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Timestamp: 2019-05-24 06:46:11+00:00

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Aumento de la extracción de detergente para el análisis de la membrana de proteomes bidimensional en gel de electroforesis
Proteome Science, 2005; 3: 5-5 (más artículos en esta revista)
A Mateo Churchward (mchurchw@ucalgary.ca) [1], R Butt Hussain (rbutt@ucalgary.ca) [1], C John Lang (johnclang@shaw.ca) [1], Kimberly K Hsu (khsu3338 @ intercambio. Ubc.ca) [1], Jens R Coorssen (jcoorsse@ucalgary.ca) [1]
[1] Dept. of Physiology and Biophysics, University of Calgary Faculty of Medicine, 3330 Hospital Drive NW, Calgary AB, T2N 4N1, CANADA
[2] Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Calgary Faculty of Medicine, 3330 Hospital Drive NW, Calgary AB, T2N 4N1, CANADA
[3] Hotchkiss Brain Institute, University of Calgary Faculty of Medicine, 3330 Hospital Drive NW, Calgary AB, T2N 4N1, CANADA
Copyright © 2005 Churchward et al; licenciatario BioMed Central Ltd
El análisis de proteínas de membrana hidrofóbica de dos dimensiones por electroforesis en gel ha sido obstaculizada por el concepto de dificultad debido a problemas de solubilidad. Hemos optimizado la extracción de protocolos con distintos detergente composición de la solubilización de amortiguación con una variedad de venta en el comercio no iónicos y zwitterionic detergentes y detergente-como fosfolípidos.
Después de los primeros análisis de una dimensión SDS-PAGE, en dos dimensiones cuantitativas de análisis de las membranas de eritrocitos humanos, membranas de hígado de ratón, y el ratón membranas cerebrales, se extrajeron con topes que incluyó la zwitterionic detergente MEGA 10 (decanoyl-N-methylglucamide) y la zwitterionic LPC lípidos (1-lauroyl lysophosphatidylcholine), mostró mejora respecto de la extracción selectiva con el común 2-DE detergente CHAPS (3 [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate). Las mezclas de los tres aditivos detergentes mostraron mejoras en el terreno número, densidad, y la resolución. La introducción de mejoras sustanciales en el análisis de la membrana de un cerebro proteoma se observaron.
Este estudio demuestra que una combinación optimizada de detergentes, junto con la rigurosa muestra de la manipulación y protocolos de electroforesis, permite sencillo y eficaz análisis de la membrana proteomes uso de la electroforesis en dos dimensiones.
Históricamente, el análisis proteómico de las proteínas de membrana hidrofóbica se ha considerado a ser difícil dentro de los límites de los protocolos convencionales de dos dimensiones en gel de electroforesis (2-DE). El carácter de primera dimensión centrada isoeléctrico (IEF) requiere que las proteínas se solubilizados a fondo ya que están sometidos a un campo eléctrico en el que migrar a su punto isoeléctrico, por definición, el estado de la red de carga más bajo posible y, por tanto, más baja solubilidad en ambientes acuosos. Además de ser altamente hidrofóbico, muchas proteínas de membrana integral tienden a ser muy grandes: humanos Ca 2 + canales 24 y hélices transmembrana son típicamente> 200 kDa [1], y los receptores tirosina quinasa son con frecuencia> 100 kDa [2, 3]. Esto nos lleva a dos grandes problemas en la preparación de muestras de proteínas de membrana 2-DE. En primer lugar, de manera eficaz la extracción de proteínas de membrana en un detergente que es compatible IEF. En segundo lugar, el mantenimiento de la solubilidad de proteínas en todo cargamento en tiras de IPG y la posterior separación IEF primera dimensión. Aunque la proteína de membrana altamente eficiente de las extracciones se llevan a cabo habitualmente con un detergente como el SDS de una dimensión PAGE, SDS es incompatible con la FEI debido a la acusada grupo de cabeza. Para superar esto, SDS solubilizados muestras a menudo sufren disolvente o precipitación ácida para eliminar o reducir las existencias y los lípidos. A pesar de estas duras e incluso tratamientos posteriores de tratamiento del precipitado con una fuerte base [4], delipidación por extracción con disolventes se cita a menudo como el aumento de la recuperación de proteínas [5, 6] sin discusión de la pérdida o alteración de las proteínas durante la precipitación. Por ejemplo, las proteínas altamente hidrofóbicas (como proteolipids) y de proteínas, con especial después de la traducción modificaciones (como palmitoylation) son capaces de particionamiento en la fase de disolvente [7 - 9], y TCA tratamiento puede causar hidrólisis ácida de las proteínas o alterar puesto Modificaciones de la traducción. Además, algunos de los primeros problemas generales con eficacia por la separación de las proteínas hidrófobas 2-DE han llevado a generalizado desprecio general para el análisis de proteínas de membrana, en particular en el desarrollo de los suplentes proteómicos enfoques [4, 5, 10, 11].
Desde proteínas de membrana representan aproximadamente el 30% de las proteínas humanas [12], y puede dar cuenta de un número mucho mayor de funciones celulares, la concentración en proteínas solubles en la llamada "plena" los análisis proteómicos es algo relativo. Hay pruebas de que la extracción de optimización de las condiciones de la alteración de buffers, chaotropes, detergentes y fiable es suficiente para lograr mapas de alta resolución de las proteínas de membrana [13 - 16]. Con este fin, hemos buscado alternativas simples para optimizar la condiciones de detergente utilizado para extraer proteínas de las membranas nativas a un análisis sistemático de las propiedades de solubilización de una amplia gama de venta en el comercio no iónicos y zwitterionic detergentes y una serie de naturales y sintéticas-como el detergente Lípidos [17 - 19]. Mediante las detergentes sintéticos, junto con más agentes nativos lipofílica, encontramos que las combinaciones de estos reactivos en general, mejorar la resolución de la membrana proteomes analizados por 2-DE, que prevé seleccionar las mejoras en el rendimiento de proteínas específicas. Optimización de las condiciones particulares de las muestras sigue siendo una de las claves para el éxito de cualquier análisis [20 - 22].
1D SDS-PAGE de RBC membrana
El análisis de los extractos de RBC 1D utilizando SDS-PAGE permitió la detección rápida de un gran número de reactivos de extracción (incluidas glycerols, lípidos, ácidos grasos, y isoprenoids), que prevé que los resultados podrían interpretarse cualitativamente selectivo basado en el aumento y disminución de la proteína Patrones de bandas en relación con el control de las extracciones con CHAPS o SDS (Fig. 1]. Por ejemplo, la banda III, un gran proteínas con múltiples dominios transmembrana que abarca [23] se podría distinguir claramente en los extractos de SDS en un aparente MW de ~ 110 kDa, en comparación con los realizados con CHAPS. Otra banda, en aparente MW, de 28 kDa, también se observó en la FDS, pero no la CHAPS extracto. Sobre la base de estos criterios simples, se seleccionaron los detergentes que dio la mejora de los patrones de bandas más de la CHAPS control de la extracción. Una primera serie de trabajo efectivo, se identificaron los detergentes para la realización de nuevos ensayos (Tabla 1], y estos fueron utilizados para la extracción de membrana RBC muestras para su posterior análisis por 2-DE. LPC en particular, la N-methylglucamide detergentes MEGA 8, 9, y 10 y la sulfobetaine basados en detergentes ASB-14 y SB 3-10 mostraron mejoras en el patrón de bandas 1D relativo a la CHAPS control. Una selección de la fuente natural de lípidos también fueron probados, incluyendo lysophsphatidylglycerol (GLP), lysophosphatidylethanolamine (LPE), lysophosphatidylcholine (LPC, de huevo), lysophosphatidylserine (LPS, de las especies bovina cerebro), y cardiolipin (bovina corazón). Aunque en general comparables, y el uso selectivo de algunos de extracciones, la mayoría de estos lípidos naturales demostrado ser de utilidad limitada en general, ya que se imputan a pH neutro, y por lo tanto intrínsecamente incompatible con la FEI. Esta limitación no elimina la posible aplicación de estos lípidos como agentes de extracción para el uso con la separación de proteínas paradigmas alternos.
2-DE Roja análisis de la membrana de células de la sangre
Inicialmente, glóbulos rojos (RBC) se extrajeron las membranas con un 2-DE buffer que contiene 4% CHAPS total (nuestro nivel de concentración) o el 1-2% total de detergente, debido a la relativamente baja solubilidad de la mayoría de los detergentes de ensayo en comparación con el altamente soluble CHAPS. Extracción de RBC con membranas sintéticas LPC (lauroyl cadena, Sigma) y el detergente zwitterionic MEGA 10, en estas condiciones, resultó en la mejora selectiva de las zonas resultantes de las pautas de 2 DE en relación con el control de los extractos en CHAPS (datos no presentados). 2-DE de las muestras extraídas con SB 3-10 arrojado similar a la proteína mapas CHAPS, sin embargo este detergente era difícil de solubilizar en buffer de urea alta, como en el informe anterior [24, 25]. Sin embargo, contrariamente a los informes anteriores [24, 26], las muestras extraídas con ASB-14 no mostraron mejora con respecto a cualquiera de CHAPS o SB 3-10 (datos no presentados). A fin de cuenta adecuadamente tanto más general para efectos de la concentración de detergente y aprovechar la alta solubilidad y eficiente solubilizing propiedades de CHAPS, tanto MEGA LPC y 10 fueron utilizados para extraer RBC membranas (Fig. 2], las membranas de cerebro de ratón (Fig. 3], y el hígado del ratón membranas (Fig. 5] como mezclas de 3% CHAPS: 1% detergente suplentes, para un total del 4% de detergente.
RBC membranas extraídas con el 4% del total de detergente mezclas CHAPS LPC y mostró pruebas generales de la mejora de la densidad in situ (Fig. 2B], así como mejoras específicas en términos de reducción de rayas horizontales en la región intermedia de peso molecular (Figura 2A]. Automatizado de detección in situ y cuantitativos análisis comparativo utilizando Progenesis Workstation software determinaron cambios en el patrón de proteínas. Las áreas específicas de los geles mostró mejoría en relación con el 4% CHAPS paralelo de control de geles (Fig. 2Bi-iv]. En particular, un prominente lugar que corresponde a la banda III se observó claramente [15, 16], así como un 2,2 ± 0,1 - multiplicado en la densidad de una cadena de puntos relativo a la CHAPS extracto (Fig. 2Bii]. Otros tres únicos puntos fueron observados cuando se extrajeron con el 3% CHAPS: 1% LPC (Fig 2Biii-iv]. RBC membrana de las muestras extraídas con el 3% CHAPS: 1% MEGA 10 (Fig. 2C] dado mapas de las proteínas en general, equivalente a la resolución del 3% CHAPS: 1% LPC y el 4% CHAPS mapas, pero no resolvían la proteína banda III Tan eficazmente como el 3% CHAPS: 1% LPC.
Con el fin de examinar los efectos de la superposición de ambos prueba detergentes, pero mejorar la observó pérdidas de proteínas, 0,5% de cada una se mezclan con el 3% CHAPS y probado en la extracción y 2-DE RBC análisis de las proteínas de membrana (Fig. 2D] . Extracción con 3% CHAPS: LPC 0,5%: 0,5% MEGA 10 no da la medida de las diferencias identificadas en el 3% CHAPS: 1% LPC extrajeron condición, aunque los mapas muestran mejoras generales por el control CHAPS condición de que se correlacionan con las mejoras Visto en las dos extracciones individuales detergente (Figs. 2B, C]. La densidad de la cadena de proteínas indicadas se aumentó una media de 1,7 ± 0,2 - veces más de CHAPS (Fig. 2Dii]. En general entonces, la adición de LPC a la extracción de proteínas de amortiguación aumenta tanto la recuperación y la posterior resolución de los mapas en 2D de proteínas.
Nuestros resultados iniciales utilizando la membrana RBC como un modelo del sistema nos lleva a ampliar el análisis a otros tipos de tejidos. Membranas de cerebro de ratón [27] y el hígado del ratón membranas fueron escogidos debido a su disponibilidad, y el amplio interés internacional en la mejora de los análisis de estos tejidos proteomes.
2-DE análisis de la membrana de cerebro de ratón
El cerebro del ratón adulto membrana muestras fueron sometidas a la final de cuatro condiciones de extracción (Fig. 3] con el fin de seguir los resultados de prueba obtenidos en RBC membranas (Fig. 2]. En general los resultados fueron muy similares a los obtenidos en los ensayos sobre RBC membranas. La extracción de las membranas de cerebro de ratón con el 3% CHAPS: 1% LPC (Fig. 3B] mostró mejora de terreno número, la densidad y la solución de extracción en comparación con el 4% CHAPS con solo (Fig. 3A); análisis cuantitativo indica las áreas específicas de mejora significativa ( Fig. 4]. Automatizado de análisis identificó 13 ± 3 nuevos puntos que se reproducen detectado principalmente en los de bajo peso molecular básica y extrema regiones del gel (Fig. 4B; flechas azules indican novela puntos). Además, 5 puntos que se identificaron aumentado en volumen un promedio 7,0 ± 3,4 veces, y el aumento en la densidad de 2,8 ± 0,9 veces en comparación con el 4% CHAPS condición (Fig. 4B; flechas verdes indican el aumento de la recuperación). De los 15 ± 2 novela manchas detectadas en el 3% CHAPS: 1 MEGA 10% condición (Fig. 4C], la mayoría también se observó en el 3% CHAPS: 1% LPC condición. En general, de los mismos 5 puntos que muestra el aumento de la recuperación, el aumento de volumen de 5,8 ± 2,5 veces, mientras que el aumento de densidad de 3,2 ± 0,9 veces (Fig 4C; flechas verdes). La extracción de la membrana del cerebro del ratón con el 3% CHAPS: LPC 0,5%: 0,5% MEGA 10 (Fig. 3D] mostró un efecto aditivo sobre el terreno número. Spots de cobrar en ambas CHAPS 3%: el 1% y el 3% LPC CHAPS: 1% MEGA 10 fueron también detectadas en el sistema combinado de extracción. 13 ± 1 novela manchas se detectaron en relación con el control, y los 5 puntos que anteriormente se habían aumentado en volumen de 6,4 ± 0,4 veces y se aumentó la densidad de 2,6 ± 0,6 veces (Fig 4D; flechas verdes). La naturaleza de la recuperación de estas proteínas en los puntos 3% CHAPS: LPC 0,5%: 0,5% MEGA 10 revela la acción específica de los dos detergentes - MEGA LPC y 10 que trabajan en concierto. Sólo una pérdida selectiva de una proteína in situ se observó en relación a esta recuperación de los puntos singulares (Fig. 4Ai); esta pérdida es el resultado de una acción específica compartida por los dos suplentes detergentes frente a un resultado de la diferencia de concentración CHAPS Durante la extracción ya que esta proteína no se recuperó aún después de la extracción total del 5% con detergente (4% CHAPS: LPC 0,5%: 0,5% MEGA 10) (datos no presentados). Esta pérdida implica alguna acción específica de la alternativa detergentes que impiden la extracción de esta proteína, o posiblemente una alteración en la movilidad electroforética de esta proteína en la primera dimensión por medio de aumentar o disminuir la cantidad de residuos expuestos ionizable. En conjunto, los resultados de la RBC membrana de la membrana del cerebro y el ratón muestran que extracciones simples combinaciones de zwitterionic detergentes (MEGA CHAPS y 10) con un zwitterionic lípidos (LPC) son generalmente más eficaces en la extracción de proteínas de membrana y el mantenimiento de la solubilidad de proteínas durante la primera dimensión de la FEI CHAPS son estándar basado en la extracción de condiciones.
Adicional 2-DE Analyses
Curiosamente, la extracción de las membranas de hígado de ratón con el mismo detergente combinaciones descritas anteriormente dio lugar a la proteína que los mapas son muy similares, con muy pocas mejoras. Automatizado análisis indica casi total resultante de la superposición de 2 DE patrones de la proteína (Fig. 5], con la específica y sustancial de la recuperación de un terreno adicional de la proteína. Interpretamos la marcada similitud en los perfiles de estas proteínas del hígado, en relación con las diferencias observadas en las muestras de cerebro y RBC, que se debe a la variabilidad entre los tejidos en condiciones de relativa homogeneización y de extracción, la eficiencia y la compatibilidad con nuestro actual sistema de amortiguación.
Para el control de las posibles diferencias derivadas de la evolución de CHAPS concentración en la prueba de extracción de estos buffers, membranas de cerebro de ratón También se extrajeron con el 5% total de detergente (5% o 4% CHAPS CHAPS: LPC 0,5%: 0,5% MEGA 10) y analizados en paralelo Con membranas extraídas, con 4% de total de detergente. No hay diferencia significativa en el patrón general de terreno o diferencias específicas, tal como se describe más arriba, se observó entre el 5% y el 4% del total de las mezclas de detergente (datos no presentados), lo que indica que las diferencias descritas aquí son específicamente atribuibles a la adición de LPC y 10 como MEGA Solubilizing agentes. En efecto, en general, los patrones de proteínas de membrana fueron en general de un poco más baja resolución en la que el CHAPS concentración total o detergente concentración se aumentó a 5%.
En experimentos iniciales se encontró proteína total que se carga de las más importantes variables de confusión análisis cuantitativos. Como tal, se tomó gran cuidado para asegurarse de que los análisis de manera significativa la prueba de extracción de la proteína y la disolución de eficiencia, en el aislamiento de las variables de complicación. Simplemente, el objetivo fue comparar los reactivos y las condiciones, no para comparar diferentes cargas de la proteína total final por 2-DE. Inicialmente muchas muestras de proteínas se cuantificaron utilizando una proteína modificados Folin total de ensayo (RC DC Proteína kit de ensayo, BioRad). Colourimetric ensayos de este tipo (por ejemplo, Bradford, Lowry, BCA, etc) realizar aceptablemente en muchas circunstancias de rutina que requiere la normalización de una serie de muestras muy similares. Sin embargo una de las varias limitaciones de tales ensayos de proteínas totales es una marcada sensibilidad a las sustancias que interfieren, incluidos los componentes típicos de la FEI solubilización soluciones tales como detergentes, agentes reductores, y la urea. En nuestros experimentos, las concentraciones de detergentes y detergente fueron sistemáticamente alteradas y combinadas. No inesperadamente, se observó gran variabilidad en los resultados de la proteína total de ensayo, en función de la solubilizing reactivos presentes. Las complicaciones de la aplicación sistemática de los controles de corrección, o separado de la preparación de las curvas de calibración para cada una de las condiciones de solubilización probado, simplemente aumentado las posibilidades de error. Independientemente, separadas las curvas de calibración no son viables, incluso en el caso de las RC de CC de ensayo, como la urea saturar causa una falsa señal positiva.
Hemos encontrado que la EZQ Proteína Quantitation kit (Molecular Probes) es insensible a la naturaleza y la concentración de detergente en todas las muestras analizadas. En este formato de ensayo, la muestra se inmovilizados proteína lavarse exhaustivamente con metanol para eliminar los componentes de la solubilización solución antes de la adición de reactivos de detección de la proteína fluorescente. Así, la química de los productos de ensayo en ausencia de confusión potenciales contaminantes. En extensas comparaciones, no hubo diferencias significativas en las curvas de nivel de proteína de ensayo, independientemente del tipo o la cantidad de detergente en cuenta (datos no presentados). Además, el método demostró ser muy sensibles (detección de rutina de 0,030 μ g de proteína total / lugar, o 15 μ g / ml), lo que está plenamente 10 veces más sensible y requiere de 4 veces menos que el material de ensayo RC DC. Por lo tanto, como la química de la prueba no se ha modificado en virtud de nuestras diferentes condiciones experimentales, tenemos la confianza de que las mejoras observadas en nuestra última proteína mapas fueron realmente el resultado de las diferencias en la eficiencia de extracción y la disolución, y no los artefactos generados por errónea ensayos de proteínas totales Conduce a la proteína total incompatible IEF cargas entre las diferentes condiciones de ensayo. Aunque la proteína de ensayo EZQ ciertamente tiene sus salvedades, no menos importante de los cuales es el costo, que ofrece distintos beneficios que apoyen su utilidad en estas y otras en curso los análisis proteómicos.
Con el fin de optimizar la recuperación de las proteínas hidrófobas para 2-DE, hemos buscado una forma simple, directa solución al problema de extracción de proteínas y solubilidad durante la FEI. La selección y combinación sistemática de los detergentes comercialmente disponible ofrece un directo, barato y conveniente método para la optimización de las condiciones de la FEI sin entrar en las complejidades de una síntesis sistemática de los nuevos detergentes específicos sobre la base de base de las moléculas, o de las pérdidas potenciales o modificación de las proteínas Relacionados con las técnicas de extracción con disolventes. Junto con nuestra capacidad de analizar eficazmente membrana proteomes mediante 2-DE [27] las conclusiones resultantes debería también resultar de la utilización en la definición de las combinaciones de extracción optimizado para su uso con los reactivos suplente protocolos de separación de proteínas.
Sobre la base de la hipótesis de que las moléculas altamente lipofílicas (aunque a menor total de las concentraciones que se puede lograr con la más estándar de los detergentes), podría imitar mejor las nativas de los lípidos de membrana de proteínas y, por tanto, mejorar las interacciones proteína solubilización, encontramos que el LPC puede aumentar sustancialmente la extracción de Proteínas de membrana de diferentes fuentes. Esta constatación no elimina la necesidad de la optimización de la extracción y 2-DE condiciones para diferentes muestras, pero nos da una poderosa, ampliamente disponible y de precios razonables alternativa que se puede probar fácilmente en paralelo con más de rutina solubilización reactivos. Rigurosas pruebas de los ensayos de proteína asegurado que estos resultados reflejan un cierto efecto de la extracción y la solubilidad de proteínas, en lugar de un artefacto de proteínas incompatibles entre diferentes cargas DE 2-análisis. En particular, el CPL y 10 siempre MEGA particularmente notables mejoras en la resolución de la membrana del cerebro del ratón proteoma.
L-α-lysophosphatidylcholine lauroyl, urea, tris acetato, lauric ácido, el pH 3-10 ampholytes, amonio persulfate, decyl-N, N-dimetil-3-ammonio-1-propanesulfonate (SB 3-10), amidosulfobetaine-14 ( ASB-14), DL-α-O-benzylglycerol, tributylphosphine (PDD), HEPES, sodio orthovanadate, staurosporine, cantharidin, y los componentes de la amplia gama de cócteles inhibidor de la proteasa [28] fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, Missouri) . IPG tiras (pH 3-10), el 30% de acrilamida / bisacrylamide solución, baja fusión de agarosa, Sypro Ruby, 10 × TGS funcionamiento de amortiguación, RC DC Protein Kit de ensayo, γ-globulina bovina, y se SDS de BioRad (Hércules, California) . EZQ Proteína Quantitation Kit fue de Molecular Probes (Eugene, OR), Zwittergent ® 3-10 fue de Calbiochem (La Jolla, California), y fue de CHAPS Anatrace (Maumee, Ohio). 1,2-dioleoyloxy-3-(dimetil) propano, docosadiynoic ácido 5,7-, y 1-oleoyl-sn-glicerol fueron de Investigación de Sustancias y Preparados Químicos de Toronto (Toronto, Ontario). Bovina cerebro L-α-lysophosphatidylserine, huevo L-α-lysophosphatidylcholine, huevo L-α-lysophosphatidylethanolamine, huevo L-α-lysophosphatidylglycerol, huevo L-α-lysophosphatidic acid, cardiolipin bovina corazón, y los ácidos grasos libres se Doosan Serdary de Investigación (Toronto, Ontario). Thiourea era de la Ciencia Fisher (Hampton, New Hampshire), y PBS, la TDT, octanoyl-N-methylglucamide (MEGA 8), nonanoyl-N-methylglucamide (MEGA 9), decanoyl-N-methylglucamide (MEGA 10), TEMED, glicerol , El 40% de acrilamida solución, y octaethylene éter de glicol monododecyl (C 12 E 8) eran de Bio básica Inc (Markham, Ontario). Rango estrecho ampholytes (pH 2.5-4, 3.5-5, 5-7, 7-9 y 8-9.5) eran de Fluka (Buchs, Suiza), y tryptophol y trans, trans-farnesol fue de Aldrich (St. Louis , Missouri). Todos los demás son productos químicos de, al menos, grado analítico.
Rojo Sangre preparación de células de la membrana
Packed RBC se obtuvieron de los Servicios de Sangre de Canadá, (Calgary, AB) y 3 × lavados con buffer isotónica (20 mM de fosfato de sodio pH 7,4, el 0,9% de NaCl). RBC fantasmas se prepararon de acuerdo con el método de Chernomordik [29] con ligeras modificaciones. Las células fueron lisadas osmotically en buffer de lisis hipotónica (5 mM fosfato de sodio pH 7,4, cóctel inhibidor de la proteasa [28], 5 mM TDT) por 20 minutos en hielo. El lisado fue flash congelado en un hielo seco / etanol baño, descongelados, y membranas fueron recolectados por centrifugación (3000 × g, 20 min, 4 ° C). Pellets fueron lavadas con buffer de lavado (20 mM de fosfato de sodio pH 8,5, cóctel inhibidor de la proteasa, 5 mM TDT) hasta sobrenadantes son claras, y luego sometidos a una segunda ronda de lisis hipotónica y congelación-deshielo. Después de lavar hasta sobrenadantes son claras, las membranas fueron recolectados por centrifugación (3000 × g, 40 min, 4 ° C), en suspensión en un volumen mínimo de buffer de lavado, y almacenados a -80 ° C. Antes de la extracción, la membrana de los aislados fueron lavadas con PBS que contenía inhibidores de la proteasa (PBS-PI) y pildoradas (3 horas, 120000 × g, 4 ° C).
Membrana preparativos de tejidos de mamíferos
Membranas fueron aislados a lo descrito previamente [27]. En pocas palabras, el cerebro o el hígado del ratón flash fueron congelados después de la disección y almacenados a -80 ° C hasta que se necesite. Para el aislamiento de todas las membranas celulares, se aplicó una simple física, separación y fraccionamiento de protocolo. En resumen, los tejidos congelados fueron descongelados en buffer de lisis hipotónica (20 mM HEPES pH 7,4, cóctel inhibidor de la proteasa, 10 mM de sodio orthovanadate, 4 μ M staurosporin, 4 μ M cantharidin) y homogeneizada manualmente en hielo con una de polietileno de pestle en un tubo de 1,5 mL microcentrífuga. El homogenado fue sometido a una ronda de congelamiento-deshielo (-80 ° C), antes de ser combinado con un volumen igual de PBS 2 × para restablecer isotonicity. Membranas fueron recolectados por ultracentrifugación (3 horas, 120000 × g, 4 ° C), y se lavaron dos veces; pellets se resuspendió en PBS-PI para cada lavado y recogida por ultracentrifugación, como se ha descrito anteriormente.
Detergente Extracciones
Detergente buffers de extracción se prepararon para 1D (7 M urea, 2 M thiourea, 9 mM Tris acetato de pH 7,0, cóctel inhibidor de la proteasa, y el detergente, como se indica) o 2-DE (IEF buffer 1, que contiene urea 8 M, 2 M thiourea, la proteasa Inhibidor de cóctel, y el detergente, como se indica [27]]. "Pellets" de membrana se resuspendió al vaso y vortexing. Extracciones fueron incubadas durante 1 hora en hielo, con el periódico vortexing. Cualquier material insoluble fue separado por ultracentrifugación que se describió anteriormente. Solubilizados muestras se analizaron para el contenido total de proteína utilizando el EZQ Proteína Quantitation Kit (Molecular Probes, Eugene, OR).
Proteínas totales fue ensayada mediante cualquiera de los EZQ Proteína Quantitation Kit o el RC DC Kit de ensayo de proteínas (BioRad, Hercules, CA). El RC DC ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante en placas de 96 pozos y la absorbancia fue medida utilizando el Wallac Victor2 HTS Multilabel Counter (PerkinElmer Ciencias de la Vida, Boston, MA). EZQ Proteína Quantitation se llevó a cabo esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto fluorescencia fue registrado por imágenes en la Proexpress multiwavelength fluorescente de imágenes (PerkinElmer, Boston MA) in situ por fluorescencia y se evalúa mediante ImageQuant 5,2 software (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
1D SDS-PAGE se realizó en formato mini gel usando el BioRad proteiforme II Electroforesis sistema, tal y como se describe en esencia [30], con modificaciones menores [31]. Las muestras se normalizaron a 2 mg / ml en la extracción de amortiguación apropiada, y luego diluido 1:1 (v / v) con 2 × SDS muestra buffer [30]. 10 μ g de proteína total fue cargado por así en el 12,5% que separa T geles con 5% T apilamiento geles, tamponada con 375 mM Tris (pH 8,8), tal como se describe [31]. Geles fueron ejecutadas a 125 V durante 10 min a pila de proteínas y, a continuación, la tensión se redujo a 90 V de la conclusión [32].
Las muestras para el IEF se normalizaron a 2 mg / ml con la adecuada amortiguación de la FEI, entonces combinado 1:1 (v / v) con un ampholyte contienen IEF amortiguación (8 M urea, 2 M thiourea, 1% pH 3-10 amplia gama Ampholytes, un 0,2% cada una estrecha gama ampholytes (pH 2.5-4, 3.5-5, 5-7, 7-9 y 8-9.5) y detergente, como se indica [27]], la introducción de un trabajo de concentración de la muestra a ampholytes .
Las muestras fueron sucesivamente reducidos y alkylated esencialmente de acuerdo con Herbert et al. [33, 34] con algunas modificaciones menores. En resumen, la muestra se redujo en el PDD y además de la TDT a final de las concentraciones de 2,3 mM y 45 mM TDT, respectivamente, y se incubaron durante 1 hora a 25 ° C. La muestra se redujo entonces alkylated con 230 mM de monómero de acrilamida durante 1 hora a 25 ° C. Inmediatamente después de alquilación, la muestra se cargan en tiras de IPG pasiva hidratación a 25 ° C (12 horas). IEF se realizó a 15 ° C utilizando la BioRad proteiforme IEF Cell; tensión se ramped linealmente a 4000 V (2 horas) y el IEF se realizó en 4000 V (constante) de 37500 Vhours. Después de centrarse, IPG tiras fueron esencialmente equilibrada de acuerdo a las instrucciones del fabricante por inmersión en el equilibrio secuencial de amortiguación (6 M urea, SDS 2% (w / v), glicerol 20% (w / v), y 375 mM Tris pH 8,8) que contiene DTT 130 mM durante 10 minutos, seguido por el equilibrio de amortiguación con 350 mM de monómero de acrilamida durante 10 minutos. Tras el equilibrio, IPG tiras se cargaron en el 12,5% que separa T geles con 5% T apilamiento geles (buffer descritas para 1D) y sellada en el lugar con una superposición de agarosa (0,5% de agarosa de baja fusión, 0,1% SDS y 375 mM Tris pH 8,8 ). SDS-PAGE se llevó a cabo de otro modo, tal como se describe para 1D SDS-PAGE.
Después de la electroforesis, geles fueron fijados en el 10% de metanol, ácido acético 7% por 1 hora, lavar cuidadosamente con agua y teñidas con Sypro Ruby noche a la mañana. Geles se visualizaron utilizando el Proexpress multiwavelength fluorescente de imágenes (PerkinElmer, Boston MA). Cuantitativas de análisis de imágenes se realizó a través Progenesis Workstation 2004 (Dinámica no lineal, Cambridge, UK). Conjuntos paralelos de geles fueron deformadas y acompañadas de análisis automatizados, y los volúmenes se normalizaron a un solo punto compatible en tamaño, la forma, la densidad y la ubicación en todos los geles.
LPC (12:0 L-α-lysophosphatidylcholine), GLP (L-α-lysophosphatidylglycerol), LPE (L-α-lysophosphatidylethanolamine), LPS (L-α-lysophosphatidylserine), MEGA 8 (octanoyl-N-methylglucamide), MEGA 9 (nonanoyl-N-methylglucamide), MEGA 10 (decanoyl-N-methylglucamide), SB 3-10 (N-decyl-N, N-dimetil-3-ammonio-1-propanesulfonate), ASB-14 (amidosulfobetaine-14 ), C12E8 (octaethylene éter de glicol monododecyl), glóbulos rojos (eritrocitos)
MAC supervisó el análisis de SDS-PAGE, diseñó y llevó a cabo el 2-DE análisis, de adquisición de datos y la interpretación y preparó el manuscrito. RHB contribuido al diseño experimental, la preparación de muestras, 2-DE análisis, y participó en la redacción del manuscrito. JCL y KKH diseñado y llevado a cabo el análisis de SDS-PAGE. CCI concebida y planificada en el estudio, y colaboró en la interpretación de los datos y la preparación final del manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.
Los autores desean agradecer a Tiffany Rice, Tammy Wilson, y el doctor V. Wee Yong amablemente para proporcionar tejidos de ratón. También queremos dar las gracias a Jeff Cordero, el doctor Ahmadi Pirshahid Sina, Marlies Ernst, y todos los miembros de la Coorssen laboratorio útil para los debates y asesoramiento. CCI reconoce el apoyo de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación para la Innovación Canadá, la Alberta Heritage Foundation for Medical Research, la Red de Alberta Proteómica Innovación, y la Fundación del Corazón y los trazos de Canadá.

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