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Timestamp: 2020-08-11 12:54:53+00:00

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Using Near-infrared Fluorescence and High-resolution Scanning to Measure Protein Expression in the Rodent Brain | Protocol (Translated to Spanish)
Aquí, presentamos un protocolo que utiliza colorantes de infrarrojo cercano junto con inmunohistoquímica y escaneo de alta resolución para analizar las proteínas en las regiones cerebrales.
La neurociencia es el estudio de cómo las células en el cerebro median diversas funciones. La medición de la expresión proteica en las neuronas y la glia es fundamental para el estudio de la neurociencia, ya que la función celular está determinada por la composición y la actividad de las proteínas celulares. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica se puede combinar con el escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano para proporcionar una medida semi-cuantitativa de la expresión proteica en regiones cerebrales distintas. Esta técnica se puede utilizar para expresión de proteína simple o doble en la misma región del cerebro. La medición de proteínas de esta manera se puede utilizar para obtener un cambio relativo en la expresión de proteínas con una manipulación experimental, la firma molecular del aprendizaje y la memoria, la actividad en vías moleculares y la actividad neuronal en múltiples regiones cerebrales. Utilizando las proteínas correctas y el análisis estadístico, la conectividad funcional entre las regiones cerebrales también se puede determinar. Dada la facilidad de implementación de la inmunocitoquímica en un laboratorio, el uso de inmunocitoquímica con escaneo de alta resolución de infrarrojo cercano puede expandir la capacidad del neurocientífico para examinar los procesos neurobiológicos a nivel de sistemas.
El estudio de la neurociencia se refiere a una investigación de cómo las células en el cerebro median funciones específicas1. Estos pueden ser de naturaleza celular como cómo las células de la glia confieren inmunidad en el sistema nervioso central o pueden implicar experimentos que tienen como objetivo explicar cómo la actividad de las neuronas en el hipocampo dorsal conduce a la navegación espacial. En un sentido amplio, la función celular está determinada por las proteínas que se expresan en una célula y la actividad de estas proteínas2. Como resultado, medir la expresión y/o actividad de las proteínas en las células cerebrales es fundamental para el estudio de la neurociencia.
Hay una serie de técnicas disponibles para medir la expresión de proteínas en el cerebro. Estos incluyen métodos in vivo como la topografía de emisión de positrones para densidades de receptores3 y micro-diálisis para péptidos pequeños4. Más comúnmente, los métodos ex vivo se utilizan para examinar la función y expresión de las proteínas. Estos incluyen las técnicas de espectrometría de masas5, Western Blot y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)6e inmunocitoquímica7. La inmunocitoquímica es ampliamente utilizada en el campo de la neurociencia. Esta técnica implica el uso de un anticuerpo primario para detectar una proteína (o antígeno) de interés (p. ej., c-Fos) y un anticuerpo secundario conjugada para detectar el complejo proteico-primario de anticuerpos (figura 1). Para permitir la detección del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico, los anticuerpo secundarios tienen agentes oxidantes como la peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugados con ellos. Esto permite la formación de precipitados en las células que se pueden detectar mediante microscopía ligera7. Los anticuerpos secundarios también pueden tener compuestos químicos fluorescencia conjugados a ellos (es decir, fluoróforos). Cuando se estimulan estos productos químicos emiten luz, que se puede utilizar para detectar proteína-anticuerpo primario-complejos de anticuerpos secundarios7. Por último, a veces los anticuerpos primarios tienen agentes reductores y sustancias químicas de fluorescencia que se unen a ellos negando directamente la necesidad de anticuerpos secundarios7 (figura 1).
Curiosamente, muchos métodos de inmunocitoquímica permiten la visualización de proteínas en las células cerebrales, pero no la capacidad de cuantificar la cantidad de proteína en una región específica de la célula o el cerebro. El uso de microscopía de luz para detectar precipitados de las reacciones de reducción permite la visualización de las neuronas y la glia, pero este método no se puede utilizar para cuantificar la expresión proteica en las células o en una región cerebral específica. En teoría, la microscopía de fluorescencia se puede utilizar para esto, porque la luz emitida por el anticuerpo secundario fluorescente es una medida del complejo de anticuerpos secundario-anticuerpo primario-proteico. Sin embargo, la autofluorescencia en el tejido cerebral puede dificultar el uso de la microscopía de fluorescencia para cuantificar la expresión proteica en el tejido cerebral8. Como resultado, la luz emitida por imágenes fluorescentes de tejido cerebral raramente se utiliza para cuantificar la expresión proteica en el cerebro.
Muchos de estos problemas se pueden abordar utilizando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano junto con el escaneo de alta resolución9,10. En este artículo, describimos cómo la inmunocitoquímica junto con los fluoróforos en los espectros de emisión de infrarrojo cercano se pueden combinar con el escaneo de alta resolución (por ejemplo, 10 – 21 μm) para obtener imágenes nítidas que permiten la semicuantificación de proteínas en distintas regiones cerebrales.
El siguiente protocolo fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Delaware. Las ratas macho de Sprague Dawley, de aproximadamente 55 a 75 días de edad, se utilizaron para este protocolo.
1. extracción del cerebro y preparación de tejido
Anestesiar rata con isoflurano en la cámara de inducción de anestesia hasta que la rata ya no exhibe una respuesta al pellizco del pie.
Sacrificar ratas a través de una rápida decapitación usando una guillotina.
Corte la piel en el cráneo posterior a la anterior y despejada de la parte superior del cráneo.
Usa los roedores para remover cuidadosamente la parte posterior del cráneo, y luego usando pequeñas tijeras diseccionantes cortadas hacia abajo de la línea media del cráneo, empujando hacia arriba contra la parte superior del cráneo en todo momento para evitar dañar el tejido cerebral.
Usa los roedores para quitar la mitad derecha e izquierda del cráneo para exponer el cerebro.
Utilice una pequeña espátula para recoger bajo el cerebro y cortar los nervios, elevar cuidadosamente el cerebro y congelar los cerebros en isopentano refrigerado en hielo seco (al menos-20 ° c). Después de esto, almacenar los cerebros en un congelador-80 ° c hasta rebanar.
Rebanar cerebros en regiones de interés a 30 – 50 μm en un criostato mantenido entre-9 ° c y-12 ° c. Monte directamente las rodajas sobre los portaobjetos de vidrio y guárdela en un congelador de-80 ° c hasta el momento del ensayo de inmunocitoquímica.
Nota: En este protocolo, las regiones cerebrales de interés eran el hipocampo y la amígdala.
2. reacción inmunohistoquímica única
Nota: Para la reacción inmunohistoquímica doble, el protocolo es el mismo que la reacción inmunohistoquímica única, excepto que esta reacción tiene dos anticuerpos primarios de diferentes hospedadores (por ejemplo, conejo y ratón) y dos anticuerpos secundarios para el correspondiente primarias deben ser de un solo huésped (p. ej., anticonejo de cabra y antiratón de cabra). Los anticuerpos secundarios también tienen que ser de dos espectros diferentes que están disponibles en escáneres de alta resolución. Por ejemplo, un anticuerpo secundario con un pico del espectro de emisión a 680 nm y un anticuerpo secundario 800CW (pico del espectro de emisión a 780 nm).
Retire los portaobjetos de vidrio del congelador y deje que se equilibren a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Bajo una campana de humo, fijar el tejido cerebral en 4% paraformaldehído en 0,1 M fosfato amortiguado salina (PBS) para 1 − 2 h a temperatura ambiente.
Enjuague las diapositivas en 0,1 M Tris con solución salina tamponada (TBS) tres veces durante 10 min cada una. Permeabilizar las membranas celulares incubando diapositivas en un detergente suave (por ejemplo, 0,01% detergente) durante 30 − 60 min.
Enjuague las diapositivas en TBS tres veces durante 15 min cada una.
Diluir el anticuerpo primario para la proteína de interés en PBS en la concentración correcta. Por ejemplo, para detectar el gen temprano inmediato c-Fos, preparar un anticuerpo primario anti c-Fos de conejo en una concentración de 1:500.
Pipetear la solución de anticuerpos primarios directamente sobre el tejido cerebral (aproximadamente 200 μL por diapositiva de 3 pulgadas x 1 pulgada).
Utilice cubreobjetos para incubar el tejido cerebral sobre láminas de vidrio en la dilución de anticuerpos primarios para 1 − 2 h a temperatura ambiente o durante la noche (~ 17 h) a 4 ° c.
Retire los cubreobjetos y lave las diapositivas en TBS que le hayan añadido una pequeña cantidad de detergente (p. ej., 0,01% de detergente, "TBS-T") cuatro veces durante 15 min cada una.
Utilice cubreobjetos para incubar las secciones cerebrales en un anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 2 h.
Nota: El anticuerpo secundario debe ser a la dilución correcta y en un diluyente que contenga TBS, detergente y 1,5% del suero huésped. Por ejemplo, un anticuerpo secundario de cabra en una dilución de 1:2000 contendrá un 1,5% de suero de cabra y un 0,05% de detergente.
Enjuague las diapositivas en TBS-T cuatro veces durante 20 min cada una, y luego en TBS cuatro veces por 20 min cada una.
Seque los toboganes a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche. Cuando las diapositivas están secas, están listas para la toma de imágenes.
Coloque las diapositivas sobre la interfaz de escaneo infrarrojo cercano con el tejido hacia abajo. Cualquiera de las imágenes una diapositiva de cristal o varias diapositivas a la vez utilizando una herramienta de selección.
Diapositivas de imagen utilizando el ajuste de la más alta calidad con un desplazamiento de 0 nm y una resolución de 21 μm. El escaneo típicamente tomará de 13 − 19 h dependiendo del equipo de escaneo utilizado.
Importar imágenes en el software de análisis de imagen (por ejemplo, ImageStudio) para ver y marcar para análisis de proteínas semi-cuantitativos.
4. Análisis de expresión proteica
Abra el software de análisis de imagen y seleccione el área de trabajo en la que se escaneó la imagen.
Abra la imagen escaneada en el software de análisis de imágenes para ver el escaneo, y ajuste las longitudes de onda visualizadas, así como el contraste, brillo y magnificación mostrados sin alterar la imagen cruda o la emisión total cuantificada.
Identifique las regiones clave para la cuantificación y seleccione la pestaña análisis a lo largo de la parte superior de la página, luego seleccione dibujar rectángulo (o dibujar elipse/dibujar mano alzada) para dibujar un rectángulo sobre el área que se cuantificarán.
Para ver el tamaño del rectángulo, seleccione formas a lo largo de la parte inferior izquierda de la pantalla y, a continuación, seleccione columnas a lo largo de la parte inferior derecha. Agregue columnas height y width para identificar el tamaño de la forma.
Nota: Es importante controlar el tamaño de la forma al comparar la cuantificación. Se recomienda utilizar formas idénticas colocadas dentro de la ubicación de cuantificación deseada, con el fin de obtener un muestreo preciso de las emisiones para esa región.
Luego nombra la forma y repite. Una vez que se muestrean todas las regiones, los datos disponibles en la pestaña columnas se pueden agregar y analizar.
Antes de usar la exploración de alta resolución para la inmunohistoquímica, uno debe verificar que el protocolo funciona. Esto se puede lograr usando un ensayo de validación donde las secciones cerebrales del mismo animal son incubadas con anticuerpos primarios y secundarios, anticuerpo secundario solo, o ningún anticuerpo primario ni secundario. Los resultados de este ensayo de validación se muestran en la figura 2. En esta reacción detectamos el gen temprano inmediato c-Jun en el hipocampo dorsal y la amígdala. La expresión de C-Jun solo se observó cuando se aplicaron anticuerpos primarios y secundarios al tejido cerebral.
La figura 3 muestra la detección de proteínas duales en núcleos de amígdala. En este experimento hemos atacado la subunidad GluR1 del receptor de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) y la subunidad NR2A del receptor N-metil-D-Aspartato (NMDA) en el mismo tejido cerebral. Esto nos permitió examinar la relación de los receptores AMPA/NMDA en los sub-núcleos de la amígdala. Esta relación es una firma neurobiológica de aprendizaje y memoria11,12. Como se puede ver en la figura 3, la señal para GluR2 (780 nm de luz pseudo coloreada en verde) y NR2A (680 nm de luz pseudo coloreada en rojo) sólo se puede observar en el tejido cerebral que fue expuesto a anticuerpos primarios y secundarios.
La figura 4 muestra cómo se pueden obtener medidas media y normalizadas de expresión proteica a partir de escaneos de alta resolución en el hipocampo ventral. Utilizando el software de análisis de imágenes, un rectángulo se coloca en la región de interés (capa molecular de CA1) y la intensidad media de la luz de la forma se puede utilizar como una medida de la expresión fluoróforo (figura 4a). A su vez, se trata de una medida de la expresión proteica (es decir, el complejo de anticuerpos de anticuerpo secundario-primario de antígeno). La forma también se puede colocar en una región que exprese una señal alta y una señal baja para obtener una curva normalizada (Figura 4B). En este ejemplo, se colocó un rectángulo a través de la capa molecular de CA1, pero cubrió también los campos dendríticos, que no expresaba cantidades significativas de c-Jun en este ensayo. El área debajo de la curva se puede utilizar como una medida de la expresión proteica. Si la configuración en un experimento involucra grupos de tratamiento (p. ej., exposición al estrés) y un control, se pueden obtener cambios relativos en la expresión proteica en el cerebro.
Figura 1 : Ilustración de la reacción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos primarios (1St) y secundarios (2ND) o simplemente anticuerpo primario. Los círculos negros rellenos representan una etiqueta, que podría ser un agente oxidante como la peroxidasa de rábano picante o un fluoróforo como el boro-dipyrromethene (BODIPY). Los cuadrados verdes representan el antígeno (sobre la proteína de interés) que se detecta en la reacción inmunohistoquímica.
Figura 2 : Imágenes de un ensayo de validación para la detección de c-Jun. En este ensayo, el tejido del mismo animal fue tratado con un anticuerpo primario de conejo que reconoce el anticuerpo secundario de c-Jun y de cabra anticonejo con fluoróforo adjunto con emisión a 780 nm (pseudocolor en verde, panel izquierdo). El tejido adyacente se trató con un anticuerpo secundario solo (panel intermedio) o sin anticuerpo (panel derecho). Barra de escala = 1 mm.
Figura 3 : Ensayo de validación para la reacción inmunohistoquímica de doble etiquetado en la amígdala. Las secciones cerebrales triplicadas de la misma rata fueron expuestas al anticuerpo de conejo que reconoce GluR1 y anticuerpo de ratón que reconoce NR2A (paneles izquierdos), anticuerpos secundarios (paneles del medio) o ningún anticuerpo (paneles de la derecha). GlurR1 se visualizó con el anticuerpo secundario de cabra anti conejo 800CW (780 nm, pseudo coloreado en verde) y NR2A se visualizó utilizando un anticuerpo secundario de cabra antiratón 680RD (680 nm, pseudo coloreado en rojo). Barra de escala = 1 mm. OT = tracto óptico; IC = cápsula interna; EC = cápsula externa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Obtención de medidas semicuantitativas de expresión proteica en el tejido cerebral. (A y B) capturas de pantalla de imágenes puntuadas en el software de análisis de imagen que se utiliza para analizar imágenes desde el escáner. El tejido era del hipocampo ventral y se trataba para visualizar c-Jun. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Los resultados presentados en este artículo muestran que la inmunocitoquímica del infrarrojo cercano en combinación con la exploración de alta resolución se puede utilizar para obtener medidas semicuantitativas de la expresión de la proteína en el tejido cerebral. También se puede utilizar para etiquetar dos proteínas simultáneamente en la misma región del cerebro. Hemos utilizado previamente inmunohistoquímica de infrarrojo cercano para medir la expresión génica temprana inmediata en múltiples regiones cerebrales9,10. Los genes tempranos inmediatos se pueden utilizar como una medida de la actividad neuronal. También sometieron estas medidas semicuantitativas de expresión proteica a análisis estadísticos que nos permitieron agrupar regiones cerebrales con niveles correlacionados de genes tempranos inmediatos (IEGs). Usamos esto como una medida de conectividad funcional para examinar cómo el estrés afecta la conectividad funcional entre los nodos dentro del circuito de miedo durante el aprendizaje emocional y la memoria9,10. Mostramos cómo las proporciones AMPA/NMDA (una firma de aprendizaje y memoria) se pueden medir usando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano con escaneo de alta resolución13. Una técnica similar se puede utilizar para medir el pan y las proteínas de fosfo para determinar la señalización molecular. Esto se logra utilizando Western Blot14. Sin embargo, esto requiere diseccionar las regiones cerebrales de las rebanadas cerebrales gruesas y no es susceptible a las pequeñas regiones cerebrales. Este problema puede eludirse utilizando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano con escaneo de alta resolución. Por último, todas las imágenes inmunocitoquímicas están digitalizadas, lo que permite un almacenamiento ilimitado y un cómodo reanálisis de ensayos previos.
Como con todos los métodos hay inconvenientes. No hay aumento en los escáneres de alta resolución y el tratamiento del tejido no permite fácilmente el sondeo utilizando técnicas microscópicas de fluorescencia. Incluso tomar porciones alternas del cerebro puede no funcionar, ya que la microscopía confocal puede funcionar mejor en el tejido cerebral perfusionado, pero las imágenes de infrarrojo cercano con escaneo de alta resolución se realizan típicamente en cerebros congelados Flash. La expresión de proteínas en neuronas específicas (p. ej., la neurona piramidal) o diferentes tipos de células en el cerebro (p. ej., neuronas frente a la glia) no se puede determinar utilizando inmunocitoquímica de infrarrojo cercano con escaneo de alta resolución. La realización de ensayos de validación es fundamental, ya que sigue siendo un método relativamente nuevo para examinar la expresión proteica en el tejido cerebral.
Cuando se usa apropiadamente, la inmunocitoquímica de infrarrojo cercano con escaneo de alta resolución ofrece ventajas. La autofluorescencia en el tejido cerebral se reduce en el rango infrarrojo cercano, se pueden obtener medidas semicuantitativas de expresión proteica, se puede obtener la expresión de dos proteínas en la misma región del cerebro, y las imágenes del ensayo se pueden almacenar indefinidamente. Cuando se combina con la proteína correcta y/o método estadístico de esta técnica se puede utilizar para examinar la expresión de la proteína, actividad neuronal, señalización molecular, y conectividad funcional dentro del cerebro.
La investigación en este informe fue financiada por una subvención de Target de los NIGMS (1P20GM103653) otorgada a DK.

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