Source: https://es.scribd.com/doc/136155794/mapa-genetico
Timestamp: 2017-08-18 01:33:18+00:00

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Cargado por Ivon Ortega Mercado
Los Mapas Genéticos
El ratón, después del hombre, es el mamífero que tiene el mapa genético más completo y fue el segundo genoma mamífero completamente secuenciado (ver más adelante). Por otro lado, las técnicas de mapeo, los programas de computación y las bases de datos están enormemente desarrolladas en esta especie. Las cualidades que hacen del ratón la especie modelo para el desarrollo de mapas genéticos son: (i) Tienen un tiempo generacional muy corto y son muy prolíficos, lo que permite criar miles de ratones híbridos F1, F2 o N2. (ii) Es una especie en la cual se pueden llevar a cabo cruzas inter-específicas. (iii) Existe una cantidad enorme de líneas genéticamente definidas, como las consanguíneas y congénicas, además de miles de mutaciones y un gran número de rearreglos cromosómicos disponibles. Por todo lo mencionado, tomaremos al mapa genético del ratón y sus métodos de desarrollo como guía (con reservas) para todos los animales de laboratorio. Como ya se vio, el ratón de laboratorio “estándar” tiene un cariotipo de 40 cromosomas (19 autosómicos más el par sexual). Los cromosomas murinos son difíciles de diferenciar en los preparados citogenéticos porque, contrariamente a los humanos, son todos acrocéntricos y muestran una graduación continua en el tamaño. Los cromosomas autosómicos se numeran del 1 al 19, en orden decreciente de longitud. Según las estimaciones más recientes, el genoma murino contendría entre 30.000 y 35.000 genes, de los cuales un tercio ya ha sido identificado, gracias a la existencia de mutaciones y a los trabajos de genética molecular. Es interesante resaltar que la mayoría de las mutaciones descubiertas por “criadores de ratones” identifican, en general, un locus nuevo más que nuevos alelos de un locus ya conocido. En este contexto, si consideramos los recientes resultados provenientes de las experiencias en noqueo de genes, es probable que la mayoría de las mutaciones que ocurren en el genoma del ratón sean indetectables, por ser incompatibles con el desarrollo normal del embrión, o por no causar efectos fenotípicamente obvios. Considerando que un gran número de genes del ratón espera ser descubierto, la existencia de un mapa genético de alta resolución y alta densidad facilitaría enormemente esa tarea. Como veremos en detalle más adelante, un mapa de alta resolución se logra analizando un gran número de ratones (meiosis) y un mapa de alta densidad se obtiene por medio del uso de muchos marcadores polimórficos. La forma más racional de desarrollar un mapa genético del genoma del ratón es hacerlo en forma gradual, primero ubicando una serie de loci de referencia (del inglés anchor loci), o de marcadores, e ir aumentando progresivamente el número de los mismos en los espacios desiertos hasta lograr un “andamio” sólido. Con este enfoque escalonado y, teniendo en cuenta que el número de marcadores a disposición es suficientemente grande, es posible hoy en día realizar mapas de alta densidad en el ratón. De hecho, ésta es la estrategia que vienen utili-
zando los genetistas desde comienzos del siglo veinte. En 1915, John B. Haldane y colaboradores informaron en el Journal of Genetics que dos mutaciones del color del pelaje, albino (Tyrc) y pink-eyed dilution (p), estaban ligadas en el cromosoma 7 del ratón1. Este trabajo es considerado hoy como el “puntapié inicial” del mapa genético del ratón. Durante las décadas de 1970 y 1980 se produjeron grandes cambios que llevaron a un gran aumento del flujo informativo referente al mapeo de genes. Estos cambios incluyen el descubrimiento de nuevos marcadores polimórficos (primero bioquímicos y luego de ADN), la puesta a punto de la tecnología de ADN recombinante, el desarrollo de las cruzas inter-específicas de ratones y, finalmente, la elección del ratón como modelo de enfermedades humanas. Desde un punto de vista físico (y muy reduccionista!) los genes no son más que segmentos de ADN alineados a lo largo de los cromosomas como cuentas de un rosario. Una manera de establecer un mapa “final” sería clonando el genoma en pequeños segmentos superpuestos y secuenciando estos fragmentos uno tras otro. Esto llevaría, finalmente, a la secuencia completa del genoma. Este planteo fue considerado poco realista en el pasado (teniendo en cuenta las técnicas disponibles) pero, debido a la gran disminución en los costos y al aumento en la eficiencia de la secuenciación automática, es hoy una realidad. Se sabe que los genes en los mamíferos no son tan compactos como la mayoría de los genes procariotas y están salpicados con secuencias repetitivas de distinto tipo, como copias de provirus, minisatélites, microsatélites y pseudogenes, cuya función, si existe, es aún desconocida (ver Capítulo I). Es por todo esto que se criticó, al principio, la idea de secuenciar completamente un genoma haciendo experimentos muy tediosos con gastos enormes e injustificados debido a las secuencias de ADN irrelevante (lo que se conoció en una época como ADN de descarte, del inglés junk DNA). Sin embargo, como veremos en detalle más adelante, la disponibilidad de las secuencias de los genomas humano y del ratón está trayendo valiosa información sobre la estructura del genoma de los mamíferos.
6.2 Tipos de mapa del genoma
Hay varias clases de mapas que interesan a los genetistas, aunque los tres más importantes son los mapas de ligamiento, los mapas cromosómicos y los mapas físicos.
6.2.1 Mapas de Ligamiento El establecimiento de mapas de ligamiento (linkage maps), también llamados mapas meióticos, se basa en el hecho de que, durante la meiosis, los loci que se encuentran en diferentes cromosomas se separan al azar en las gametas, mientras que los que se encuentran en un mismo cro1
El mapa actual de esa misma región del cromosoma 7 posee alrededor de 2.300 loci!
mosoma tienden a co-segregar, al menos que un evento de recombinación rompa esa asociación de tipo “parental” (Figura 6.1). La presencia de este fenómeno de entrecruzamiento (del inglés crossing-over) se visualiza en los cromosomas como una estructura llamada quiasma. Por lo tanto, para desarrollar este tipo de mapas de ligamiento hace falta realizar cruzas de animales.
Figura 6.1. Recombinación del ADN. El esquema muestra la recombinación del ADN en cromátidas no hermanas de un par de cromosomas homólogos durante el entrecruzamiento. Como consecuencia, se generan gametas recombinates entre los loci A y B (AB y ab no se encontraban en el mismo cromosoma en los padres). Este fenómeno de recombinación es la base de los estudios de ligamiento (del inglés linkage analysis).
Básicamente, la probabilidad de que dos genes sean separados por un evento de recombinación dependerá de la distancia que haya entre ellos. En el caso de dos loci no ligados, la frecuencia de gametas esperada será 50% tipo parental y 50% tipo no parental (recombinante), mientras que en aquellos loci que estén ligados la frecuencia de gametas tipo parentales será siempre mayor al 50% (Figura 6.2). Esto se ve reflejado en la elección de la unidad de mapeo, el centiMorgan (cM), que corresponde al 1% de probabilidad de producir una gameta recombinante luego de una meiosis.
En otras palabras, un mapa de ligamiento es un diagrama de los rearreglos lineales de los genes localizados en un cromosoma dado. Estos mapas fueron diseñados a principios del siglo XX por el científico americano (premio Nobel de Medicina y Fisiología en 1933) Thomas H. Morgan y sus discípulos (en particular Alfred H. Sturtevant), usando cruzas de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) y fueron aplicados posteriormente a los mamíferos. Como se verá más adelante, para desarrollar este tipo de mapas es esencial cruzar animales (genera-
Figura 6.2. Tipos de segregación. A. Segregación independiente de alelos en el caso de loci no ligados. Las cuatro clases de productos de la meiosis (gametas) tienen frecuencias similares. B. Segregación no independiente de alelos pertenecientes a loci ligados. Como consecuencia del ligamiento, el porcentaje de gametas del tipo parental es mayor del 50%. En el ejemplo, el porcentaje de gametas recombinantes es de sólo el 10%. C. Efecto de la presencia de múltiples entrecruzamiento en la detección de cromosomas recombinantes. Aunque este tipo de eventos es muy infrecuente, cuando el número de recombinaciones múltiples es par, la recombinación no se detecta. Adaptado de Silver L. M. (ed) Mouse Genetics. Concepts and applications. Oxford University Press, Oxford, 1995.
m.. Se muestran tres intercruzas sub-específicas. para poder estudiar el patrón de segregación en la descendencia. musculus) y CAST/Ei (M. mientras que su resolución depende del número de gametas (= número total de meiosis) analizadas en la progenie. empleando las líneas MAI y MBT (M. La Figura 6. Inmunogenetics 53: 233-242. Figura 6.LOS MAPAS GENÉTICOS 159 ción parental) que tengan alelos diferentes en dos o más loci. por definición. a modo de ejemplo.3. (ii) La densidad de un mapa genético estará correlacionada con el número de polimorfismos que segregan en una cruza particular. que al menos un evento de recombinación rompa el orden lineal de origen parental. Esto es poco frecuente si los dos marcadores están fuertemente ligados. m. castaneus). Es por esta razón que los mapas de ligamiento dependen enormemente de la disponibilidad de polimorfismos (la existencia de 2 ó más alelos en un locus dado). A la izquierda de los mapas se observa la distancia en cM (± desvío estándar) entre loci. 2001. Tomado de Benavides et al. Mapas de ligamiento. y un mapa consenso (derecha) incluyendo el total de meiosis analizadas. . calculadas al 5% de nivel de riesgo. Todos los marcadores indicados son microsatelites. Este ejemplo de mapa de ligamiento muestra la localización de la mutación recesiva nackt (Ctslnkt) en el cromosoma 13 del ratón.3 muestra. Existen un par de puntos a tener en cuenta con respecto a estos mapas: (i) Para establecer el orden de los loci se requiere. un mapa (parcial) del cromosoma 13 del ratón donde se localizó la mutación inmunodeficiente nackt (Ctslnkt).
mcw.000 marcadores de ADN. En particular. La distancia promedio entre marcadores es menor a 0. dos genes pueden aparecer completamente ligados en un mapa de alta resolución y resultar estar muy distantes en términos moleculares mientras que. Estos datos deben considerarse estrictamente como promedios porque no hay una correlación absoluta entre escalas en cM y kb. Ningún otro roedor de laboratorio posee un mapa genético avanzado como los del ratón y la rata. (ii) híbridos de células somáticas y (iii) híbridos de radiación. dos genes pueden parecer relativamente alejados uno del otro si existe un “hot spot” de recombinación en la región intergénica. estos mapas presentan la ventaja de no requerir del uso de marcadores polimórficos). debido a la distribución despareja de los eventos de recombinación a lo largo de las cromátides (en el ratón se calcula un promedio de 28 quiasmas por genoma). También hay que considerar que existe un fenómeno conocido como interferencia de entrecruzamientos (del inglés crossover interference) que impide la formación de quiasmas cercanos en un mismo cromosoma (la localización de los quiasmas en las cromátides no es al azar). Esas técnicas son: (i) hibridación in situ. usando diferentes enfoques. Estados Unidos) y Gene-Link de Xavier Montagutelli (Institut Pasteur.informatics.000 genes y 15. predicted genes) y 11.org) y en la base de datos del genoma de la rata (http://rgd.01 cM y la densidad promedio del mapa murino es de 12. Mapas Cromosómicos Mientras que los mapas de ligamiento requieren de la realización de protocolos con cruzas de animales.0 (1992) de Eric Lander (Whitehead Institute. Estados Unidos). Esto quiere decir que. Varios programas de computación han sido desarrollados para ayudar a los genetistas a procesar los datos obtenidos de las cruzas experimentales y la evaluación de los marcadores en un análisis de ligamiento. asignan una localización según las regiones citogenéticas (además. en el orden de los 1500 a 1600 cM. 6.600 genes. Por ello. de Kenneth Manly y colaboradores (Roswell Park Cancer Institute. los mapas cromosómicos se logran usando técnicas que no incluyen la reproducción sexual y.160 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO La longitud total del mapa de ligamiento del ratón ha sido estimada por diversos investigadores.edu). 1 cM en el genoma del ratón corresponde a 1700 kb. por lo tanto.jax. En el momento de este escrito.2. 6. MapManager QT (1999) y MapManager QTX (2001).500 secuencias que podrían representar genes (en inglés.5 loci por cM. el tercero más avanzado después de los mapas del hombre y el ratón.000 marcadores genéticos (la mayoría marcadores moleculares). El mapa de la rata. Entre ellos: MAPMAKER/EXP 3. el mapa de ligamiento del ratón cuenta con alrededor de 18. posee localizados alrededor de 1. contrariamente. el genoma del ratón muestra un fenómeno de interferencia mucho más fuerte que el descripto en el genoma humano. . mientras que en el humano esta cifra es equivalente a 1000 kb. Francia). La versión actualizada de los mapas genéticos de estos roedores de laboratorio se encuentra a disposición a través de la base de datos de The Jackson Laboratory (MGD) (http://www.2. en promedio.
como ya se dijo.2. la rodamina (XRITC) y el Texas Red. el FISH es poco utilizado en la construcción de mapas en el ratón por varias razones: (i) en muchos casos es más fácil y práctico realizar esquemas reproductivos. Es también muy útil para evaluar si los grandes insertos en los cromosomas artificiales de levadura (YAC’s) derivan todos del mismo cromosoma o. se observa que los cromosomas que se van perdiendo en las células híbridas pertenecen exclusivamente a uno de los conjuntos parentales. han sido muy usados para localizar genes humanos en los . Los híbridos de células somáticas humano/ ratón. Por último.2. De todas maneras. son quiméricos.2 Híbridos de Células Somáticas Para esta técnica se utilizan células híbridas (viables) derivadas de la fusión in vitro de células somáticas de especies diferentes de mamíferos.2. el pintado de cromosomas (del inglés chromosome painting) es una variante del FISH que emplea una mezcla de sondas de ADN derivada de un cromosoma entero o de una región cromosómica de interés. La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica muy sensible siempre que se cuente con sondas lo suficientemente grandes (y homólogas) y que se suprima la fluorescencia de fondo. son muy difíciles de distinguir entre sí. Se utiliza para obtener patrones de regiones homólogas entre diferentes especies y es una forma muy directa de evaluar la cantidad de rearreglos que se produjeron entre dos especies en el curso de la evolución. Cuando una secuencia de ADN. Debido a esto. con un complemento limitado de cromosomas humanos (intactos). detectando patrones de presencia o ausencia de marcadores (o expresión de genes) y correlacionando con los cromosomas presentes en el híbrido. Aunque se desconoce la razón. Los fluorocromos más empleados son la fluoresceina (FITC). la hibridación in situ es la técnica de elección para la localización rápida de los transgenes (ver Capítulo VIII). es posible derivar un panel de células híbridas que representen cada cromosoma humano en forma única. es marcada con isótopos radioactivos o fluorescencia.1 Hibridación In Situ. Aunque se trata de una técnica muy confiable. por el contrario.2.LOS MAPAS GENÉTICOS 161 6. Por ejemplo. en un preparado citogenético. en este caso referida como una “sonda” de ADN (en inglés. probe). los híbridos humano/roedor tienden a perder (a través de los sucesivos cultivos y en forma preferencial) los cromosomas humanos y quedarse con una mayoría de cromosomas de roedor. no una localización precisa y (iii) los cromosomas murinos. podemos hibridarla con su secuencia complementaria en el ADN genómico de un cromosoma específico y observar la marca directamente sobre el extendido cromosómico con un microscopio óptico. De esta manera. La sensibilidad de esta variante de la técnica de hibridación in situ permite localizar una secuencia con una precisión de hasta 30 Mb y de detectar anormalidades cariotípicas en cromosomas metafásicos tanto como interfásicos. Por lo tanto. (ii) la hibridación in situ nos provee de una posición regional. mientras que sólo los genes presentes en el único cromosoma humano que quedó retenido en ese híbrido podrán ser localizados por medio del uso de sondas moleculares o el análisis de expresión. se puede asignar un gen humano a un cromosoma en particular. 6. todos los genes de origen roedor son retenidos (y se expresan normalmente). sobre un conjunto de cromosomas de roedor.
3 Híbridos de Radiación (HR) Otra técnica desarrollada para obtener mapas de alta resolución en humanos son los paneles de híbridos de radiación (Radiation Hybrid –RH). constituyendo un puente entre éstos y los mapas físicos. Desde el año 1999. algún fragmento cromosómico proveniente de las células dadoras. contienen sólo un pequeño segmento del genoma donante (irradiado) incorporado en los cromosomas de la especie receptora (no irradiada).jax. el primero en su momento para un organismo modelo. Los paneles HR ratón/hámster y rata/hámster se encuentran . En 1998 se puso a disponibilidad de la comunidad científica un panel HR del ratón. Como en los paneles de ADN obtenidos con cruzas de animales.2. para el mapeo de genes humanos se utilizó siempre un fondo de células receptoras de roedor. contrariamente a los cromosomas humanos. La información más actualizada sobre este panel y las secuencias que se encuentran localizadas se puede obtener en The Jackson Laboratory T31 Mouse Radiation Hybrid Database (http://www. lo que complica la asignación sub-cromosómica de genes por este método. Además. Estos paneles de células híbridas se construyen a partir de células donantes (de la especie a ser mapeada) que han sido irradiadas letalmente (ya sea con rayos g o X) para causar la fragmentación de sus cromosomas (por roturas de doble cadena). obtenidas por las técnicas clásicas de fusión celular. pero no han sido muy utilizados porque es en general más fácil y rápido usar el ADN derivado de cruzas de animales. en el cuan se han localizado más de 5.162 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO últimos 20 años. son raros los híbridos de células somáticas del ratón con deleciones o translocaciones.000 marcadores genéticos. Su nombre es T31 y fue creado por Linda McCarthy y sus colaboradores usando fragmentos de cromosomas de ratón (de una línea de células embrionarias de la cepa 129) retenidos en cromosomas de hámster chino (provenientes de una línea de fibroblastos TK–). a pesar de ser muy inestables. Muchas de las líneas de células híbridas obtenidas por este método retienen cantidades detectables del ADN donante (normalmente entre 20 y 30% del genoma). Las dos grandes ventajas de este sistema son que pueden mapearse marcadores o genes no polimórficos (ya que se evalúa sólo la presencia o ausencia de un marcador) y que se logra una resolución mayor que con los mapas de ligamiento. Esta característica es similar al principio de ligamiento genético que hemos visto en los mapas meióticos. enfoque descripto por Goss y Harris en 1975. Las células así irradiadas son fusionadas con líneas celulares receptoras deficientes para un marcador de selección.org/resources/documents/cmdata/rhmap/). la información de los paneles HR es acumulativa y puede proveer datos para el ordenamiento (de alta resolución) de regiones no polimórficas o no separables por los mapas de ligamiento. en particular de ratón o hámster chino (Cricetulus griseus) (Figura 6. Por ejemplo.4). Por lo tanto. totalizando 104 líneas celulares. El concepto teórico es que aquellos loci que se encuentran muy próximos unos de otros serán retenidos en el mismo fragmento cromosómico después de la irradiación. como ser la timidina quinasa (TK–) o la hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT–). la rata posee también su panel HR (T55). sobrevivirán sólo aquellas células que contengan.2. estas células híbridas. 6. por lo menos. Usando condiciones de selección con medios apropiados. También existen híbridos similares segregando cromosomas de ratón.
Híbridos de radiación. . Diagrama esquemático mostrando la construcción de clones de híbridos de radiación (HR) a partir de células donantes con un único cromosoma humano (híbrido mono-cromosómico) y células receptoras de hámster Chino. Los 6 loci hipotéticos (A a F) se marcan como + (presencia) o . La selección de células donde hubo fusión se realiza por medio del uso de genes de selección como la timidina kinasa.(ausencia). Cada clon (abajo) presenta una colección diferente (al azar) de fragmentos del cromosoma humano original.LOS MAPAS GENÉTICOS 163 Figura 6. dando una idea del ordenamiento en el cromosoma original.4.
Este mapa contiene 11. Estos estudios se conocen como “patrones de retención de marcadores” y nos ayudan a determinar la ubicación de un gen o marcador.resgen. FISH o PCR).php3#info). la unidad utilizada para medir la distancia en el mapa es el Ray o el centiRay (cR). Debido a que la dosis de rayos X tiene gran influencia sobre esta medida. en el panel T55 de la rata un cR3000 es equivalente a una distancia física de 106 kb.000 rads de radiación X. será necesario convertirla a distancias de mapas físicos (en kb o Mb).3 Mapas Físicos Un mapa físico (physical map) es la representación real del alineamiento de los genes en un cromosoma.164 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO disponibles comercialmente a través de la empresa Research Genetics Inc. existe un exceso de genes en los cromosomas 11 y 19 y un déficit en los cromosomas 18 y X. La evaluación estadística de los resultados debe hacerse con programas de computación especiales.109 genes (incluyendo genes expresados sólo en embriones y neonatos) que fueron emplazados con respecto a un mapa de referencia conteniendo alrededor de 2000 marcadores genéticos.com/products/MRH. En estos casos. es necesario aclararlo de la siguiente manera: un cR3000 indica una frecuencia de rotura del 1% entre dos loci dados luego de una exposición a 3. Uno de los aspectos más notables que surge del análisis de este mapa es la distribución irregular de genes a lo largo de los cromosomas. El orden de los genes es el mismo que el dado por los mapas de ligamiento.wi. como RHMAPPER (http://www-genome. Por ejemplo. Como esta distancia entre marcadores puede tener poca significación para un mapa genético. el patrón de presencia (+) o ausencia (–) a través del panel. Estos mapas constituyen un paso crucial en la caracterización estructural y funcional del genoma. en la misma forma que un mapa de ruta indica la localización de las ciudades a lo largo de una autopista. por ejemplo uniendo extremos de insertos de ADN clonados en YAC’s (y detectando otros clones usando esos extremos como sondas hasta tener grandes segmentos ordenados). cósmidos. Siguiendo esta estrategia. pero las distancias son medidas en kb o Mb. (http://www. la realización de un mapa físico es un “se- . ya sean estos clonados en fagos (P1 en general). 6.658 genes homólogos con secuencias humanas (genes ortólogos).edu/ftp/distribution/software/rhmapper/).2. El mapa más reciente del ratón basado en híbridos de radiación (panel T31) fue publicado en la revista Nature Genetics en el año 2001. Cuando se evalúa un marcador (por Southern blot.mit. Pueden lograrse por diversos métodos pero el más conveniente es el ordenamiento de grupos de clones superpuestos (contigs). el establecimiento de dicho mapa se vería muy facilitado si existiese previamente un mapa de ligamiento de alta densidad (200-400 marcadores por cromosoma). e incluye 3. Aunque en teoría es posible desarrollar un mapa físico de novo. por ejemplo. define el emplazamiento del mismo: aquellos marcadores con el mismo patrón de + y – estarán localizados en el mismo “bin” o posición. cromosomas artificiales de bacterias (BAC’s) o cromosomas artificiales de levaduras (YAC’s) (ver Capítulo I).
LOS MAPAS GENÉTICOS 165 Figura 6. La secuencia de un gen o región del genoma es la etapa final de este proceso. El vector resultante será un mosaico y su uso puede llevar a resultados incongruentes. por azar. cósmidos o P1 es necesario construir varias genotecas independientes con diversas enzimas de restricción. (ii) Para establecer contigs superpuestos de clones de YAC’s. dos segmentos completamente independientes sean empaquetados juntos en el mismo vector. BAC’s. gundo paso” una vez establecido el mapa de ligamiento (Figura 6. El diagrama muestra el sistema escalonado que nos lleva del mapa de ligamiento donde se ha localizado una mutación (Mut) a la secuencia de un gen candidato por el proceso denominado clonaje posicional. BAC’s o P1 es importante confirmar que cada molécula de ADN clonada representa realmente una secuencia inalterada y derivada sólo de un cromosoma. pero aún más grave. existen varios puntos a tener en cuenta: (i) Antes de establecer contigs de YAC’s.5. Como en los mapas de ligamiento. Clonaje posicional. con digestión completa o incompleta.5). puede ocurrir si un segmento de ADN queda delecionado en el proceso de clonación. es muy común que. El mapa físico es la etapa siguiente al mapa genético y se elabora gracias a la ayuda de clones contiguos (contigs) de vectores de gran capacidad como los YAC y BAC. Una situación similar. . Dado que todas las bibliotecas genómicas (o genotecas) son construidas con la misma estrategia (fragmentación del ADN de alto peso molecular con enzimas de restricción y el posterior ligado de los productos a un vector).
En la segunda etapa los investigadores usaron miles de marcadores genéticos para posicionar los contigs en el mapa genético del ratón. alrededor de 10 eubacterias (Haemophilus influenzae. Escherichia coli. El genoma humano. existen ambiciosos proyectos conjuntos. Con un genoma de apenas 120 Mb. Mycoplasma genitalium.9% de precisión) antes del 2005.uk/Projects/D_rerio/) y el pez globo japonés (Fugu rubripes) (http://fugu. conteniendo alrededor de 35.ac.000 marcadores genéticos.hgmp. 2002) un mapa físico del ratón que cuenta con 296 contigs superpuestos de clones BAC y casi 17. 6.500 Mb (2.752 Mb). la rata.500 contigs de clones superpuestos. la primer planta secuenciada (2000). un número sorpresivamente inferior a los 100.uk/).3 Mb (296 x 9. tiene un tamaño de 2. se encuentran terminadas las secuencias genómicas completas correspondientes a varios microorganismos. se encuentra Arabidopsis thaliana. Hasta el año 2000.900 Mb. La primera etapa fue identificar la superposición de los 300. Recientemente se sumó el mosquito (Anopheles gambiae) como segundo insecto con su genoma completamente secuenciado (2002). el ratón. para poder construir 7. Estados Unidos).5 Gb). más de 150 virus. entre otras). aunque se trata de un emprendimiento de gran envergadura cuando se quiere secuenciar más allá de un gen y sus alrededores. este mapa cubre la totalidad del genoma ya que el tamaño promedio de los contigs es de 9. Usando la información proveniente de las secuencias de los extremos de los fragmentos clonados en los BAC’s. El primer organismo metazoario fue el nematode Caenorabditis elegans.3 = 2.000 clones de BAC disponibles por medio del uso de enzimas de restricción (fingerprints). y otros vertebrados como el pez cebra (Danio rerio) http://www.mrc. se pudo alinear estos contigs con la secuencia del genoma humano.166 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO Se ha publicado recientemente (Nature. arcobacterias (Methanococcus jannaschii) y eucariotas (la levadura Saccharomyces cerevisiae fue el primero). entre ellos. secuenciado por la empresa Celera Genomics (Rockville. terminado después de 15 años de trabajo en el año 1998. como el de la secuenciación completa del genoma humano (lanzado en 1988 y terminado en el año 2001).sanger. Como veremos.000 calculados con anterioridad. lo que generó un mapa de homología humano-ratón.4 Secuenciando Genomas La información más detallada que podemos obtener de una región del genoma (o de un genoma completo) es su secuencia nucleotídica. Asumiendo que el tamaño del genoma del ratón es de alrededor de 2. el mismo tiene un tamaño aproximado de 278 Mb y alrededor de 14000 genes.000 genes. Este mapa físico permitirá terminar la secuencia completa del genoma del ratón (con 99. Bacillus subtilis y Mycobacterium tuberculosis. el genoma más grande secuenciado en forma completa era el de la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) con 180 Mb y alrededor de 13000 genes. Este mapa fue creado básicamente en dos etapas. el primer vertebrado secuenciado. En la actualidad.ac.2. Secuenciar fragmentos pequeños de ADN (obtenidos por técnicas de sub-clonación o por PCR) es hoy en día relativamente accesible. Recientemente se sumaron a la lista de vertebrados secuenciados .
800 Mb y el pez globo. aparecía en la revista Science con el título de The Sequence of the Human Genome el trabajo de Craig Venter de la empresa Celera Genomics. La tabla muestra algunos organismos cuyos genomas fueron secuenciados en forma completa. nematodes. Alemania y China.1. Se incluye un procariota.1). hongos (Saccharomyces cerevisae) y animales pertenecientes a las clases de los insectos. El 15 de febrero de 2001 la revista Nature publicaba el artículo titulado Initial Sequencing and Analysis of The Human Genome con los resultados de una colaboración entre 20 centros de Estados Unidos. peces y mamíferos (ver texto). y nueve de los eucariotas secuenciados hasta la actualidad (algunos en una versión borrador). esta vez totalmente con fondos privados. Japón.500 Mb. A diez años del lanzamiento del Proyecto Genoma Humano por James Watson. la rata (Rattus norvegicus). involucrando una enorme cantidad de participantes. Dentro de los eucariotas secuenciados encontramos plantas (Arabidopsis thaliana). con 2. con su genoma llamativamente compacto de 365 Mb (Tabla 6. Se llegaba así a . la bacteria Haemophilus influenzae. NIH) y liderado por Francis Collins. con un tamaño estimado de 2. la presentación simultánea de dos versiones del primer borrador de la secuencia casi completa del genoma humano fue un acontecimiento sin precedente y de indudable importancia. Inglaterra. Francia. Tabla 6. y sus múltiples colaboradores. Un día después.LOS MAPAS GENÉTICOS 167 el ratón de laboratorio (Mus musculus). el tamaño comparativo de sus genomas y el número estimado de genes. Secuencias completas de genomas. Se trató de un emprendimiento de gran envergadura con fondos públicos originados en los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos (National Institutes of Health.
desarrollados en el Whitehead Institute y el Sanger Institute. Este consorcio es un grupo internacional de investigadores pertenecientes al Whitehead Institute y la Washington University en Estados Unidos. los supercontigs adyacentes fueron unidos para formar ultracontigs (de alrededor de 50 Mb). conocidos en inglés como genome assemblers. incluyendo http://mouse.org (European Bioinformatics Institute). En el caso del ratón. llegándose a una situación donde la secuencia casi completa de todo un cromosoma estaba contenida en unas decenas de ultracontigs. sistema que también eligió el Proyecto Genoma Humano) y la secuencia completa por escopetazo (whole-genome shotgun sequencing. lo que asegura la alta precisión de la secuencia.168 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO un final feliz de lo que representó una costosa y a veces muy agresiva disputa entre los dos grupos. esta reducción en el tamaño estaría reflejando una mayor proporción de deleciones en el genoma de los ratones. a su vez. 2 El cromosoma Y del ratón está siendo secuenciado en forma independiente por “escopetazo jerarquizado”.9 gigabases). el consorcio público (Mouse Genome Sequencing Consortium) que realiza su secuenciación (utilizando ADN de una hembra de la línea C57BL/6)2. el análisis preliminar de las secuencias permite prever un número de genes (codificantes de proteínas) cercano al del hombre (alrededor de 35. los científicos usaron la información obtenida de más de 33 millones de experimentos individuales de secuenciación y dos sistemas de computación (ARACHNE y PHUSION). Los fondos provienen del National Human Genome Research Institute (NIH) en Estados Unidos y el Wellcome Trust en el Reino Unido. Esto quiere decir que cada nucleótido en el genoma fue determinado. Al nivel de sus secuencias nucleotídicas. una verdadera carrera contra el tiempo ya que inicialmente la meta estaba fijada para el año 2005. 14% más chico que el genoma humano (2. respectivamente. alrededor del 40% del genoma humano puede ser alineado con la secuencia del ratón. No obstante.5 gigabases). el conjunto de secuencias clonadas en contigs. Los resultados de este esfuerzo indican que el genoma del ratón tendría un tamaño de alrededor de 2. método que usó Celera Genomics para secuenciar la mosca de la fruta y parte del genoma humano) (ver Capítulo I). fue organizado (por análisis de superposición de secuencias) en fragmentos más grandes llamados supercontigs (de alrededor de 17 Mb) y éstos. Los resultados de estos análisis pueden encontrarse (con acceso público y gratuito) en varios sitios de Internet. fueron anclados en el mapa físico del ratón (basado en clones de BAC’s). Para realizar el ensamble de secuencias. Alrededor del 80% de los genes del ratón posee un gen ortólogo (ascendencia común) reconocible en el genoma humano. en promedio. hasta siete veces. Brevemente. Luego.500 Mb (2. .ensembl. 2002]. ha hecho disponible el borrador inicial del genoma de este roedor en el año 2002 con un volumen especial en la revista Nature [volumen 420 (6915). El genoma del ratón fue secuenciado por un sistema mixto que combina el escopetazo jerarquizado (BAC-based shotgun sequencing.000). La secuencia borrador obtenida incluye mas del 96% del genoma del ratón y representa una cobertura equivalente a siete veces el genoma. y el Wellcome Trust Sanger Institute y el European Bioinformatics Institute en Inglaterra.
Este borrador inicial cubre más del 90% de las estimadas 2. la identificación de loci responsables de rasgos cuantitativos (QTL’s). realizado con las líneas DBA/2. estará por delante la tarea más ardua: aquella de analizar su función. su regulación y su interacción.tmc. La denominada era “pos-genómica” (en inglés post-genomics) ya está entre nosotros y será esencial contar con modelos animales para el estudio funcional de las secuencias obtenidas de los proyectos del genoma humano y murino. Se ha logrado un progreso enorme en la identificación de .LOS MAPAS GENÉTICOS 169 http://www. La disponibilidad de la secuencia final del genoma tendrá grandes implicancias para la genética del ratón de laboratorio y ayudará al avance de las ciencias biomédicas. La próxima fase del proyecto internacional es producir una versión “terminada”. Medical College of Wisconsin.ncbi. más colaboraciones de Celera Genomics. Santa Cruz). Las áreas más beneficiadas serán el clonaje posicional de genes.gov/genome/guide/mouse (National Center for Biotechnology Information at the National Library of Medicine) y http://genome. Genome Therapeutics.com/products/mouse. Children’s Hospital Oakland Research Institute.2. llenando todos los espacios y resolviendo los errores e incongruencias. Al momento de este escrito se acaba de hacer público el primer ensamble (versión 2.celera. Esta etapa será realizada exclusivamente por escopetazo jerarquizado. The Institute for Genome Research.edu (University of California.edu/projects/rat/ y http://rgd. la empresa privada Celera Genomics ya ofreció su versión del borrador del genoma murino el año 2001.800 Mb (2. no es razonable esperar hasta ese momento para diseñar mapas de transcripción (del inglés transcript maps o gene maps). denominados EST’s (Expressed Sequence Tags) (Figura 6. y BC Genome Sciences Center.cfm).mcw. El consorcio encargado del proyecto (Rat Genome Sequencing Consortium) está liderado por el Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center. A/J y 129X1/Sv (http://www.edu). amplificados por PCR a partir de extremos no-traducidos de ARNm.hgsc.nlm. Por otra parte.5 Mapas de Transcripción Más allá del tremendo valor que tendrán las versiones completas (y analizadas) de las secuencia genómicas para la biomedicina. La secuenciación del genoma del ratón tiene dos razones fundamentales: el conocimiento científico propiamente dicho y la aceleración en la detección de las regiones codificantes de los genes en las dos especies. haciendo uso del mapa físico del ratón.ucsc. ya que son las únicas regiones que conservan una alta homología. Es por eso que se está trabajando actualmente en construir mapas sobre la base de fragmentos cortos de ADNc. haciendo uso del mismo sistema mixto que el utilizado para el ratón.0) del genoma de la rata Rattus norvegicus (línea BN/SsMCW).bcm.6). entre otras. la creación de mutaciones dirigidas (ratones knock-out y knock-in) y la genómica funcional (del inglés functional genomics). pero el acceso a la información no es gratuito. 6.8 gigabases) que tendría este genoma (ver http://www.nih. The University of Utah. Los tres sitios incluyen comparaciones de las secuencias del ratón con la del genoma humano. Aún cuando estén mapeados y secuenciados todos los genes de estas especies.
Todas las secuencias EST se depositan en la bases de datos dbEST y están disponibles para comparaciones con programas de computación. Para el ratón. Los EST (Expressed Sequence Tags) son secuencias parciales provenientes de los extremos (tanto 3’ como 5’) de clones de ADNc. el número de EST’s es alrededor de tres millones y para la rata en el orden de los 800. el perro.000 marcadores genéticos de los cuales 4. Mapas de este tipo existen también para la rata. Así mismo.170 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO Figura 6. La colección pública de EST’s humanos es de cerca de cuatro millones de secuencias. Las secuencias EST. conociéndose incluso su posición en el mapa genético. el pez cebra y el hombre.nlm. lo que ha generado los denominados mapas de transcripción.gov/dbEST/index. en la actualidad los EST’s se han con- . La estrategia de los EST se desarrolló para poder lograr una identificación rápida de los genes que se expresan gracias a la posibilidad de contar con secuencias únicas que identifiquen cada clon de ADNc. lo que permitirá descubrir nuevas homologías entre estas especies. Los EST’s sirven como sondas moleculares para la identificación de secuencias del genoma que están siendo expresadas y que seguramente corresponden a genes. se está trabajando en la localización de EST’s humanos en el genoma de la rata y el ratón (utilizando iniciadores humanos). Aunque su uso generó controversias en un comienzo.html). El primer mapa de transcripción basado en híbridos de radiación (panel T31) para el ratón fue presentado por Philip Avner y colaboradores en el año 2001 (Nature Genetics). entre las cuales se encuentran representados el 90% de los genes humanos. secuencias parciales obtenidas de clones de ADNc (EST’s) en el hombre y en el ratón. Este mapa de primera generación emplaza alrededor de 6. obtenidas por medio de una secuenciación de pasaje simple.ncbi. éstos serán útiles en la identificación de muchos de los mutantes generados por mutagénesis química por ENU (ver Capítulo VII).nih. por medio del enfoque “gen candidato”.000 son EST’s.6.000 (dbEST: http://www. el gato.
riken. sumándose en la actualidad los programas del Jackson Laboratory.riken. al día de hoy.uk/Emage/database/intro.edu/). 6. lo que sin dudas acelerará el descubrimiento de nuevos genes. Históricamente.jp/activity. En Japón.html) se encuentran trabajando en una enciclopedia de ADNc completos del ratón (full-length cDNA encyclopedia).html. lo que implica que muchos genes del ratón (más del 30%) están utilizando el mecanismo de splicing alternativo (ver Capítulo I). los laboratorios del RIKEN Genomic Sciences Center (http://genome.wi.informatics. junto con los híbridos de radiación. el Mouse Genome Project del National Center for Human Genome Research (NIH) y el programa en colaboración entre el MRC Británico y el Institut Pasteur (European Collaborative Interspecific Backcross o EUCIB).ac. los YAC’s y los BAC’s (estos últimos han sido esenciales para preparar el terreno a la secuenciación completa del genoma humano. Los mapas consenso actualizados para el genoma del ratón y la rata pueden obtenerse vía Internet: (http://www. Esto es posible solamente cuando los datos obtenidos de cruzas independientes poseen marcadores en común.org). el número de esos marcadores es muchas veces limitado.mit.hgu. Para ayudar a la integración de los diversos mapas genéticos.edu) y (http://www-genome. (http://rgd.jax.gsc. lamentablemente. Esta limitación se extiende también al polimorfismo entre las líneas parentales (o las técnicas utilizadas para detectarlo). Francia (Guénet y colaboradores) y en el Frederick Cancer Research and Development Center.7 Programas de Mapeo a Gran Escala Varios programas de mapeo a gran escala se han venido desarrollando en los últimos 12 años en el genoma del ratón. es muy importante combinar los resultados obtenidos en distintas cruzas independientes en un mapa consenso.mrc. este centro cuentan con alrededor de 60. Por eso. Es. Actualmente.LOS MAPAS GENÉTICOS 171 vertido en una herramienta de rutina.2.gsc.go. Para mayor información sobre los genes que se expresan durante el desarrollo embrionario del ratón consultar el Edinburgh Mouse Atlas of Gene Expression (EMAGE) http://genex.html#3). la rata y el ratón).2.6 Integración de Mapas (Mapas Consenso) Para una cruza de animales determinada. la colección más completa de unidades de transcripción (transcriptoma) en los mamíferos.jp/home. 6. los dos más importantes son los llevados a cabo en el Institut Pasteur. los genetistas han definido un grupo de loci de referencia que se encuentran uniformemente distribuidos en todos los cromosomas y son también muy polimórficos.go. se puede establecer un mapa de ligamiento exclusivamente para los marcadores que segregan en la misma pero.mcw. USA (Copeland y colaboradores). El panel de retrocruzas .000 ADNc completos (ver RIKEN Mouse Full-length cDNA Encyclopedia http://genome. Maryland. París.
Por ejemplo. hasta 46 pares pequeños (2n=92). Los mamíferos placentados poseen un genoma extremadamente conservado y probablemente compartan la gran mayoría de su conjunto de 30. Por ejemplo. Con este panel del EUCIB. Estos programas proveen los medios necesarios para la realización de mapas de alta resolución.2. mientras que los monotremas lo hicieron hace 200 millones de años. el cromosoma X se encuentra casi completamente conservado en todos los mamíferos placentados y los cromosomas 4 y 17 del humano aparecen casi intactos en los carnívoros. Existen tres grandes grupos de mamíferos: Euteria (placentados). y los consecuentes mapeos físicos en el ratón. la combinación de la información genética proveniente del hombre y del resto de los mamíferos está siendo analizada en beneficio de varios proyectos conjuntos.000 genes. Estos trabajos se están realizando fundamentalmente con la técnica de pintado de cromosomas o Zoo-FISH y son coordinados por la Comparative Genome Organization. Además.000 a 40. . El mapeo comparativo está probando que esto no es así y que el grado de conservación entre especies es sorpresivamente grande. artiodáctilos. los marsupiales y los monotremas estarían “revueltos” hasta el nivel de no poder reconocer los segmentos de origen común. Teniendo en cuenta que el genoma de los mamíferos está muy conservado. Los marsupiales divergieron de los placentados hace 120-150 millones de años. dos marcadores genéticos que aparezcan ligados en las casi 1000 muestras de ADN (porque no logran recombinar) estarán a una distancia menor a 0. los investigadores imaginaran que el orden de los genes en las diferentes especies estaba muy mezclado.172 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO del EUCIB (Mus spretus y C57BL/6) es en la actualidad el más grande del mundo con un número de 982 muestras de ADN evaluadas para loci de referencia a lo largo del genoma. 6. Otro dato particularmente llamativo es la conservación de cromosomas enteros entre los primates y otros ordenes de mamíferos. por mucho tiempo se asumió que. cetáceos e insectívoros. y en particular entre los mamíferos.8 Mapeos Comparativos El mapeo comparativo entre los vertebrados (genoma comparativo). los genomas de los mamíferos placentados.3 cM con un nivel de confianza de 95% (equivalente a 500 kb en el genoma del ratón). Curiosamente. como el ratón y el hombre mostraban tantos cambios provenientes de rearreglos cromosómicos. en el rinoceronte negro (Diceros bicornis). este genoma común lo podemos encontrar dividido desde tres pares de cromosomas grandes (2n=6) en el Muntjac Indio (Muntiacus muntjak). se han identificado grupos de genes ligados en el humano que también forman grupos (del inglés clusters) en el pollo y hasta en los peces. Metateria (marsupiales) y Prototeria (monotremas). los cuales aportarán información muy útil para el mapeo comparativo entre especies. Esta variación cariotípica hizo que. está aportando una nueva dimensión a los proyectos de mapeo del genoma humano y de otras especies de interés científico o zootécnico. Los mamíferos evolucionaron hace aproximadamente 200 millones de años a partir de un grupo de reptiles (sinápsidos). y son sus únicos descendientes vivos. durante muchos años.
12.9 Localización de rasgos cuantitativos (Quantitative Trait Loci) Hasta ahora hemos visto los mapas realizados en base a rasgos de herencia simple (rasgos monogénicos). daremos sólo una breve reseña de los pasos a seguir para localizar loci responsables de rasgos cuantitativos (del inglés quantitative trait loci o QTL). Se considera que el proceso que lleva del descubrimiento de un QTL a la identificación del gen responsable involucra cinco pasos: (i) localizar el QTL en un segmento cromosómico.LOS MAPAS GENÉTICOS 173 Por otra parte. Esto implica la generación de cientos de animales de retrocruza (N2) o intercruza (F2) que serán genotipados con marcadores moleculares espaciados entre 15 y 20 cM. el genoma de los vertebrados parece haber permanecido estable por algo así como 400 millones de años (la conservación parece ser la regla en los genomas de las aves y los peces) y las diferencias que se observan entre los genomas de los placentados serían más bien perturbaciones recientes en la evolución. si es que la hay. 6. se desconocen los mecanismos de rearreglos de los cromosomas durante la especiación y también su finalidad. el mapa del ratón se presenta especialmente “roto” con respecto al humano. Debido a que este tema excede los propósitos de este libro. En forma similar. para el rasgo de interés. como la presión arterial. después del mapa humano. prácticamente la totalidad del genoma de la rata está cubierto de regiones homólogas del ratón. de manera de poder clasificar a los animales siguiendo una graduación de fenotipos. con su gran número de rearreglos. El tamaño promedio de los segmentos conservados entre estas dos especies es de sólo 7 cM. 11. se pudo identificar (por medio del uso de zoo-FISH) la presencia de 49 segmentos cromosómicos que se encuentran conservados entre la rata y el ratón. con alrededor de 180 rearreglos que los separan. con la excepción de pequeños segmentos cerca de los centrómeros y de los brazos cortos de los cromosomas 3. por lo tanto se ven influenciados por muchos genes simultáneamente (rasgos multigénicos) y por factores ambientales. muchos rasgos y enfermedades de interés médico. la rata. El objetivo de este mapeo es identificar aquellas re- . Sin embargo. son los animales que rompieron la regla de la evolución de cromosomas. como es el caso de muchas mutaciones del ratón y la rata. La información genética puede fluir también en la dirección opuesta: la información de los mapas en las diferentes especies (notar que. Analizando las regiones con sondas fluorescentes (“pintadas”). Al día de hoy. Este grupo de animales debe ser analizado. En particular. la obesidad y la resistencia a infecciones son naturalmente de carácter cuantitativo. normalmente se utilizan entre 75 y 100 marcadores microsatélites para cubrir todo el genoma (whole genome scan). Podríamos decir que los placentados y en especial el ratón. a su vez. aunque debemos tener en cuenta que sólo se conocen aquellos segmentos de fácil detección. los cuatro mapas de ligamiento más completos son los del ratón. y 13. el bovino y el cerdo. La disponibilidad de un mapa detallado del genoma humano y el ratón ayudará a diseñar los mapas de las otras especies de animales de laboratorio. incluidas aquellas especies no tradicionales.2. en ese orden) puede ser transferida al mapa humano en el marco de las regiones homólogas.
considerándose ligamiento cuando este valor es igual o mayor a 3. hasta el momento de este escrito sólo un puñado de genes QTL han sido identificados (ocho en el ratón y tres en la rata). . en promedio. otras alternativas son el uso de grupos heterogéneos (del inglés heterogeneous stocks) o de las líneas de intercruza avanzada (del inglés advanced intercross lines). (v) El paso final será la prueba de identidad del gen candidato. en el caso del ratón. esta etapa incluye análisis de fenotipo y genotipados.174 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO giones del genoma que están contribuyendo a la variación en el rasgo de interés. un segmento de 1 cM contendrá más de 30 genes para analizar. Las asociaciones entre los marcadores y el fenotipo se evalúan de manera de calcular la probabilidad estadística de que un QTL se encuentre cerca de un marcador. la identificación y evaluación de genes candidato es un trabajo muy arduo ya que. Normalmente. Es necesario aclarar que estos métodos convencionales de mapeo de QTL pierden poder a medida que la complejidad genética del rasgo aumenta.html). Estos valores son presentados normalmente como LOD score (del inglés. situación que seguramente se revertirá con la disponibilidad de las secuencias de los genomas de estos roedores. Aquellos lectores interesados en los rasgos cuantitativos pueden consultar la página de Internet del Complex Trait Consortium (http://www. (iii) Reducir la región de interés a un tamaño menor a 1 cM por medio de nuevas cruzas entre la línea congénica y la línea parental. Como hemos visto.complextrait. con el objetivo de hacer una localización más precisa del QTL.org/mapmgr.roswellpark. seguramente no serán separados. La única limitante es que aquellos QTL’s que estén localizados muy cerca en la misma región cromosómica. El principal inconveniente es que la habilidad para detectar QTL’s que tienen poca influencia en el fenotipo (débiles) es función del número de animales analizados.org/). De esta manera. log of the odds). el análisis de cientos de animales permite detectar aquellos QTL que aportan más del 10% de la varianza del fenotipo. (iv) Búsqueda de genes candidato. lo que se suele hacer por técnicas de manipulación genética de embriones (transgénesis o mutagénesis dirigida). En el caso de una retrocruza teórica AA x AB. Como veremos más adelante. las líneas recombinantes congénicas y las líneas consómicas (ver Capítulo IV) son una alternativa interesante para el mapeo de QTL’s. Esta primer etapa lleva mucho tiempo. habrá que asociar el fenotipo de un animal en particular con el hecho de haber heredado (del parental F1) el alelo A o el alelo B. y además se considera que el QTL queda localizado con baja precisión. Para tal propósito existen programas de computación. A pesar de disponer de estas estrategias. (ii) Construcción de una línea congénica (ver Capítulo IV) con el objetivo de aislar genéticamente el QTL (localizado en la etapa anterior) de otros QTL’s (normalmente se realiza un grupo de líneas congénicas abarcando los distintos QTL’s). manipulamos un rasgo poligénico para estudiarlo como monogénico. cientos de análisis de fenotipo y decenas de miles de genotipados. entre los cuales se encuentra la familia de programas Map Manager (http://mapmgr. Una vez más.
los ojos. fácil evaluación y técnicas de detección de bajo costo. al uso del ratón como modelo experimental en estudios de radiaciones y mutágenos químicos. han contribuido al establecimiento de la “columna vertebral” del actual mapa de ligamiento del ratón (algunos todavía son considerados marcadores útiles por algunos genetistas). 6. tienen dos grandes inconvenientes y ya no representan una fuente importante de nuevos marcadores: (i) Frecuentemente alteran la viabilidad y/o fertilidad de los animales afectados y resulta muy difícil establecer cruzas con más de tres o cuatro marcadores de esta naturaleza segregando al mismo tiempo. Desde esta observación inicial. Finalmente. con la observación de un ligamiento entre el locus albino (Tyrc) y el locus pink eye dilution (p). el comportamiento etc.3 Marcadores utilizados en la construcción de mapas de ligamiento Cualquier tipo de cambio en el ADN que haga a un individuo o grupo de individuos diferente de los otros miembros de la misma especie puede ser considerado como un potencial marcador genético (suponiendo que contamos con los medios. pero ya no representan una fuente importante de marcadores genéticos. el esqueleto. gracias al descubrimiento de nuevos alelos mutantes en diferentes loci del genoma murino. relativamente bajo. Los marcadores genéticos que se vienen utilizando han sido seleccionados por tres características fundamentales: abundancia. Más de 200 alelos mutantes con efectos sobre el color del pelaje. los alelos mutantes detectados por la inspección grosera del fenotipo externo de los animales pueden ser interesantes por su efecto sobre el desarrollo o como modelos de enfermedades genéticas. en términos de marcadores genéticos. el número total de este tipo de mutaciones se mantiene.LOS MAPAS GENÉTICOS 175 6.. de seguirlo a través de las generaciones).3. en parte. (ii) Si bien la mayoría de las mutaciones que ocurren de novo en el ratón afecta a nuevos loci. La acumulación de estas mutaciones fue debida. Desafortunadamente. el mapa de ligamiento del ratón empezó a formarse en 1915. y en parte también a la elección de la endocría como esquema reproductivo para mantener las líneas consanguíneas (la consanguinidad facilita la detección de mutaciones recesivas).1 Marcadores Fenotípicos Como fue mencionado anteriormente. directos o indirectos. . el mapa genético se ha enriquecido y crecido en densidad.
Al comportarse como caracteres mendelianos co-dominantes. hay que tener en cuenta que los marcadores de tipo II (genes codificantes) son muy útiles para la genética comparativa. Este traba- .2 Marcadores Proteicos El desarrollo de los geles de electroforesis en la década de 1960 permitió la identificación de nuevos loci. y tienen una distribución amplia en el genoma (existen actualmente más de 100 marcadores de este tipo y siguen apareciendo nuevas variantes). la variabilidad genética de estos marcadores es relativamente baja en el hombre y los animales y la búsqueda de nuevos RFLP’s es un trabajo caro. surgieron los primeros polimorfismos en las secuencias de ADN que son los RFLP’s o polimorfismos de longitud en fragmentos de restricción. lo que resulta muy caro y dificulta los proyectos de mapeos de gran envergadura. secuencias no codificantes y por lo tanto muy variables. tienen tres ventajas sobre los clásicos marcadores fenotípicos: (i) se expresan en forma co-dominante.1 RFLP’s (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Con la llegada de las técnicas de genética molecular (Southern blot. los RFLP’s son muy útiles como marcadores genéticos (Figura 6.3. exhiben polimorfismos determinados por la presencia o ausencia de un sitio de enzima de restricción específico.). por lo tanto pueden ser evaluados en animales heterocigotas. 6. Además. (ii) son en general compatibles con el normal funcionamiento de la proteína (enzimas) y no alteran la viabilidad ni la fertilidad de los portadores y (iii) son relativamente abundantes. es obvio que si los marcadores proteicos fuesen los únicos disponibles. cuando son separados en un gel de agarosa e identificados por una sonda molecular marcada.3. Por lo tanto. sondas moleculares etc. atribuibles a polimorfismos resultantes de variaciones en las cargas eléctricas de algunas proteínas. Los fragmentos generados por la digestión de una muestra de ADN genómico.3.3. largo y tedioso. Sin embargo.176 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO 6. 6. cabe recordar que no más del 3 % del ADN genómico es finalmente traducido a proteínas y que sólo unas pocas de éstas pueden mutar sin alterar la viabilidad de los animales. Estos polimorfismos han contribuido al rápido desarrollo del mapa genético del ratón. probablemente por ser neutros en términos de selección. pero tienen el inconveniente de requerir de técnicas tediosas y específicas para cada enzima o proteína. Estas proteínas tienen funciones similares pero diferentes estructuras primarias (ej: isoenzimas). Sin embargo. Este tipo de marcadores moleculares conocidos como variantes electroforéticas (ej: aloenzimas).3. serían insuficientes para el desarrollo de un mapa de alta densidad. Marcadores de ADN Todos los marcadores de ADN usados para construir mapas de ligamiento pertenecen a los llamados marcadores de tipo I.7).
El cromosoma 3 sufrió una mutación A por C (asterisco) lo que creó un nuevo sitio de restricción (banda de 2 kb). Esto genera una gran cantidad de alelos diferenciados por el número de repeticiones que posee cada uno.5 kb). la insulina.2 Minisatélites En 1980 A. el alelo #1 dará 2 bandas de 200 pb y el alelo #2 (que perdió el sitio de restricción) será de 400 pb. La banda en el gel será de 4 kb. Esta última característica se ve reflejada en el alto porcentaje de heterocigosis (generalmente mayor al 80 %) alcanzado para estos loci. 1995. la primera región hipervariable del ADN humano. Wyman y R. Oxford University Press. . A diferencia de los RFLP’s. El cromosoma 2 sufrió una mutación puntual C por T (asterisco) que elimina el sitio de restricción (la banda será de 5 kb). en el caso del estudio de pedigríes humanos. 6. El cromosoma 4 sufrió una inserción de 0. el bajo número de alelos que presenta un locus de RFLP (la mayoría son di-alélicos) produce una disminución en el porcentaje de heterocigosis con la consecuente pérdida de valor como marcador en los estudios de ligamiento.LOS MAPAS GENÉTICOS 177 Figura 6. la mioglobina y otros.5 kb (banda de 4. grandes cantidades de ADN genómico (típicamente 5 a 10 mg) y varias enzimas de restricción (aunque existen miles de enzimas de restricción sólo se comercializan algunos cientos).3. jo incluye técnicas de Southern blot con el uso de isótopos radioactivos (como 32P o 33P). Oxford. estos polimorfismos no surgen por la presencia o ausencia de un sitio de restricción sino por el número variable de repeticiones en tandem en cada alelo. Además. (ed) Mouse Genetics. Concepts and applications. están compuestas por “motivos” (del inglés motifs) cortos (de una longitud aproximada de entre 10 y 50 pb) repetidos en tandem un número variable de veces. A la derecha. El cromosoma 1 es la secuencia ancestral con tres sitios de restricción para la enzima TaqI (TCGA). White descubrieron. M.7. por azar. El producto inicial de PCR será el mismo para ambos alelos (400 pb) pero luego de la restricción con TaqI. R. Eventos moleculares que generan polimorfismos RFLP. Adaptado de Silver L. lo que los convierte en marcadores altamente informativos en estudios de análisis de ligamiento y pruebas de identificación. formando secuencias de entre 5 y 50 kb de longitud. y subsecuentemente se fueron hallando en el genoma humano otras regiones de ese tipo cerca de los genes de la α globina. Los iniciadores (primers) amplifican un segmento que contiene el sitio de restricción para TaqI.3. Estas secuencias no codificantes e hipervariables del ADN denominadas “minisatélites”. un polimorfismo RFLP-PCR.
8). Como se puede apreciar. dieron origen a la técnica conocida como “fingerprinting de ADN”. los sitios de restricción de las enzimas se encuentran flanqueando las secuencias repetidas en tandem. Las sondas moleculares desarrolladas por Jeffreys y colaboradores en el año 1985 a partir de secuencias repetitivas de un intrón de la mioglobina humana.8. Fingerprinting de ADN. Muchos minisatélites comparten entre sí una secuencia más corta (del orden de 15 pb) llamada “core”. Figura 6. cada cepa consanguínea presenta un patrón de bandas individual (fingerprint). capaces de detectar múltiples minisatélites a lo largo del genoma (fingerprinting multi-locus) (Figura 6. La foto muestra los patrones de bandas generados por la técnica de Fingerprinting de ADN utilizando la sonda 33. formando así familias de minisatélites con un core en común.178 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO En estas técnicas. . El fingerprinting de ADN es el patrón de bandas único y específico de individuo (excepto para los gemelos monocigóticos) obtenido por la hibridación de muestras de ADN digerido con sondas basadas en la secuencia core. La misma ha revolucionado el campo de la medicina forense y los estudios de paternidad en todo el mundo.6 desarrollada por Jeffreys y colaboradores.
3 Microsatélites A fines de la década de 1980. En el año 1987 Nakamura y sus colegas definieron los VNTR’s (Variable Number of Tandem Repeats) secuencias polimórficas usadas como marcadores en los mapeos de genes. Su frecuencia es mayor que la de los minisatélites. características que los convierten en excelentes marcadores genéticos. Por ejemplo. específicos de cada especie. STR (Simple Tandem Repeats) o SSR (Simple Sequence Repeats) y podemos considerarlas como otro tipo de VNTR. en general.6 y 33. lo que facilita la posibilidad de amplificación de estos pequeños segmentos por medio de la técnica de PCR para el análisis de los polimorfismos. El uso de los microsatélites en el ratón y la rata aceleró los trabajos de mapeo del genoma gracias a su abundancia (hay más de 8. El uso masivo de estos marcadores en la década de 1990 los convirtió en la “vedette” entre los marcadores moleculares. técnica denominada fingerprinting locus-específico. un marcador cada 400 kb) y estabilidad. se han descripto y mapeado cientos de loci de VNTR en el genoma humano y de algunos animales. Además. aunque existen diferencias en cuanto a su densidad. A estas secuencias se las conoce como microsatélites.000 por genoma. comprende un rango de entre 15 y 40. el 50 % de los microsatélites descriptos has- . los estudios comparativos de los genomas humano y del ratón mostraron que éste tiene entre dos y tres veces más microsatélites que el humano. presentan la ventaja de estar distribuidos al azar.15 evidencian una complejidad e intensidad de bandas comparables a las obtenidas por las mismas sondas en humanos. siendo su único inconveniente el hecho de que los iniciadores son.3. Por ejemplo. por ejemplo del motivo (CA)n. 6.000 copias del dinucleótido (CA)n (con un n mayor a 10) en el genoma del ratón. Hasta el momento. calculándose que su número podría superar los 200. dando un promedio de un locus cada 30 kb.3. SSLP (Simple Sequence Length Polymorphisms). Aproximadamente. El número de repeticiones. según sea homocigota o heterocigota. Esto nos ofrece la ventaja de generar fingerprints específicos de línea que sirven para el control de la calidad genética de las líneas consanguíneas (ver Capítulo IV). se calcula que existen cerca de 100. Al día de hoy ya no se utilizan más en el desarrollo de mapas genéticos. regiones codificantes o intergénicas. en promedio. lo que asegura. los fingerprinting de ADN generados por las sondas de Jeffreys 33. Los microsatélites se encuentran en los genomas de todos los eucariotas. en intrones. Estos investigadores introdujeron un nuevo enfoque en el manejo de los minisatélites al desarrollar una serie de sondas locus-específicas que ya no generan un patrón de bandas o fingerprinting sino una o dos bandas por locus de VNTR. aunque con una leve tendencia a presentar una mayor densidad en la región distal (telomérica) de los cromosomas. desde las plantas hasta los mamíferos.000 descriptos para ambas especies.LOS MAPAS GENÉTICOS 179 En el caso del ratón y la rata de laboratorio. se da a conocer la existencia de polimorfismos de ADN conteniendo repeticiones en tandem de dos nucleótidos [en particular (CA)n y (GA)n] además de otros formados por secuencias de entre 1 y 5 nucleótidos. aunque se calcula que su número podría ser de varios miles por genoma.
resgen.1). son detectables por la observación de los productos de PCR en geles de agarosa o poliacrilamida (Figura 6. Muchas de estas variaciones. Benavides. se encuentra disponible información sobre tamaños de alelos de 4.4. En la rata.M.180 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO ta el momento en el ratón muestra polimorfismo entre las distintas líneas consanguíneas de laboratorio. sus usos en genética poblacional y estudios de evolución. Los iniciadores para los SSLP del ratón (Mouse MapPairs® Primers). A. The University of Texas . (http://www.edu/GENOMESCANNER). Figura 6. Detección de alelos de microsatélite por PCR.genome.org y http://www. B.D. a la derecha un gel de poliacrilamida teñido con sales de plata.mcw. Aquellos lectores interesados en otros aspectos de los microsatélites. Department of Carcinogenesis . .wi. Se muestran tres alelos diferentes de un locus compuesto de repeticiones CA y los respectivos genotipos en la electroforesis. Los marcadores microsatélite. Estados Unidos.jax. A la izquierda un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio.edu).informatics. en el rango de 2 a 40 pb. la rata (Rat MapPairs® Primers) y otras especies pueden adquirirse a precios accesibles en Research Genetics Inc. Texas.Science Park.mit. el tamaño de sus productos y el polimorfismo entre las líneas de laboratorio puede encontrarse en Internet (http://www.500 SSLP en 48 líneas consanguíneas en el Rat Genome Database (ver http://rgd. como ser sus posibles funciones en la regulación de genes. La lista completa de SSLP’s del ratón y la rata. aunque ese porcentaje se eleva al 77% entre la línea C57BL/6 y Mus musculus castaneus. y al 90% si se trata de Mus spretus (ver más adelante el punto 6.9.5. la secuencia de sus primers. Fotos: F. pueden consultar el libro Microsatellites: Evolution and Applications de DV Goldstein y C Schlotterer C (2000).com).9). Anderson Cancer Center. Fotografías de electroforesis de productos de microsatelites del ratón por PCR.
lo que no permite diferenciar animales heterocigotas de homocigotas para un locus determinado (Figura 6. Oxford. Concepts and applications. Técnica basada en el uso de iniciadores únicos (o combinados de a pares) cuyas secuencias cortas (generalmente 10 nucleótidos) fueron diseñadas al azar. Las líneas horizontales representan los cromosomas de las líneas consanguíneas C3H y C57BL/6 (B6).3. las bandas amplificadas no presentan variantes de tamaño (alelos). Aunque la fuerza informativa de estos marcadores -en los estudios humanos– es menor a la de los microsatélites. Oxford University Press. Este es actualmente el método de elección en las especies menos estudiadas (por ejemplo es muy usado en peces) debido a que (i) no requiere información previa sobre secuencias de ADN en el organismo a estudiar. Las cajas blancas representan fragmentos genómicos (loci RAPD) amplificables por PCR con un iniciador diseñado al azar. como se lo suele pronunciar en inglés. se ven . o “snips”. Además. Otros marcadores moleculares. Los encontramos tanto dentro de secuencias anónimas de ADN como en secuencias codificantes (genes) y presentan en general dos alelos.3. Adaptado de Silver L. simplemente el producto de PCR está presente o ausente. son el resultado de la presencia de una base variante en cualquier sitio del genoma y constituyen la forma más común de variación genética. el locus B es polimórfico entre estas líneas. en reacciones de PCR de muy bajo requerimiento. Pero debido a las altas concentraciones de Cl2Mg y las bajas temperaturas de pegado de los iniciadores presenta la desventaja de tener baja “repetibilidad”. M.10.10). (ed) Mouse Genetics. Cada iniciador genera un fingerprinting individual. Como puede observarse. Figura 6. 1995.4 RAPD’s (Random Amplified Polymorfic DNA).5 SNP’s (Single Nucleotide Polymorphisms) Los SNP’s. (ii) se identifican muchos marcadores moleculares simultáneamente. Detección de loci polimórficos por la técnica de RAPD (AP-PCR).3. 6. y (iii) los costos son relativamente bajos y no se requiere laboratorio ni mano de obra muy sofisticada.3.LOS MAPAS GENÉTICOS 181 6.
Estos datos surgieron a partir de los primeros estudios de la secuencia del genoma del ratón. Esta técnica detecta polimorfismos en las secuencias propiamente dichas. las comparaciones entre cualquier línea clásica y la línea CAST/Ei (derivada de M. y 12. se encuentran identificados alrededor de 80. .com/genomics/academic/home. y no en su longitud. Esto se logra comparando la movilidad electroforética de los productos de PCR en geles de poliacrilamida después de su desnaturalización. basados en PCR y microchips de ADN. El número total (teórico) de sitios polimórficos SNP en el genoma humano estaría cerca de los 3-4 millones (esto coincide con los 3. m. según las estructuras secundarias que adoptan las cadenas simples.roche. Finalmente.200 pb. Este tipo de marcadores se está desarrollando velozmente en el ratón debido a la ventaja que ofrecería contar con nuevos marcadores polimórficos. donde se puedo comprobar la presencia de grandes segmentos de ADN con niveles de polimorfismo extremadamente alto (alrededor de 40 SNP’s cada 10 kb) y otros bloques de muy baja densidad (alrededor de 0. Más allá de estos promedios. hoy en día están tomando mucha importancia en el ratón y la rata. esto se vio favorecido por la aparición de métodos de “genotipado” automático. estos marcadores bi-alélicos son la última gran revolución en la creación de mapas de alta resolución y alta densidad de marcadores. si bien no es un tipo de marcador per se.wi.celera. promedio que se eleva a un SNP cada 80-100 pb en el caso de comparar con líneas consanguíneas derivadas de Mus spretus. http://mouseSNP. castaneus) muestra un promedio de un SNP cada 200 pb. domesticus) analizadas fue de aproximadamente 1 SNP cada 500-700 pb.mit. Por otra parte.5 SNP’s cada 10 kb).4 millones de SNP’s hallados por la empresa Celera comparando cuatro líneas consanguíneas de ratones).000 candidatos a SNP’s entre las líneas 129S1/SvImJ y C57BL/6J. m. Actualmente. es interesante ver que la distribución de los SNP’s no es en absoluto uniforme. Existen regiones muy grandes que se encuentran desiertas de SNP’s (en un estudio de secuencias de C57BL/6 se detectó una región de este tipo de un tamaño de 26 Mb) y otras regiones son muy ricas en SNP’s. La Roche (The mouse SNP database. aún entre líneas muy emparentadas. calculada empíricamente (promedio) como 1 SNP cada 600 a 1. En particular. Por consiguiente.edu/SNP/mouse/).edu/SNP/human/). http://www.com) y Celera (Mouse Reference SNP database.mit. El SSCP es muy utilizado para detectar diferencias alélicas en marcadores microsatélites y SNP. gracias a la secuencia inicial del genoma del ratón.182 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO compensados por su enorme frecuencia. La frecuencia de polimorfismos (promedio) entre las líneas clásicas (M. mencionaremos la técnica SSCP (del inglés Single Strand Conformation Polymorphism) como una herramienta muy útil a la hora de detectar nuevos polimorfismos.cfm?ppage=cds&cpage=mousesnps).000 entre C3H/HeJ y C57BL/6J. Para obtener información acerca de SNP’s en 15 líneas consanguíneas (clásicas y derivadas de ratones salvajes) se puede consultar la base de datos del Whitehead Institute for Biomedical Research/MIT Center for Genome Research (http://www-genome.000 entre BALB/cByJ y C57BL/6J.wi. que permiten analizar miles de muestras a la vez. Si bien se desarrollaron primero en los mapas humanos (ver http://www-genome. 20.000 SNP’s. El método es tan sensible que es capaz de reconocer una mutación puntual en secuencias de entre 80 y 250 pb de longitud. Esta colección inicial de SNP’s identificó alrededor de 47.
(ii) las líneas consanguíneas producen un solo tipo de gameta.11). AaBB y AABb en iguales proporciones.LOS MAPAS GENÉTICOS 183 6. y las líneas consanguíneas recombinantes (RIS) por el otro. con dos alelos cada locus (A y a. BC) es la cruza de un animal F1 por un representante de cualquiera de las líneas parentales. sin ninguna duda. la presencia de formas alternativas (alelos) de los marcadores genéticos en la generación parental es una condición indispensable para los estudios de ligamiento. donde C57BL/6 y DBA/2 son las líneas parentales (la hembra. la mayoría de la información ha provenido.4 Cruzas para análisis de ligamiento La utilización de líneas de ratones de laboratorio favorece los trabajos de mapeo genético porque: (i) es posible establecer cruzamientos a voluntad. lo que genera animales N2 (Figura 6. Aun si el entrecruzamiento se produce en ambos reproductores (en el ratón F1 y en la línea parental) sólo las recombinaciones entre los cromosomas del animal F1 darán recombinantes reconocibles.r) n . en el ratón como en el hombre. Los mismos se anotan de la siguiente manera: (C57BL/6xDBA/2)F1xDBA/2. si los marcadores no están ligados. están ligados. El uso de las retrocruzas para localizar mutaciones está recomendado en los siguientes casos: (i) si el alelo mutante (Mu) es dominante. Si f es el número de genotipos recombinantes observado y n el número total de animales. Si. Veamos un ejemplo teórico del uso del análisis de ligamiento en una retrocruza: A y B son dos marcadores que se quieren analizar para determinar ligamiento. Es importante recordar que. Aunque se han usado ocasionalmente técnicas no sexuales en mapeos genéticos del ratón. el valor r (porcentaje de recombinación) será dado por la fórmula: r= f n El desvío estándar estará dado por la siguiente fórmula: SE r = √ r (1 .1 Retrocruzas La retrocruza (del inglés backcross. y (iii) es posible criar un número ilimitado de animales de un cruzamiento dado. B y b).4. de un lado. 6. (ii) si el alelo mutante es recesivo y los homocigotas (mu/mu) son fértiles. se anota primero). en este caso el híbrido F1. por el contrario. Estas cruzas son: las retrocruzas y las intercruzas (líneas clásicas entre sí o líneas clásicas con líneas de origen salvaje). la retrocruza producirá una proporción de genotipos recombinantes de acuerdo a la fuerza de ese ligamiento. AABB. del uso de cruzas informativas de ratones. la retrocruza AaBb X AA BB producirá cuatro genotipos: AaBb.
Notar que los ratones N2 reciben siempre un cromosoma entero (no recombinante) de la cepa B. lo que reduce considerablemente el trabajo de genotipado. De todas formas. Tres pares de cromosomas [representando grande (100 cM). en promedio. Con esta fórmula uno puede calcular que un panel de retrocruzas de 300 animales provee un 95 % de probabilidad de detectar ligamiento para dos genes que se encuentren a 1 cM de distancia. Esquema de una retrocruza. Las retrocruzas.184 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO Figura 6. la cepa B es homocigota para una mutación recesiva (m) que no altera la viabilidad ni la fertilidad.11. 100 a 200 animales N2 es un número adecuado para comenzar un trabajo de localización de una mutación. (Una vez localizada una mutación entre dos marcadores. B. A. para afinar el mapa sólo hace falta estudiar los recombinantes entre estos marcadores.2 Intercruzas La intercruza (del inglés intercross) es el resultado del acoplamiento de dos híbridos F1. mediano (75 cM) y chico (50cM)] de cuatro progenies independientes de ratones N2. los cuales se anotan de la siguiente manera: . lo que genera animales F2 (Figura 6. Esta probabilidad se eleva a 99 % si el panel de progenie es de 460 animales. En el ejemplo.12).4. 50% serán heterocigotas (normales) y 50% homocigotas con fenotipo mutante. Todos los ratones de la generación N2 pueden ser genotipados sabiendo que.) 6.
Tres pares de cromosomas [representando grande (100 cM). Notar que los ratones F2 pueden recibir cromosomas recombinantes de ambos progenitores. B. A. la cepa B es homocigota para una mutación recesiva (m) que no altera la viabilidad ni la fertilidad. Entonces. el uso de las intercruzas para localizar mutaciones está recomendado en los siguientes casos: (i) si el alelo mutante es recesivo y los homocigotas (mu/mu) son infértiles y (ii) si el alelo mutante es co-dominante. Los ratones de la generación F2 serán. En el ejemplo. Las intercruzas. ¿Cuál es la mejor elección entonces: intercruza o retrocruza? Las ventajas de la intercruza son: .12.LOS MAPAS GENÉTICOS 185 Figura 6. mediano (75 cM) y chico (50cM)] de cuatro progenies independientes de ratones F2. Presentan dos ventajas sobre las retrocruzas: (i) cada cría F2 que analizamos nos proporciona el doble de información recombinogénica (proveniente de las gametas paterna y materna). Estos últimos son los ratones que elegimos para el genotipado con marcadores. y el ADN de las crías F2 puede ser obtenido en cualquier momento del desarrollo (inclusive prenatal) para su tipificación. (C57BL/6xDBA/2)F2. ya que ocurren meiosis informativas en ambos progenitores y (ii) pueden ser usadas para mutaciones recesivas deletéreas. 75% normales y 25% con fenotipo mutante. Esquema de una intercruza. Entre 50 y 100 animales F2 es un número adecuado para comenzar un trabajo de localización de una mutación. en promedio. ya que ambos padres (heterocigotas para la mutación) serán viables.
4.3 Líneas Consanguíneas Recombinantes Las líneas consanguíneas recombinantes (Recombinant Inbred Strains. cada línea de un panel de ratones RIS representa una colección de individuos con genomas idénticos.186 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO (i) Se analizan dos meiosis por animal (por lo tanto se usa la mitad de animales). muy útiles debido a su alto nivel de polimorfismo. el 100% de los animales será informativo. pero sólo 13 grupos (162 líneas) se comercializan. (ii) Permite estudiar los tres genotipos: mu/mu.13).html. lo que significa una gran ventaja. Uno de los grupos más usado es el BXD. (ii) Exige tener animales F1 fértiles en los dos sexos (por lo tanto no sirve para las cruzas inter-específicas).org/html/infosearch/pricelistframeset. los animales de fenotipo normal deberán ser genotipados para discernir entre mu/+ y +/+. Las desventajas de la retrocruza son: (i) Se analiza sólo una meiosis por animal. sólo un animal de cada cuatro (25%) será mutante (y por lo tanto directamente informativo para el análisis de ligamiento). RIS) son paneles (del inglés set) de líneas que se producen por 20 ó más generaciones de endocría sistemática de las crías sucesivas de una cruza entre dos animales F1. homocigotas para todos sus genes. junto con los grupos AXB y BXA. cuyas líneas parentales son C57BL/6 y DBA/2. donde las parejas en la generación F2 son tomadas al azar (Figura 6. + = alelo salvaje). El Jackson Laboratory es el laboratorio que dispone de mayor número de líneas RIS. y que pueden ser criados en número ilimitado. 6.jax. las mismas pueden consultarse en Internet: http://jaxmice. Estas lí- . Al optar por estos animales hay que tener en cuenta dos características: (i) Siendo líneas consanguíneas. (ii) Permite tener animales F1 fértiles en un sólo sexo (ideal para las cruzas inter-específicas). Las desventajas de la intercruza son: (i) En el caso de mutaciones recesivas. Hasta la actualidad se crearon 30 paneles de líneas RIS (con un total de 441 líneas) derivadas de 23 líneas consanguíneas parentales. Las ventajas de la retrocruza son: (i) En el caso de las mutaciones recesivas. mu/+ y +/+ (mu = mutante.
Los recuadros son alelos que ya han sido fijados en la generación F2. Con motivos didácticos. Maine. Esquema de la construcción de un grupo de líneas RIS usando AKR (AK) y DBA (D) como progenitoras. A. La tabla muestra los paneles de líneas RIS disponibles en el Jackson Laboratory. B.LOS MAPAS GENÉTICOS 187 Figura 6. el diagrama muestra un único par de cromosomas a lo largo del proceso. .13. Estados Unidos. Luego de 20 generaciones de endocría obtenemos cepas consanguíneas (isogénicas) que portan en promedio 50% de cada progenitor (se muestran el mismo par de cromosomas para cuatro individuos en cada línea). La posición de 4 loci hipotéticos se indica en los cromosomas parentales. Las líneas recombinantes consanguíneas.
probablemente al azar. Cuando un panel de RIS está siendo creado. (ii) Habiéndose originado de dos líneas progenitoras no relacionadas. de las dos líneas parentales (50% y 50% en promedio). con la sola excepción de la posibilidad de mutaciones. 50% y 50%. Luego. los cromosomas son “fragmentados” progresivamente en pequeñas regiones que se fijarán. será 87. excepto cuando una recombinación anule esa asociación. cruzando dos líneas consanguíneas. al azar.188 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO neas también permanecen estables a lo largo de las generaciones. para el caso de dos retrocruzas.5% de la línea donante. De esta manera. entre otros (Figura 6. SDP). cada línea es como un “tapiz” hecho de “trozos” de cromosomas derivados.4 Líneas Congénicas Recombinantes Las líneas congénicas recombinantes (del inglés recombinant congenic strains. heredan cada componente de su estructura genética de una u otra línea parental. la proporción de la línea de fondo y la donante no será. como son los genes de susceptibilidad al cáncer. Las RCS. La distribución de los marcadores o genes en estas líneas se conoce como patrón de distribución por cepa (del inglés strain distribution pattern. son especialmente útiles para el estudio de caracteres hereditarios complejos (QTL’s). Una variante de las líneas congénicas recombinantes son las líneas congénicas recombinantes inter-específicas (inter-specific recombinant congenic strains. a nivel genético. El programa MapManager también puede ser usado para identificar ligamientos en estas cruzas. en primer lugar.5% de la línea de fondo y 12. La gran ventaja que presentan estas líneas para el análisis de ligamiento es la posibilidad de acumular información en forma aditiva a lo largo de los años sobre el mismo panel de ratones RIS.14). a partir de los animales F1. junto con las líneas consómicas (en las cuales se reemplaza un cromosoma completo). Por ejemplo. IRCS) donde C57BL/6 es la línea de fondo y SEG/Pas (Mus spretus) la línea donante (ver Capítulo IV). en cada línea RIS. como por ejemplo Mus musculus y Mus spretus.5 Cruzas inter-específicas (la contribución de los ratones salvajes) Hablamos de cruzas inter-específicas cuando apareamos ratones de distintas especies (siempre dentro del mismo género). En cambio. 6. RCS) constituyen una suerte de variación de la filosofía de las RIS y se forman. como en el caso de las RIS. En otras palabras. De esta manera. Aquellos genes que se encuentren ligados en el mismo cromosoma tendrán una tendencia a permanecer juntos a través de las sucesivas generaciones. en ambos miembros de la pareja reproductora. las cruzas inter-subespecíficas se logran cuando apareamos ratones de distinta subespecie (el .4. pueden ocurrir eventos de recombinación meiótica en cada generación. 6.4. se realizan algunas (generalmente dos) generaciones de retrocruza contra una de las líneas parentales (la línea de fondo) para finalmente proseguir con la endocría -sin selección– de estos animales.
fue entonces superada cuando los genetistas del ratón decidieron tomar ventaja de la diversidad existente en los especímenes salvajes del género Mus. los efectos de la epistasis o la predisposición a ciertas enfermedades infecciosas. RCS. 6. Esto sirvió para desarrollar nuevas líneas consanguíneas que permitieron cruzas muy polimórficas entre líneas de origen salvaje y líneas clásicas de laboratorio (cruzas inter-específicas e inter-subespecíficas). Estas nuevas líneas han introducido en los laboratorios un polimorfismo considerable a partir del cual fueron posibles. Para las RIS el promedio de cada línea parental es de 50%. la línea donante (color negro) contribuye con un 12. con una variación alélica relativamente baja comparada con el hombre. Las líneas consómicas poseen un cromosoma entero que fue transferido a la línea receptora. Para las líneas RCS (empezando la endocria en la segunda generación de retrocruza). Cromosomas recombinantes. Haciendo una analogía con la pintura podríamos decir que al trabajar con las líneas clásicas de laboratorio los genetistas están usando una paleta a la cual le faltan varios colores fundamentales. entre otros.14. como por ejemplo Mus musculus domesticus y Mus musculus castaneus (para detalles sobre la sistemática del ratón remitirse al Capítulo III). El esquema muestra la imagen hipotética de las recombinaciones en tres pares de cromosomas (representando grande. estudiar la impronta genética (del inglés genomic imprinting). esto se convirtió en un gran inconveniente a la hora de realizar mapas genéticos de alta densidad (indispensables por ejemplo para el clonaje posicional de genes).LOS MAPAS GENÉTICOS 189 Figura 6. en cierta medida. Por otro lado.5%. Es en parte por esta razón que fueron creadas nuevas líneas consanguíneas a partir de ratones capturados en la naturaleza.4. La desventaja de las líneas clásicas de poseer un conjunto (del inglés pool) genético restringido. en estado salvaje.1 Los ratones salvajes como fuente de polimorfismo genético La relativa homogeneidad genética de las líneas clásicas de laboratorio ayudó a los primeros genetistas simplificando. los estudios de genética cuantitativa (QTL’s). mediano y chico) para las líneas RIS. tercer componente del trinomio en latín). Salvo algunas excepciones. por ejemplo. el . el análisis del determinismo genético de algunos genotipos complejos. como aquellos implicados en la histocompatibilidad o la predisposición a ciertos tipos de cáncer. congénicas y consómicas. Para las líneas congénicas. el segmento seleccionado es en promedio de 20 cM en la generación N10.5.
en la cruza inter-específica de elección para la realización de mapas genéticos de alta densidad/alta resolución. por ejemplo clasificando a un heterocigota como homocigota). aunque se logró en varias ocasiones. pueden fallar en la amplificación del segmento de ADN “salvaje” homólogo. Es necesario hacer notar que algunos iniciadores de PCR. el polimorfismo de los marcadores microsatélites entre las líneas clásicas y cualquier línea derivada del grupo Mus musculus tiene un nivel aceptable para cualquier trabajo de cartografía genética. como ya se vio. Este mismo tipo de comparaciones fue realizado entre líneas consanguíneas de rata y ratas capturadas en la naturaleza. Estos hallazgos fueron confirmados y expandidos recientemente por el grupo dirigido por Carlos Penha-Gonçalves usando 10 líneas consanguíneas derivadas de ratones salvajes y el análisis de polimorfismo de 254 microsatélites. BIK/g y 38CH). al haber sido diseñados para las líneas clásicas de laboratorio. PWK y MAI). Mus spretus (STF y SEG) y Mus spicilegus (ZYD). que puede ser cruzada con las líneas de laboratorio y producir híbridos fértiles (solamente las hembras. Además. comparadas con cualquier línea clásica. La cruza con esta especie se ha convertido. debido al denominado efecto Haldane). dentro del género Mus. domesticus (WMP. Este alto nivel de polimorfismo debería ser aprovechado para generar líneas consanguíneas derivadas de ratas salvajes. en promedio. musculus o Mus m. en los últimos años. tales como Mus spretus o Mus spicilegus. castaneus y un 90% entre C57BL/6 y Mus spretus. Mus spretus es la especie más distante. pero mucho más fáciles de reproducir. Haciendo un análisis del polimorfismo en estas nuevas líneas consanguíneas se ha encontrado que el 81% de los clones de ADN. Es interesante notar que estos investigadores hallaron 632 alelos derivados de las líneas salvajes que no se encontraban presentes en las líneas clásicas de laboratorio y que. como lo hemos visto para el ratón. resultando en la ausencia del producto de PCR proveniente de Mus spretus (este resultado puede conducir a una interpretación errónea. el nivel de polimorfismo de estas líneas. m. Además de su gran valor como fuente de polimorfismo. musculus (MBT. El uso de las nuevas técnicas para detectar polimorfismo ha hecho que cobren más valor las cruzas inter-subespecíficas (con las líneas consanguíneas derivadas de Mus m. castaneus). En cambio. m. Esta estrategia de mapeo de genes ha demostrado ser confiable y probablemente no introduce ningún desvío en la localización de los genes en el genoma del ratón. lo que aportaría nuevos alelos de microsatélites para la construcción de mapas genéticos. M. utilizando sólo cuatro enzimas. fue más difícil. tomados al azar.190 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO establecimiento de líneas consanguíneas a partir de ratones salvajes del complejo Mus musculus fue siempre exitoso. En las líneas de labo- . los ratones salvajes representan también una fuente valiosa de variaciones morfológicas a nivel del cariotipo. WLA. donde alrededor del 80% de los microsatélites estudiados fueron polimórficos. la creación de nuevas líneas consanguíneas a partir de otras especies del género Mus. menos distantes de las líneas de laboratorio que Mus spretus. Al evaluar el polimorfismo por PCR (para un panel de marcadores microsatélites) se observó un nivel de 77% entre C57BL/6 y Mus m. era de 80%. entre Mus spretus y C57BL/6 muestran un polimorfismo de restricción (RFLP). Las líneas salvajes estudiadas fueron M.
y por eso es muy apropiado pensar en diseñar cruzas con líneas consanguíneas de origen salvaje para el clonaje posicional de genes en el ratón. el uso de estos ratones salvajes va a expanderse hacia otras áreas.3 cM. Para cumplir este objetivo se requiere de la realización de un mapa de alta densidad de marcadores –de las regiones que flanquean al gen– y la identificación de los dos marcadores más cercanos al gen.2 El valor de los ratones salvajes para el clonaje posicional de genes Por todo lo expresado. por ejemplo. Estos rearreglos espontáneos (de ocurrencia natural) han sido muy usados para generar una gran variedad de monosomías y trisomías y también para la demostración del fenómeno de impronta genética. es muy probable que estudiando la reacción de los ratones salvajes -de diferentes especies– se llegue a la identificación de genes nuevos potencialmente interesantes. Son además herramientas útiles para la localización de genes por hibridación in situ ya que ayudan en la discriminación entre pares cromosómicos.LOS MAPAS GENÉTICOS 191 ratorio existe una gran variedad de translocaciones reciprocas e inversiones que son el resultado de todos los ensayos de radiación realizados a lo largo de los años. las translocaciones Robertsonianas o las fusiones céntricas. en promedio. La situación ideal es cuando el locus mutado puede ser flanqueado por dos marcadores que se encuentren a una distancia menor de 0. En cambio. entre 500 y 600 kb de ADN genómico. Lamentablemente esto es muy difícil de lograr en la práctica con las líneas clásicas. son poco comunes en estas líneas de laboratorio. lo que representaría. para evitar trabajo innecesario en los pasos finales. debido a su bajo nivel de polimorfismo. 6.5 Aplicaciones de los mapas genéticos Veremos muy brevemente las aplicaciones más importantes de los mapas que hemos delineado en este capítulo: . Como veremos más adelante el clonaje de un gen que es conocido sólo por su fenotipo deletéreo implica que el gen en cuestión sea aislado en un vector con la menor cantidad de ADN flanqueante posible. Teniendo en cuenta que las líneas de ratones de laboratorio presentan un espectro de reacciones muy pobre cuando son infectados con organismos patógenos o son expuestos a una droga. 6. lo que suele ser difícil usando el complemento cromosómico normal del ratón. No parece arriesgado asegurar que. Seguramente se convertirá en una herramienta útil en el estudio de las interacciones epistáticas y como una fuente de “genes a clonar”.5. queda claro que las líneas consanguíneas salvajes son una herramienta fundamental para el clonaje posicional (del inglés positional cloning) de genes. así como lo es la hierba Arabidopsis thaliana para los que trabajan en genética de plantas. mas allá del mapeo de genes y el estudio de la impronta genética. este tipo de variaciones cromosómicas son muy comunes en las poblaciones naturales de la especie Mus musculus domesticus. Se han hallado en todos los cromosomas acrocéntricos del cariotipo normal (con la excepción del cromosoma Y) diversos tipos de translocaciones Robertsonianas y es muy probable que existan muchas más por descubrir. Sin embargo.4. en el futuro.
con el desarrollo de buenos mapas genéticos. a las mutaciones obese (ob) y dwarf (dw).5. presentan una expresión diferencial según los tejidos. Estas observaciones señalan la importancia evoluti- . ahora Gli3Xt) en el cromosoma 13. Es aquí donde la información de un mapa genético puede ser de gran utilidad. Algunas. antes de que enfermen (ver Anexo I). 6.2 cM) del locus Xt (Extra toes. antes de su divergencia de los peces sin mandíbulas (vertebrados primitivos como la lamprea).2 Estudios de Evolución del Genoma Existen múltiples ejemplos para ilustrar la importancia de los mapas genéticos en los estudios de evolución del genoma. El otro ejemplo lo constituyen los estudios realizados sobre el origen del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (ver capítulo V). Dentro del genoma del ratón existen muchas secuencias que se encuentran repetidas un número determinado de veces. pero estos animales mueren rápidamente. mientras que los homocigotas + pmn/+ pmn (dedos normales) pueden ser reconocidos desde recién nacidos. mueren in utero. en el período perinatal o el defecto les impide reproducirse. Es decir que estas regiones emergieron como resultado de una duplicación cromosómica producida. Amy1 y Amy2. se podrá comprender mejor lo ocurrido durante la evolución de estas secuencias. es decir sobre el cromosoma que no porta el alelo mutante pmn. Esta localización ha permitido aumentar la eficiencia de los programas de cría de mutantes pmn/pmn utilizando al dedo extra de la mutación Xt como marcador fenotípico de fácil identificación. se intercruzan animales con genotipos Xt +/+ pmn (dedo suplementario): los animales Xt +/Xt +. generalmente mueren in utero. Como resultado de esa duplicación existen dos copias ligadas del gen. Por trabajos de mapeo.192 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO 6. siendo el primer gen activo en las glándulas salivales y el segundo en el páncreas. entre ellos citaremos sólo dos. Algunas de ellas son genes funcionales y sus diferentes copias pueden estar en el mismo cromosoma o en cromosomas distintos. entre los días 50 y 55 de vida. entre otras. Esto se logró estableciendo un grupo de ratones con la mutación Xt en repulsión. Haciendo uso de esta ayuda. Estos mecanismos aún no son bien conocidos pero. en un ancestro común a todos los vertebrados con mandíbula. Esto último es lo que le ocurre. Esta distribución responde a cambios producidos durante la evolución del genoma en diferentes momentos de la historia de la especie. en la mutación autosómica recesiva progressive motor neuronopathy (ahora Tbcepmn) los ratones homocigotas pueden ser identificados entre los días 14 y 20 de nacidos (cuando comienzan a desarrollar una parálisis de los miembros anteriores). aparentemente. Por ejemplo. se localizó esta mutación muy cerca (< 0. los cuales son buscados para muchas experiencias.1 Identificación de Genotipos Específicos Criar ratones mutantes para investigación es muchas veces complicado por el hecho de que los genotipos homocigotas. que no portan más el alelo pmn. Los enigmas sobre su origen parecen haber sido resueltos recientemente con el descubrimiento de regiones que evolucionaron paralelamente -por duplicación– de un gen ancestral común. Este es el caso de la duplicación de un gen ancestral que codifica para la amilasa en el cromosoma 3 del ratón. inclusive.5.
(Además. lo que hace referencia a los genes que se encuentran en el mismo cromosoma. en el cromosoma 16 del ratón. Por ejemplo. de los cuales alrededor de 2. Estos mapas comparativos pueden usarse para predecir ligamientos entre genes y para identificar “genes candidato” para enfermedades genéticas en ambas especies. respectivamente. syntenic segment). se identificaron 342 segmentos conservados entre los genoma del ratón y el humano. o sea que se trata de grupos de genes que muestran el mismo orden lineal en ambas especies. Alrededor del 90% del genoma humano y 93% del genoma del ratón reside en estos segmentos conservados. Algunos autores diferencian entre “segmentos conservados” (también “ligadura conservada” o. se conocen alrededor de 3. pero no necesariamente el mismo orden (también llamados -en inglés– syntenic blocks). Cada grupo de genes homólogos constituye un segmento cromosómico conservado. Kit y Lyst (mutación beige) cuyas enfermedades homólogas humanas son la aniridia. en inglés. lo que se denomina conservación de la sintenía (del griego “sobre el mismo hilo”). con una conservación del orden de genes casi perfecta. donde se conserva la localización cromosómica de los genes. 6.3 Establecimiento de Homologías Cromosómicas entre Especies De los 18. el mapeo de un gen murino (aku) homólogo de la enfermedad metabólica humana alkaptonuria. la hiper- . Hasta la fecha de este escrito (incluyendo la información proveniente del primer borrador del genoma del ratón). Otros hallazgos recientes son que el cromosoma X está representado por un único bloque sinténico en ambas especies y que el cromosoma 20 humano corresponde enteramente a una porción del cromosoma 2 del ratón. la información vertida recientemente por las comparaciones de los genomas completos del ratón y el hombre -con un ancestro común que se remonta a 75 millones de años– estaría indicando que aproximadamente el 99% de los genes del ratón tiene un homólogo en el genoma humano).500 homólogos con genes humanos (incluyendo cerca de 400 loci homólogos con enfermedades genéticas humanas). con tamaños que van desde 300 kb hasta 65 Mb (un promedio de 7 Mb). sirvió de base para la localización del gen humano en la región homóloga correspondiente del cromosoma 3. como la diabetes. como sucedió con los genes Pax6.500 están mapeados en ambas especies en distintos segmentos homólogos. Otro ejemplo es el desarrollo de un modelo murino para el síndrome de Down: se han identificado por lo menos 25 genes conservados entre la región de homología del cromosoma 16 del ratón y el brazo largo del cromosoma 21 humano (recordar que la imagen citogenética del síndrome es la trisomía del cromosoma 21).5. el piebaldismo y el síndrome de Chediak-Higasahi.LOS MAPAS GENÉTICOS 193 va que tienen los fenómenos de duplicación cromosómica en la creación de sistemas cada vez más complejos en los organismos vivos. y “sintenía conservada”. Esto demuestra la importancia que puede tener este tipo de estudios comparativos en la disección genética de las enfermedades complejas. aquellas regiones donde el orden de varios genes es el mismo en ambas especies.000 genes mapeados actualmente en el ratón.
consiste en que el gen en cuestión sea aislado en un vector con la menor cantidad posible de ADN flanqueante. pero no por la proteína para la cual codifica. Figura 6. Identificación de genes a partir de ADN clonado.194 MANUAL DE GENÉTICA DE ROEDORES DE LABORATORIO tensión y el cáncer. el establecimiento de un mapa de alta densidad en las regiones flanqueantes del gen. donde no se ha tenido éxito con la búsqueda de genes candidato en la región. se procede a identificarlo por medio de varias técnicas. Una vez que se identifica un intervalo que (con gran certitud) posee el gen de interés. Detectando genes. Esto requiere. El diagrama muestra las técnicas más utilizadas para detectar genes en una secuencia de ADN clonado.4 Clonaje Posicional de Mutaciones El proceso de clonaje de un gen que es conocido sólo por su fenotipo.5.15. como ser la trampa de exones (del inglés exon trapping). se conoce como clonaje posicional. BAC’s o fagos P1). en primer lugar. entre las más utilizadas (Figura 6. el conocimiento preciso del orden de los genes dentro de estos segmentos homólogos puede incluso ser usado para transferir información desde el ratón y el hombre a otras especies de animales de laboratorio y domésticos. para evitar trabajo innecesario en los pasos finales de la identificación del gen. Finalmente. junto con el hallazgo de los dos marcadores genéticos más cercanos. antes llamada “genética reversa”. Esta estrategia.15). La estrategia de clonaje posicional ha sido utilizada en medicina humana para aislar los genes responsables de varias enfermedades genéticas como la fibrosis quística y la enfermedad de Huntington. El clonaje posicional implica un “caminar” a través de esos marcadores moleculares cercanos a la mutación utilizando clones de ADN (YAC’s. 6. . Esta situación se presenta en las etapas finales del clonado posicional de una mutación. la selección de ADNc o la secuenciación.
A brief history of genetic variation analysis. STUPKA E. 2001. Esto es lo que ocurrió con el gen Pax1. . CHAPMAN J. El rápido aumento en el número de EST’s y ADNc humanos y murinos más el refinamiento y el aumento de la densidad de ambos mapas genéticos a mejorado mucho las posibilidades de realizar clonaje posicional. que fue localizado en el cromosoma 2 del ratón en una región donde había sido mapeada una vieja mutación llamada undulated (un). al mismo tiempo. Genetic analysis of the mouse using interspecific crosses. muchos de ellos se encuentran actualmente en proceso de clonaje. DANDOLO L. HERBERT E. APARICIO S. CHRISTOFFELS A. SOUSA-NUNES R. un resultó ser una mutación del gen Pax1. HAYNES A.LOS MAPAS GENÉTICOS 195 Otras mutaciones han sido identificadas en términos moleculares por el método del gen candidato: si un gen. 1988. BENTLEY L. 1991. aportar ideas sobre la función de los genes. A radiation hybrid transcript map of the mouse genome. Mammalian Genome 1: 206-210. RODRIGUEZ-TOME P. Hasta la fecha. balding (bal) resultó ser una mutación del gen desmoglein 3 (Dsg3) y nackt (nkt) del gen catepsina L (Ctsl). LEHRACH H.000 mutaciones espontáneas que causan enfermedades genéticas. LUNDEBERG J. MORISSETTE J. DUNWOODIE S. Además. Trends in Genetics 4: 18-23. Bibliografía General AHMADIAN A. a su vez. descartar o confirmar genes candidato para la mutación. AITMAN T. BRULS T. lo cual constituye una fuente de nuevos modelos animales interesantes para la biomedicina (ver Capítulo IX) y que pueden. Nature Genetics 29: 194-200. Por otro lado. SOUTHAM L. PORAS I. KETTLEBOROUGH R. que es conocido bajo la forma de un alelo mutante. et al. ELEY L. COX RD. Con la disponibilidad de varias genotecas de BAC’s y de las secuencias completas del genoma del ratón y la rata. AMAR L. muy pocos han sido clonados. PUTNAM N. GOLDSWORTHY M. como hemos visto. RANA A. Science 297: 1301-1310. entre muchos ejemplos más. WEISSENBACH J. 2002. muchos genes responsables de caracteres de variación cuantitativa (QTL’s) han sido mapeados pero. RUIZ P. HEARNE C. Whole-genome shotgun assembly and analysis of the genome of Fugu rubripes. Hay que tener en cuenta que en el ratón existen más de 1. Existen muchos genes en el ratón que son de interés por ser modelos de enfermedades genéticas humanas o por alterar alguna función esencial del desarrollo embrionario. es posible actualmente llevar a cabo el clonaje posicional de cualquier mutación. Mononucleotide repeats are an abundant source of length variants in mouse genomic DNA. AVNER P. un clon de ADNc es posicionado en la misma región del genoma se analiza la posible conexión entre ellos. MANENTI G. es ubicado en el mapa genético y. GAS S. el uso de información cruzada entre estas dos especies aumenta las posibilidades de sugerir. Biotechniques 32: 1122-1136. La identificación del gen obese (Lepob) responsable de fenómenos de obesidad en el ratón y el hombre es un ejemplo reciente de este tipo de trabajos. De esta manera. GUÉNET J-L. casi tres cuartos de todos los genes clonados en el ratón han sido identificados usando este enfoque del gen candidato. CHIA JM. TODD J. DEHAL P. BEDDINGTON R. AVNER P. De la misma forma. WILES MV. 2002.
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