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Timestamp: 2017-01-16 19:10:40+00:00

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Química+analítica+instrumental Química+analítica+instrumental
1. 1 Química Analítica Instrumental © 2013 Dr. José María Fernández Álvarez Facultad de Ciencias Universidad de Navarra Química Analítica Instrumental Tema 1.- Fundamentos de espectroscopía. La radiación electromagnética. Propiedades ondulatorias de la radiación. Aspectos mecanocuánticos de la radiación. Espectroscopía atómica y molecular. Tema 2.- Diseño y componentes de los instrumentos espectroscópicos. Fuentes de radiación. Células. Selectores de longitud de onda. Detectores. Tratamiento de señales. Tema 3.- Espectroscopía UV-visible. Sistemas que absorben en el UV-visible. Ley de Beer. Instrumentación. Métodos y aplicaciones. Tema 4.- Espectroscopía de luminiscencia molecular. Fluorescencia y fosforescencia. Quimioluminiscencia. Instrumentación. Aplicaciones. Tema 5.- Principios de espectroscopía atómica. Espectros atómicos de emisión y absorción. Términos espectrales. Anchuras de línea. Atomización por llama y electrotérmica. Elección de las condiciones óptimas. Atomización con fuentes de plasma. Atomización con arco y chispa. Instrumentación. Aplicaciones. Tema 6.- Clasificación de las Técnicas Electroanalíticas. Leyes Generales. Fenómeno Electródico. Límite de Electroactividad. Montaje Potenciostático. Electrodos selectivos de iones. Tema 7.- Etapas de la Reacción Electroquímica: control difusional; capa de difusión; hipótesis de Nernst; flujo difusional y convectivo; leyes de Fick. Curvas i-E. Potenciales de equilibrio, mixto y límite. Tema 8.- Valoraciones amperométricas y potenciométricas. Sistemas autoindicadores. Sistemas electroquímicos indicadores de reacciones en equilibrio. Tema 1. 1. Fundamentos de la espectroscopía. 2. La radiación electromagnética. 3. Propiedades ondulatorias de la radiación. 4. Aspectos mecanocuánticos de la radiación. 5. Espectroscopía atómica y molecular. Introducción La Química Analítica es la ciencia que identifica los componentes de una muestra (análisis cualitiativo) y que determina las cantidades relativas de cada uno de ellos (análisis cuantitativo). Generalmente se precisa una separación previa del analito de interés. Métodos Clásicos: Química por vía húmeda (volumetrías, gravimetrías y análisis cualitativo sistemático) Métodos Instrumentales: explotan las propiedades físicas del analito para obtener información cualitativa y cuantitativa Espectroscopía: estudia la interacción del campo eléctrico de la radiación electromagnética con la materia mediante fenómenos de absorción, emisión y dispersión de luz Algunas modalidades espectrométricas Regiones del espectro electromagnético
2. 2 Regiones del espectro electromagnético Interacción de la energía radiante con la materia Interacción de la energía radiante con la materia Interacción de la energía radiante con la materia La luz: radiación electromagnética La luz tiene una naturaleza dual: • Corpuscular (fotones) • Ondulatoria (ondas) Ver Skoog, pag. 135-7 La luz: niveles discretos de energía El principio de quantización de la energía implica que sólo son posibles ciertos valores discretos de energía.
3. 3 La luz y su interacción con la materia: niveles discretos de energía Onda electromagnética 1 s][hertz][ s ciclos ][   Frecuencia: número de ciclos por unidad de tiempo. Depende de la fuente emisora y permanece invariante, independientemente del medio que atraviese. Periodo: tiempo empleado en un ciclo completo. T = 1/ [=] s Longitud de onda, i: distancia entre dos máximos o mínimos sucesivos. Número de onda: número de ondas por cm.     ·K v 1 ;cm][ 1 i 1 i Velocidad de propagación: vi =  · i v y  son función del medio que atraviesan En el vacío, la velocidad de la radiación se hace independiente de la longitud de onda y alcanza su valor máximo. c =  ·  = 3,00·108 ms-1 Onda electromagnética Potencia, P, es la energía expresada en watios que alcanza un área determinada por unidad de tiempo Intensidad, I, es la potencia de la radiación por unidad de ángulo sólido    ·c·h c·h ·hE h, constante de Planck = 6,63·10-34 J s La P de un haz es directamente proporcional al número de fotones por segundo. Figuras de interferencias La amplitud de la onda resultante depende del desfase entre las ondas individuales Interferencias constructivas y destructivas A desfase cero,  =0, se obtiene la interferencia constructiva máxima Para  = 180, se obtiene la máxima interferencia destructiva Superposición de ondas Animations courtesy of Dr. Dan Russell, Kettering University
4. 4 Transmisión de la luz a través de un medio: frenado de onda El frenado es función de la naturaleza y concentración de la materia atravesada. i i v c n Índice de refracción Curva de dispersión refractiva Lentes, n  cte. Prismas ni = f (i) vi = f (i) Dispersión de la luz (scattering) Radiación dispersada en todas las direcciones Centro dispersante (p.e.: molécula, partícula insoluble o coloidal) Haz incidente Rayleigh Dispersión de la luz (scattering) La mayoría de los fotones dispersados tienen la misma frecuencia que la fuente (dispersión Rayleigh); sin embargo, la frecuencia de algunos fotones (aprox. 1 en 107) ha variado (dispersión Raman). Polarización Se dice que la radiación electromagnética está despolarizada cuando los vectores magnético y eléctrico alcanzan la misma magnitud en todas las direcciones. La luz se dice linealmente polarizada cuando oscila en un único plano al moverse por el espacio. Luz polarizada en el plano y luz polarizada circular E = Eocost E = Eoe-t = Eocost + Eo sin t Luz polarizada en el plano Luz polarizada circular
5. 5 Refracción de la luz: ley de Snell 2211 θsennθsenn  Cambio abrupto de la dirección de una radiación al pasar de un medio a otro con distinta densidad, como consecuencia del cambio de velocidad de la radiación en los dos medios. 2 1 2 1 2 1 1 2 1 2 2 1 v v v c v c n n θsen θsen       Si el medio 1 es el vacío, n1 = 1 nvacío = 1,00027 · naire Reflexión de la luz Principio de Fermat: la luz sigue el camino más corto (menos tiempo). La longitud L de A a B es: Puesto que la velocidad es cte (mismo medio) la ruta de tiempo mínimo es la de distancia mínima que se puede calcular igualando a cero la derivada. Reflexión de la luz Si la rugosidad de la superficie límite es menor que la longitud de onda, entonces se produce una reflexión propiamente dicha, para la cual se cumple la ley de la reflexión (ángulo de incidencia = ángulo de reflexión). Por lo general se refleja únicamente una parte del rayo incidente, pues la otra penetra en el medio y es refractada. Si la rugosidad de la superficie límite es comparable a la longitud de onda del rayo incidente se obtiene una difusión (reflexión difusa) Si el rayo sobrepasa un ángulo límite determinado, se produce la denominada reflexión total. Reflexión de la luz Para un rayo que incida perpendicularmente a la superficie, la reflectancia viene dada por: i r 2 12 2 12 I I ρgeneral,eny, )n(n )n(n ρ     Pasar del aire (n=1) a vidrio (n=1,5) supone una reflectancia de  = 0,04 = 4% Si hay muchas superficies en el camino óptico, se producen muchas pérdidas: stray light Ii Ir Ver Skoog, pg 133 Ejemplo 6.2 Difracción de radiación monocromática por rendijas Difracción: todo haz paralelo de radiación electromagnética se curva al pasar por un objeto puntiagudo o por una rendija estrecha. La difracción es consecuencia de la interferencia y fue demostrada en 1800 por Young Difracción de radiación monocromática por rendijas OE DEBC OD DEBC λm θsenODDE ciainterferendeorden:m θsenBCλm θsenBCCFλ θCBF DOEBCF         Ver Skoog, pg 129-130 Ejemplo 6.1
6. 6 Radiación coherente Radiación emitida por una fuente cuando todas las ondas elementales emitidas poseen una diferencia de fase constante en el tiempo y en el espacio (IUPAC, 1997) La luz producida por un láser es: Monocromática (longitud de onda única) Coherente (en fase) Direccional (cono de divergencia estrechísimo) La lámpara incandescente produce una luz: Cromática Incoherente No direccional Fuente de luz monocromática: Coherente No direccional Diagrama simplificado de niveles energéticos + E rot E E = E electr + E vibr Átomos absorbentes: espectro atómico Los dos picos de absorción surgen de la promoción del electrón 3s a los dos estados 3p Absorción y resolución espectral Espectros de absorción Desactivación radiacional y no-radiacional
7. 7 Emisión atómica y molecular Emisión de un cuerpo negro: continuo de radiación vs. líneas discretas de RX )(VW (Stefan)T)W(B (Wien) T 1 λ 4 4 ν máx VISelen   Tema 2 1. Diseño y componentes de los instrumentos espectroscópicos. 2. Fuentes de radiación. 3. Células. 4. Selectores de longitud de onda. 5. Detectores. 6. Tratamiento de señales. Instrumentación general para espectroscopía Fuente Selector de  Celda Detector Detector y registrador de la señal M t Instrumentación general para espectroscopía Absorción Fluorescencia Emisión Diagrama de bloques para absorción
8. 8 Diagrama de bloques para absorción Diagrama de bloques para fluorescencia y fosforescencia Fuentes de radiación en EAM Características relevantes: 1. Distribución espectral: intensidad a distintas  (fuentes de continuo vs. fuentes de líneas) 2. Intensidad 3. Estabilidad 1. Ruido (fluctuaciones a corto plazo) 2. Deriva (fluctuaciones a largo plazo) 4. Coste 5. Tiempo de vida 6. Geometría Fuentes de radiación en EAM Espectro continuo Espectro de líneas discretas I: Fuentes de continuo Comportamiento del Cuerpo Negro: Como W~ T4, cuando se usa una fuente incandescente se precisa una temperatura constante para que la emisión sea estable. A) Radiación térmica (incandescencia) Los sólidos calentados emiten radiación próxima a la radiación teórica del “cuerpo negro”. )(VW (Stefan)T)W(B (Wien) T 1 λ 4 4 ν máx VISelen   I: Fuentes de continuo VIS 1. Filamento de wolframio encapsulado en un bulbo de vidrio Normalmente funciona a unos 3.000ºC Se necesita atmósfera inerte para prevenir la oxidación del filamento Es útil entre 350-2.200 nm (VIS- IR cercano) Por debajo de 350 nm el vidrio absorbe la mayor parte de la radiación 2. Lámparas halógenas en bulbo de cuarzo El halógeno sirve para formar haluros volátiles de volframio Al enfriar la lámpara, el W se re-deposita sobre el filamento Mayor tiempo de vida. Pueden funcionar a T más altas (hasta unos 3.500ºC) Proporcionan mayor intensidad lumínica Elevadas T demandan cuarzo en las paredes de la lámpara. El cuarzo transmite mejor en el UV.
9. 9 I: Fuentes de continuo B) Lámparas de descarga de gases Flujo de corriente entre dos electrodos sumergidos en un tubo relleno de gas. Los electrones colisionan con el gasexcitaciónemisión  hDDDED eléctrica '''* 22 Intervalo de : 160 – 380 nm Muy adecuadas para el UV Lámpara de Deuterio I: Fuentes de continuo B) Lámparas de descarga de gases Flujo de corriente entre dos electrodos sumergidos en un tubo relleno de gas. Los electrones colisionan con el gasexcitaciónemisión Intervalo de : 180 – 370 nm Muy adecuadas para el UV Lámpara de H2: 3-5 veces menos intensa que la de Deuterio. D2 más pesado que H2 menores pérdidas por colisiones I: Fuentes de continuo B) Lámparas de descarga de gases Flujo de corriente entre dos electrodos sumergidos en un tubo relleno de gas. Los electrones colisionan con el gasexcitaciónemisión Para una más elevada intensidad: Lámpara de Xenon a 10-20 atm Más colisiones: continuo Inconvenientes: Vida relativamente corta Necesita cebado Arco errante Potencia dependiente del tiempo I: Fuentes de continuo B) Lámparas de descarga de gases Flujo de corriente entre dos electrodos sumergidos en un tubo relleno de gas. Los electrones colisionan con el gasexcitaciónemisión Lámpara de vapor de mercurio Útil para cuando se necesitan unas pocas líneas muy intensas (Fluorimetría) Fuentes en EAM Para EAM UV-VIS: H2 o D2 en el UV y W para el VIS (cambio durante el barrido) Para Espectrofluorimetría con barrido: lámpara de arco de Xe Con fluorómetros de longitud de onda fija: lámpara de Hg a baja Presión Fuentes en EAM
10. 10 Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Laser He-Ne Ratio emisión estimulada/absorción 1 2 )(absorbida12 a)(estimulad21 N N R R  Conclusión: para lograr emisión estimulada se precisa una inversión de la población: N2 > N1 Mecanismo Laser Energy pumping mechanism Energy input Lasing medium High reflectance mirror Partially transmitting mirror Output coupler Feedback mechanism Laser en acción Lasing medium at ground state Population inversion Start of stimulated emission Stimulated emission building up Laser in full operation Pump energy Pump energy Pump energy Pump energy
11. 11 Laser: tipos 1) Estado sólido a) Laser de Ruby [Al2O3+Cr(III)]. Opera a 694,3 nm bombeado por lámpara de arco de Xe. Pulsante (puede ser CW también) b) Laser de Nd/YAG (granate de Y-Al con Nd): 1.064 nm 2) Gaseosos a) Átomo neutro: He-Ne: 632,8 nm b) Iones: Ar+ o Kr+: 514,5 nm c) Moleculares: CO2 : 10.000 nm (1.000cm-1); N2: 337,1 nm d) Excímeros: gas inerte + F: ArF+ (193 nm); KrF+ (248 nm); XeF+ (351 nm) 3) Colorante (dye laser). Amplia gama de colorantes que pueden proporcionar una variedad de . 4) Diodo semiconductor. Amplia gama de . Continuo. Laser: características La luz producida por un láser es: Monocromática (longitud de onda única) Coherente (en fase) Direccional (cono de divergencia estrechísimo) Intensa La lámpara incandescente produce una luz: Cromática Incoherente No direccional Fuente de luz monocromática: Coherente No direccional Sistema de aislamiento de  Tres enfoques o planteamientos: 1) Bloqueo de la radiación no deseada: FILTRO 2) Dispersión de la radiación y selección de la banda estrecha de  de interés: MONOCROMADOR 3) Modulación de las  a diferentes frecuencias: INTERFERÓMETRO Sistema de aislamiento de  1. Filtros • Absorción (vidrio, película o disolución coloreada: solución más barata) • Corte • Interferencia 2. Monocromadores • Prisma • Red Filtros de absorción (filtros de paso de banda) • Muestran muy baja transmitancia • Presentan un perfil de pico muy ancho • Pueden usarse 2 ó más filtros en serie • Pueden ser de cuarzo o vidrio • Relativamente baratos Caracterización de los filtros Dos términos asociados con los filtros ópticos son: 1. Anchura de banda efectiva medida a la mitad de altura de pico. 2.  nominal (450 y 500 nm, en estos casos)
12. 12 Filtros de corte (Cut-off filters) %T / nm La combinación de 2 filtros de corte produce el efecto de un filtro de paso de banda Combinación de filtros de absorción y de corte Filtro de interferencia Haz incidente Capas metálicas semi-reflectantes Radiación transmitida Láminas de vidrio Material dieléctrico (CaF, MgF) Filtro de interferencia Recorrido entre superficies: cos t Reforzamiento: cos t2 m λ' 1cos0   t2'm  En el aire:  = ’·n Longitud de onda transmitida: m nt2 λ t Filtro de interferencia Típicamente, el %T disminuye con anchuras de banda decrecientes. Filtro de interferencia vs. filtro de absorción
13. 13 Cuña de interferencia (wedge) Glass Moveable Slit Dielectric Layer Metallic Layer White Radiation Monochromatic Radiation Son útiles para seleccionar varias bandas de radiación gracias al movimiento de la radiación incidente a lo largo del filtro. Las anchuras de banda típicas son  20 nm Monocromador: Prisma Se pueden usar desde el UV hasta el IR El material a emplear depende de la zona del espectro Vidrio: en el VIS por encima de 350 nm Cuarzo: en el UV Sales cristalinas (NaCl, KBr): en el IR Monocromador: Red En la red de escalerilla (rejilla) se hacen una serie de hendiduras paralelas (surcos) en una superficie lisa con espaciado diferente en función de la zona del espectro. UV_VIS: 500 a 5.000 líneas por mm IR: 50 a 200 líneas por mm Red de escalerilla: interferencia constructiva )ABCD(mλ  isendCD  rsendAB  r)seni(sendλm  Red de escalerilla: interferencia constructiva Una red que contiene 1.450 surcos/mm es irradiada con luz policromática con un ángulo incidente de 48º. ¿Qué longitudes de onda aparecerán a un ángulo de reflexión de +20º y de -10º? r)seni(sendm  nm689,7 mm nm10 1.450 mm d 6  Para r = 20º:  = (689,7/m) (sen 48 + sen 20) = 748,4/m nm (748,4; 374,2; 249,5 nm, etc.) Para r = -10º:  = (689,7/m) [sen 48 + sen (-10)] = 397,9/m nm (397,9; 199,0; 132,6 nm, etc.) Monocromador de red
14. 14 Monocromador de red. Montajes Czerny-Turner y Ebert Monocromador: Dispersión Dispersión lineal: variación de la  en función de la distancia a lo largo del plano focal. D = dy/d = F dr/d = F· A F: distancia focal de la lente de enfoque Dispersión recíproca lineal: D-1 = d/dy = 1/F· d/dr [=] nm/mm Dispersión angular: cambio en el ángulo de reflexión a medida que varía la  A = dr/d1 2 y r)seni(sendm  cosrd m d dr   Fm cosrd dy d D 1    A menor d le corresponde una mayor dispersión angular Para r < 20º  cos r  1 Fm d D 1  Si r es pequeño, D –para una red- es constante Para un prisma: D NO es constante.     d dn dn dr d dr FD Variable (ver curvas de dispersión) Monocromador: Poder de Resolución, R 21 21 ∆; 2 ; ∆ R       Red: 103 - 104 Prisma: 101 - 102 Rred = m·N Rprisma = b · dn/d b Nº de rayas Orden de interferencia Ej.: Si R = 103 y  = 500, entonces  = 0,5 nm Ej.: Calcular la resolución necesaria para observar procesos de absorción a 599,9 y 600,1 nm sin interferencia. R = 600 / 0,2 = 3.000 Monocromador: Velocidad, f/número d F f  F: distancia focal d: diámetro de la lente f/número: 1 -10 El poder colector de luz es ~ f -2 Cuanto menor es el número más luz se recoge. Un monocromador con f/2 recoge 4 veces más de luz que uno con f/4 El poder colector de luz es una medida de la cantidad de luz que alcanza el detector. Cuanta más energía radiante llegue al detector, mayor relación señal/ruido se obtendrá en la medida resultante. Comparación de prestaciones de los sistemas aisladores de  Red de escalera Fm d D sendm ir    cos2 2 1    
15. 15 Monocromador de red de escalera Monocromador doblemente dispersante • Dispersión más elevada • Mejor resolución que un monocromador convencional Los dos elementos dispersantes son una red de escalera y un prisma de baja dispersión. Monocromador de red de escalera Anchura de rendija y resolución w ef ef    wySi y D 1 1 ef Dw   Anchura de rendija y resolución Si la w se ajusta de modo que ef = ½ se consigue resolución espectral completa. mm nm 1,2 y R     ¿w? mm0,25 mm nm 1,2 nm0,3 D w nm0,3589)(589,6 2 1 1 ef ef      Anchura de rendija y resolución Rendijas estrechas garantizan mejor resolución P P   Anchura de rendija y resolución Rendija estrecha Mejor resolución: aptas para análisis cualitativo Pérdida de potencia del haz: no recomendables para análisis cuantitativo
16. 16 Material óptico Lentes, prismas y celdillas han de ser transparentes a la radiación utilizada • En el VIS se puede emplear el vidrio de 350 nm en adelante • En el UV, el cuarzo es el más adecuado • En el IR: NaCl, KBr… Cuanto más pesado sea el átomo más transparente a radiaciones alejadas en el IR (mayores ). Su mayor problema es la posibilidad de absorber la humedad ambiente que hace que se velen. Celdas para la muestra Transductores de radiación (Detectores) Los primeros detectores fueron el ojo humano y las placas fotográficas. Los instrumentos modernos contienen dispositivos que convierten la radiación en una señal eléctrica. Dos tipos habituales: Detectores de fotones Los detectores fotoeléctricos o cuánticos poseen una superficie activa capaz de absorber radiación EM En algunos, la radiación absorbida produce la emisión de electrones dando lugar a una fotocorriente En otros, la absorción de radiación promueve electrones a la banda de valencia de un semiconductor posibilitando la conducción (fotoconducción) Uso común en instrumentos UV, VIS, IR cercano Detectores térmicos Miden el calor inducido por la radiación incidente Uso frecuente en espectroscopía IR Características del detector ideal • Elevada sensibilidad • Alta relación señal/ruido (S/N ratio) • Respuesta independiente de la  (o al menos dar una respuesta constante a lo largo de un intervalo amplio de ) • Tiempo de respuesta corto • Ausencia de corriente oscura • Señal directamente proporcional a la potencia radiante incidente Célula fotovoltaica h: rotura de enlaces covalentes; creación de electrones y huecos conductores • Muy sencillo • S = kP • Poco sensible • Fatiga Fototubo de vacío
17. 17 Tubo fotomultiplicador (PMT) Tubo fotomultiplicador (PMT) Muy sensibles a radiación Vis-UV Factor limitante: corriente oscura  refrigeración Se usan para medir radiación de baja potencia Detector de diodo de silicio Se origina una corriente proporcional a la potencia radiante Sensibilidad intermedia entre el fototubo de vacío y el tubo fotomultiplicador Detector de diodo de silicio (unión p-n) I0 I1 h + - Depletion layer 190 1100 nm R(a.u.) Detector de diodo de silicio Serie de fotodiodos (Photodiode array)
18. 18 Serie de fotodiodos (Photodiode array) Multi-channel Amplifier Diode Array Los detectores de fotodiodos han revolucionado el diseño de instrumentos VIS-UV al hacer posible la miniaturización de los espectrómetros Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) CCD Charge-Coupled Device, "dispositivo de cargas (eléctricas) interconectadas Los primeros dispositivos CCD fueron inventados por Willard Boyle y George Smith en 1969 en los Laboratorios Bell. Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) Determining the brilliance distribution of an astronomical object (star, planet, galaxie,...) with the help of a CCD is pretty much similar to the measurments of the quantity of infalling rain on a farm. As soon as the rain stops, collecting buckets are displaced horizontally on conveyor belts. Then the water content of the buckets is collected in other buckets on a vertical conveyor belt. The overall content is sent onto a weighting system. Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) The way a CCD works is illustrated by means of a simplified CCD made of 9 pixels, an output register and an amplifier. Each pixel is divided in 3 regions (electrodes who serve to create a potential well). (a) when an exposure is made, the central electrode of each pixel is maintained at a higher potential (yellow) than the others ( green) and the charges collecting process takes place. (b) At the end of the exposure, the electrodes potentials are changed and charges transferred from one electrode to the other. To Output amplification Output register Pixel Electrodes Electrons (a) (b) Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) (a) By changing in a synchronized way the potential of the electrodes, electrons are transfered from pixel to pixel. Charges on the right are guided to the output register (b) The horizontal transfer of charges is then stopped and charge packages at the output register are transfered vertically, one by one, to an output amplifier and then read one by one. The cycle starts again until all the charges have been read (reading time of about 1 minute for a large CCD). (b)(a) Impurity (doping)
19. 19 Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) Mosaïc of 4 CCDs, containing each 2040 x 2048 pixels. This composite detector is about 6 cm large and contains a total of 16 millions pixels (Kitt Peak National Observatory, Arizona). Dispositivo de carga acoplada (Charge Coupled Device, CCD) Quantum efficiency curves of different types of CCDs as a function of the wavelenght compared to the one of other detectors. We can see on this plot the large domain of wavelenghts for the spectral response of CCDs. La medida instrumental cuantitativa Todas las medidas instrumentales involucran una señal Desafortunadamente, todas las señales incorporan ruido En ocasiones el ruido es grande A veces el ruido es tan pequeño que no se percibe. A menudo el ruido es constante e independiente de la señal Cociente Señal/Ruido (Signal to Noise ratio; S/N): Su estimación Da una idea de la calidad de las medidas instrumentales RelativaEstándarDesviaciónER DER 1 s x estándardesviación señallademedia N S  x = 0.9 Nt = 1.0 x 10-15 A s = Nt/5 = 1.0 x 10-15/5 = 0.2 x 10-15 x = 0.9 x 10-15 S/N = x/s = 0.9 x 10-15/0.2 x 10-15 = 45 Cociente Señal/Ruido (Signal to Noise ratio; S/N) Un cociente S/N bajo proporciona muy poca fiabilidad para la medida de señales analíticas. El Límite de Detección suele tomarse para S/N ~ 2 ó 3 Fuentes de ruido • Ruido Químico: temperatura, presión, humedad, etc. Las variaciones provocan fluctuaciones incontrolables • Ruido Instrumental: debido a los componentes de los aparatos - Térmico (Johnson noise): movimiento térmico de los electrones en los resistores - Disparo (Shot noise): movimiento de los electrones a través de una unión. - Parpadeo (Flicker noise): cualquier ruido que es inversamente proporcional a la señal: 1/f - Ambiental (Environmental noise): mezcla de múltiples fuentes de ruido.
20. 20 Ruido térmico (ruido blanco) Vrms: raíz cuadrática media o valor eficaz del ruido de la tensión que está dentro de una… k: constante de Boltzmann (1,38·10-23 JK-1) T: temperatura absoluta en K R: resistencia en  f: anchura de banda de la frecuencia del ruido en Hz rt3 1 f  Tiempo de ascenso, tr, es el tiempo de respuesta expresado en s de un instrumento a un cambio brusco de la señal de entrada. Se toma como el t necesario para que la señal de salida pase del 10% al 90% de su valor final Ej.: tr = 0,01 s  ancho de banda = 33 Hz Ruido de disparo (shot noise) irms: raíz cuadrática media o valor eficaz de las fluctuaciones de corriente relacionadas con… i: La corriente continua promedio e: carga del electrón (1,60·10-19 C) f: ancho de banda de las frecuencias consideradas También tiene carácter de ruido “blanco” Ruido ambiental Mejora del cociente S/N Hardware & software Hardware: 1. Toma de tierra y protección (caja de Faraday) 2. Filtración analógica y RC 3. Modulación: conversión de la señal DC a AC de alta frecuencia y posterior demodulación 4. “Chopping” de la señal: disco rotatorio, ayuda a discriminar señales continuas de las transientes 5. Amplificadores operacionales Filtro de paso bajo Raw Data Filtered Data Low Pass Filter Deja pasar las señales de frecuencia baja, eliminando el ruido asociado a frecuencias altas (ruido térmico y de disparo) Útil para instrumentos que miden señales analíticas de baja frecuencia Filtro de paso alto Raw Data Time i Time 0 Filtered Data High Pass Filter Elimina el ruido de frecuencia baja (parpadeo y deriva) permitiendo el paso de las frecuencias altas. Útil para instrumentos que miden señales analíticas de alta frecuencia
21. 21 Filtro de paso de banda Band Pass 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.01 0.1 101.0 100 1000 10,000 Frequency, Hz RelativeSignal Band Pass Filter High PassLow Pass 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.01 0.1 101.0 100 1000 10,000 Frequency, Hz RelativeSignal Combinación adecuada de filtros de paso bajo y alto para dejar pasar solamente la(s) frecuencia(s) de interés. Modulación - desmodulación • La señal se modula haciéndola pasar por un chopper (disco rotatorio) de modo que pasa de poseer baja frecuencia a ser una señal de alta frecuencia (el ruido 1/f es menos problemático a frecuencias elevadas) • A continuación la señal se amplifica y se pasa a través de un filtro de paso alto para eliminar el ruido 1/f • La señal se demodula y se pasa por un filtro de paso bajo para dar lugar a una señal de corriente continua (dc) amplificada Mejora del cociente S/N Hardware & software Software: 1. Promediado conjunto 2. Promediado por grupos 3. Filtrado digital 1. Promediado conjunto Si la señal en “x” tiene un valor de Sx, Al sumar n series de datos, la suma valdrá: n Sx. La señal del ruido, Nx, contenido en Sx, también se sumará pero como las señales de ruido son aleatorias se acumulan como la Por tanto la suma del ruido de x después de sumar n series de datos es: Nx n n En este algoritmo, sucesivas series de datos (matrices) se recogen y suman punto por punto como en una matriz de la memoria de un ordenador (COADICIÓN). Después de la coadición, los datos se promedian dividiendo la suma para cada punto por el número de barridos realizados. x x x x N S n N S n n N S  Promediado conjunto (ensemble averaging) Registro de sucesivos espectros, suma punto a punto y promediado n S S n i i x   1          n i ix x n i ix xx SS S n n SS S N S 1 2 1 2 Donde: Sx = señal promedio (punto) Si = medida individual de la señal n = número de medidas Entonces:   n SS N n i ix   1 2 )noiserms( Promediado conjunto (ensemble averaging) 56.1214.316 N S n N S 1 1x  1 1x N S n N S  A Single Spectrum 0.0 0.5 1.0 1.5 0 100 200 300 400 500 600 Time (s) Signal S N S/N 0.91 0.289 3.14 Average of Sixteen Spectra 0.0 0.5 1.0 1.5 0 100 200 300 400 500 600 Time (s) Signal S N S/N 0.90 0.070 12.81 Promediado por grupos (boxcar averaging) • Suaviza las irregularidades de alta frecuencia en una onda de más baja frecuencia • Se hace en tiempo real a medida que el ordenador registra la señal • Se emplea para señales complejas que varían rápidamente con el tiempo
22. 22 Sensibilidad a) Calibrado S = mc + Sbl S = señal o respuesta del instrumento Sbl = señal del blanco c = concentración de la muestra m = sensibilidad del calibrado (pendiente de la curva de calibrado; no tiene en cuenta la precisión de las medidas individuales) 0 20 40 60 80 100 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Concentration (c ) Signal(S) m2 m1 Sbl Sm1 C Sm2 b) Analítica Ss m  : sensibilidad analítica sS: desviación estándar de la medida de la señal + No depende de los factores de amplificación + Independiente de las unidades de medida de S - Depende de la concentración [ss = f(C)] Límite de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) LOD: mínima concentración o masa de analito que puede ser detectada por un método instrumental a un nivel dado de confianza (95%) LOQ: mínima concentración que puede ser fiablemente cuantificada LOD Señal analítica mínima detectable: Sm = Savg, bl + k·sbl Sm: Señal mínima detectable Savg, bl: Señal promedio del blanco k: número entero (3) sbl: desviación estándar del blancoConcentración mínima detectable: m SS c blavg,m m   m s·k c bl m  Límite de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) Intervalo dinámico de linealidad y límite de linealidad (LOL) Concentration InstrumentResponse Dynamic Range cm LOL LOQ El intervalo dinámico se extiende desde el LOQ hasta el LOL m s·10 c bl q LOQ Señal mínima cuantificable: Sq = Savg, bl + 10·sbl Concentración mínima cuantificable: Tema 3 1. Espectroscopía UV-visible. 2. Sistemas que absorben en el UV-visible. 3. Ley de Beer. 4. Instrumentación. 5. Métodos y aplicaciones. Espectroscopía VIS - UV 160 780
23. 23 Ley de Beer: presupuestos básicos 1. La radiación es monocromática 2. Las partículas absorben de modo independiente 3. Sección recta y uniforme de absorción 4. Los procesos de absorción y desorción de energía han de ser rápidos 5. La degeneración de la energía absorbida ha de hacerse por vía no radiacional 6. El índice de refracción del medio absorbente debe ser independiente de la concentración Ley de Beer: deducción d b b S P0 P b = 10 mm Ley de Beer: deducción d b b SP0 P b [=] cm c [=] mol/L a = , absortividad molar;  [=] L mol-1 cm-1 dP  N (nº de partículas absorbentes) · P (nº de fotones) dV = S · db; dV [=] cm2 · cm [=] cm3 C·db·S·10·6,02310·(L)dV· mol átomos 6,023·10· L mol CN K' 20323            P·C·db·KP·C·db·K'·cteP·N·ctedP K   b·C·K P dP ;P·C·db·KdP  b·C·K P P ln;dbC·K P dP b 0 0 P P0   C··b 2,303 K P P log 0  AbsTlog P P log 0  Abs = a · b · C Ley de Beer Ley de Beer: terminología común Ley de Beer: Absorbancia, Transmitancia y Absorción T = P/Po %T = (P/Po) x 100 A = -log T= abc %Absorción = 100 - %T Ley de Beer: Pérdidas de potencia radiante
24. 24 Ley de Beer: Corrección de pérdidas P1P P’ P’1 Muestra Blanco P1 P0 P P 1 01 0 1 medida P P loglogTAbs; P' P' P P T  Experimentalmente se miden sólo potencias salientes ; P' P' T 1 real  Ley de Beer En un medio absorbente, la potencia decae exponencialmente con la longitud de paso óptico P P1 b1 celda b Potencia P b1 P1 cb 0 10·PP   Ley de Beer En un medio absorbente, la potencia decae exponencialmente con la longitud de paso óptico P P1 b1 celda b Potencia P b1 P1 cb 0 10·PP   P P2 b2 b2 P2 Ley de Beer En un medio absorbente, la potencia decae exponencialmente con la concentración. C Potencia P P P1 C1 P P2 C2 C1 P1 C2 P2 cb 0 10·PP   Ley de Beer: Ejemplos Beer-Lambert plot for Parsol 340 in ethanol y = 13245x + 0.0351 R2 = 0.9995 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 0.00E+00 2.00E-05 4.00E-05 6.00E-05 8.00E-05 1.00E-04 1.20E-04 [P340]/M absorbance T vs [P340] y = 0.9224e-30498x R2 = 0.9995 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.00E+00 2.00E-05 4.00E-05 6.00E-05 8.00E-05 1.00E-04 1.20E-04 [P340]/M T Parsol 340 (10 -4 M in MEOH) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 220 270 320 370 420 Wavelength/nm Absorbance Ley de Beer: ejemplos Concentración Absorbancia C·b·Abs  Se pueden encontrar valores elevados de hasta 105 L mol-1 cm-1 para la constante de proporcionalidad. Mexoryl® SX HO3S O O SO 3H O SO 3H UVA UVA HO3S O 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 200 250 300 350 400 Wavelength/nm Absorbance max~45.000
25. 25 Ley de Beer: aditividad nnnTotal nTotal cbcbcbcbA AAAAA    ...... ...... 333222111 321 Elucidación de muestras binarias o ternarias de componentes absorbentes        [N]b[M]b'A':'' [N]b[M]bA':' '' N '' M ' N ' M Las absorbancias son siempre aditivas ][Yε][BiYε][CuYε][Biε][CuεAbs 4745 Y 745 BiY 2745 CuY 3745 Bi 2745 Cu 745 4232    Ley de Beer: desviaciones Propias a la Ley • Dependencia de  respecto de n • Interacciones moleculares • Procesos no absorbentes Químicas • Equilibrios en disolución • Disolvente • Impureza de reactivos • Presencia de interferencias absorbentes Instrumentales • Radiación policrómatica • Radiación parásita o dispersa • Ruido instrumental • Anchura de rendija Ley de Beer: desviaciones Propias a la Ley A no tiene limitación con respecto a b Se pueden emplear celdillas pequeñas para analitos concentrados y celdilla más largas para muestras más diluidas. Si A = 0,410 en una celdilla de 1,0 cm, entonces: Si b = 2,0 cm, A = 0,820 Si b = 0,1 cm, A = 0,041 Concentraciones > 0,01 M  alteración del proceso de absorción individual Ley de Beer es una ley límite Un aumento de la concentración del buffer o del disolvente tiene un efecto similar Si la modificación de C implica cambio de n, entonces  varía ε(n) = ε [n/(n2 + 2)2] Ley de Beer: desviaciones Propias a la Ley A no tiene limitación con respecto a b Se pueden emplear celdillas pequeñas para analitos concentrados y celdilla más largas para muestras más diluidas. Si A = 0,410 en una celdilla de 1,0 cm, entonces: Si b = 2,0 cm, A = 0,820 Si b = 0,1 cm, A = 0,041 Concentraciones > 0,01 M  alteración del proceso de absorción individual Ley de Beer es una ley límite Un aumento de la concentración del buffer o del disolvente tiene un efecto similar Si la modificación de C implica cambio de n, entonces  varía ε(n) = ε [n/(n2 + 2)2] Ley de Beer: desviaciones Químicas Reacciones del compuesto absorbente provocan el incumplimiento de la ley de Beer. 2color1color   InHHIn  Ley de Beer: desviaciones Ejemplo: si Ka = 10-4 CHIn [HIn] [In-] 10-5 8.5x10-7 9.2x10-6 10-4 3.8x10-5 6.2x10-5 10-3 7.3x10-4 2.7x10-4 C HIn Expected Actual 2color1color   InHHIn  Estudiar el ej. 13.1 de las páginas 326-7 del Skoog
26. 26 Ley de Beer: desviaciones. Punto isosbéstico Se observa un punto isosbéstico cuando dos especies absorbentes en equilibrio, X e Y, tienen la misma absortividad molar a una longitud de onda. Si X e Y están en equilibrio, para la longitud de onda del punto isosbéstico, la absorbancia total es independiente de las concentraciones relativas de X e Y. Rojo fenol -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 400 450 500 550 600 650 Wavelangth (nm) Absorbance El punto isosbéstico puede llegar a ser una longitud de onda analíticamente útil ya que, a esta longitud de onda, se obtiene una curva de calibración lineal sin controlar las condiciones de la disolución (disolución no tamponada). A =  b ([HIn] + [In-]) Ley de Beer: desviaciones. Instrumentales La absorbancia medida Am es: Sólo cuando las absortividades molares son iguales a las dos longitudes de onda, ’ y ’’, la expresión anterior se simplifica a: Efecto de la radiación policromática En la práctica, el monocromador deja pasar una banda de radiación. Ley de Beer: desviaciones. Instrumentales Efecto de la radiación policromática La ley de Beer se cumple cuando la anchura de paso de banda del monocromador es 200 nm) cuando se hallan enlazados a una cadena orgánica saturada no absorbente. Auxocromos: Grupos funcionales que poseen electrones de valencia no-enlazantes, n, que no absorben a  > 220nm, pero muestran absorción intensa de radiación en el UV lejano (180-200 nm), debido a transiciones n  *. Ej. -OH; -NH2; -Cl, etc. Si un grupo auxocromo se asocia a la cadena de un cromóforo se exalta el color del mismo, lo que en términos espectroscópicos significa que la banda de absorción del cromóforo se desplaza a  mas largas (Efecto Batocrómico o Desviación hacia el Rojo) a la vez que aumenta su intensidad (Efecto Hipercrómico). Efecto Hipocrómico: Cuando disminuye la intensidad de una banda. Si se desplaza la  del máximo de absorción de un cromóforo a  más cortas (ej. al cambiar a un disolvente más polar) se ha producido un Efecto Hipsocrómico o Desviación hacia el Azul. La conjugación de varios cromóforos en una molécula produce un desplazamiento Batocrómico o Desviación hacia el rojo de la  del máximo de absorción. Ej.  Nomenclatura Conjugación de cromóforos La multiplicidad de grupos cromóforos tiene escasa influencia en , pero incrementa notablemente  La conjugación produce deslocalización de electrones , estabilizando *, por lo que la señal se desplaza a mayores  (menor energía) La relevancia de la conjugación de cromóforos Naturaleza del desplazamiento Término descriptivo A  mayores Batocrómico A  menores Hipsocrómico A mayor absorbancia Hipercrómico A menor absorbancia Hipocrómico
29. 29 Algunos grupos cromóforos y auxocromos Substituyentes en los compuestos aromáticos • Los compuestos aromáticos poseen tres conjuntos de bandas debido a transiciones   *. Benceno: 184 nm ( ~ 60.000) Banda E2 a 204 nm ( = 7.900) Banda B a 256 nm ( = 200) Efecto del disolvente 1,2,4,5-tetracina • Cada banda tiene una estructura fina asociada a transiciones vibracionales que se reduce –e incluso desaparece- en disolventes polares. Un incremento de la polaridad del disolvente: n→*: desplazamiento hipsocrómico n→*: desplazamiento hipsocrómico →*: desplazamiento batocrómico Disolventes más frecuentes. Influencia de la polaridad Disolventes no polares respetan mejor la estructura fina del espectro CH3CHO Pigmentos orgánicos naturales -CAROTENO-CAROTENO LYCOPENOLYCOPENO Lantánidos y actínidos Los metales de las series 4f y 5f absorben merced a transiciones que involucran a los electrones f Apenas se nota efecto alguno por parte del disolvente y de posibles ligandos, puesto que se trata de electrones de capas internas que están protegidas. Los espectros de absorción muestran señales agudas y bien definidas.
30. 30 Color de los iones sencillos Color de los metales de transición La mayoría de los cationes de los metales de transición presentan color en disolución. La absorción de radiación en el visible se debe a transiciones que involucran electrones d en orbitales d incompletos. Las capas d son más externas y están más expuestas que las f. Sus espectros son más anchos y la máx se ve influenciada por el disolvente y/o los ligandos. Efecto del campo ligando Absorción por transferencia de carga Involucra la presencia de un aceptor (ión metálico) y de un donor (ligando) de e-. La absorción de la radiación hace que se transfiera un e- desde el orbital del donor al orbital del aceptor. Se origina un estado excitado en el que ha tenido lugar una reacción redox. Absortividades molares elevadas ( > 10.000) Ej.: Fe(SCN)2+ + h  Fe2+ + SCN0 Instrumentación Cuatro tipos básicos de diseños instrumentales • Haz simple • Doble haz resuelto en el espacio • Doble haz resuelto en el tiempo • Multicanal Haz simple Puede ser de unicanal o de barrido Instrumentación Doble haz resuelto en el espacio Las señales de la celdilla de muestra y de la celdilla de referencia se miden simultáneamente y se sustraen. Se precisan 2 detectores  coste elevado
31. 31 Instrumentación Doble haz resuelto en el tiempo Es el diseño comercial más frecuente Ventajas del doble haz frente al monohaz: Corrige las variaciones en la intensidad de la fuente Compensa la deriva del detector y del amplificador (resuelto en el tiempo) Compensa la variación de potencia del haz con la longitud de onda Instrumentación • Puede hacer un registro (“barrido”) completo del espectro en 0,1 s • Promedia la señal durante 1 s ó más, para mejorar la S/N • Pocos componentes ópticos: mínima pérdida de potencia del haz • Lámpara de D2 y resolución (ancho de banda) de 2 nm Multicanal Instrumentación: fuentes más utilizadas en el VIS-UV Instrumentación: fuentes más utilizadas en el VIS-UV Lámpara de Deuterio y su espectro Un filamento calentado recubierto de óxido proporciona electrones Lámpara de filamento de Wolframio y su espectro Instrumentación: celdillas más comunes en el VIS-UV Volumen (L): 160, 100 or 50 b = 10 mm Instrumentación: detectores
32. 32 Instrumentación: instrumentos típicos Fotómetros • Instrumentos sencillos que usan filtros para seleccionar la  • Solo pueden hacer medidas secuenciales a cada  • Escasa disminución de la potencia del haz (óptica escasa)  buena S/N • Baratos Espectrofotómetros • Emplean un monocromador o un elemento dispersivo para seleccionar la  • Pueden hacer barridos de   registro de espectros • Óptica más compleja  peor S/N • Caros Instrumentación: Fotómetro (VIS) Instrumentación: Fotómetro (UV) • Detector muy común en HPLC • Emplea una lámpara de Hg y con un filtro se aisla la línea a 254 nm • Práctico para cuantificar sustancias orgánicas que absorben a 254 nm. Fotómetro de sonda • Utiliza fibra óptica y un espejo para proyectar el haz a través de la muestra. • Es habitual en instrumentos de campo. • Elimina la necesidad de celda. Instrumentación: Espectrofotómetro (VIS) • Económico: 450 – 2500 € • Intervalo: 380 – 800 nm • Resolución: 8 – 20 nm Instrumentación: Espectrofotómetros VIS-UV de haz simple y doble • Normalmente emplean lámparas intercambiables de W y D2 • Intervalo: 200 – 900 nm • Coste: 3000 – 8000 € (monohaz); 4000 – 15000 € (doble haz) • Resolución: 0,5 – 8 nm (monohaz); 0,1 – 3 nm (haz doble) Instrumentación: Espectrofotómetros VIS-UV de doble haz
33. 33 Instrumentación: Espectrofotómetros VIS-UV de doble haz Instrumentación: Espectrofotómetros VIS-UV de doble dispersión • La luz pasa dos veces por el sistema dispersante mejorando mucho la resolución. • Caro: > 10.000 € • Ancho de banda: 0,07 nm • Luz dispersada o errática: 0,0008% Instrumentación: Espectrofotómetros VIS-UV de doble dispersión Instrumentación: Espectrofotómetros VIS-UV con fotodiodos • Pueden llegar a ser muy compactos en tamaño • Registro de espectro muy rápido: 0,1 s • Intervalo: 200 – 820 nm • Ancho de banda: 2 nm • Coste: 3.000 - 20.000 € Instrumentación: Espectroscopía diferencial con escala expandida Mezclas de substancias absorbentes        [N]b[M]b'A':'' [N]b[M]bA':' '' N '' M ' N ' M Las absorbancias son siempre aditivas
34. 34 Determinación de estequiometrías: Ordenada de Job Disoluciones del catión y del ligando con idénticas concentraciones formales se mezclan en distintas proporciones de volumen, de tal modo que el volumen total de cada mezcla sea igual. CM + CL = cte M 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 mL L 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 mL   L mol C 10mL L mol CmLx10 10mL L mol CxmL     XM 0........0,1........0,5........0,9........1 XL 1........0,9.......0,5........0,1.........0 Se mide la absorbancia de cada disolución a una  apropiada y se corrige por cualquier absorbancia de la mezcla si no se hubiese producido reacción. XM + XL = 1 Determinación de estequiometrías: Ordenada de Job AJ = MLn [MLn] + M[M] + L[L] sin corregir. Introduciendo la corrección: AJ = MLn [MLn] + M[M] + L[L] - (M·CM + L·CL) = = = MLn [MLn] + M[M] + L[L] - M[M] - M [MLn] - L[L] - L· n [MLn] AJ = (MLn - M - n·L) [MLn] = K·[MLn] En el máximo: 0   x AJ ;   0   x MLn CM = [M] + [MLn] CL = [L] + n [MLn] AJ 0 XL 1 1 XM 0 Determinación de estequiometrías: Ordenada de Job n nd n n d [L][M]][MLK; ][ML [L][M] K  En el máximo de Aj:  0 x [M][L] x ][MLK n nd       x : fracción molar de L 1-x: fracción molar de M ][MLx)·C(1[M] ]n[MLx·C[L] nlibre nlibre            0 x ][ML nC·][MLnx·C·n·][MLx)C(1][MLnx·C x ][ML c)(1][MLnx·C][MLx)·C(1 x n1n nn n n nn nn                       0 0           :máximoelenLuegox).(1nx ][MLnCx)(1n][MLnx·C ][MLCx)(1n][MLnx·C ][MLCx)(1C·][MLnx·Cn][MLnx·CC nn nn n 1n n n n      xmax n Esteq. 0,5 1 ML 0,66 2 ML2 0,75 3 ML3 max max x1 x n   Determinación de constantes de complejación: método de Job JOB M + n L MLn C  nC C(1-)          nnn n f nCnCC C LM ML K           1 )( 1 M SM A AA   AJ 0 XL 1 1 XM 0 AM AS Lo que se ha disociado Lo que debería haberse formado Determinación de estequiometrías: método de las relaciones molares Consiste en la medida de la absorbancia de disoluciones con una concentración constante de metal y una concentración creciente de ligando, y su representación frente al cociente CL/CM. Partiendo de disoluciones isomolares, basta con mezclar un volumen constante de la disolución de metal y volúmenes crecientes de la del ligando, midiendo a la  a que absorbe el complejo. A CL/CM n Determinación de constantes de complejación: método de las relaciones molares M + n L MLn C  nC C(1-)      n n f LM ML K   A CL/CM AM AS AM = MLn·CMLn = MLn· CM; AS = MLn·[MLn] CM    n M n M S ML C ML A A  [M] = CM - [MLn] [L] = CL - n [MLn] Substituyendo, se obtiene Kf Dividiendo: M SM A AA   Lo que se ha disociado Lo que debería haberse formado
35. 35 Determinación de constantes de equilibrio HInHIn d f K K   ][In [HIn] logpHpK; [HIn] ][In][H K dd    Se miden las absorbancias de una disolución de concentración analítica (CT) conocida a tres pH diferentes. 1. pH ácido (HIn) A1 = εHIn CT  εHIn 2. pH básico (In-) A2 = εIn- CT  εIn- 3. pH intermedio (HIn + In-) CT = [HIn] + [In-] [HIn] A3 = εHIn [HIn] + εIn- [In-] [In-] Midiendo el pH de la disolución y sustituyendo se obtiene Kd Determinación del grado de disociación    cc)c(1 HInHIn dK        1 c )c(1 c K 222 d A3 = εHIn[c(1-)] + εIn- (c) = εHInc – εHInc + εIn-c A3 = A1 + (εIn- c – εHIn c) = A1 + (A2 – A1) 12 13 AA AA    Aplicaciones: análisis cualitativo • Análisis de grupos funcionales (complemento de IR y RMN) • Control de calidad: Ciertos productos tienen que ser transparentes al VIS-UV Ej.: El alcohol etílico de 96º puede contener benceno y debe purificarse hasta no absorber. • Elucidación de isómeros. Ej.: bifenilos cis-trans Ej.: Tautomería ceto-enólica del acetilacetato de etilo 275 nm ε = 20 Lmol-1cm-1 C O C H2 C O OC2 H5 CH3 C OH CH3 C H C O OC2 H5 245 nm Esta forma posee dobles enlaces conjugados ε = 18000 Lmol-1cm-1 Aplicaciones: análisis cuantitativo mediante valoraciones fotométricas A (analito) + T (valorante) → P (producto) ][Yε][BiYε][CuYε][Biε][CuεAbs 4745 Y 745 BiY 2745 CuY 3745 Bi 2745 Cu 745 4232    Aplicaciones: análisis cuantitativo A. DIRECTO: Componente absorbente en el VIS-UV: Compuestos orgánicos B. INDIRECTO: Mucho más común en Inorgánica B.1) M + R  P coloreado (complejación y redox principalmente) M + n L  MLn. Elección de L condicionada por: Selectividad, Sensibilidad y Solubilidad B.2) M + Sistema coloreado  Decoloración ~ C Aplicaciones: determinación de macrociclos • A class of biological molecules containing a ring of seven, fifteen, or any arbitrarily large number of atoms • Important class is porphyrins which include the heme group and Chlorophyll a • heme has a π-π* transiton in the blue region at 400 nm. Chlorophyll a π-π* transiton in the 650 nm region to give it its green color
36. 36 Substance pH Phenylalanine 6 257 200 Tyrosine 6 275 1.300 Tryptophan 6 280 5.000 Adenosine-5’-phosphate 7 259 15.000 Cytidine-5’-phosphate 7 271 9.000 Uridine-5’-phosphate 7 262 10.000 Guanosine-5’-phosphate 7 252 14.000 (nm)max mol)(L/cm Aplicaciones: determinación de aminoácidos y nucleótidos Aplicaciones: estudios conformacionales － DNA melting: Hypochromism: Decrease in  upon formation of double helix (H-bond) Muy útil para caracterizar la conformación de ácidos nucleicos y proteínas Binding of a lanthanide complex to an oligonucleotide Changes from form I to form II Recta de calibrado con patrones o estándares http://www.unav.es/quimicayedafologia/quimanal/monografias/estadistica/ Recta de calibrado por adiciones estándar Se emplea en los casos en que los analitos se encuentran en matrices complejas en las que es fácil que surjan interferencias. 1. Preparar varias alícuotas idénticas, de un volumen Vx, de la muestra desconocida 2. Añadir a cada muestra alícuota un volumen creciente, Vs, de una disolución estándar de concentración conocida, Cs, del analito a medir. 3. Enrasar todas las disoluciones a un volumen idéntico, Vt. 4. Hacer la medida instrumental de cada disolución. 5. Trazar la recta de calibrado 6. Calcular la concentración del analito, Cx, en la muestra. V s InstrumentResponse(S) m =  y/  x b = y-intercept (V s ) 0 bmVS s  Recta de calibrado por adiciones estándar t xx t ss V CkV V CkV S  Donde: S señal analítica k constante de proporcionalidad Vs volumen de estándar añadido Cs concentración del estándar Vx volumen de la muestra alícuota Cx concentración del analito en la muestra Vt volumen total de las disoluciones diluídas La expresión que nos da la señal analítica para cada adición estándar es: Recta de calibrado por adiciones estándar Combinado las dos expresiones: t xx t ss V CkV V CkV S bmVS s  x s x mV bC C 
37. 37 Recta de calibrado por adiciones estándar: Ejemplo Ej.: el As presente en una muestra biológica se determina por el método de adiciones estándar. Para ello se pipetearon 10,00 mL de muestra en otros tantos matraces de 100,00 mL. A continuación, se añadieron volúmenes crecientes de un estándar de 22,1 ppm de As a 4 de los 5 matraces, y –finalmente- se llevaron todos hasta el enrase con agua desionizada. A partir de las medidas de absorbancia, calcular la concentración de As en la muestra problema. Arsenic Standard Addition 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0 5 10 15 20 Volume Standard (Vs) Absorbance m = 0.00818 b = 0.1554 sm = 0.000119 sb = 0.001463 Muestra (mL) Estándar (mL) 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Estándar (mL) 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Estándar (mL) Absorbancia 0,156 0,195 0,239 0,276 0,320 g/mL9841 a/mL(10)mL(0,00818)u g/mL(22,1)(0,1554)ua Vm Cb C x s x   , Recta de calibrado por adiciones estándar: Ejemplo Ej.: el As presente en una muestra biológica se determina por el método de adiciones estándar. Para ello se pipetearon 10,00 mL de muestra en otros tantos matraces de 100,00 mL. A continuación, se añadieron volúmenes crecientes de un estándar de 22,1 ppm de As a 4 de los 5 matraces, y –finalmente- se llevaron todos hasta el enrase con agua desionizada. A partir de las medidas de absorbancia, calcular la concentración de As en la muestra problema. 1- mLg1,105 mL g22,1 mL100 mL5,00   C0,0370·0,1554A  Para A = 0: ppm4,2C  Teniendo en cuenta la dilución 10:100, la concentración en la muestra es: 42 ppm Adiciones estándar con concentraciones 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0 1 2 3 4 5 C (ppm) Abs Muestra (mL) Estándar (mL) 10,00 10,00 10,00 10,00 10,00 Estándar (mL) 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Estándar (mL) Absorbancia 0,156 0,195 0,239 0,276 0,320 Standard Addition Method (spiking the sample) - used for analytes in a complex matrix where interferences in the UV/Vis for the analyte will occur: i.e. blood, sediment, human serum, etc.. - Method: (1) Prepare several identical aliquots, Vx, of the unknown sample. (2) Add a variable volume, Vs, of a standard solution of known concentration, cs, to each unknown aliquot. Note: This method assumes a linear relationship between instrument response and sample concentration. (3) Dilute each solution to an equal volume, Vt. (4) Make instrumental measurements of each sample to get an instrument response, IR. Estimación de las concentraciones por adiciones estándar 1. Preparar dos disoluciones con alícuotas idénticas del problema. 2. Hacer una adición del estándar a una de ellas 3. Llevar a volumen las dos disoluciones y medir   x12 ss1 x VSS VCS C   Vs S2 S1 s1 VmSS  Estimación de las concentraciones por adiciones estándar; Ejemplo Una alícuota de 25,00 mL de una disolución acuosa que contiene quinina fue diluida a 50,00 mL y su absorbancia a 348 nm fue de 0,416 con una celdilla de 1,00 cm. A una segunda alícuota de 25,00 mL de disolución problema se le añadieron 10,00 mL de una disolución de 23,4 ppm de quinina. Después de diluir a 50,00 mL la absorbancia resultó de 0,610. Calcular la concentración de quinina en la celda. -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 Abs 348 [Quinina] / g mL -1 1- mLg68,4 mL g23,4 mL50 mL10   La adición realizada supone, tras la dilución, una concentración de Quinina de:   ppm20,07 0,416)(25)(0,610 (23,4)(10)(0,416) VSS VCS C x12 ss1 x     
38. 38 Método del estándar interno Esta metodología intenta corregir fluctuaciones operacionales e instrumentales • Se añade una concentración fija de un estándar (interno) de una sustancia distinta de la analizada, tanto a los patrones del analito como a la muestra problema. • El comportamiento del estándar interno debe ser similar al del analito. • Su señal no debe interferir en la señal del analito. • La respuesta instrumental debida al estándar interno debería ser constante y las posibles desviaciones se asumen que son las mismas que sufre el analito. • Se representa el cociente de señales analito/estándar interno, como en un calibrado normal. Sanalito/Sest int Concentración del analito Método del estándar interno: Ejemplo El Ca puede cuantificarse por espectroscopía de emisión. Al preparar la recta de calibrado, se añadió Sr a todos los patrones de Ca y a la disolución problema, de modo que todas las disoluciones contienen 2,50 g Sr mL-1. Se midieron las intensidades de emisión del Ca a 422,7 nm y las del Sr a 460,7 nm. En función de los datos, calcular la concentración de Ca en la muestra problema. Ca (g mL-1) I (422,7 nm) I (460,7 nm) I(422,7)/ I(460,7) 2,00 16,6 21,5 0,772 4,00 37,8 24,7 1,53 6,00 43,2 18,6 2,32 8,00 68,7 22,3 3,08 10,00 95,2 24,6 3,87 Muestra problema 36,3 19,4 1,87 2 4 6 8 10 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 I(422,7nm)/I(460,7nm) Ca (g L -1 ) 4,85 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 Sin estándar interno Tema 4 1. Espectroscopía de luminiscencia molecular 2. Fluorescencia y fosforescencia 3. Quimioluminiscencia 4. Instrumentación 5. Aplicaciones Espectroscopía VIS - UV 160 780 Incandescencia emisión de luz por parte de un cuerpo a elevada T Luminiscencia Fotoluminiscencia previa absorción de luz IR, UV-Vis Quimioluminiscencia Bioluminiscencia Electroluminiscencia descarga eléctrica en un gas ionizado NO + O3  NO2* + O2 NO2*  NO2 + h (= 600 - 2800 nm) Emisión de radiación Fluorescencia y Fosforescencia
39. 39 Transiciones involucradas en la fluorescencia Reglas de selección Vibrational relaxation Singlet excited states Triplet excited states S2 S1 Internal conversion Intersystem crossing T1 Internal and external conversion Absorption Fluorescence Phosphorescence Ground state Energy λ2 λ1 λ3 λ4 S0 Vibrational relaxation Singlet excited states Triplet excited states S2 S1 Internal conversion Intersystem crossing T1 Internal and external conversion Absorption Fluorescence Phosphorescence Ground state Energy λ2 λ1 λ3 λ4 S0 Mecanismos de excitación y relajación Procesos y escala de tiempos Bandas de absorción y emisión Transiciones y energía
40. 40 Procesos y escala de tiempos Excitación vibracional: Principio clásico de Franck-Condon La transición tiene lugar con el núcleo estacionario. Las transiciones más probables tienen lugar cuando la línea vertical toca la curva superior. Diagrama de energía de Franck-Condon De acuerdo con este principio, la absorción de un fotón es un proceso instantáneo. James Frank se dio cuenta de lo obvio: los núcleos son enormemente pesados en comparación con los electrones. Durante la absorción de la radiación, los que se pueden mover son los electrones, pero no los núcleos. El núcleo atómico, mucho más pesado, no tiene tiempo de reajustarse durante la absorción misma, pero sí lo puede hacer después, y esto es lo que produce las vibraciones. Franck-Condon principle Bandas de absorción y emisión electrónicas 495 nm 520 nm Stokes Shift is 25 nm Fluorescein molecule FluorescneceIntensity Wavelength Es la diferencia de energía entre el pico de absorción de menor energía y el de emisión fluorescente más energético. Desplazamiento de Stokes Espectros de absorción y de emisión de la Quinina
41. 41 • Para una substancia pura presente en disolución en una única forma, su espectro es invariable e independiente de la fuente de excitación • El espectro de fluorescencia se encuentra a longitudes de onda superiores al de absorción • El espectro de fluorescencia viene a ser la imagen especular de la banda de absorción de menor energía (especialmente si la molécula es rígida y no sufre equilibrios de disociación en el estado excitado) Reglas generales del espectro de fluorescencia →* rara vez conduce a fluorescencia pues Eexc es tan elevada que favorece Kd y Kpd →*: más probable y útil para fluorescencia. El cruce intersistema S*1→ T*1 no es muy probable debido a una diferencia notable de energía. n→* también pueden originar procesos fluorescentes. Transiciones fluorescentes Tiempo que transcurre entre la absorción y la emisión fotones emitidos fotones absorbidos  = kr kr + knr = 1 kr + knr = dpdiceciscf f kkkkkk k   Rendimiento cuántico Tiempo de vida de la fluorescencia () Rendimiento cuántico Proceso de absorción eficiente (elevada absortividad) Fluorescencia • Diferencias elevadas de energía entre el singlete y triplete excitados • Diferencias energéticas relativamente altas entre el singlete fundamental y el excitado como para prevenir desactivaciones por vía no radiacional Fosforescencia • Pequeñas diferencias energéticas entre singlete y triplete excitados • Baja probabilidad de transición no radiacional entre el triplete excitado y el singlete fundamental Factores que afectan a la fotoluminiscencia Las moléculas con alto grado de aromaticidad tienden a presentar fluorescencia La rigidez estructural previene la pérdida de energía por desactivaciones rotacionales y vibracionales Fluorescencia y aromaticidad
42. 42 Fluoresceína No fluorescen Cruce intersistema muy favorecido Fluorescen Estructuras fluorescentes Fluoreno Bifenilo   La rigidez molecular tiende a inhibir la conversión interna y por tanto favorece la fluorescencia Fluoresceína Fenolftaleína Efecto de la rigidez estructural Reacciones que incrementan (o disminuyen –apagan-) la fluorescencia pueden tener utilidad analítica como, por ejemplo, las reacciones de complejación de metales con ligandos orgánicos. N O Zn 2 Efecto de la rigidez estructural Compuesto Fórmula F (nm) IF relativa Benceno C6H5 270-310 10 Tolueno C6H5CH3 270-320 17 Propilbenceno C6H5C3H7 270-320 17 Fluorobenceno C6H5F 270-320 10 Clorobenceno C6H5Cl 275-345 7 Bromobenceno C6H5Br 290-380 5 Yodobenceno C6H5I --- 0 Fenol C6H5OH 285-365 18 Fenolato C6H5O- 310-400 10 Anisol C6H5OCH3 285-345 20 Anilina C6H5NH2 310-405 20 Anilinio C6H5NH3 + --- 0 Ácido benzoico C6H5COOH 310-390 3 Benzonitrilo C6H5CN 280-360 20 Nitrobenceno C6H5NO2 --- 0 Substituyentes deslocalizadores de e- : incrementan F Substituyentes de primer orden (dirigen a o-p-) donan e- al anillo: F crece (-OH, -OCH3, -CH3) Substituyentes de segundo orden (dirigen a m-) retiran e- del anillo: F disminuye (-NO2, -COOH) Probabilidad de pre-disociación Fluorescencia: heteroátomos y substituyentes Efecto del átomo pesado Efecto del átomo pesado Disminución de la Fluorescencia por favorecimiento del cruce intersistema o conversiones externas Los átomos pesados favorecen un fuerte acoplamiento spin/orbital y por tanto un cambio de spin. Especies paramagnéticas El O2 disuelto es un fuerte inhibidor de la fluorescencia por favorecer el cruce intersistema (al igual que cualquier substancia paramagnética) Amortiguación (quenching) de la fluorescencia
43. 43 M* → M + h Fluorescencia M* + Q → M + Q + Calor “Quenching” La concentración del “quencher” está relacionada con la intensidad fluorescente por medio de la ecuación de Stern-Volmer 1 F F0  [NaI] 1 F F0  Amortiguación de la Fluorescencia del triptófano 0,1 mM en presencia de concentraciones crecientes de NaI Ecuación de Stern-Volmer Amortiguación (quenching) de la fluorescencia • Un incremento de la T provoca una disminución de IF • Un disolvente menos viscoso disminuye la IF En ambos casos se acentúa la posibilidad de una conversión externa • CBr4 , C2H5I : disolventes que desactivan la fluorescencia y favorecen la fosforescencia Efecto de la T y del disolvente Geometría de equilibrio del estado excitado A F Estado fundamental Franck- Condon Geometría de equilibrio del estado fundamental Estado excitado Franck-Condon ∆E’ ∆E ∆E’s = f (polaridad de los estados fundamental y excitado) n*: estado fundamental más polar. ∆polaridaddisolvente: F *: estado excitado más polar: ∆polaridaddisolvente: F Efecto del disolvente N HH N HH N HH H - + - + : N + H H H Ión anilinio: una sola forma resonante No se observa fluorescencia en el VIS Anilina: tres formas resonantes * más bajo, menor ∆E, mayor : se ve fluorescencia en el VIS Necesidad de tamponar disoluciones patrón y muestra Efecto del pH El pH afecta tanto a la max como al F OH O + H+ pK = 10 max: 285-365 nm 350-400 nm F : 0,18 0,09 SO3 - NH Colorante ANS (8-anilin-naftalen sulfonato) F ~ 0 en disolución acuosa F = 0,98 cuando está enlazado a regiones hidrofóbicas de proteinas y membranas F = 16 ns, max = 454 nm N + H2N NH2 CH2CH3 Br- Bromuro de etidio F ~ 0 En disolución acuosa Unido a ácidos nucleicos F ~ 1, F = 26,5 ns Efecto de la adsorción (inmovilización)
44. 44 P)(PK'F 0  εbc 0 10 P P :Beer            ··· 3! c)b(2,303ε 2! c)b(2,303ε cbε2,303PK'Maclaurin)10(1PK'F 32 0 εbc 0 cbε2,303PK'F 0 cKF Si P0= cte: Si 2,303  b c < 0,05 )10(1PK'F εbc 0   * Si  b c > 1,5 00 εbc PKPK'F110  Existe un valor límite superior para la F Efecto de la concentración Auto-amortiguación (self-quenching) Colisiones entre las moléculas excitadas. Desactivación no-radiacional aumentada Auto-absorción (inner cell effect, inner filter effect) Solapamiento de las bandas de absorción y de emisión: radiación fluorescente que no abandona la celda. Trabajar con muestras diluidas (absorción máx:  0,1) Autoabsorción Luciferin + O2 Luciferase O C O O C R2 R1 Spontaneous CO2 + O C* R2 R1 Light Fluorescencia retardada Fluorescencia Rápida (10-8s) Fosforescencia Lenta (ms–s). Los procesos colisionales competitivos pueden eliminarla completamente a no ser que se eviten totalmente (p.e. en un vidrio) Extinción de la luminiscencia Se puede definir el tiempo de vida de la fluorescencia, f , como el tiempo que ha de trancurrir, desde que se apaga la fuente de excitación, para que la F se reduzca a 1/e (0,368) de la F original f tk 0 f eFF   f fff τkτk 0 0 0f k 1 ττkeln ee;eF e F /e;F:τ ffff    La F sigue una cinética de primer orden (en ausencia de otros procesos) Extinción de la fluorescencia • Las medidas fluorimétricas están limitadas por los blancos • Disolventes e impurezas presentan corrientes de fondo  2 ns • La señal del analito es discernible midiendo a tiempos más largos. Time-resolved fluorimetry
45. 45 • Tiempo de vida elevado > 500 s • Gran desplazamiento Stokes • Perfiles de picos de emisión finos • La F está basada en procesos de transferencia de energía del ligando al catión central. Propiedades de los compuestos lantánidos de coordinación Propiedades de los compuestos lantánidos de coordinación  naftilamina Seguimiento de una reacción enzimática Green Fluorescent Protein (GFP) procedente de las medusas es la más utilizada para seguir la expresión de genes. Marcadores fluorescentes N O N tryptophane  = 280 nm eGFP  = 488 nm O N NO O O TDI  = 630 nm N C NH2 CNH2 NH NH DAPI  = 355 nm O O O N + N NH S TMR  = 514 nm NN NH2 O SO3 - -O3S Cy5  = 630 nm + Fluoróforos típicos Compuesto (nm) Hidrocarburos aromáticos Naftaleno 300-365 Pireno 370-460 Antraceno 370-400 1,2-benzopireno 400-450 Compuestos Heterocíclicos Quinolina 385-400 Sulfato de quinina 410-500 7-hidroxicumarina 450 3-hidroxi-indol 380-460 Tintes Fluoresceína 510-590 Rodamina B 550-700 Azul de metileno 650-700 Coenzimas, ácidos nucléicos, pirimidinas Adenina 380 Adenosina trifosfato (ATP) 390 Dinucleótido de la nicotinamida adenina (NADH) 460 Compuesto (nm) Esteroides Aldosterona 400-450 Colesterol 600 Cortisona 570 Testosterona 580 Vitaminas Riboflavina (B2) 565 Cianocobalamina (B12) 305 Tocoferol (E) 340 Fármacos Aspirina 335 Codeína 350 Estrógenos 546 LSD 365 Fenobarbital 440 Compuestos naturales fluorescentes
46. 46 Moléculas cercanas pueden transferirse energía entre ellas. Esto sucede cuando el espectro de emisión de una solapa con el de absorción de la otra. Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) • FRET es una interacción dependiente de la distancia entre los estados excitados de dos moléculas. La transferencia resonante de energía tiene lugar cuando las moléculas donora y aceptora están a menos de 100 Å una de la otra. • FRET varía con la potencia 1/6 de la separación intermolecular, por lo que funciona muy bien a distancias similares a las dimensiones de macromoléculas biológicas. • FRET puede utilizarse para desplazar espectralmente la emisión fluorescente de una combinación molecualr. • El espectro de absorción del aceptor debe solaparse con el espectro de emisión del donor. • La transferencia de energía es por vía no radiacional, es decir, el donor no emite un fotón que es captado por el aceptor. Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Wavelength Absorbance DONOR Absorbance Fluorescence Fluorescence ACCEPTOR Molecule 1 Molecule 2 La transferencia de energía de resonancia puede tener lugar cuando los compuestos donor y aceptor están próximos ( < 100 Å) La FRET puede ser útil para lograr un espectro de fluorescencia desplazado a  superiores. D* + A  D + A* Donor Aceptor Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Punto crítico: encontrar la pareja donor-aceptor adecuada h FRET h R = 1 - 10 nm ~ 1/R6 kT  1 D R0 r     6 La velocidad de transferencia está predicha por la teoría de Förster R0  9.78 10 3 2 QDJ() n4     1 6 Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET)
47. 47 El grupo dansilo es muy apropiado para FRET con proteínas que contienen triptófano. Puede unirse covalentemente a la proteina. Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) triptófano - max F = 350 nm dansilo - max Abs = 340 nm max F = 510 nm Ensayo de ruptura peptídica + proteasa La ruptura del péptido supone la pérdida de FRET, desapareciendo la F del aceptor Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonant Energy Transfer (FRET) Bioluminiscence Resonance Energy Transfer (BRET) Sodio dodecil sulfato, SDS Luminiscencia en medios micelares
48. 48 Luminiscencia en medios micelares Luminiscencia en medios micelares Concentración micelar crítica (CMC) Concentración micelar crítica (CMC) Solubilización micelar Solubilización micelar
49. 49 Fosforescencia Fosforescencia y cruce intersistema Espectros de absorción y emisión Fosforescencia a temperatura ambiente (RTP) A + B  C*  C + h Detección de sangre con luminol C NH NH C NH2 O O O2/OH- NH2 COO- COO- + h + N2 + H2O Barras luminosas con ester fenil oxalato Quimioluminiscencia Química forense
50. 50 Determinación de agentes oxidantes Cl2, HOCl, OCl-, H2O2, NO2 Quimioluminiscencia • Determinación de reactivos gaseosos en reactores • Análisis de contaminantes en el aire • Estudios atmosféricos • Indicación del punto final en valoraciones en fase gas • Determinación de metales traza • Determinación de reactivos orgánicos y bioquímicos Aplicaciones emergentes Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia Plantas “emisoras” Gen luciferasa clonado en plantas Luciferin + O2 Luciferase O C O O C R2 R1 Spontaneous CO2 + O C* R2 R1 Light S N HO N S O HO 510-670 nm Bioluminiscencia Bioluminiscencia
51. 51 Instrumentación: fluorímetro de filtros simple • Buena estabilidad • Haz espacialmente difuso • Baja intensidad • Buena estabilidad • Continuo desde 300 – 1.300 nm • Alta intensidad Instrumentación: fuentes Instrumentación: espectrofluorímetro Emission Instrumentación: espectrofluorímetro Instrumentación: celdillas Instrumentación: medida de la fosforescencia
52. 52 Money (helps?) world go round! Tema 5 1. Principios de espectroscopía atómica 2. Espectros atómicos de emisión y absorción 3. Términos espectrales 4. Anchuras de línea 5. Atomización por llama y electrotérmica 6. Elección de las condiciones óptimas 7. Atomización con fuentes de plasma 8. Atomización con arco y chispa 9. Instrumentación 10. Aplicaciones Emisión Atómica (EA, AE) Kirchoff y Bunsen pioneros, s XIX 1957: Ramírez Muñoz y Burriel Martí, “Flame Photometry. A Manual of Methods and Applications” primer libro sobre fotometría de llama Absorción Atómica (AA) ’60: Walsh (Australia) publica los primeros trabajos en absorción atómica apoyado por Alkemade y Milatz en Holanda Fluorescencia Atómica (FA, AF) 1964: West y Winefordner comienzan a trabajar en FA con Zn, Hg y Cd Espectrometría Atómica E0 E1 E2 UV-VIS E E0 E1 E2 v0 v1 v2 r0 r1 r2 UV-VIS IR E Diagramas de energía atómico y molecular Atomic Emission Spectroscopy (AES) Atomic Absorption Spectroscopy (AAS) Atomic Fluorescence Spectroscopy (AFS) Tipos de espectroscopias atómicas Na Mg+ • Modelos similares entre átomos, pero diferente espaciado • El espectro iónico es diferente al atómico • Las separaciones se miden en eV 1eV =1.602x10-19 J = 96. 484 kJ ×mol-1 • A medida que crece el número de electrones, el número de niveles se incrementa y los espectros de emisión se hacen más complejos Li 30 líneas, Cs 645 líneas, Cr 2277 líneas Niveles de energía de Na atómico y del ión Mg(II)
53. 53 Niveles de energía de Mg atómico Espectro de emisión del Na atómico Espectros de líneas: transiciones electrónicas puras Anchura de pico: Anchura expresada en unidades de frecuencia cuando la magnitud de la señal es la mitad de la máxima Valores típicos: centésimas de Å Espectros atómicos Ejemplos: carbono oxígeno nitrógeno • Las posiciones de las líneas están bien definidas y son características para cada elemento • En espectroscopía atómica es factible hacer análisis cualitativo Espectros atómicos o de líneas Espectro de emisión de salmuera 1. Incertidumbre (ensanchamiento natural de línea) ; 1  t ;1 t ;hht   t h EhEt   ; 2. Efecto Doppler (agitación térmica de los átomos que varían su posición respecto del observador) ; n c  2/12 0 1 1                  V u V u  0 : frecuencia de la radiación observada cuando la fuente se mueve respecto al detector V=c/n : velocidad de la radiación en un medio dado u : velocidad del movimiento de la fuente lumínica (átomo) hacia el detector Relativamente pequeño (~10-4 Å) Δtπ2 1 Δ N 2π h ·t; 2π h Et  h Ensanchamiento de las líneas atómicas
54. 54 Si los átomos se mueven hacia el detector, las ondas están más compactas, mayor frecuencia,  más corta. Si los átomos se alejan del detector, las ondas se descomprimen, frecuencia más baja,  más larga. Efecto Doppler 3. Ensanchamiento Lorentz (efecto de la presión; colisiones entre los átomos emisores y otras partículas presentes) 4. Efecto de los campos magnéticos (Zeeman) y eléctricos (Stark) 0D c u Δ   u  Temperatura, masa-1 ND 1/2 D0D Δ100Δ;TΔ; m T Δ   Buena aproximación para explicar la zona central de la línea PΔ L  P: presión total del gas en cuyo seno se hallan los átomos del analito Buena explicación de lo que sucede en las alas de la línea Ensanchamiento de las líneas atómicas Espectros de bandas de especies moleculares Fuente Muestra PP0 Chopper Selector de  Detector Procesador de la señal Tipo Método de Atomización Fuente de radiación atómica (llama) aspiración de la muestra Lámpara de cátodo a la llama hueco (LCH, HCL) atómica (sin llama) disolución de muestra HCL evaporada y calcinada absorción R-X no es necesario tubo de RX0 Espectroscopía de absorción atómica Fuente Muestra P Monocromador Detector Procesador de la señal Tipo Método de atomización Fuente de Radiación arco arco eléctrico muestra chispa arco de alto voltaje muestra plasma de Ar muestra calentada en un plasma de Ar muestra llama disolución de la muestra aspirada a la llama muestra emisión de RX no es necesario; muestra bombardeada con e- muestra Espectroscopía de emisión atómica Tipo Método de Atomización Fuente de radiación atómica (llama) muestra disuelta muestra aspirada a la llama atómica (sin llama) muestra disuelta muestra evaporada y calcinada fluorescencia RX no es necesario muestra Fuente Muestra PP0 90o Selector de  Detector Procesador de la señal Espectroscopía de fluorescencia atómica
55. 55 Resonancia Línea directa normal Por etapas normal Resonancia activada térmicamente Línea directa activada térmicamente Anti-Stokes activada térmicamente a a a aaa f f f fff t t t Mecanismos de fluorescencia atómica Desactivación no-radiacional Radiaciones fluorescentes resonante y normal del Tl Fuente de excitación Sistema atomizador Sistema de selección espectral Sistema de detección electrónica Componentes instrumentales básicos Para que se cumpla la ley de Beer, la anchura de la línea de la fuente ha de ser menor que la anchura de la línea de absorción por parte del vapor atómico Absorción atómica de una línea de resonancia Absorción atómica de una línea de resonancia Atomizadores utilizados en espectroscopía atómica
56. 56 Introducción de la muestra a) Tubo concéntrico: gas a elevada presión que arrastra la muestra que sale del capilar b) Flujo cruzado: el aerosol se produce por un flujo transversal al final del capilar c) Frita cerámica: bombeo del líquido sobre un disco de frita cerámica a través del cual fluye el gas; produce una niebla más fina. d) Babington: el líquido incide sobre la superficie esférica hueca que contiene un orificio por el que fluye el gas. Nebulizadores neumáticos: convierten la muestra en una niebla de finas gotículas (spray) que son portadas por el gas hacia el atomizador. Introducción de la muestra Nebulizadores ultrasónicos: la disolución es nebulizada sobre una superficie piezoeléctrica produciendo una niebla densa y homogénea. Introducción de la muestra Vaporizadores electrotérmicos: • depósito de la muestra sólida o líquida sobre la superficie de un resistor • el paso de corriente a través del resistor produce la evaporación de la muestra • un gas (Ar) fluye a través del resistor y porta la muestra gaseosa hacia el atomizador • la señal obtenida es transiente en lugar de contínua Introducción de la muestra Generación de hidruros: • útil para As, Sb, Sn, Se, Bi, Pb • Reacción modelo: 3 BH4 - + 3 H+ + 4 H3AsO3  3 H3BO3 + 4 AsH3 + 3 H2O Sample Add NaBH4 SbH3, AsH3 SbH3 + Q  Sb + 3/2 H2 Introducción de la muestra Introducción de la muestra
57. 57 • Directa • Vaporización electrotérmica • Ablación por Arco o Chispa • Ablación por Láser • Descarga luminiscente Introducción de muestras sólidas 100g min-1 Descarga luminiscente como fuente de plasma iónico Introducción de la muestra Chopper Instrumentación básica típica en AA de llama (Flame Atomic Absorption) Es el componente más importante y crítico El spray de muestra que llega a la llama sufre : vaporización, atomización y excitación de los átomos El atomizador de llama consta de 2 componentes: NEBULIZADOR Y MECHERO Sistema atomizador: llama Nebulizador: transforma la muestra aspirada en una neblina de gotas finísimas (spray) Mechero: genera la llama en cuyo seno se vaporiza, atomiza y excita la muestra. Dos tipos fundamentales de llamas: TURBULENTAS LAMINARES O PREMEZCLA (Premix) Sistema atomizador: llama
58. 58 Consumo total Premezcla Llama turbulenta, ruidosa Gran sensibilidad Pobre selectividad Llama laminar, silenciosa Gran selectividad Poca sensibilidad (3% aspirada) Mecheros Velocidad de aspiración: ~5 mL/min Eficienica de nebulización: ~5% Mecheros de premezcla Aspiración de la muestra Procesos durante la atomización en llama Procesos durante la atomización en llama Composición de las llamas
59. 59 Zona primaria: 2 C2H2 + 2 O2  4 CO + 2 H2 Zona secundaria: 4 CO + 2 H2 + O2  4 CO2 + 2 H2O Max temperature location about 1 cm above the primary combustion zone. Optical focus to this region Estructura y temperatura de una llama Distribución de metales en llama rica y pobre (lean) en combustible • Ag (no fácilmente oxidable) • Crecimiento contínuo con la altura de la llama • Cr (forma óxidos estables) • Señal contínuamente decreciente • Predomina la formación del óxido • Mg • Compromiso entre atomización y formación de compuestos moleculares • Elección juiciosa de la altura de llama adecuada en cada caso Efecto de la altura de observación en la llama Perfil de la llama para la línea del Ca en una llama cianógeno-oxígeno para diferentes caudales de muestra. Efecto de la altura y de la velocidad de flujo Lámpara de cátodo hueco (HCL) Ánodo: W, Ni, Zr ΔV  300 V; I = 5 – 20 mA A mayor ΔV, se obtiene intensidades más elevadas Inconveniente: autoabsorción Lámparas mixtas: Cr, Co, Cu, Fe, Mn, Ni Ca, Mg, Al Fe, Cu, Mn Cu, Zn, Pb, Sn Sección transversal de una HCL
60. 60 Compartimento para las lámparas 0,1 – 5 torr 2450 MHz Tiempo de vida > 50 h 10 veces más intensa que HCL Inconveniente: inestabilidad requiere enfriamiento Útil en Fluorescencia Atómica Disponible para: As, Bi, Cd, Cs, Ge, Hg, K, Pb, Rb, Sb, Se, Sn, Ti, Tl, Zn Lámpara de descarga sin electrodos (EDL) Corriente relativamente elevada: 0,5 A ∆V  30 V Ar: 1-5 torr Filamento recubierto de óxido de Ba, Ca, Sr Intensidad: TGL  EDL > HCL EDLTGL nm 2/12/1 001,0   TGL y EDL : se usan para As y Se  < 200 nm Lámpara de gradiente de temperatura (TGL) Interferencias comunes a las tres • Espectrales • Físicas • Químicas • Variaciones en la T • Ionización Interferencias en AA y FA: Dispersión de luz incidente (scattering) Interferencia típica de FA: Amortiguación de la fluorescencia (quenching) Interferencias en espectroscopías atómicas Espectrales: solapamiento de líneas. Más crítico en EA. Casi inexistente en AA y poco común en FA Físicas: variación de viscosidad y tensión superficial que afectan a la nebulización. Afectan por igual a las tres técnicas Variación de T en el atomizador: supone una modificación del número de átomos excitados. Afecta especialmente a la EA Ionización: disminución de la señal analítica por producción de iones en lugar de átomos M0  M+ + e- (especialmente en alcalinos y alcalinotérreos y en llamas calientes) Alternativa: supresores de ionización Interferencias Interferencia espectral : proximidad de líneas < 0,1 Å Análisis de Al: 3 082,15 Å, 3 092,7 Å El V tiene una línea a 3 082,11 Å ¿interfiere la cuantificación del Al? Ciertamente, NO Interferencias espectrales
61. 61 Se usa como referencia una segunda línea procedente de la fuente que esté muy próxima a la línea de absorción del analito. El analito no debe absorber a la longitud de onda de la línea de referencia. Esta modalidad de corrección no se usa con mucha frecuencia debido a la dificultad de encontrar una línea de referencia adecuada. Cualquier absorbancia observada para la línea de referencia se asume que se debe a la dispersión/absorción de especies moleculares (fondo). Restando este valor del obtenido en la línea del analito, obtenemos la absorbancia corregida debida únicamente a la especie atómica de interés. La línea de referencia puede ser: • Impureza de la lámpara • Línea del gas de relleno de la lámpara • Línea no resonante del propio elemento constitutivo de la lámpara Interferencias espectrales: corrección con dos líneas Interferencias espectrales: corrección con fuente continua = Boltzmann Equation: e -E kTN* N0 g* g0 = Number of atoms at each energy Number of levels at each energy (degeneracy) Temperature in K 1.38x10-23 J/K Boltzmann constant (E* - E0) La temperatura modifica el número de átomos en los estados fundamental y excitado Efecto de la T en la espectrometría atómica 2.510 K: 6.000 K: N*/N0 = 1.01x10-5 N*/N0 = 8.27x10-3 N*/N0 = 1.05x10-5 (4% más en el estado excitado para un incremento de 10 K en la T) La absorción atómica se produce en la transición desde el estado fundamental a un estado excitado La emisión atómica tiene lugar al pasar de un estado excitado al fundamental La emisión estará más afectada por variaciones de la temperatura, pues el porcentaje de átomos en el estado excitado depende fuertemente de la T Ej.: Calcular el cociente N*/No para un átomo que tiene 2 niveles de energía (ambos monodegenerados) que se diferencian en 3,97·10-19 J/átomo que está expuesto a una llama a 2.500 , 2.510 y 6.000 K. 2.500 K: Efecto de la T en la espectrometría atómica Interferencia de ionización Este problema se puede minimizar por la adición de supresores de ionización, que son sustancias más fácilmente ionizables y que producen una elevada concentración de electrones en la llama que retrotraen o impiden la ionización del analito. Ej.: el K es un buen supresor para la determinación de Sr. Interferencia de ionización
62. 62 Ciertos componentes de la muestra perjudican la eficiencia de la atomización del analito Ej.: PO4 3- y SO4 2- dificultan la atomización del Ca2+ Solución: añadir un agente liberador o protector AEDT: se une preferentemente al Ca2+, pero no impide la atomización (protector) La3+: reacciona preferentemente con el PO4 3-, liberando el Ca2+ (liberador) Interferencias químicas 1. Formación de compuestos poco volátiles Ca (PO4 3-, SO4 2-); Mg(Al) Alternativas: T y uso de agentes liberadores y protectores OMMO  ClNaNaCl  2. Equilibrios de disociación Alcalinos: óxidos poco estables  predominio de líneas atómicas Alcalinotérreos: óxidos relativamente estables  predominio de bandas OxTiOx OxAlOx OxVVOx    Ti Al    Llamas ricas en combustible Interferencias químicas Una nebulización deficiente puede permitir que lleguen gotas gruesas a la llama, que producen dispersión de radiación, que resulta en: • Disminución de la potencia del haz radiante • Señales falsas (espúreas): absorciones inespecíficas Desactivación por vía colisional con las moléculas de los gases que se queman en la llama. Ar, N2 y gases nobles no amortiguan o apagan la fluorescencia. Alternativa: purga con Ar  fondos muy bajos. Scattering (AA y FA) Quenching (AA y FA)         stm wat b π4 h ANB 2022   kT h 0 2 0 2 e g g N N             stm wat Ne g g b π4 h AB 20 kT h 0 2 02    C QT F ·103N 21 0   Winefordner F: Flujo de muestra líquida aspirada (mL/s) : eficiencia en la vaporización : eficiencia en la atomización Q: flujo de desaparición del vapor en la llama T: temperatura absoluta C: concentración analítica de la disolución C)(wat/mIdθB 2   b V S N2 at*/m3 dθ Efecto de la concentración (EA) Lámpara 0 , I0 b I Abs = K · b · N0 = K’· b · C b V S dθ I0 IF CNbfI 4π dθ I 0F0F         f: fuerza del oscilador de la transición implicada : depende de la geometría del atomizador (llama, filamento..) F: rendimiento cuántico de la fluorescencia. Marcada dependencia de los gases de la llama (pueden “quenchar”) Efecto de la concentración (AA) Efecto de la concentración (FA) • La corriente oscura se anula con un obturador • El 100%T se ajusta con un blanco aspirado a la llama En AA tanto la luz procedente de la LCH como de la llama alcanzan el detector - medida de una señal pequeña en el seno de un fondo grande - necesidad de restar el fondo (continuo) de la llama para recoger sólo la señal analítica procedente de la lámpara (P/P0)  Modulación de la fuente  Doble haz Instrumentación: monohaz P tiempo Llama sola Llama + fuente
63. 63 • El haz de referencia corrige las posibles variaciones en la intensidad de la lámpara • El haz de referencia no atraviesa la llama. Posibles pérdidas de potencia causadas por absorción o dispersión de la llama quedan sin compensar. Instrumentación: doble haz • Sistema dinámico de altas T • Tremendamente estable, reproducible, fiable • Pocos efectos memoria • Combinando adecuadamente combustible y comburente se logran intervalos de T muy amplios y se logran elevados grados de atomización • Atomizador barato y duradero • Elevadas prestaciones en cuanto a sensibilidad y selectividad para más de 70 elementos medidos entre 200 - 800 nm Ventajas de la llama como sistema atomizador • Volumen mínimo de muestra líquida relativamente elevado (1,5 – 2 mL) • Hay que mantener la cámara de premezcla llena para garantizar un régimen estacionario • En disolución acuosa la menor tensión superficial hace que el rendimiento de la nebulización sea bajo (se prefieren disolventes orgánicos; además se mejora la combustión y se aporta calor a la llama con la consiguiente mejora en sensibilidad) • Gotas gruesas que llegan a la llama: absorciones inespecíficas • Necesidad de trabajar con gases embotellados (riesgo relativo) Desventajas de la llama: 1.- Prácticas • Disolución y expansión de la muestra en el caudal grande (hasta 10 L/min) de gases que pasan por la llama: dilución y pérdida de sensibilidad • Escaso rendimiento de atomización para los elementos que muestran avidez por el O2 para formar óxidos refractarios, que se suma al escaso tiempo de residencia del analito en la llama • Existe un margen de maniobra para modificar la proporción de oxidante, pero siempre habrá necesidad de comburente • No se pueden introducir sólidos Desventajas de la llama: 1.- Intrínsecas 1. Incremento de la sensibilidad. (> 103) Los átomos no se expanden Ausencia de O2 (purga con Ar) 2. Posibilidad de usar micromuestras (5, 10, 20 L) 3. Análisis de muestras sólidas, sin ataque previo 4. Disminución de absorciones inespecíficas, facilitado por la purga con gas noble, aunque no siempre es así 5. Señales transientes Ventajas de los atomizadores sin llama Navecilla de Tántalo Tantalum boat (1968) : abandonado por falta de reproducibilidad Atom trap: cilindro de cuarzo refrigerado (recoge átomos) - calentado (desorbe átomos) LCH D Copa de Delves (Ni) Delves cup: primer intento de confinamiento del vapor atómico en el paso óptico. Determinación de Pb en sangre Primeras y rudimentarias Alternativas a la llama
64. 64 Sample Add NaBH4 SbH3, AsH3 SbH3 + Q  Sb + 3/2 H2 Ruta alternativa Apropiado para grupos IV, V, VI B: Ge, Sn, Pb, As, Sb, Bi, formadores de hidruros gaseosos y muy volátiles a T ambiente 3 BH4 - + 3 H+ + 4 H3AsO3  3 H3BO3 + 4 AsH3 + 3 H2O • Estos elementos en la llama tienden a formar compuestos, no átomos • Sus líneas de resonancia (190 nm) caen en la fuerte absorción del fondo de la llama ( 103 AA Atomizadores electrotérmicos: horno de grafito Automatización Equipo de AA en Quimedaf Composición típica del horno: Grafito GFAAS: Graphite Furnace Atomic Absorption Spectroscopy • Longitud: 18 - 28 mm • Volumen de muestra: 5 - 100 L • Vida del horno: 200 - 1000 ciclos • Temperatura máxima: 3000C para evitar descomposición del grafito • El C puede actuar como reductor de iones metálicos • Flujo de Ar: evita oxidación del C grafítico Otros materiales: Ta, W, Pt • Se requiere alto punto de fusión • No deberán emitir radiancia a alta temperatura (desventaja del W y Ta) Atomizadores electrotérmicos: horno de grafito
Química+analítica+instrumental,
Francisco Muoyerro Gonzlez
Version 2014-06-22

References: resolución 
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