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Timestamp: 2018-11-15 03:44:55+00:00

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Tema cromatografía de líquidos de alta resolución características y equipos disponibles 0 Características más importantes
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4.0. CARACTERÍSTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES
4.0.1. Características más importantes
4.0.2. Equipos disponibles en el departamento de Ingeniería Química y en los Servicios Técnicos de investigación de la Universidad de Alicante
4.1. INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
4.1.1. Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes
4.1.2. Sistemas de bombeo
4.1.2.1. Tipos de bombas
4.1.2.2. Amortiguadores de pulsos
4.1.2.3. Control del caudal y sistemas de programación
4.1.3. Sistemas de inyección de muestra
4.1.4. Columnas para cromatografía de líquidos
4.1.4.1. Columnas analíticas
4.1.4.2. Precolumnas
4.1.4.3. Termostatos
4.1.4.4. Tipos de rellenos de la columna
4.1.5. Detectores
4.1.5.1. Detectores de absorbancia
4.1.5.2. Detectores de fluorescencia
4.1.5.3. Detectores de índice de refracción
4.1.5.4. Detector de dispersión de luz
4.1.5.5. Detectores electroquímicos
4.2. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA HPLC
4.2.1. Cromatografía de reparto
4.2.1.1. Columnas para cromatografía con fases unidas químicamente
4.2.1.2. Establecimiento del método en cromatografía de reparto
4.2.1.3. Aplicaciones de la cromatografía de reparto
4.2.2. Cromatografía de adsorción
4.2.2.1. Selección del disolvente en cromatografía de adsorción
4.2.2.2. Aplicaciones de la cromatografía de adsorción
4.2.3. Cromatografía iónica
4.2.3.1. Equilibrios de intercambio iónico
4.2.3.2. Rellenos de intercambio iónico
4.2.3.3. Aplicaciones inorgánicas de la cromatografía íónica
4.2.3.4. Aplicaciones orgánicas y bioquímicas
4.2.4. Cromatografía de exclusión por tamaños
4.2.4.1. Rellenos de columna
4.2.4.2. Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaños
4.0. CARACTERISTICAS Y EQUIPOS DISPONIBLES
Aplicaciones principales: Técnica de separación para los materiales menos volátiles e iónicos; análisis cuantitativo de multicomponentes.
Fenómeno molecular: Reparto entre una solución líquida y un substrato
Ventajas en el análisis cuantitativo: Aplicación amplia a los materiales menos volátiles, análisis de multicomponentes.
Muestra promedio deseable: 10 mg
Limitaciones del método: Se tarda en desarrollar el método
Limitaciones para la muestra: Ninguna
Tres cromatógrafos Shimadzu.
Detectores de absorbancia ultravioleta, de conductividad iónica y de índices de refracción.
Termostatos para control de la temperatura de la columna.
Tres cromatógrafos (Shimadzu, Waters y Dionex) todos con posibilidades de gradientes de concentración de eluyente.
Detectores de absorción ultravioleta, índices de refracción, fluorescencia, conductividad, serie de diodos (UV) y espectrometría de masas.
Un inyector automático de muestras.
Este capítulo trata de los cuatro tipos básicos de cromatografia en los que la fase móvil es un líquido: (1) cromatografía de reparto; (2) croma­tografía de adsorción, o líquido sólido; (3) croma­tografía iónica; y (4) cromatografía de exclusión por tamaños, o en geles. Todo este capítulo tiene relación con las aplicaciones en columna de estos cuatro importantes tipos de cromatografia.
En una primera etapa la cromatografia de líquidos se realizaba en columnas de vidrio con diámetros de 1 a 5 cm y longitudes de 50 a 500 cm. En este tipo de columnas realizó Tswett sus trabajos originales. Para asegurar unos cau­dales razonables, el diámetro de las partículas de la fase estacionaria sólida por lo general era de 150 a 200 m. Incluso así, los caudales eran bajos, llegando a unas pocas décimas de mililitro por minuto. En consecuencia, los tiempos de separación eran largos a menudo de varias horas . Los intentos para acelerar el procedi­miento clásico mediante la aplicación de vacío, o por bombeo no resultaron efectivos, puesto que el aumento de caudal originaba un aumento de la altura de plato por encima del mínimo característico que se observa en las gráficas de la altura de plato frente al caudal y el resultado era una menor eficacia.
En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografía de líquidos, los científicos se die­ron cuenta de que se podían conseguir grandes aumentos en la eficacia de la columna disminu­yendo el tamaño de las partículas de los rellenos. Sin embargo, no fue sino hasta finales de los años sesenta cuando se desarrolló la tecnología adecuada para producir y utilizar rellenos de tamaño de partícula del orden de los 3 o 10 m. Esta tecnología requiere una instrumentación sofisticada, que contrasta con las simples colum­nas de vidrio de la cromatografía de líquidos clásica. Para distinguir estos procedimientos más nuevos de los métodos básicos, que todavía se utilizan con fines preparativos, se emplea la de­nominación de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC).
Es incuestionable que la cromatografía de líqui­dos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada, con unas ventas anuales de equipos de HPLC que se aproximan a la cifra de cientos de miles de millones de pesetas. Las razones de la popularidad de esta técnica son su sensibi­lidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la se­paración de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nu­cleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibióticos esteroides, especies organometálicas y una cierta variedad de sustancias inorgánicas.
La Figura 4.1 pone de manifiesto que los distintos procedimientos que utilizan la cromatografía de líquidos tienden a ser complemen­tarios por lo que a sus campos de aplicación se refiere. Así, para solutos con masas molecula­res superiores a 10 000, a menudo se utiliza la cromatografía de exclusión, aunque ahora tam­bién es posible tratar estos compuestos con cro­matografia de reparto en fase inversa. Para es­pecies iónicas de baja masa molecular, se utiliza con frecuencia la cromatografia de intercambio iónico. Los métodos de reparto se aplican a las especies poco polares pero no iónicas. Además, este procedimiento se utiliza muchas veces para la separación de los integrantes de una serie homóloga. La cromatografia de adsorción se elige con frecuencia para separar compuestos como, por ejemplo, los hidrocarburos alifáticos de los alcoholes alifáticos.
Figura 4.1. Aplicaciones de la cromatografía de líquidos
Por otro lado, la discusión sobre el ensanchamiento de banda del tema 2 es aplicable a la cromatografia de líquidos. A continuación se ilustra el importante efecto del tamaño de partícula del relleno y se describen otras dos causas del ensanchamiento de zona, que a veces son de notable importancia en cromatografia de líquidos,
Efectos del tamaño de partícula del relleno. El coeficiente de transferencia de ma­sa de la fase móvil es función inversa del cuadrado del diámetro de las partículas que constituyen el relleno. Como consecuencia de ello, la eficacia de una columna de HPLC debería mejorar espectacularmente cuando disminuye el tamaño de partícula. Por ejemplo una reducción del tamaño de partícula de 45 a 6 m origina una disminución de diez o más veces de la altura de plato.
Ensanchamiento de banda extracolumna en cromatografía de líquidos. En cromatografia de líquidos, tiene lugar a veces un ensanchamiento de banda significativo fuera del relleno de la columna. Este ensanchamiento, denominado ensanchamiento de banda extraco­lumna, tiene lugar cuando se transporta el soluto a través de tubos como los que se utilizan en los sistemas de inyección, en los detectores y en los tubos que conectan los distintos componentes del sistema. El ensanchamiento proviene de la dife­rente velocidad de flujo que hay entre las capas de líquido adyacentes a las paredes del tubo y las del centro. Como consecuencia, la parte central de una banda de soluto se mueve con más rapidez que la periferia. En cromatografia de gases la difusión compensa la dispersión extracolumna. Sin embargo, la difusión en los líquidos es signi­ficativamente menor, y con frecuencia este tipo de ensanchamiento de banda se hace evidente.
Cuando se utilizan columnas de pequeño diámetro, el ensanchamiento extracolumna pue­de hacerse bastante importante. En este caso, todos los esfuerzos han de orientarse a la reduc­ción del radio de los tubos del sistema externos a la columna.
Efecto del tamaño de muestra en la eficacia de la columna. La cantidad de muestra (g de muestra/g de relleno) también afecta a la eficacia de la columna. Para las aplicaciones con columnas de reparto y adsorción, la eficacia decrece notablemente con la cantidad de muestra. En columnas de fase inversa el decrecimiento en eficacia es mucho mas pequeño.
Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comu­nes en la moderna cromatografia de líquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que el que se utiliza en otros tipos de cro­matografia. La Figura 4.2 muestra un esquema de los componentes fundamentales de un cro­matógrafo de líquidos de alta resolución típico. Cada uno de los componentes se trata en los párrafos que siguen a continuación.
Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero ino­xidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes a me­nudo se equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos en general oxígeno y nitró­geno que interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para ca­lentar y agitar los disolventes o, como se muestra en la Figura 4.2, sistemas de difusión que per­miten arrastrar los gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas iner­te de baja solubilidad. Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las partículas sólidas en suspensión de los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 4.2. Por ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente, consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño. Este tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión.
Una separación que utiliza un solo disolven­te de composición constante se denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polari­dad significativamente distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalona­das. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía continuamente y la rela­ción de volumen de los disolventes se puede mo­dificar lineal o exponencialmente con el tiempo.
La Figura 4.3 ilustra la ventaja de una elu­ción con gradiente en la separación de una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gra­diente, que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la concen­tración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los primeros picos. Nótese también que la elución con gradiente produce unos efectos si­milares a los producidos por la programación de temperatura en cromatografía de gases.
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:
(1) la generación de presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% re­lativo y (5) componentes resistentes a la corro­sión (juntas de acero inoxidable o teflón). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosión, debido a que los líquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema sólo supone una pérdida de disolvente. Es evidente que esta pér­dida puede suponer un riesgo de incendio.
Figura 4.3. Mejora de la eficiencia de la separación mediante la elución con gradiente. Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase ODS. Muestra: 5 L de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotómetro de UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60ºC, presión 80 kg/cm2. (a) elución con gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporción de metanol a una velocidad de un 8% / min (b) Elución isocrática con metanol 50% / agua 50%
Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamien­to y bombas neumáticas o de presión constante.
Las bombas recíprocas, que se utilizan en apro­ximadamente el 90% de los sistemas de HPLC comercializados, consisten, por lo general, en una pequeña cámara en la que el disolvente es impe­lido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la línea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recíprocas se pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 500 kg/cm2), su fácil adaptación a la elución con gradiente, y sus caudales constantes, que son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del disolvente.
Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones de flujo. Un método sencillo de amortiguación contiene un fuelle flexible o un gas compresible en la porción superior cerrada de un tubo en T para absorber parte de la energía de pulsación. Cuando la bomba se rellena esta energía se libera para ayudar a suavizar la pulsación de presión. Los amortiguadores electrónicos de pulsos proporcionan una carrera hacia delante corta y rápida del pistón, y enseguida la carrera rápida de recarga de la bomba. El pequeño impulso hacia delante amortigua el pulso de flujo llevando disolvente a la presión del sistema.
Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comerciales se equipan con dispositivos controlados por ordenador que per­miten medir el caudal mediante la determinación de la caída de presión a través de un restrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la velocidad del motor de la bomba.
Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composición del disolvente bien sea de una forma continua o bien de forma escalonada.
A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de ser muy pe­queños, de unas pocas décimas de microlitro a tal vez 500 L. Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.
En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para la introducción de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura 4.4. Estos dispositivos están normalmente integrados en el equipo cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisión relativa de unas dé­cimas por ciento. También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con vo­lúmenes de 0,5 a 5 L.
Figura 4.4. Bucle de muestra para cromatografía de líquidos.
Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario con tubo de acero ino­xidable de diámetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas que difieren en tamaño y relleno se comercializan por distin­tos fabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.
La mayoría de las columnas para cromatogra­fía de líquidos tienen una longitud entre 5 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3, 5 y 10 m.
Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partícu­las de 5 m. Estas columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro.
También, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores dimensiones que las ante­riormente descritas. Estas columnas pueden tener diámetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de 3 o 5 m. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente. La última propiedad es de considerable importancia, puesto que los di­solventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros.
En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se coloca delante una pre­columna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de los disolventes. Además, en cromatografía líquido líquido, la precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase esta­cionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica. La composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para minimizar la caída de presión.
En muchas aplicaciones no se necesita un con­trol estricto de la temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas décimas de grado centí­grado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas que con­trolan la temperatura de la columna a las déci­mas de grado, desde la temperatura ambiente hasta 150 ºC. Para poder controlar con precisión la temperatura, las columnas también se pueden colocar en camisas con agua que provenga de un baño a temperatura constante.
En cromatografía de líquidos se han utilizado dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de par­tícula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos diámetros característicos de 30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de una resina de intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento adicio­nal, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por adsorción. Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una capa superficial orgánica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan am­pliamente en las precolumnas y no en las co­lumnas analíticas.
Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía de líquidos están formados por micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 m y con la menor dispersión posible para un tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina o resinas de intercambio iónico, aunque la sílice es el material más común. Las partículas de sílice se sintetizan aglomeran­do partículas de sílice de tamaños inferiores al micrón en unas condiciones tales que se forman partículas mayores con diámetros muy unifor­mes. Las partículas que resultan se recubren muchas veces con películas orgánicas, que se unen química o físicamente a la superficie.
A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización de llama y de conducti­vidad térmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cro­matografía de líquidos ha sido el perfecciona­miento de los detectores.
Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una pro­piedad del soluto responden a alguna de las pro­piedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. En la Tabla 4.1 se indican los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos publicados en los que tenía un papel importante la cromatografia de líquidos, reveló que el 71 % se utilizaban en la detección de la absorción UV, el 15% la fluo­rescencia, el 5,4% el índice de refracción, el 4,3% empleaba medidas electroquímicas y el 4,3% restante otras medidas.
La Figura 4.5 muestra el esquema de una cu­beta de flujo en forma de Z para la medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatográfica. A fin de minimizar el ensancha­miento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volúmenes se limitan por lo co­mún de 1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilización de cubetas de este tipo está restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.
Tabla 4.1. Características de los detectores de HPLC
Figura 4.5. Celda de detector ultravioleta en HPLC
Muchos detectores de absorbancia son dis­positivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados. También se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la absorbancia.
Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lo más co­mún en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de for­ma restringida para aquellos solutos que absor­ben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos gru­pos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben una banda ancha de ab­sorción a una o más de esas longitudes de onda.
Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores. La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en un espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la ra­diación ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se pue­de obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen están suficientemente separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espec­tros completos con fines de identificación, se pue­de parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de la región de longitud de onda que interesa.
Los detectores espectrofotométricos de ultra­violeta más potentes son los instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro com­pleto en aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada pico cro­matográfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo de la columna. Una de las formas de presentación de los datos espec­trales, que resulta útil para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de la determinación cuantitativa, consiste en un grá­fico tridimensional tal como el que se muestra en la Figura 4.6. En este caso, los espectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La aparición y desaparición de cada uno de los es­teroides en el efluente de la columna resulta evi­dente.
Figura 4.6. Espectros de absorción del efluente de una columna de HPLC tomados a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.
Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se ofrecen dos tipos de detec­tores de infrarrojo. El primero con barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro semi­circulares. El segundo, mucho más sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier.
Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiación ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volúmenes de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo más sencillos pueden trabajar a una o más longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los espec­tros de los picos parando el flujo en su tiempo de elución. Los instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera análoga a los instrumentos de series de diodos para las medi­das de absorbancia ultravioleta que se han des­crito en la sección anterior.
Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorímetros y espec­trofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excita­ción. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluores­cencia probablemente se basarán en el uso de fuentes de láser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y selectividad.
Una ventaja inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser más de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia. En cromatografía de líquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separación y determinación de los componentes fluorescen­tes de las muestras.
Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente que en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluen­te de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación de un haz de luz incidente. El des­plazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida, la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.
Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos. Es decir, son detectores universales aná­logos a los detectores de llama en cromatografia de gases. Además, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.
Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC, el detector de dispersión de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se llevan a través de un tubo de conducción a tem­peratura controlada donde tiene lugar la evapo­ración de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas de analito. La nube de partículas de analito pasa a través de un haz láser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo.
Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser aproxi­madamente la misma para todos los solutos no volátiles. Además es notablemente más sensible que el detector de índice de refracción.
Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores elec­troquímicos. Estos dispositivos se basan en cua­tro métodos electroanalíticos que incluyen la amperometría, la voltamperometría, la coulom­bimetría y la conductimetría.

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