2 + H 2 O
Ácido glucorónico + H 2 O 2
2H 2 O 2  4-aminofenazona + fenol
quinoneimina + 4H 2 O
Materiales y Métodos Gradilla con tubos de ensayo Pipetas automáticas de 100 y 1000 ul Espectrofotómetro Kit de Glucosa Material para extracción de sangre (tubos al vacío, algodón con alcohol, torniquete)
Para la determinación de glucosa preparar los siguientes tubos.
Standard reactivo
Muestra (Prueba)
Agitar cada tubo e incubar 15 min. y leer en el espectrofotómetro a 540-546 nm de longitud de onda.
[Prueba de Glucosa] mg/dl
Prueba de Glucosa mg/dl = F x Ap
Ap x Cs / As
Ap: Absorbancia del problema/muestra Cs: Concentración Standard As: Absorbancia Standard F: factor obtenido por curva de calibración o casa comercial en caso de ser provisto
Calcular los resultados y reportarlos.
1. Redactar conclusiones y discusión que se deriven de los datos obtenidos por el grupo de trabajo, de acuerdo a los valores de referencia; analizar si los resultados obtenidos
están de acuerdo con la hipótesis planteada.
2. Consultar los valores de referencia en ayunas para recién nacidos, niños, adolescentes, adultos y ancianos.
PRÁCTICA N o 5
Determinación de lípidos y lipoproteínas plasmáticas
1. Recordar la importancia y la clasificación de los lípidos presentes en el organismo
2. Describir los principios analíticos para la determinación del colesterol total, colesterol HDL y LDL, apolipoproteínas y triglicéridos plasmáticos.
3. Calcular la concentración de VLDL y LDL a partir de las concentraciones de colesterol total, HDL y triglicéridos.
4. Describir las diferentes fuentes de colesterol, su función y la dinámica del colesterol plasmático.
5. Describir la composición y la función de las lipoproteínas.
La grasa de los alimentos es una fuente importante de energía. La grasa en la dieta puede venir tanto de productos animales como de los vegetales. Los lípidos o grasas pueden ser consumidos en la dieta y también ser sintetizados por el organismo. En el hombre, los lípidos comprenden un grupo variado de sustancias, así tenemos: los ácidos grasos, triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos y el colesterol. Los lípidos tienen un papel fisiológico importante para el buen funcionamiento de todas y cada una de las células del organismo. Así, el tejido adiposo bajo la piel sirve como reserva energética y ayuda a mantener la temperatura corporal. Los lípidos forman parte de la membrana de todas las células y llevan mensajes al interior de las mismas para su normal funcionamiento. Además, un alto porcentaje del tejido nervioso está constituido por lípidos y algunas hormonas entre ellas las hormonas sexuales, estrógenos y testosterona, se derivan del colesterol. Otros, lípidos como las prostaglandinas y leucotrienos son mediadores del proceso inflamatorio en la respuesta inmune contra infecciones. La grasa en las comidas ayuda al transporte y almacenamiento de las vitaminas liposolubles A, D, E, y K. Finalmente, los lípidos dan la sensación de llenura después de comer y mejoran el sabor de los alimentos.
Los lípidos de la dieta son insolubles en el medio acuoso intestinal por lo que para su absorción estos deben ser emulsificados (solubilizados) por las sales biliares hepáticas. Una vez que los lípidos han sido emulsificados, estos pueden ser substrato de las lipasas pancreáticas (lipasa, fosfolipasa A 2 ) que convierten los triglicéridos de la dieta en ácidos grasos libres y en mono y diacilgliceroles para que puedan ser absorbidos por las células epiteliales del intestino delgado. En el interior de las células epiteliales, se re-sintetizan los triglicéridos a partir de los ácidos grasos libres y de los acilgliceroles y son “empacados” en los llamados quilomicrones que son un tipo de lipoproteína para su transporte a otros
tejidos para su almacenamiento u oxidación. Una lipoproteína es una estructura esférica formada de una parte central lipídica (triglicérido, colesterol) rodeada por una capa de proteínas que permite el transporte de todos los lípidos en el medio acuoso del plasma. La fracción proteica de las lipoproteínas se conoce como apolipoproteína. Se han aislado y caracterizado seis clases principales de apoproteínas A, B, C, D, E y (a). Además de las principales clases de lipoproteínas existe la lipoproteína (a) Lp(a), la cual tiene una composición lipídica muy similar a la LDL, contiene apoB y una glicoproteína llamada apo(a). La apo(a) es polimórfica (de longitud y secuencia) y tiene una gran homología con el plasminógeno. Esta homología es importante porque en la actualidad se asocia a la Lp(a) con el bloqueo de la activación del plasminógeno y la consiguiente lisis de los coágulos de fibrina, así como con la estimulación de la proliferación de células musculares lisas, procesos que pueden dar origen a lesiones ateroscleróticas.
Los triglicéridos endógenos, sintetizados en el hígado, son empacados en las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) para ser transportados a las células extra hepáticas. Por otro lado las lipoproteínas de baja densidad (LDL) transportan colesterol desde el hígado a los diferentes tejidos y las lipoproteínas de alta densidad (HDL) transportan colesterol desde las células extra hepáticas al hígado.
La oxidación y subsecuente generación de energía a partir de los ácidos grasos se realiza en la mitocondria de las células mediante el fenómeno de β-oxidación. Se llama β - oxidación porque este fenómeno ocurre mediante la remoción secuencial de unidades de dos-carbonos de la posición β del ácido graso que está siendo degradado. Existen cuatro pasos en la β -oxidación, una oxidación dependiente de FAD, una hidratación, una oxidación dependiente de NAD, y una reacción de tiólisis que incluye a la coenzima A (CoA). Cada ciclo de β-oxidación produce un mol de NADH, un mol de FADH 2 y un mol de Acetil-CoA. La Acetil-CoA es completamente oxidada en el ciclo de Krebs a CO 2 con la generación concomitante de tres moles de NADH, un mol de FADH 2 , y un mol de ATP. El NADH y FADH 2 generados en la β-oxidación entran subsecuentemente en la vía respiratoria para la síntesis de ATP. El resultado de la oxidación completa de un mol del ácido oleico de 18 carbones es 146 moles de ATP. El paso limitante en la β -oxidación de los ácidos grasos es la disponibilidad de la enzima lipoacilcarnitina.
En relación a la síntesis de ácidos grasos, a diferencia de su degradación, ésta ocurre en el citoplasma celular utilizando como co-factor al NADHP. La síntesis de ácidos grasos se inicia a partir de la Acetil-CoA citoplasmática. Esta última proviene del metabolismo intramitocondrial de la β-oxidación y de la actividad de la enzima piruvato deshidrogenasa. Cuando la necesidad de energía de la célula disminuye y no hay necesidad de generar energía por medio de la β-oxidación o la oxidación de los carbohidratos, las unidades de Acetil-CoA entonces pueden ser almacenadas en forma de lípidos (ácidos grasos) para su eventual utilización. Las unidades de Acetil-CoA mitocondriales son entonces transportadas al citoplasma en forma de citrato. En el citoplasma el citrato es convertido a Acetil-CoA. Durante la síntesis de ácidos grasos la Acetil-CoA está temporalmente unida al complejo enzimático de síntesis como malonil-
CoA. La síntesis de malonil-CoA a partir de Acetil-CoA está catalizada por la Acetil- CoAcarboxilasa que es el sitio más importante de regulación en la síntesis de ácidos grasos. La síntesis de ácidos grasos a partir de la Acetil-CoA y la malonil-CoA se lleva a cabo por la enzima sintasa de ácidos grasos (SAG). La sintasa de ácidos grasos es un dímero de subunidades idénticas con múltiples actividades enzimáticas. La síntesis de ácidos grasos también requiere de cuatro actividades enzimáticas que están dadas por la β-cetoacil-proteína portadora de acilos sintasa (CSasa); la β-cetoacil-proteína portadora de acilos reductasa, la 3-OH-acil- proteína portadora de acilos deshidratasa y la enoil- CoAreductasa. El principal ácido graso sintetizado por la SAG es el palmitato. Luego de su síntesis el palmitato es separado de la enzima y puede posteriormente ser elongado y/o desaturado para dar origen a otras moléculas de ácidos grasos.
El consumo exagerado de grasa especialmente de tipo saturada de origen animal o insaturada del tipo omega-6 es un factor de riesgo para la salud, en particular para el desarrollo de enfermedades vasculares como la arteriosclerosis y enfermedades crónicas degenerativas como la artritis reumatoide. La elevación crónica de los niveles de triglicéridos y colesterol a nivel sanguíneo eventualmente lleva al desarrollo de una inflamación crónica a nivel del endotelio vascular que termina con la formación de las denominadas placas ateromatosas.
Los dos lípidos en sangre con un máximo interés en el diagnóstico clínico son el colesterol y los triglicéridos, ambos se transportan en las lipoproteínas. Estudios epidemiológicos han establecido que mientras mayor sea la concentración del HDL colesterol, menor será el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria. Por otro lado, cifras elevadas de LDL colesterol y/o ácidos grasos in-saturados omega-6 son aterógenas.
La prueba de laboratorio más informativa es la que mide el “perfil lipídico” sanguíneo completo que incluye: colesterol total, HDL, LDL, y triglicéridos. El Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol del Instituto Nacional de corazón, sangre y pulmón (NCEP) recomienda los siguientes valores de lípidos en sangre para personas mayores de 20 años:
Lipoproteínas de baja densidad (LDL):
Si el paciente ya tiene una enfermedad cardiovascular, se recomienda un valor de LDL menor a 100 mg/dl.
Lipoproteínas de alta densidad (HDL):
En general, un valor de HDL inferior a 35 mg/dl es bajo mientras que un valor de 60 mg/dl es muy bueno y puede anular otros factores de riesgo (valores normales de HDL para hombres 44-45 mg/dl y para mujeres 55 mg/dl).
El radio entre HDL/LDL puede utilizarse como valor predictivo de enfermedad cardiaca, se considera que este radio debe ser aproximadamente 0.34  0.11.
Se considera que un valor normal de triglicérido está entre 90-150 mg/dl.
Los siguientes son factores que influyen en la determinación de los niveles de colesterol o lipoproteínas y que deben ser tomados en cuenta cuando se analicen los datos de laboratorio:
-Durante el periodo menstrual el LDL puede ser más bajo y el HDL más alto -Las píldoras anticonceptivas pueden incrementar el LDL y disminuir el HDL -Los niveles totales de colesterol pueden incrementarse durante el embarazo y permanecer elevados hasta por veinte semanas después del parto -La terapia de reemplazo de estrógenos puede disminuir el colesterol total y el LDL e incrementar el HDL
Fundamento de las determinaciones La evaluación de los pacientes en los que se sospecha alguna alteración en los lípidos plasmáticos puede incluir la medición de colesterol total, triglicéridos, y de una o más lipoproteínas. Además la cuantificación de Lp(a), apoA1 y ApoB, o la actividad de la lipoproteína lipasa u otras enzimas, está siendo valorada para incluirla como procedimiento clínico de rutina.
Determinación de Colesterol total: el colesterol es igual a la suma del colesterol contenido en las tres lipoproteínas que lo transportan
Colesterol total = colesterol VLDL  colesterol HDL  colesterol LDL
El colesterol existe en el organismo en dos fracciones, una en estado libre y la otra esterificado, por lo cual para su determinación se utiliza una serie de reacciones enzimáticas donde en una primera fase, los esteres se hidrolizan dejando libre el grupo 3- OH del colesterol. En la segunda reacción, este grupo se oxida y se obtiene como un producto, el peróxido de hidrógeno, el cual por efecto de la peroxidasa, transfiere uno de sus oxígenos a un aceptor cromógeno. La absorbancia del cromógeno (4-benzoquinona- monoimino-fenazona) se determina a 546 nm y es proporcional a la concentración de colesterol. La reacción global es la siguiente:
Colesterol Ácidos grasos
Colesterol  O 2
4-colestenona + H 2 O 2
2 H 2 O 2 + 4-aminoantipirina+ fenol
quinoneimina + 4 H 2 O
Determinación de Triglicéridos (TG): El método utilizado se basa en la hidrólisis de los TG por una lipasa y la determinación del glicerol liberado en la reacción. Para ello, el glicerol es fosforilado por la glicerol cinasa formando glicerol 1-fosfato, el cual se oxida por la glicerol fosfato oxidasa a dihidroxiacetona fosfato generando en la reacción peróxido de hidrógeno. La peroxidasa cataliza la transferencia de oxígeno del peróxido a un aceptor que es un cromógeno, como la 4-aminoantipirina (4-AAP) y el 3,5-dicloro-2- hidroxibencensulfonato (DHBS) que se colorean al oxidarse. La absorbancia a 520 nm es proporcional a la concentración de TG. La reacción completa se expresa:
glicerolcinasa
glicerofosfato oxidasa Glicerol-3-fosfato + O 2
glicerol-3-fosfato + ADP
dihidroxiacetona-P+ H 2 O 2
H 2 O 2 + 4-AAP + DHBS
cromógeno oxidado + H 2 O
Determinación de colesterol HDL: Por regla general, el análisis de las lipoproteínas del plasma requiere primero, la separación de todas las clases de lipoproteínas y segundo, la medición de la lipoproteína o del componente lipoprotéico de interés. Para la determinación de HDL, la medición es relativamente simple si se precipitan todas las lipoproteínas que contienen ApoB [VLDL, IDL, LDL y Lp(a)] con un poli anión como los glucosaminoglicanos con carga negativa (heparina, dextrano o fosfotungsteno) y un catión
bivalente (Mn o Mg). Las lipoproteínas precipitadas pueden ahora separarse del colesterol HDL que queda en solución. El colesterol HDL puede ahora medirse utilizando el método descrito anteriormente para el colesterol total (ver descripción anterior). La relación colesterol total/colesterol HDL se considera como otro indicador de riesgo coronario. Normalmente esta relación es menor a 5. Mientras más baja sea la relación colesterol total/colesterol HDL, menor será el riesgo para las personas.
Determinación de colesterol VLDL: En general, la concentración de TG en el plasma sanguíneo proporciona un parámetro excelente para calcular la concentración de las VLDL. Es importante que el paciente esté en condiciones de ayuno. Así, el cálculo se realiza de la siguiente forma:
Esta fórmula no es apropiada para muestras con una concentración de TG mayores a 400 mg/dl.
Determinación de colesterol LDL: Aproximadamente las dos terceras partes del colesterol plasmático total son transportadas en las LDL, de tal manera que la concentración de este lípido proporciona una medida bastante precisa del nivel de LDL en la mayoría de las personas. Por ello es posible estimar con bastante exactitud, en casi todos los casos, la concentración de LDL sobre la base del conocimiento de la concentración de VLDL (estimada por los TG) y la del colesterol total. No obstante, para estimar con mayor exactitud la concentración de LDL debe cuantificarse la concentración de HDL, lo cual es relativamente simple. Las LDL se calculan de la siguiente manera:
Colesterol LDL = Colesterol total – (Colesterol HDL + Colesterol VLDL)
El colesterol LDL puede también determinarse mediante otras técnicas de laboratorio.
Quilomicrones: Cuando existen quilomicrones pueden ser detectados si se deja el tubo de ensayo que contiene el plasma sanguíneo en el refrigerador durante una noche. Los quilomicrones de mayor tamaño, pero no las VLDL, se ubicarán en la superficie del tubo formando una capa cremosa que se detecta visualmente. La presencia de quilomicrones en el plasma en ayunas se considera anormal.
Determinación de Lp(a): La Lp(a) se determina por métodos inmunoquímicos y su concentración constituye un factor independiente del riesgo coronario.
Determinación de apoA y apoB: La técnica más usada en la determinación de estas apo proteínas es el inmunoanálisis ligado a enzimas (ELISA) y de fluorescencia. La determinación de apoproteínas, es un dato complementario en la cuantificación de otros componentes lipoprotéicos.
Materiales y Métodos Gradillas con tubos de ensayo Pipetas automáticas de 100 y 1000 ul. Kits comerciales para determinar colesterol y HDL colesterol y TG Espectrofotómetro Baño María (37°C) Centrífuga Material para extracción de sangre (tubos al vacío, algodón con alcohol, torniquete)
NOTA: Obtener suero de un voluntario. El plasma o suero postprandial contiene quilomicrones, lo que puede aumentar marcadamente la concentración plasmática de TG, por ello idealmente la muestra se toma después de 12 horas de ayuno.
Para determinar los Colesterol Total (CH) preparar la siguiente serie de tubos:
Prueba CH
Standard colesterol
Reactivo colesterol
Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C Leer la absorbancia (A) en el espectrofotómetro a 540 nm; calibrar el cero con el blanco de reactivo.
Para determinar los HDL-Colesterol preparar la siguiente serie de tubos:
Standard HDL colesterol
Reactivo ENZIMA (ENZ)
Mezclar e incubar 5 minutos EXACTOS a 37°C
Reactivo SUSTRATO (SUB)
Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C Leer la absorbancia (A) en el espectrofotómetro a 578 nm; calibrar el cero con el blanco de reactivo.
Para determinar los Triglicéridos (TG) preparar la siguiente serie de tubos:
Standard triglicéridos
Muestra (TG)
Reactivo trigliceridos
1. Calcular la concentración de colesterol
Colesterol = F x Ap Colesterol = Ap x Cs / As
2. Calcular la concentración de HDL colesterol Colesterol = F x Ap Colesterol = Ap x Cs / As
3. Calcular la concentración de TG:
Triglicéridos = F x Ap Triglicéridos = Ap x Cs / As
F: factor obtenido por curva de calibración o casa comercial en caso de ser provisto Ap: Absorbancia de la prueba/muestra Cs: Concentración Standard As: Absorbancia Standard
1. Calcular los resultados y reportar (colesterol total, HDL, LDL, VLDL, triglicéridos)
2. Compare los resultados con los valores normales
1. Redactar conclusiones y discusión que se deriven de los datos obtenidos por el grupo de trabajo, de acuerdo a los valores de referencia.
PRÁCTICA N o 6
Determinación de Proteínas totales / Albúmina:
1. Identificar el papel de las proteínas y de la albúmina en el organismo
2. Reconocer la utilidad clínica que tiene la determinación de proteínas y albúmina en suero
3. Describir los mecanismos involucrados en la digestión y absorción de proteínas
4. Interpretar y discutir un trabajo científico del metabolismo de aminoácidos o proteínas
El objetivo fundamental de la oxidación de carbohidratos y grasas es producir energía. Debemos ahora indicar que el metabolismo del otro macro nutriente de la dieta humana, las proteínas, es necesario para reemplazar las proteínas degradadas en los tejidos y para proveer sustancias nitrogenadas para la síntesis de proteínas.
Las proteínas constituyen la mayor porción de solutos en el plasma. Las proteínas del suero se dividen en dos fracciones Albúmina y Globulina. La albúmina representa el más abundante constituyente de las proteínas, mientras que las globulinas son un grupo heterogéneo de componentes como las inmunoglobulinas, complemento, enzimas, factores de coagulación, hormonas y proteínas de transporte específicas.
La determinación de las proteínas totales es útil en la detección de hiperproteinemia debido a la hemoconcentración como en las deshidrataciones y varias condiciones de hiperglobulinemia con mieloma múltiple, marcoglobulinemia de Wadenstrom, infecciones y ciertas enfermedades hepáticas y otro estado patológico asociado con un incremento de uno o más de las muchas proteínas encontradas en suero. Los ensayos de proteínas totales son útiles también en la detección de hipoproteinemia observada en la mal nutrición, enfermedades renales asociadas con pérdida de proteínas, edema, hemorragias, procesos malignos y otras condiciones.
La cuantificación de albúmina, proporciona mayor información del estado nutricional, de la capacidad sintetizadora del hígado o de nefropatía por perdida de proteínas. Permite además interpretar niveles elevados o disminuidos de calcio y magnesio, ya que la albúmina fija alrededor de la mitad de cada uno de estos iones.
Los cálculos de diferencia entre la proteína total y albúmina dan el valor de globulinas, compuesta por varias fracciones que individualmente pueden elevarse en trastornos graves.
La electroforesis de proteínas, separa las globulinas de la albúmina y fija las principales proteínas del suero en patrones que pueden ser altamente específicos para algunas
enfermedades. Esta prueba puede constituir un instrumento útil para vigilar a pacientes durante periodos prolongados, en casos de alteraciones marcadas en los niveles de proteínas determinadas, como en el mieloma, el síndrome nefrótico, la cirrosis o en casos de quemadura corporal extensa.
La proteína más abundante en el plasma es la albúmina, que habitualmente constituye 2/3 de las proteínas totales del plasma, por esta razón la disminución del nivel de albúmina causada por un deterioro en la síntesis o perdidas (ascitis, nefropatía o enteropatía con pérdida de proteínas) da como resultado un grave desequilibrio de la presión osmótica intravascular. Esta pérdida se manifiesta clínicamente por el desarrollo de edema periférico. La ausencia congénita de albúmina (analbuminemia) no conduce a estos problemas, posiblemente a causa de mecanismos compensadores que se mantienen de por vida y controlan las presiones hidrostáticas. La albúmina también sirve como depósito móvil de aminoácidos desde el hígado, desde donde es sintetizada a otros tejidos, en donde se desdobla intracelularmente en aminoácidos libres para su incorporación a otras proteínas. Una tercera función atribuida a la albúmina es como transporte general o proteína vehiculizadora. Muchas sustancia orgánicas e inorgánicas susceptibles de ser ligadas (p. ej. tiroxina, bilirrubina, penicilina, cortisol, estrógeno, ácidos grasos libres, cumarina, calcio, magnesio, hem) forman complejos con diferentes regiones de la molécula de albúmina en forma covalente (p. ej. Delta-bilirrubina) o disociables. Estas interacciones de fijación con muy diferentes sustancias susceptibles de ser ligadas son posibles debido a una amplia variedad de lugares de fijación sobre la molécula de albúmina, que consta de 585 aminoácidos dispuestos en nueve asas que se mantienen juntas mediante enlaces disulfuro entre restos de cisterna. La secuencia primaria de albúmina contiene tres regiones principales con tres asas peptídicas.
PROCEDIMIENTO DE PROTEINAS TOTALES (Reacción de Biuret) UNDAMENTO El procedimiento de proteínas totales es una modificación de la reacción de Biuret descrito originalmente por Kingsley. Un color violeta resulta cuando los iones cúpricos en medio alcalino se unen con los electrones no saturados de los átomos de nitrógeno y oxígeno de los enlaces de todas las proteínas. La cantidad de color producido es proporcional a la concentración de proteínas y es medida espectrofotométricamente a 550 nm.
Dejar en reposo por 5 min. a temperatura ambiente (15-30°C). Ajuste el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 546-550 nm. Usando blanco de reactivo. Lea y registre los valores de la absorbancia del estándar y prueba.
VALORES DE REFERENCIA 6.4-8.3 g/dl
[Prueba Proteína] g/dl =
Prueba Proteína g/dl = F x Ap
LIMITACIONES La reacción de Biuret no es suficientemente sensible para permitir la determinación de proteínas en fluidos con baja concentración, tales como orina y líquido cerebro espinal. En algunos casos, una disminución de una fracción de las proteínas totales está acompañada por el incremento de otras fracciones. Por consiguiente, la determinación de las proteínas totales no refleja por sí sola la naturaleza o la extensión de la anormalidad existente. En tales casos, la determinación de ALBUMINA / GLOBULINA (A/G) es sugerido para llevar a cabo la diferenciación. Después de determinar las PROTEINAS TOTALES y ALBUMINA la relación A/G puede ser calculado como sigue:
------------------------------------------------------------- = A/G
Proteínas totales (g/dl) -- ALBUMINA (g/dl)
VALORES DE REFERENCIA RAZON A/G 1.1 - 2.5 PROCEDIMIENTO DE ALBUMINA METODO BCG (Bromo Cresol Verde)
FUNDAMENTO Este procedimiento está basado en las propiedades de albúmina sérica de copularse con colorantes, en este caso con el BCG. La absorbancia de BCG a 546 nm incrementa al unirse con la albúmina y es proporcional a la concentración de albúmina presente en el suero.
Dejar en reposo por 5 min. a temperatura ambiente (15-30°C). Ajuste el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 546 nm. Usando blanco de reactivo. Lea y registre los valores de la absorbancia del estándar y prueba.
VALORES DE REFERENCIA 3.5 a 5.5 g/dl
[Prueba Albumina] g/dl =
Prueba Albumina g/dl = F x Ap
LIMITACIONES Los calibradores y controles usados en esta técnica deberán contener albúmina humana ya que las propiedades de unión a colorantes varían entre las diferentes especies animales.
1. Calcular los valores de Proteínas totales, Albumina y Globulina en base a las formulas indicadas.
2. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de las muestras
procesadas por los diferentes grupos.
1. Redactar conclusiones y discusión que se deriven de los datos obtenidos por el grupo
de trabajo, de acuerdo a los valores de referencia.
2. ¿Qué conclusión puede sacar en base al coeficiente de variación obtenido?
3. Calcular la razón A/G de las muestras procesadas, e indique la importancia de este dato.
4. Consultar los valores de referencia de PROTEINAS, ALBUMINA, GLOBULINA en ayunas para recién nacidos, niños, adolescentes, adultos y ancianos.
PRÁCTICA N o 7
Determinación de transaminasas séricas (GPT y GOT)
1. Describir las reacciones de transaminación e identificar los sustratos, enzimas y productos de la actividad de las transaminasas.
2. Identificar el papel de la transaminasa glutámico pirúvica (GPT) en el metabolismo de los compuestos nitrogenados.
3. Identificar el papel de la transaminasa glutámico oxalacética (GOT) en el metabolismo de los compuestos nitrogenados.
4. Reconocer la utilidad clínica que tiene la determinación de la actividad de la GPT y de la GOT en el suero.
Las proteínas constituyen la mayor parte de la materia estructural del organismo después del agua, son macronutrientes presentes en prácticamente todos los alimentos que integran la dieta de los seres humanos, sus unidades estructurales llamadas aminoácidos son 22 en total. Los aminoácidos que pueden ser no esenciales aquellos que pueden ser formados en el organismo, mientras que aquellos que deben ingresar en la dieta y que no los podemos sintetizar se denominan esenciales. Las proteínas en cuya estructura existe abundancia de aminoácidos esenciales tienen un valor nutritivo mayor que aquellas en donde la presencia de aminoácidos esenciales es mínima. En general, las proteínas animales como la leche, carne, huevos, tienen un alto valor nutritivo. Las proteínas de los vegetales no contienen cantidades altas de aminoácidos esenciales y por tanto su valor nutritivo es menor.
Una característica esencial de los aminoácidos es que estos son compuestos nitrogenados. Los seres humanos dependemos de otros organismos para convertir el nitrógeno atmosférico en formas que puedan ser utilizadas por el organismo (aminoácidos, proteínas, amoníaco de las bacterias intestinales). En el organismo existen dos enzimas muy importantes la glutamato deshidrogenasa y la glutamina sintasa que catalizan la conversión (incorporación) de amoníaco en los aminoácidos glutamato y glutamina, respectivamente. Los grupos amina y amida de estos dos aminoácidos pueden ser transferidos a otros esqueletos de carbonos mediante reacciones de transaminación y transamidación. Existen aminotransferasas para todos los aminoácidos excepto para treonina y lisina. El glutamato y el α-cetoglutarato son los principales donadores o aceptores en reacciones de transaminación. Las aminotransferasas del suero, aminotransferasa-glutamato-oxalacetato (SGOT; llamada también aminotransferasa de aspartato AST) y aminotransferasas-glutamato-piruvato (SGPT; llamada también transaminasa de alanina, ALT) se utilizan como marcadores clínicos de daño tisular. El hígado es el órgano más importante del metabolismo del nitrógeno.
Las reacciones de transaminación son las reacciones más importantes que llevan a la eliminación del nitrógeno de los aminoácidos del organismo. Por medio de esta reacción el nitrógeno liberado de los amino ácidos que no están formando proteínas es llevado a un grupo pequeño de compuestos los mismos que pueden ser desaminados por oxidación produciendo amoníaco o sus grupos aminos y luego son convertidos en urea en el ciclo de la urea para ser eliminados en la orina. La transaminación consiste en la remoción de un grupo α-amino a partir de un α-aminoácido donador al carbón ceto de un α-cetoácido aceptor. Debido a la participación del α-cetoglutarato en varias transaminaciones, el glutamato es un intermediario importante en la eliminación del nitrógeno así como también en las vías anabólicas de asimilación de nitrógeno. El glutamato que se forma en la eliminación del nitrógeno puede ser desaminado por oxidación por la glutamato deshidrogenasa, formando amoníaco, o puede ser convertido a glutamina por la sintasa de glutamina y ser transportado a las células de los túbulos renales. Allí la glutamina es desaminada secuencialmente por la glutaminasa y la glutamato deshidrogenasa del riñón. El amoniaco es eliminado en forma de NH4 + en la orina en donde ayuda al mantenimiento del pH urinario (valores normales entre 4 a 8). El amoniaco es tóxico para el organismo, la concentración normal de este compuesto está entre 20-40 mM. Un incremento de amoniaco a 400 mM llevaría al desarrollo de alcalosis y neurotoxicidad.
Se ha indicado que la glutaminasa renal es la responsable de convertir el exceso de glutamina proveniente del hígado a amoníaco urinario. No obstante, debemos indicar que hasta el 80% del nitrógeno que se elimina sale en forma de urea (formada principalmente en el hígado). En el ciclo de la urea, la arginina de la dieta o de la degradación de las proteínas, es dividida por la enzima citosólicaarginasa dando lugar a la formación de urea y ornitina. En reacciones subsecuentes, una nueva molécula de urea se formara a partir de la ornitina, regenerando arginina y perpetuando el ciclo. La única función del ciclo de la urea es la eliminación del exceso de nitrógeno. Este ciclo por tanto estará activo cuando la ingesta de proteínas sea alta o durante el catabolismo de proteínas endógenas (e.g. ayuno). La ausencia de enzimas del ciclo de la urea no es compatible con la vida. Se han descrito deficiencias de algunas de estas enzimas (alteraciones del ciclo de la urea) cuyo denominador común es la hiperamonemia que se caracteriza por ataxia, convulsiones, letargia, anorexia, coma y hasta la muerte, si no es tratada prontamente. En general el tratamiento de las alteraciones del ciclo de la urea consiste en la disminución de la proteína de la dieta, eliminación del exceso de amoníaco y el reemplazo de las enzimas defectuosas del ciclo de la urea.
El elevado número de aminoácidos y la variedad de sus esqueletos carbonados aumentan considerablemente las dificultades para hacer un estudio sistemático del metabolismo de todos los aminoácidos. Sin embargo, es posible describir una serie de reacciones generales del metabolismo de los aminoácidos como son las reacciones de transaminación, desaminación y descarboxilación.
Para la oxidación del esqueleto carbonado de los aminoácidos, primero se pierde el grupo amino (desaminación). El grupo amino es entonces transferido a un α-cetoácido por la acción de una aminotransferasa especifica (transaminasa). El grupo amino del aminoácido que se ha formado en la primera reacción, generalmente el glutamato, se pierde en un proceso llamado desaminación oxidativa por la glutamato deshidrogenasa en el cual se vuelve a recuperar el cetoácido con producción de NADPH y liberación de amonio.
Aminotransferasa (AST) L-glutamato + oxalacetato (L-aspartato)
Aminoácido + α-cetoglutarato
Oxalacetato + NADH + H +
L-malato + NAD +
La descarboxilación produce compuestos aminados que tienen importantes propiedades fisiológicas como la histamina (por la acción de la histidina decarboxilasa) la beta-alanina (por la aspartatodescarboxilasa).
Entre los estudios realizados con las transaminasas han merecido especial atención los llevados a cabo con las transaminasas glutámico pirúvica (GPT) y glutámico oxalacética (GOT). Estas enzimas se encuentran en todos los tejidos y se relacionan principalmente con los procesos de ¨escape¨ de enzimas del miocardio o del hígado cuando ocurre un daño en estos tejidos. Dichas enzimas de escape llegan al torrente circulatorio por lo cual sus niveles séricos están sensiblemente aumentados cuando hay daño tisular. Los niveles séricos aumentados de la GPT se relacionan con trastornos hepatocelulares, sobre todo en la hepatitis infecciosa aguda y otras formas de necrosis hepáticas.
En esta práctica se determina la cantidad de piruvato, uno de los productos de la acción de la GOT o GPT sobre el sustrato alanina/α-cetoglutarato.
La cantidad de piruvato formado presente en el suero problema se identifica mediante la reacción del piruvato con la 2,4-dinitrofenil hidracina para formar la hidrazona correspondiente. Este compuesto produce, con el hidróxido de sodio, una coloración café que es proporcional a la cantidad de piruvato formado, éste es a su vez un índice de la actividad de la enzima.
α-oxoglutarato + L-alanina
Piruvato + NADH +
L-glutamato + piruvato
L-lactato + NAD +
Materiales y Métodos Gradillas con tubos de ensayo Pipetas de 100 y 1000 ul. Kits comerciales para determinar GPT / GOT Espectrofotómetro UV Baño María de 37°C y termómetro Centrifuga Material para extracción de sangre (tubos al vacío, algodón con alcohol, torniquete).
Para la determinación de GPT / GOT preparar los siguientes tubos.
Sol. reactivo GPT o GOT(ml)
1 ml (1000 µl) 1 ml (1000 µl)
Mezclar y activar el cronometro. Leer la absorbancia después de exactamente 1 y 2 minutos, anotar la absorbancia 1 y 2
Ajuste el espectrofotómetro a cero de absorbancia a 340 nm. Usando como blanco agua destilada.
VALORES DE REFERENCIA GPT: Hombres = hasta 37 U/l – Mujeres = hasta 31 Ul GOT: Hombres = hasta 42 U/l – Mujeres = hasta 32 Ul
Resultados Valores de la actividad enzimática de:
U/l de GPT a 25° C= ∆A/min. x (F) U/l de GOT a 25° C= ∆A/min. x (F)
1. Calcular los valores de GPT y GOT en base a las formulas indicadas.
2. Calcular la media, la desviación estándar y el coeficiente de variación de las muestras procesada en el curso
3. Consultar los valores de referencia de PROTEINAS, ALBUMINA, GLOBULINA, A/G en ayunas para recién nacidos, niños, adolescentes, adultos y ancianos.
 Yepez, R. Bonilla, A. Cuadernos Didácticos de Bioquímica. SECIAN. 2013-2014.
 Murray RK, et al. Harper. Bioquímica Ilustrada. 28 va ed., Manual Moderno, 2010. ISBN: 9781615023097
 Text Book of Biochemistry with clinical correlations 5 th edition by Thomas M. Devlin, 2002.
 Henry, JB. Clinical Diagnosis and management by laboratory methods. 24 th ed. W.B. Saunders Company, 2009.
 Manual de Prácticas de laboratorio. Programa de Actividades Experimentales y Seminarios. UCE. 2012.
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