Source: http://www.slideshare.net/mpochoa/manual-de-practicas-instrumentales-y-analiticas
Timestamp: 2015-08-05 13:03:04+00:00

Document:
Het Koken Van Kreeften Met Of Zonde...
Les 2 - MKT (F2A / F2B / L2A / L2B)
Transcript of "Manual de practicas instrumentales y analiticas"
de química analítica II
José Ramón Verde Calvo • Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorantes•Frida Malpica Sánchez
Ramón Verde Calvo es egresado
de la Facultad de Química de la
UNAM, en donde obtuvo su título
de químico farmacéutico biólogo,
tecnólogo en alimentos. Poste-
riormente realizó sus estudios de
maestría en la Facultad de Ciencias
de la UNAM. Actualmente trabaja
en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enología y Ali-
mentos Fermentados, en donde lleva a cabo investiga-
ciones sobre el cambio en el color del vino tinto du-
rante el añejamiento.
María de Lourdes Escamilla Hur-
tado realizó sus estudios de licen-
ciatura en la Facultad de Química
de la UNAM, obteniendo el título
de química farmacéutica bióloga,
orientación en Tecnología de Ali-
mentos. Posteriormente obtuvo su
grado de maestría en la Universi-
dad de Hiroshima, Japón, en el área de Tecnología de
Fermentaciones. Posteriormente se ha desarrollado
profesionalmente como profesora-investigadora en la
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapa-
lapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermen-
taciones lácticas en alimentos indígenas tradicionales,
producción de aromas por fermentación y enología, de
los cuales surgieron diversas publicaciones nacionales
e internacionales. También ha ejercido la docencia, tanto
en la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Química
de la UNAM, formando recursos humanos en los cam-
pos de microbiología y biotecnología alimentaria.
Dr. Luis Miery Terán Casanueva
Dr. Eduardo Carrillo Hoyo
Dr. José LuisArredondo Figueroa
Director de la División de Ciencias Biológicasy de la Salud
Jefe del Departamento de Biotecnología
Casa abierta altiempo
José Ramón Verde Calvo
Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado
Alberto Reyes Dorantes
Frida Malpica Sánchez
guc i
Cuidado de la edición y corrección deestilo:
Ma. Guadalupe Olvera Arellano
Primera impresión: 1999
Av.MichoacányLa Purísima
Iztapalapa, 09340,México,D.F.
ISBN: 970-654-363-5
Impreso y hecho en México / Printed inMéxico
Capítulo 1. CROMATOGRAFÍA DE GASES 11
Práctica1.Análisis cualitativo de cromatografía
de gases (dos columnas) 33
Práctica 2. Factor de respuesta en cromatografía de gases 37
Capítulo 2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA RESOLUCIÓN 43
Práctica3. Cuantificación deunamuestra problema de anisaldehído
(método delpatrón interno) 63
Práctica4.Separación ycuantificación deunamuestra de antocianinas
(método del patrón externo) 69
Capítulo 3.ESPECTROFOTOMETRÍA 75
I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77
Práctica 5. Desarrollo de un método espectrofotométrico 85
Práctica 6. Determinación por espectrofotometría de la
concentración decobalto yníquel enunamezcla 91
II. TURBIDIMETRÍA 95
Práctica7. Cuantificaciónturbidimétrica de sulfates 97
Capítulo 4-MÉTODOS ELECTROQUÍMICOS 103
Práctica8.Determinación potenciométnca de constantes
deionización 113
Práctica9,Titulación potenciométnca del ferrocianuro conceno 117
Elpresente manual tiene como meta apoyar de lamaneramás amplia el curso
teórico-práctico de Química Analítica II,materia que se imparte en el sexto
trimestre delascarreras deingeniería en alimentos e ingenieríabioquímica in-
dustrial. El material está elaborado pensando en el sistema trimestral de la
Universidad Autónoma Metropolitana, hecho que no restringe que cual-
quier curso de química analítica impartido en otra escuela puedautilizar este
En elmanual se abordan temascomo:cromatografía de gasesy de líquidos
de alta resolución, espectrofotometría y potenciometría. Cada capítulo está
estructurado conuna introducción (los fundamentos teóricos necesarios para
comprender lostemas incluidos en lapartepráctica),ypresenta la descripción
de los aparatos autilizar, así como la forma correcta de operarlos.
El texto secompone denueveprácticas,estructuradas con objetivos, intro-
ducción,materialyreactivos,normasyreglasdeseguridad,técnicas,tratamiento
dedatos experimentales, cuestionario ybibliografía. Estaúltima sepresentaal
finaldecadacapítulo eincluyetextosdeautoresreconocidos,asícomorevistas
con artículos actualizados de apoyo a los experimentos.
Para la obtención de mejores resultados, se recomienda relacionar am-
pliamente losconceptosteóricos con las actividades experimentales.
Este capítulotienecomo objetivo mostrar alalumno losfundamentos prácticos
de lacromatografía de gases:cómo funciona un cromatógrafo condetector de
conductividad térmica y cómo se obtiene e interpreta el cromatograma, in-
cluyendo una explicación sobre los cálculos para cuantificar muestras apartir
de compuestos puros.
La cromatografía de gases es la técnica más utilizada entre los métodos
instrumentales de separación, ya que identifica demanera sencillayrápida el
número de componentes de una mezcla. El único requisito para su imple-
mentación es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura ne-
cesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979).
Por sus características analíticas lacromatografía puede ser:
a) Cromatografíacualitativa, que consiste solamente en la separación
de los componentes deuna mezcla.
b) Cromatografía cuantitativa o analítica, que permite identificar y
cuantificar cada uno de los componentes de la mezcla.
De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografía de
gases se divide endos:
a) Cromatografía gas sólido (CGS), también conocida como croma-
tografía de adsorción, en donde la fase estacionaria cuenta con un
material sólido como el sílice granular, laalúmina oelcarbón. El soluto
seadsorbe en la superficie de laspartículas sólidas.Las separaciones se
llevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrio
entre el adsorbente y lasmoléculas de lafase móvil. Silas moléculas de
un componente están estrechamente ligadas al adsorbente, la sustancia
no correrá por la columna ya que es retenida fuertemente por ésta. Si las
moléculas tienen unabaja atracción por el adsorbente,tenderán a moverse
con rapidezjunto con la fase móvil (figura 1.1).
Soluto absorbido en la
superficie de la fase
Figura 1.1 Cromatografía de adsorción.
Latabla siguientemuestra algunos ejemplos decolumnas capilares comer-
ciales,utilizadas en cromatografía gas sólido,mencionando su aplicación
y la temperatura máxima de trabajo.
Tabla 1.1 Columnascapilares comerciales.
HPSoM
Hidrocarburos, gas natural
Alcoholes volátiles en
agua,gases
Compuestos volátiles polares,
Columnas capilares, soporte; A12O3
b) Cromatografía gas líquido (CGL) o cromatografía de reparto, en
donde la fase estacionaria esuna capa delgada deun líquido no volátil,
colocada sobre un soporte sólido (figura 1.2).
Lafase estacionaria forma unapelícula delgada en la superficie deun
soporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y
una fase móvil gaseosa. La cromatografía de reparto o de partición
presentagrandesventajas, comparada conlacromatografía deadsorción:
es mucho más reproducible y,gracias a que el coeficiente de partición
sehace constante enunmargenmásampliodeconcentraciones,permite
que las bandas sean más definidas ymucho más simétricas.
Soluto disuelto en la fase
líquida que recubre la
Figura 1.2 Cromatografía de reparto.
El soporte sólido ideal no debe tener efecto en el proceso
cromatográfico, sólo debe servir como matriz mecánica para la fase
líquida.Elsoportemáscomúneslatierradediatomeas,tambiénconocida
como kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos grupos
oxidrilo libresen su superficie.
Componentes importantes de un cromatógrafo de gases
Uno delospuntos más importantes aconsiderar en lacromatografía degases,
es el grado de separación quepuede lograrse entre diferentes componentes en
una columna dada. Sonvarios los factores quepueden influir en la separación
deseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad deflujodel gas
acarreador, volumen de la muestra ycaída depresión en la columna.
Existen dos diferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares.
En lasprimeras el soporte seencuentra empacado entubos deacero inoxidable
o vidrio, que comúnmente tienen un diámetro de 3 a 6mm y de uno a cinco
metrosdelongitud.Lascolumnas conmayordiámetro sonutilizadasen trabajos
de preparación para obtener una mayor cantidad de compuestos separados.
En las columnas capilares la longitud esmucho mayor, pudiendo llegar hasta
100metros conun diámetro de 0.1 a 0.3 mm. Estasúltimas secaracterizan por
tener un mayor número de platos teóricos, lo que implica mejor resolución,
menor tiempo de análisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidad de
muestra por correr debe ser menor (Harris, 1992).
Se pueden emplear muy diversos soportes sólidos y fases líquidas esta-
cionarias.Laeleccióndepende básicamente delanaturaleza delos compuestos
que sedesean separar (tabla 1.2). Laliteratura informa acercade grancantidad
de soportes sólidos quehanresultado satisfactorios, ydeunnúmero aunmayor
de líquidos para la fase estacionaria. El líquido estacionario debeproducir un
reparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensayo,y
poseer suficiente poder de disolución sobre los componentes en estado vapor.
Por supuesto, el líquido estacionario no hade ser volátil alastemperaturas de
trabajo, pues de otra manera se evaporaría abandonando la columna. Si se
tiene interés por profundizar en estetema, sepueden consultar lostrabajos de
Bens (1961), donde describe algunas propiedades y características de los
soportes ordinarios.Rohrschneider (1971)reportóunaclasificación delas fases
líquidas en función de supolaridad, ypropuso una escala de 0 a 100en laque
el escualeno estomado como ceroy el oxidipropionitrilo como cien.
La temperatura necesaria para efectuar la separación de una mezcla está
determinadapordosfactores: el gradodeseparación queseconsidere suficiente
y el tiempo razonable para el análisis. En general, cuanto más baja es latem-
peraturamayoreslaseparacióndeloscomponentes,ymayortambién eltiempo
deretención deestos últimos enlacolumna. Rowan (1961),aligual queDesty
(1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de la
temperatura en lacromatografía degases.
Lavelocidad deflujodelgasportadorvaríaconcadaanálisisypuedecambiar
para diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en la
cuantificación de la altura equivalente de un plato teórico (AEPT). Para las
columnas empacadas de 0.63 cm de diámetro, se recomiendan flujos de 40 a
100ml/min, que deberán regularse conunaprecisión mayor de 1ml/min.
Los gases portadores que se utilizan con más frecuencia son: nitrógeno,
helio, argón y dióxido de carbono. Su elección se basa, al menos enparte, en
el factor económico, pero un criterio más importante es el tipo de detector
empleado. Para un detector de conductividad térmica, los gases adecuados
son:nitrógeno,hidrógeno,argónyhelio.Elhidrógeno presenta altosvaloresde
conductividad térmica, factor muy importante en ladetección decompuestos,
pero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El helio
también tiene un alto valor de conductividad térmica, pero es un recurso no
renovable yde costo elevado.Encambio,elnitrógeno seutiliza ampliamente
por ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividad
Tabla 1.2 Fases estacionarias líquidas de uso común en
Apienzon L
UCW-982
SE-52 0 SE-54
Dexsii 300
Carbowax20M
Carbowax1500
SilariOC
100% goma de silicona
goma del 99% metil, 1%vinil
100% de metil silicona líquida
fenilo al 5%
Metil carbonato de silicona
Metil fenil silicona al 50%
Metil fenil silicona al 75%
3,3,3-trifluoropropilo al50%
con ácido tereftálico
Cianopropil silicona al 100%
Polaridad*
Iíquido/°C
* I a IV de menor a mayor polaridad.
La muestra líquida se introduce en el cromatógrafo inyectándola con una
jeringa através de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra yel
gasacarreadorlollevaalolargodelacolumna.Lascolumnasanalíticasrequieren
de 0.1 a 10 jal de muestra líquida, mientras que las columnas para trabajo
preparativo llegan autilizar de 20 a 1000jil. Lasmuestras gaseosas requieren
dejeringasconcierrehermético oválvulasdemuestreo degases.Parael trabajo
analítico seutilizanvolúmenesde0.5a 10midegas,yparaelanálisispreparativo
los volúmenespueden aumentar hastaun litro (Harris, 1992).
Detector de conductividad térmica. La capacidad de enfriamiento de un
gas está basada en la facilidad quetiene para transferir el calor que absorbe,
cualidad representadapor suvalor deconductividad térmica.Entre másgrande
sea el valor, la capacidad paratransmitir el calor serámejor. Por lotanto, si se
suministra unacantidad constante deenergíaeléctricaalfilamentodel detector,
sutemperatura estaráenfunción delaconductividad térmicadelgasacarreador.
Conun gaspuro,latemperatura delfilamentoesconstante,pero al presentarse
cambios en la composición del gas, la temperatura varía y se modifica la
resistencia eléctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a los
cambios detemperaturayalacorrosión química.Para sufabricación seemplea
generalmente platino,tungstenoyníquel.
Losfactores que afectan la sensibilidad delosfilamentosson: sugeometría,
lacorriente quepasa através de losmismos, suresistencia yelvalor de lacon-
ductividad térmica del gas.Latabla 1.3 muestra la conductividad térmica de
los gasesyde algunos compuestos utilizados en cromatografía.
Tabla 1.3 Conductividadtérmica.
* unidades de la conductividad térmica cal cnrr2
seg^2
/°C crrr1
Cálculos en cromatografía
Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de cálculos
sencillos para conocer parámetros como laeficiencia de la columna, además,
siaplicamostécnicas deestándares sepuedeconocertambién la concentración
demuestrasproblema.Acontinuación sedesarrollan loscálculosmáscomunes
yútiles en cromatografía.
Número de platos teóricos en una columna (n)
Un plato teórico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribución
de la muestra entre la fase móvil y la fase estacionaria. A mayor número de
platosteóricos, la separación en lacolumna es mejor.
n - número de platos teóricos
t^ = tiempo quetranscurre desde la inyección hasta el centro del pico del
Aw=ancho del pico del componente
tj^yAwseexpresan en lasmismas unidades (tiempo,volumen, distancia, etc.)
Altura equivalente de un plato teórico (AEPT)
Un plato teórico puede considerarse la longitud de columna necesaria para
establecer unequilibrio dedistribución entrelafase estacionaria del solutoyla
fasemóvil.
AEPT = ^
AEPT = altura equivalente deunplato teórico
L= longitud de lacolumna
n = número deplatos teóricos
Cálculo del área de un pico con forma de triángulo
Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una forma
gaussiana.Unmétodosencilloparacalculareláreabajo lacurvaes transformarla
en un triángulo, extrapolando latangente en los puntos de inflexión hacia la
línea dereferencia, como lo indicalafigura1.3.
tr o vr
(parte más j
inclinada de la /
curva) /
tiempo o volumen
Figura 1.3 Cromatograma ideal
Fórmula para calcular el área deuntriángulo:
A b*h
b = longitud de la base
Cálculo de la resolución
Mide la separación entre componentes. La figura 1.4 indica lamanera de medir
ECUACIÓN DE RESOLUCIÓN
Figura 1.4 Resolución entre dos picos cromatográficos.
V -VV
1/2 (Wx + W2)
Vx = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 1
V2 = distancia desde la aplicación hasta el centro del pico 2
FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2
Existen diversos métodos para el cálculo de concentraciones en un sistema
cromatográfico. Loshaysencillos,peropococonfiables,puesnoutilizanninguna
sustancia de referencia, y los hay más elaborados con un mayor grado de
confiabilidad. Estosmétodos son:
2. Calibración absoluta
3. Estándar interno
4. Estándar externo
Normalización o porcentaje por áreas
Con base en el cromatograma de una mezcla separada, esposible determinar
la concentración de cada uno de sus componentes por el área bajo la curva.
Primero hay que medir las áreas individuales de cada pico, sumarlas y, con
base en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentaje es
proporcional alaconcentración delcomponenteenlamezcla, siempreycuando
laconductividad térmica de loscomponentes sea lamisma, omuyparecida,y
que larespuesta del detector de conductividad térmica también sea igual para
todos los componentes. Como esto no esposible en la mayoría de los casos,
serequiere utilizar otros métodos másexactos.
Calibración absoluta
Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia pura
paramedir el áreadelpicoresultante.Enseguida, bajo lasmismas condiciones
decorrimiento cromatográfico, semideeláreadelpicoqueresultedelasustancia
en lamezcla desconocida.
Finalmente, estableciendo una proporción, se puede encontrar la con-
centración de la sustancia desconocida.
Estemétodo sepuedeutilizar dedosformas,paracalcularunfactor derespuesta
o elaborandounacurvaestándarparaencontrar laconcentración deunamuestra
problema. El estándar o patrón interno es aquella sustancia que se inyecta
junto con lao lasmuestrasproblema enuncromatógrafo. Lascondiciones que
esta sustancia debe cumplir son (León, 1982):
• No debe formar parte de la muestra que se desea analizar.
• Tener similitud conlos componentes delproblema.
• Proporcionar por sísolayjuntoconlamuestraproblema,picosbienresueltos
y de buena forma.
• Eluir enuntiempo cercano al de los componentes del problema.
• No debe reaccionar con los componentes de la muestra.
a) FactorderespuestaElmétodo sebasa encalcular elfactor derespuesta
para cada sustancia analizada, yaque losdetectores noresponden dela
misma manera atodos los solutos.Latécnica no esmuy complicaday
consiste enmedir el áreabajo lospicos de cada compuesto, enrelación
con el área de lospicos deun patrón interno. El factor derespuesta está
definido porlarelación:
[P] Ap
[S] = concentración del soluto (cualquier unidad de masa/volumen)
[P] = concentración del patrón (cualquier unidad de masa/volumen)
As = Área del soluto
Ap = Área del patrón
Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el método de
normalización como conel delpatróninterno.
b) Estándar interno con elaboración de curva estándar.En este caso
también se requiere de la adición de un compuesto de concentración
conocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrón (P) y del soluto o
analito (S)paraconstruir unacurvapatrón,como en lafigura1.5. Siuna
cantidad conocida de patrón seagrega auna muestra problema, lacurva
de calibración puede utilizarse para hallar laconcentración delsoluto.
Cuando seuseunestándar interno esrecomendable quela curva de
calibración seelabore cuando menos con tres puntos. Las unidades de
concentración pueden ser moles/litro, g/1,mg/1,porcentuales, etc.
[S] = concentración del soluto hs = altura del soluto
[P]= concentración del patrón hp = altura del patrón
Figura 1.5 Curva para estándares internos.
Esta técnica es menos complicada que el estándar interno, pero requiere de
mayor cuidado durante las separaciones cromatográficas. Las curvas de
calibración con patrones puros son elaboradas con base en varias concen-
traciones.Esimportante cuidarquelosvolúmenes deinyección seanlosmismos
que para los compuestos de interés. Seconstruye una gráfica de área o altura,
en función de la concentración, la cual puede estar en cualquier unidad de
masa/volumen, ya sea molaridad, %p/v,otambién puede utilizarse el %p/p.
La concentración del compuesto desconocido se interpola en el gráfico, con
base en el dato de área o altura del pico correspondiente (figura 1.6).
Figura 1.6 Curva para estándares externos.
Operación del cromatógrafo
Gow-Mac modelo 69-350
Todos los controles de operación del modelo 69-350 están localizados en la
parte frontal del aparato (figura 1.7).
Figura 1.7 Cromatógrafo de gases Gow-Mac.
1. Puerto de inyección para lacolumna "A"
2. Control de ajuste delflujodela columna "A"
3. Control detemperatura del puerto de inyección
4. Control detemperatura del detector
5. Control detemperatura de la columna
6. Sistemaanalógico demedición
7. Selector de medición
8. Control de encendido del cromatógrafo
9. Control de cambio de polaridad
10. Control de encendido del detector
11. Control de ajuste del cero
12. Control de atenuación
13. Control de lacorriente del detector
14. Control de ajuste deflujodela columna"B"
15. Puerto de inyecciónpara lacolumna"B"
16. Tapa delhorno del cromatógrafo
Uso del cromatógrafo
1. Verifique quetodosloscontroles esténapagadosysigalasinstrucciones,
en función de los parámetros a utilizar en cada una de las prácticas de
cromatografía degases.
2. Abra lallavedeltanque quecontiene el gasacarreadoryverifique quela
presión se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2
, en caso de ser menor a
, repórtelo al profesor.
3. La presión de entrada del gas al cromatógrafo debe ser de 30 lb/in2
Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando un
flujómetro deburbuja que tenga una disolución dejabón al 3%.
Flujo del gas del
_ Disolución
Figura 1.8 Medidordeflujo.
Lametodologíaes la siguiente:conecte lamanguera delflujómetroala
salidadelacolumnadondesequiereajustar elflujo.Presioneligeramente
elbulbollenodedisoluciónjabonosa,paraformar lasburbujas queserán
arrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la marca
cero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguiente
Conbaseenelresultadoyutilizando elcontrolcorrespondiente (columna
"A"o "B") ajuste elflujorequerido.
4. Ajuste loscontroles detemperatura ydeinyección (tanto dela columna
como del detector). Fije la corriente de esteúltimo.
5. Verifique que el registrador tengapapel ytinta para un buen funciona-
miento,enciéndaloy seleccione lavelocidad decorrimiento.
Para subuen funcionamiento el cromatógrafo requiere aproximada-
mentede2horasparaqueseestabilice lalíneabase.Durante estetiempo
sepuede preparar la muestra, limpiar lajeringa y ajustar elcero.
6. Ajuste del cero: el atenuador del cromatógrafo debe marcar infinito
(número 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador,
coloque la plumilla donde desee la línea base. Ponga el control de la
atenuación del cromatógrafo en laposición 1.Coloque el atenuador en
la posición 256 yel cero con el control del cromatógrafo.
7. Inyección de lamuestra. Se debetener cuidado al introducir lajeringa,
si ésta es de una capacidad de 5o 10 |il,tanto el émbolo como la aguja
sonmuy delgadas y sedoblan fácilmente. Debe colocarse lajeringa en
posición perpendicular conrespecto alcromatógrafo eintroducirla enel
puerto de inyección de la columna. Efectuar la inyección con fuerza,
para asegurar que lamuestra entre en la columna.
Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringa
cuando menos cincoveces con el disolvente adecuado.Debe limpiarse
inmediatamente después deusarla,paraprevenir quelamuestra seseque
yqueden residuos en lajeringa oel émbolo.
8. Si lospicos delamuestra se salen deescala, incremente laatenuacióny
corra nuevamente su sistema.
9. Unavezterminado eltrabajo cromatografía) disminuyalas temperaturas
de lacolumna, inyector ydetector,yapague lacorriente de esteúltimo.
Cuidequeelflujodelgascontinúehastaquelatemperaturadelacolumna
descienda hasta 50 °C o menos. Cierre él paso del gas acarreador y
limpie lajeringa.
Precauciones en el manejo del detector de conductividad térmica
a) Para evitar que se queme elfilamentodel detector, verifique que el gas
acarreador fluya a través del cromatógrafo, antes de encender el
b) Apagar la corriente delfilamento,antes de abrir el sistema,para evitar
que éste se oxide.
c) Lavelocidad deflujodel gas portador debe permanecer constante.
Metodología para las prácticas de química analítica II
1. Losalumnosdebencubrirtotalmente lasnueveprácticasdeestemanual.
2. Cada alumno debe elaborar una bitácora, en la cual, además de anotar
todas lasobservaciones delaprácticaencuestión,realizará lassiguientes
• Dibujar un diagrama de bloques de la práctica que seva a realizar.
• Anotar laspropiedadesfísicas,químicasytóxicas de cadauno delos
reactivos mencionados en el protocolo de lapráctica (investigados
previamente enlabiblioteca).
• Realizar loscálculosnecesariosparalapreparacióndelasdisoluciones
mencionadas enlapráctica,tomando comobase 100midedisolución.
con sustancias químicas*
1. Al manipular sustancias corrosivas será obligatorio el uso de equipo
2. La transferencia de líquidos, especialmente los corrosivos otóxicos,
debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamente
prohibido usar las pipetas succionando con laboca.
3. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentamente o al
calentar líquidos entubos de ensayo ofrascos, la cara deberá apartarse
para que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usar
anteojos protectores o careta de plástico.
4. Nunca vierta agua sobre ácido sulfúrico concentrado.
5. Todas las operaciones con sustancias volátiles deberán hacerse en la
6. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia química.
7. Lassustancias susceptiblesdegenerarperóxidos (THF,éter,etc.)deberán
serverificadas periódicamente.
* Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extraídas del Instructivo sobre
elfuncionamiento internoy operativopara regular el uso de losservicios einstalaciones
de los laboratorios de docencia de la UAM, aprobado por el Consejo Académico en su
sesión 133.
Análisis cualitativo de cromatografía de gases
Conocer yutilizar la cromatografía de gases eshoy en díaun aspecto primor-
dial, tanto en la industria como en el campo científico. La elaboración de
productos alimenticios ofarmacéuticos necesita deunbuencontrol decalidad,
ymuchas delastécnicasutilizadasparaestorequieren delaprecisión delanálisis
Uno de los primeros problemas en cromatografía es la selección de la fase
estacionaria otipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de fases
líquidas disponibles paralacromatografía dereparto gas-líquido.Pararesolver
este problema es necesario considerar que un soporte polar retendrá más
fuertemente un soluto polary que,por lotanto,las sustanciasmenos polares
saldrán con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retención
En estapráctica secorrobora tal criterio,ya que son separados compuestos
de diferente polaridad corriéndolos enuna columna polar como la Carbowax
20M.Posteriormente seefectúa lamismaseparación,peroutilizandolacolumna
DC-200 no polar.
El alumno aprenderá autilizar el cromatógrafo de gases Gow-Mac, modelo
69-350, para el análisis cualitativo de mezclas y observará la diferencia de
separar unamismamuestra en dos columnas de diferente polaridad.
Manual de prácticas de química analítica Ií
• Medidor deflujo deburbuja
• Jeringa para cromatografía de gases de 50mi
• 5tubos de ensayo de 10x 150 mm con tapón de baquelita
• 5vasos deprecipitados de 50 mi
5 pipetas volumétricas de 1mi
• n-pentano
• 2-butanona
En laparte teórica de este capítulo se encuentran las instrucciones deope-
ración del cromatógrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p.27).
Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilice
propipetas para hacer la mezcla. Asegúrese de que no haya mecheros
prendidos y coloque letreros para indicar que está trabajando con
Cuando trabaje con el cromatógrafo, asegúrese de que se encuentre
presente elprofesor del laboratorio,quien leayudaráybrindará asesoría
sobre el buen manejo del equipo.
1. Mezcleunmililitrodecadaunodelossiguientesdisolventes:n-heptano,
tetrahidrofurano, 2-butanona yn-propanol. Guarde lamezcla enunre-
cipiente cerrado.
2. Las condiciones del cromatógrafo deben ser las siguientes:
Corriente del detector
200 mA (si el gas es helio)
100 mA (si el gas es nitrógeno)
3. Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de ca-
lentamientoprevio,conelfindeestabilizar latemperaturadelacolumna,
el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todo
esto serefleje en una línea base estable.
4. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor de
burbuja como se indica en la figura 1.8.
5. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4y
ponga a funcionar el graficador auna velocidad de 2.5 cm/min.
6. Conunajeringa de 50 fil, mida 3 ú den-heptano yadicione otros 10 |Lil
de aire.Inyéctelos en la columnayenjuague lajeringa.
7. Marque el punto de inyección en la carta, así como la información
relacionada con lamuestra inyectada.
8. El primer pico que debe eluir es elpico de aire, seguido por el pico del
9. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por último,
inyecte lamezcla de losdisolventes.
10. Bajolasmismascondiciones detrabajo,repitatodoelproceso utilizando
lacolumnaDC-200.Cambie lapolaridad del sistemaparaquelospicos
salgan enelmismo sentido que conlacolumna polar.
• Midaytabule todos lostiempos yvolúmenes deretención detodas las
• Con la ayuda de los tiempos de retención de las sustancias puras,
identifique los componentes de lamezcla en los cromatogramas de las
doscolumnas.
Calcule el número de platos teóricos "n" y AEPT para cada columna,
utilizando losdatos deln-heptano.
Calcule elporcentaje de cada componente de lasmezclas,utilizando el
método de normalización (por áreas).
¿En qué se basa la cromatografía de gases?
¿Cómo puede medirse laeficiencia deuna columna?
¿Qué seentiendeporcromatografía líquido-líquido ycromatografía gas-
¿Quéventajas tienelaprogramación detemperatura enla cromatografía
de gases? ¿Se puede hacer esta programación en un cromatógrafo de
gases con detector de conductividad térmica? Justifique su respuesta.
Explique cuáles sonlasventajas ydesventajas delascolumnas capilares
y las columnas empacadas.
Conbaseenlossiguientesdatos,obtenidosconelempleodeunacolumna
deftalatode dodecilo, realice los ejercicios que se piden.
Acetilcetona
Vr(ml)
a) Calcular elnúmero deplatosteóricos"n"yAEPTparacadacompuesto.
b) Calcular el porcentaje de cada componente, utilizando el método de
Factor de respuesta en cromatografía de gases
El uso de estándares internos es necesario en el análisis cuantitativo. La
sensibilidad delosdetectoresdeconductividad térmicadifiere deuncompuesto
a otro, ya que depende de la conductividad térmica del analito. A menor
conductividad térmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada de
compuesto. Por lo tanto, debe medirse unfactor de respuesta empírico para
cada sustancia que se somete aun análisis cuantitativo. El factor de respuesta
F está definido por larelación:
[P] ApJ
El alumno efectuará el análisis de cromatografía de gases para conocer el
factor de respuesta con el n-heptano, empleando como estándar interno al
Jeringa para cromatografía de gases de 50mi
2 tubos de ensayo de 10x 150 mm con tapón de baquelita
2 vasos de precipitados de 50 mi
2 pipetas volumétricas de 1mi
Los compuestos atrabajar sonmuyvolátiles yflamables,trabaje enun
área ventilada ylejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas de
seguridad de lapráctica 1.
1. Prepareentubodeensayounadisoluciónestándar,mezclandounmililitro
de n-heptano con otro de n-pentano.
2. Ajuste lascondiciones del cromatógrafo conbaseenlossiguientesdatos:
Velocidad de la carta
2.5 cm/min.
3. Verifique que la líneabase seencuentre estable.
4. Inyecte 3 (il de la disolución estándar, repitapor triplicado.
5. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3 ú9 repita por
Midaytabule todos lostiempos yvolúmenes deretención detodas las
Conbaseenlasáreasyconcentraciones deladisoluciónpatrón, calcular
el factor derespuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano como
estándar interno.
Calcularlaconcentracióndeln-heptanoenlamuestraproblema,utilizando
el factor derespuesta y las áreas del segundo grupo de cromatogramas.
1. Explicar qué se entiende por factor de respuesta.
2. Esta técnica para el cálculo del factor ¿se puede utilizar con otros
detectores como eldeionizacióndeflamaoeldecapturade electrones?
3. ¿Cómo seseleccionan lastemperaturas para el inyector, lacolumnayel
4. Problema: Para la cuantificación de una muestra comercial del
antimicrobianometilparabeno,seutilizólatécnicadelfactor derespuesta
usando elpropilparabeno como estándar interno. Secorrieron lasmues-
tras enun cromatógrafo con detector de ionización deflama,columna
capilar BP5 conpelícula de 0.5 |Lim,temperatura inicial de 160°Cyun
gradiente de 15 °C/min. La temperatura final fue de 280 °C. Para el
cálculo delfactor seutilizaron 0.98mmoldemetilparabenoy0.75mmol
depropilparabeno. Seobtuvieron lassiguientes alturasrespectivas: 180
y 165mm.
Una segunda corrida cromatográfica es utilizada para cuantificar la
muestra comercial. Se mezcla el problema con 1.2 mmol de propil
parabeno.Lasalturasresultantes fueron 150mmparaelmetily 160mm
para el propil parabeno. Calcular la concentración del metil parabeno
en lamuestra comercial.
Baugh, P. J. (editor). 1993. Gas Chromatography A Praetical Approach.
IRL Press, Gran Bretaña.
Bens, E. 1961."Adsorption Characteristics of Some Gas-Liquid Chromato-
graphic Supports."Anal Chem.,33:178, California.
Brewer, S. 1987.Solución deproblemas de química analítica. Ed. Limusa,
Ewing, G. W. 1979.Métodos instrumentalesde análisis químicos. Ed. Me
GrawHill,México.
Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965.Advances in Chromatography.
Vol. 1:199, USA.
Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1971.Advances in Chromatography.
Vol. 4:333, USA.
Harris, D. C. 1992. Análisis químico cuantitativo. Grupo Editorial
Iberoamérica, México.
Meloan, C. F. y R. M. Kiser. 1973.Problemasy experimentos en análisis
instrumental.Ed. Reverte, México.
Miller, J. M. y R. L. Harmon. 1978. Elementary Theory ofGas Croma-
tography. Gow-Mac Instrument Co.,USA.
s Manual Gas Chromatograph,Model 69-350.1989. Gow Mac
Instrument Co.,USA.
Pecsok, R. L. 1981.Métodos modernos de análisis químico. Ed. Limusa,
Rowan, R. Jr. 1961."Prediction of Retention Temperatures in Programmed
Temperature Gas Chromatography. A Descriptive Equation and Com-
putacional Method."Anal. Chem.,33:510-515,Nueva Jersey.
Storch de García y Asensio, J. M. 1975.Fundamentos de lacromatografía
degases. Alhambra, España.
La cromatografía de líquidos de alta resolución en los pasados diez años ha
incrementado suimportancia en muchas delas áreas del análisis,tanto anivel
investigación como anivel industrial. Muchasde lastécnicas decontrol deca-
lidad de fármacos, alimentos,aditivos ycontaminantes yase están efectuando
conHPLC.
Hace más de 80años que seconoce la cromatografía delíquidos,pero sólo
a partir de 1967 los avances tecnológicos permitieron desarrollar un proceso
cromatográfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ninguna
manera sustituye a lacromatografía de gases, sólo esun complemento parael
análisis decomponentes quenotoleranunafase móvil gaseosa otemperaturas
muyelevadas.Dehecho,presentalassiguientesventajasfrenteala cromatografía
degases:
• Tieneunadifusión mínimaenlafasemóvil,debidoalarapidezdelanálisis.
• No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente serealiza a
temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas a
temperaturas menores de 100°C.
• La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uso
La cromatografía de líquidos es una técnica de separación que utiliza una
fase móvil líquida, es ideal para la separación de macromoléculas de interés
biológico y de compuestos iónicos,ya queno depende de lavolatilidad oes-
tabilidad térmica delos componentes. Sepuede utilizarpara separarproteínas,
aminoácidos, lípidos,ácidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales sonel
análisis de pesticidas, aceites, polímeros, antioxidantes, análisis de agua,
contaminantes, sabores,colorantes, etc.La cromatografía de líquidos sebasa
en la solubilidad de los compuestos:hayqueescoger el disolvente o lamezcla
dedisolventesapropiadosparallevar alamuestraatravésdel sistema,también
hay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o mayor
medida enla fase estacionaria yque gracias alas altas presiones con lasquese
mueve lafase móvil,sepuedeobtenerunarápidaseparacióndeloscomponentes
deunamezcla.
Lacromatografía delíquidos sepuedeclasificar encuatrotipos,dependiendo
de suuso:
Cromatografía de líquido-sólido
En este caso, la separación depende de la afinidad de lamuestra hacia la fase
sólida olíquida. Silamuestra esmuy afín alafase estacionaria (compuestapor
partículas sólidas pequeñas) el tiempo de retención será mayor. El solvente
utilizado se conoce como eluyente ytambién influye demanera importante en
laseparación: silamuestraesmásafín alafase líquida,lostiemposderetención
serán más cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes según su
capacidad para eluir solutos.
La selección de la fase móvil influye directamente en la separación de las
muestras. Los solventes pueden ser denaturaleza orgánica o acuosa. Existen
muchas características que debe tener una buena fase móvil, entre las más
importantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolver la
muestra, serdebaja viscosidady,unavezterminadalaseparación,debepermitir
la recuperación del soluto demanera simple (Watty, 1989).
En la cromatografía líquido-sólido existen dos subdivisiones que están en
función de suconformación: lafase normalylafase inversa.
Para l^fase normalserequiere de una fase estacionaria polar, por lotanto,
la fase móvil debe ser no polar. Los empaques que sepueden utilizar en fase
normal son diol, sílicayamino,entreotros.
En difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase móvil po-
lar. Los empaques más comunes para la fase reversa son: ODS (C18),octyl,
dimetil,etc.
Otra variación de este tipo de cromatografía se conoce comofase ligada
(bondedphase), que consiste en enlazar con el soporte de sílica compuestos
que aumenten su carácter no polar (C2,C6,C8, Clg). En función del tamaño de
lacadena dehidrocarburos que sehayaunido, lostiempos deretención delos
solutos que eluyan en estas columnas,tenderán a aumentar, pues seretendrán
Tabla 2.1 Lista dedisolventes.
onda de corte nm
agua % p/p
Consiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encuen-
tran disueltos en la fase móvil. Aniones como el sulfito -SO3~ o cationes
[N-(CH3*)3
] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones de
soluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atraídos por fuerzas
electrostáticas (la fase móvil es un líquido, figura 2.1). Se puede efectuar
cromatografía de intercambio iónico no solamente enHPLC,sinotambién en
capafina,en columna yen papel impregnado deresina. En estemétodo lase-
paración depende de las variables: fuerza iónica, capacidad de carga de la
columna ydel pH durante elproceso de separación. Elprocedimiento deriva
de lacromatografía delíquido-sólido,yseutilizaenlaseparación deaminoáci-
dos, en análisis de trazas, en la separación de metales por formación de
Lasresinasutilizadas enlascolumnaspuedenestaronopolimerizadas.Enel
mercado existenresinas intercambiadoras catiónicas,tipo ácido fuerte odébil,
e intercambiadores amónicos tipo base fuerte o débil. También hay geles de
intercambio iónico,queseutilizanpara separar moléculaspequeñas conpesos
moleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnas de
intercambio iónicocomerciales,mencionando eltipodeionesquepuederetener,
el pH detrabajo y lapresión máxima a la quepueden serutilizadas.
Aniones móviles
mantenidos cerca de
los cationes unidos
covalentemente a la
Figura 2.1 Cromatografía de intercambio iónico (resina de intercambio
aniónico, sólo los aniones pueden ser atraídos hacia ella).
Tabla 2.2 Columnaspara HPLC de intercambioiónico.
Syn Chropac SAX
Fuertemente aniónica
Syn Chropac WAX
Débilmente aniónica
Syn Chropac SCX
Fuertemente catiónica
TSKcatiónica
Conestemétodo lasmoléculas se separanpor sutamañoyconformación: siel
peso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molécula es
globular, laretención serámayor, comparada conunamolécula depeso supe-
rior al de la capacidad del gel o con una molécula de conformación irregular
(figura 2.2).Lasaplicaciones deestatécnica sonamplias,yaquepermite separar
muestras conpesos moleculares entre 700y más de 150millones, particular-
mente aquellas de interés bioquímico. También es muy utilizada para la
separación depolímeros (tabla2.3).Los soportes utilizados pueden serdegel
de sílice unido a compuestos que aumentan su carácter hidrofílico, como las
columnas Biosep-SEC-S;opueden serpolímeros como losdelaseriePolysep-
GFC-P (poliestireno,polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.).En
el mercado de lacromatografía deexclusión molecular existeun grannúmero
de columnas quepermiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento que se
requiera (Phenomenex, 1994).
penetran el gel
Figura 2.2 Cromatografía de exclusión molecular.
Tabla 2.3 Columnas comercialespara la exclusión molecular.
Styagel HR 0.5
Styagel HT 4
Styagel HMW7
Rango PM
0 a 1 000
5 000 a 600 000
500 000 a 1x108
Aditivos, fenoles, epóxidos, urea
PM intermedio
PM alto
Sebasa enla interacción específica que existe entre un soluto deunamezclay
un sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columna. Las
interacciones están relacionadas más con lascaracterísticas estructurales que
con la carga, tamaño, solubilidad u otras propiedades que se aprovechan en
otrostipos decromatografía. Ejemplos deaplicaciones sonlarelación sustrato
enzima y larelación antígeno anticuerpo (DayyUnderwood, 1989).
Una mayor fuente de información sobre los métodos cromatográficos se
puede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992;Pecsok, 1981.
Operación del cromatógrafo de
alta resolución (HPLC)
El HPLC constadecuatropartes:el sistemadebombas encargado demantener
constante elflujodelafase móvil;elsistemadeinyecciónquepermiteintroducir
lamuestraatrabajar;lacolumnaquetienelafunción deseparar loscomponentes
de la muestra y el sistema de detección de los solutos eluidos, el cual manda
una señal al sistema deregistro.
Este sistema es un componente importante del cromatógrafo de líquidos, el
cual requiere de una bomba de alta presión, comúnmente de un máximo de
6 000psi.Lapresión esnecesariapara mover laspartículas del soluto entre la
fase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografía de líquidos
debe tenerunflujocontinuo y libre depulsaciones.
Existen dostipos de sistemas deelución:uno donde eldisolvente no cambia
de composición durante el proceso de aislamiento, conocido como elución
¡socrática, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separación de
los componentes enuna mezcla (elución porgradiente).
Lasbombasconpistonessincronizados sonlasmásempleadasenlossistemas
deHPLC.Un pistón siemprebombea disolvente,mientras el otro se llena.Es-
te arregloproporciona unflujorelativamente libre depulsos opulsaciones.
Pueden evitarsemuchosproblemas conlasbombas sisecuidanlossolventes
utilizados:nodebentenerunpHmuybajo ni formar precipitados con facilidad.
Encolumnasconvencionales de 5mm dediámetro internoyconflujosentre
1y2ml/min, pueden resultar presiones de400bar,dependiendo de la longitud
de la columna, eltamaño departícula yel disolvente.
El sistema de bombas debe de mantenerse en óptimas condiciones si se
quieretener reproducibilidad en las corridas cromatográficas.
Figura 2.3 Control del sistema de bombas del HPLC
Figura 2.4 Sistema de bombas del HPLC
Operacióndel sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4):
Se enciende el aparato con el botón rojo de laparte inferior derecha (número
8 de lafigura2.4).Laparte frontal consta de (figura 2.3):
1. Pantalla digital para conocer lapresión del sistema, lacual está dadaen
librasporpulgada cuadrada (psi).Elnúmero que aparece en lapantalla
debe multiplicarse por 10,a fin de obtener lapresión verdadera.
2. Botones quefijan la presión mínima y máxima de trabajo durante el
proceso de separación. Se recomienda establecer la presión baja en
ceropsiy lamáxima en 3 500psi.Elvalor máximo depende deltipo de
columna autilizarydelaviscosidad del disolvente omezcla deellos.Si
durante el proceso de separación la presión del sistema rebasa estos
valores, el sistema debombas seapaga automáticamente.
3. Standby. Permite que el motor se apague y el sistema eléctrico siga
4. Reset.Botónquereenciende lasbombasyrestablece elflujoylapresión
5. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo del
sistema tiende acero.
6. Control deflujo.Consta detres diales rotatorios individuales ypermite
preseleccionar elflujodel sistemaenml/min.Elflujodebe incrementarse
poco a poco (de décima de mi en décima de mi). Una lectura de 070
indicaunflujode0.70 ml/min.
7. Válvula depurga. Permite lapurgahidráulica del sistema.
8. Botón de encendido o apagado.
Sistema de detección de solutos eluidos
Existendiferentes tiposdedetectoresutilizados enlacromatografía delíquidos,
loshay defluorescencia,índice derefracción, conductividad eléctrica, deUV-
visible, arreglo de diodos,etc.
El tipo UV-visible es el más ampliamente distribuido como detector en
HPLC,lamayoríadeloscompuestostienen cuandomenos alguna absorbancia
en las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de estas
Figura 2.5 Control del sistema de detección de solutos eluidos.
Figura 2.6 Detector UV-visible.
determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, lacual relaciona la
absorbancia del soluto con su concentración (c, en moles/1)y la longitud del
paso del haz de luz (b):A = 8be.
Los detectores delosequipos actualestienenunamayorflexibilidadquelos
espectros comunes,yaquepuedenreportar valoresmenores de0.001 unidades
Operación del sistema de detección
Se enciende el aparato con el botón rojo de laparte inferior derecha. Laparte
frontal (figuras 2.5 y2.6) constade:
1. Pantalla. Permite leer hasta diezmilésimas deunidades de absorbancia.
2. Botón depolaridad. Sirvepara cambiar la señal de salida del sistemade
3. Botón de corte (short switch). Conecta o desconecta las terminales
positiva ynegativanulificando la señal del integrador oregistrador. Este
efecto eslomismoquesisemandaraunaseñaldecerovoltsalregistrador,
permitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho enel
registrador o integrador.
4. Mark. Este botón permite producir una marca en la carta y se utiliza
generalmente para indicar el momento de lainyección de lamuestra.
5. Auto cero.Estebotónpermite definir lalíneabaseytieneunintervalode
± 0.7 UA (unidades deabsorbancia).Cuando lalámparaparpadea indica
que la señal de salida de la línea base excede el intervalo detrabajo del
6. Pantalla indicadora de la longitud deonda seleccionada.
7. Control de selección de longitud deonda. Ajusta la longitud de ondade
trabajo entre 190y 700 nm con incrementos de 0.2 nm.
8. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS,Absorbance Units Full
Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan la
sensibilidad de lasunidades de absorbancia.
9. Botón de control. Consta de seisposiciones que sepueden seleccionar
yobservar en lapantalla:
SE {Sample Energy).La pantalla reporta la energía UV de la celda
de lamuestra problema.
RE (Reference Energy). Reporta la energía UV de la celda de
AU (Absorbance Units).Se observan la unidades de absorbancia
presentes enlamuestra problema.
Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato toma
• DLV(Deuterium Lamp Voltage). Reporta el voltaje de la lámpara
de deuterio.
DLC{Deuterium LampCurrent). Reporta lacorriente del filamento
de lalámpara enmiliamperios, una lectura de 300 es idealy de285
a 315 es aceptable.
10. Tiempoderespuesta. Soncincoposicionesqueseleccionanlos diferentes
• 0.05 sea, respuesta rápida que provoca picos angostos y mucho
ruido en la líneabase.
• 0.10 sea, respuesta rápida con ruido ligeramente menor que la
• 0.50 sea, másrápidaquelarespuestanormalyconruido ligeramente
mayor de lonormal.
• 1.00 sea, respuesta normal con picos angostos y una cantidad
pequeña deruido.
• 5.00 sea, respuesta lentaparauna supresión máxima delruido.
Operación del integrador SP4400
Es un equipo que permite interpretar la señal mostrando no sólo el croma-
tograma, sino también un reporte completo con lostiempos deretención, las
áreasy susporcentajes. Siserequiere,tambiénproporciona información sobre
las condiciones bajo las cuales se corrió el sistema y cuenta con programas
para hacer cálculos con patrones externos e internos (figura 2.7).
Figura 2.7 Integrador
Figura 2.8 Vistaparcial del teclado delintegrador.
Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentran los
métodos numéricos que permiten realizar diferentes tipos de cálculos, como
a) Método numérico cero:MN =0. Es un método de porciento de área
usado cuando los resultados de concentración no son necesarios. Este
método noutiliza factores derespuesta del detector y deestamanerano
requiere de calibración. Una vez que el diálogo de rutina termina, se
selecciona el método en el reporte, el cual incluye todos los picos del
cromatograma identificados por orden de elución. Los nombres de los
componentes no son generalmenteutilizados.
b) Método numéricouno:MN =1.Es el más utilizado en cromatografía
de gases,enparticular cuandotodos los componentes de lamuestra son
conocidos. Es muy similar al método cero, con excepción de que las
áreas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuesta,
calculados previamente en una corrida con sustancias patrón de con-
centración conocida.
c) Método numéricodos:MN = 2. Requiere la utilización de estándares
internosparacuantificar demaneraexactaloscomponentesdeunamezcla.
Es deuso común en análisis de compuestos farmacéuticos, aditivosali-
mentarios,etc.Laconcentración delestándarinternodebe serligeramente
mayor,pero nopasar deunfactor de 10,conrespecto alos componentes
de interés enuna mezcla.
Descripción del teclado (figura 2.8)
Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrás.
LCDstatus:Presenta un cuadro enpantalla donde indica el canal(C/z),
archivo (FI número de inyecciones en ese archivo (Biri), la velocidad
de la carta (Cs),atenuación (Atteri), tiempo de corrimiento (Runtime),
nivel (Level)y capacidad de memoria.
Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar la
inyección enlacolumna"A".
Shiftinj/endA:Detiene eldesarrollo del cromatograma sindar elreporte
Aítem Se usa para verificar la atenuación en cualquier momento del
proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen en la pantalla
losvalores numéricos válidos para cambiarla. Entre paréntesis aparece
elvalor que seestáutilizando.
Chartspeed: Seutilizaparaverificar lavelocidad delacartaencualquier
momento del proceso cromatográfico. Cuando se presiona, aparecen
en la pantalla los valores numéricos válidos para cambiarla. Entre
paréntesis aparece el valor que se está utilizando. Se recomienda usar
velocidad 2 para cromatogramas con pocos picos y 2 o 4 para
cromatogramasricosenpicos.
PTeval: No debe utilizarsedurante la corrida.Normalmente se ob-
serva suvalor antes deinyectar nuevamente lamuestra, yaqueunvalor
menor a250indicaqueyanohayresiduos de solutodel análisis anterior
pasando por el detector.
Metodología para el manejo del HPLC
1. Preparación del disolvente y la muestra a analizar. Ambos deben ser
filtrados enmembranas de 0.4 |um,paraevitar quelasimpurezas entren
y contaminen lacolumna. El disolvente debe ser gradoHPLC.
2. Revisar que el sistema de entrada y salida de los disolventes estén
sumergidos en susrespectivos recipientes.
3. Encender el sistema de bombas (número 8de lafigura2.4).
4. Ajustar el flujo oprimiendo los botones respectivos (número 6 de la
figura2.3) del sistema debombas.
5. Seleccione lalongitud deondaconbaseenelsistemaaseparar,moviendo
el dial correspondiente (número 7 de la figura 2.6). Al igual que el
cromatógrafo degases,elHPLCrequieredeuntiempo (20a 30minutos)
para que se estabilicen las condiciones de trabajo.
6. Encender elintegrador y ajustar lavelocidad de lacartay la atenuación,
presionando primero latecla Chartspeeddel teclado del integrador y
posteriormente la tecla Atten (figura 2.8). Se puede elegir entre una
serie de valores que van desde 0.5 hasta 4 096 en incrementos
geométricos para la atenuación. Si en una primera corrida los picos
rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuación al
valor próximo, demanera que lospicos reduzcan a lamitad sutamaño
(siemprey cuando seutilicen lasmismas condiciones de separación).
7. Verifique el valor del PT evaluation: debe ser como máximo de250.
8. Inyecte lamuestra conunajeringa de 50 jalcon aguja sin punta, mida
la cantidad establecida en el manual deprácticas de lamuestra acorrer
e introduzca lajeringa en la válvula de inyección. El mecanismo de
inyección de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: carga y
descarga. Presione el émbolo para que la muestra pase a latubería de
acceso (loop).Mueva la palanca a laposición de descarga para que la
muestra sea llevada a la columna, el líquido contenido en el loopserá
desplazado hacialacolumna. Elmovimiento debe serrápidoparaevitar
una caída brusca de presión que desconecte el sistema de bombas.
Posteriormente oprima latecla inj/endA del integrador.
Terminado eltiempodecorrimiento vuelvaapresionar latecla inj/end
A, el integrador le dará un reporte completo de su sistema separado.
Jeringuilla I
Figura 2.9 Válvula de inyección para cromatógrafo de líquidos de alta
Cuantificación de una muestra problema de
anisaldehído (método del patrón interno)
Elfuncionamiento deuncomatógrafo dealtaresoluciónempiezaconelsistema
de bombas de alta presión, el cual impulsa el disolvente a través de todo el
sistema.Lamuestra esinyectadapormedio deunamicrojeringa,elvolumenes
de unos cuantos microlitros para que laresolución de lospicos seabuena yla
separación sea más rápida. Una vez en la columna, se realiza la interacción
soporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separación de los componentes
de la muestra. El detector está compuesto por una microcelda en forma de
"Z", atravésdelacualfluyeladisolución; esexcelenteparaqueloscompuestos
no se mezclen y el flujo searápido. Por último, en el integrador, la absorban-
cia es convertida en señal eléctrica y así esreproducida como cromatograma.
En la cromatografía de líquidos departición existen dos grupos de trabajo,
el más frecuente se conoce como cromatografía de fase inversa, en ella la
fase estacionaria tiene un carácter nopolar y se eluye conun disolvente polar.
El segundo grupo es la cromatografía defase normal que utiliza un soporte
polaryun disolvente no polar. El sistema de elución puede ser isocrático opor
gradienteyeldetector máscomúneseluv-visible, aunquetambién esutilizado
el deíndice de refracción.
Lacuantificación deunamuestraproblemapormediodeunestándarinterno
se puede efectuar con la elaboración de una curva estándar, la cual debe ser
hechamínimo contrespuntos.Enel laboratorio sedebetener especial cuidado
sobre las condiciones de separación, en cuanto avolumen inyectado,flujoy
composición delafase móvil.Lacurvasedesarrollará enfunción delarelación
de alturas oáreas delospicosdel compuesto entrelasdelestándar (vercapítulo
1: Cálculos en cromatografía). En las abscisas se coloca la relación de la
concentración del soluto entre la concentración de la sustancia patrón. La
concentración de lamuestra problema se interpola de la curva patrón.
El alumno aprenderá autilizar el cromatógrafo de líquidos de alta resolución
para cuantificar unamuestra problema de anisaldehído, utilizando el método
del patrón interno.
Columna Spherisorb ODS C]810 mm
Filtros deteflón de 0.4 mm
Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC
5 frascos viales de 5mi con tapa
Muestraproblema con anisaldehído
Alpreparar lamezclaacetonitriloaguayacetonitrilotoluenodebehacerlo
en la campana de extracción.
Revise su bitácora para recordar que el acetonitrilo es venenoso yfla-
mable,quedebeevitarrespirar susvaporesyquepuedecausar irritación
enlapiel.
Cuantificación de una muestra problema de anisaldehído
1. Las condiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser las si-
Columna Spherisorb
10ODS10jim
acetonitrilo/agua (50:50)
Prendayacondicioneelcromatógrafo dejando queelsistemaseestabilice.
Prepare las siguientes mezclas de anisaldehído ytolueno:
Filtre por membranas de 0.4 jom: a) Lamezcla de acetonitrilo agua,b)
cada una de las mezclas patrón y c) lamuestra problema.
Solicite alprofesor lamuestraproblemaquecontiene 0.05 Mdetolueno
como estándar interno,mida 2 |il einyéctelos.
Repitaportriplicado la determinación.
Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrón externo,
elabore una curva patrón como laque se muestra en lafigura2.10.
ALTURA P
[SOLUTO S]
[SOLUTO P]
Figura 2.10 Curva patrón.
La concentración de la muestra problema se calcula a partir de sustituir
el valor de la altura del anisaldehído (altura S) en la mezcla problema en
La altura "P"es la altura del tolueno, el valor de esta relación se interpola
en la curva patrón y el valor de la gráfica es sustituido en la siguiente
relación, para obtener laconcentración del soluto de lamuestra problema:
SOLUTO S
SOLUTO P
1. Mencione tres diferencias, en cuanto a suaplicación, entre la cromatografía
degasesyelHPLC.
2. Describa los cuidados experimentales que se deben tener para: a) los
disolventes a utilizar como fase móvil, b) la muestra problema a separar
o cuantificar.
Cuantifícación de una muestra problema de anisaldehído
Indique usted qué fase estacionaria, quéfase móvil yquédetector serían
losindicadosparaefectuar unabuenaseparacióndelassiguientesmezclas:
a) de carbohidratos, b) de aminoácidos y c) de proteínas.
Para conocer elcontenido de anfetamina enunpreparado farmacéutico
comercial,seutilizacomoestándarinternolametanfetamina yse efectúan
tres corridas cromatográficas. Con base en estos datos construya una
curva patrón y calcule la concentración de una muestra problema de
anfetamina quedio una altura de 123mm.
Conc.= concentración en mM.
Separación y cuantificación de una muestra de
antocianinas (método del patrón externo)
La cromatografía de líquidos de altaresolución ha tenido un gran auge en los
últimos 20años,sehautilizado comotécnicaparaseparar,identificar ypreparar
sustancias en muchas áreas. Actualmente estos equipos se combinan con el
banco dememoria de una computadora, lo que ofrece unamayor facilidad en
laidentificación decompuestos.
Una aplicación actualizada esla separación eidentificación deantocianinas,
tanto en uvas como en vinos tintos. A pesar de tener el vino tantos años de
historia, aún no se conoce qué ocurre con sus compuestos durante el
añejamiento. El color es uno de los atributos más importantes del vino y es
determinante en la evaluación sensorial. En las uvas tintas está dado por el
contenido de antocianinas y en las uvas blancas por los flavonoles. Existen
en las uvas tintas 14 antocianinas, de las cuales cinco se encuentran en ma-
yorproporción:malvidina, petunidina, cianidina,peonidinay delfidina (Reyes
Lasantocianinas sonpigmentos decolorrojo, azulyvioleta. En condiciones
acidas, el color rojo predomina; en presencia del ion bisulfito (HSO~3 )
reaccionan y se decoloran, esta reacción es reversible. El color de los vinos
tintos sedebeprincipalmente alasantocianinas libres(estoscompuestostienden
a polimerizarse casi de manera inmediata desde que son estrujadas), y a
pigmentos polímeros formados durante eltiempo deafiejamiento delvino,por
condensación de antocianinas con otros compuestos flavonoides y proba-
blemente aldehidos. El color de losvinostintos depende del pH, el contenido
de SO2? de los pigmentos poliméricos y lostaninos.
El uso de equipos como elHPLC permite la separación de las antocianinas
envinos tintos y éstas aparecen como picos discretos.
El alumno utilizará el cromatógrafo delíquidos de altaresolución para separar
ycuantificar unamuestradeantocianinas,utilizandoelmétododelpatrónextemo.
Columna Spherisorb ODS Clg 10mm
PapelfiltroWhatmanNo. 1
4 tubos de ensayo con tapa de rosca
Mortero conpistilo
Pipeta graduada de 10mi
Clorhidrato de malvidinamonoglucósido
HC1(concentrado)
Cuidequealpreparar lasmezclasacetonitrilo aguayacetonitrilo tolueno
se haga en la campana de extracción.
Separación y cuantifícación de una muestra de antocianinas
Recuerde queelacetonitrilo esvenenoso,flamableyquecausairritación
en lapiel. Se debe evitar respirar susvapores.
Maneje con cuidado el ácido fórmico yevite el contacto con lapiel,ya
1. Extracto apartir del hollejo de lauva: lavar yquitar elhollejoa 10uvas
tintas,colocando ésteenunmortero limpio.Adicionar 10midemetanol
ypresionar suavemente con elpistilo contra elhollejo para obtener una
disolución muy colorida. El extracto esprefiltrado conpapel Whatman
No. 1,antes defiltrarconmembranas Millipore de 0.45 |Ltm.El extracto
se guarda enuntubo de ensayo limpioy con tapón derosca. Seprotege
de la luzy debe utilizarse a la brevedad.
2. Lascondiciones de funcionamiento del cromatógrafo deben ser:
Columna Spherisorb 10ODS 10 |jm
Dimensiones 250x4.6mm
Presión máxima 3 500psi
Fasemóvil. Seutilizaun gradiente deelución condos disolventes:
Disolvente A, ácido fórmico al40%
DisolventeB,acetonitrilo
Gradiente inicial:25%solventeA
6 minutos después incremente el disolvente Ba 23 %.
8 minutos después incremente el disolvente B a 50%.
5 minutos después incremente el disolvente Ba 95 %.
Flujo 0.7ml/min
NOTA:verifique quetanto lasmuestras como los disolventes de la fase
móvil sefiltrenenmembranas Millipore de 0.45 |jm.
3. Prenda yacondicione el cromatógrafo, permitiendo que se estabilice el
flujo ylacolumna.
4. Se inyectan 2 (il del extracto colorido. Repítalo por triplicado.
5. Para elaborar la curva patrón con el clorhidrato de malvidin 3-
monoglucósido, sepreparan cuatro diferentes concentraciones 25,50,
100y 150mg/1en metanol con 1ml/1de HC1 concentrado. Se inyectan
en la columna por separado, losvolúmenes de inyección deben ser de
214,1.Ajuste la atenuación para que los picos no rebasen la escala del
elabore unacurvapatrón como ladelafigura1.6. Calcule el coeficiente
Conlaalturadelospicosdelextractodeuvaenelcromatogramainterpole
los datos en la curva patrón.
Con el valor verdadero (datoproporcionado por elprofesor) calcule la
precisión y exactitud ydiscuta susresultados.
1. ¿Qué influencia pueden tener los siguientes cambios sobre el croma-
tograma obtenido en esta práctica?
a) Utilizar una columna C-8 en lugar deunaC-18.
b) Disminuir elflujodelafasemóvil.
c) Hacerunaelución isocrática (enlugardeunapor gradiente) encondi-
cionesdedisminución delflujodelafase móvil.
2. ¿Qué puede suceder si,por descuido,no sefiltrael extracto de materia
colorante y seinyecta en el cromatógrafo?
Separación y cuantificación de una muestra de antocianinas
3. ¿Se puede confiar en un cromatograma que fue obtenido durante una
corrida que presentó fuertes variaciones en la presión de las bombas?
¿Qué puede ocasionar este comportamiento?
4. ¿Qué otros sistemas de detección son de uso frecuente en los croma-
tógrafos dealta resolución?
5. Mencione brevemente tres aplicaciones directas de la cromatografía
líquida de altaresolución, mencionando además tipo de columna, fase
móvil que sepodría utilizar yel detector adecuado.
Brewer, S. 1987.Solución deproblemas de química analítica.Ed. Limusa,
Dallas, C. y O. Laureano. 1994. "Effects of pH, Sulphur Dioxide, Alcohol
Content, Temperature and Storage Time on Colour Composition of a
YoungPortugueseRedTable Wine". J.Scl Food Agrie. 65:477-485.
León, R. 1982.Libro básicopara cromatografíade líquidos. LDC/Milton
Roy,USA.
Meites, L. (editor). 1963.HandbookofChemistry. Me Graw Hill, USA.
Operator'sManual. 1993. SpeetroMonitor 3200 Variable Wavelength De-
tector. Thermo Separation Products,USA.
Operator'sManual. 1993.ConstaMetric 3200 Fluid Metering Pump.Thermo
Separation Products,USA.
Pecsok, R. L.y L.D. Shields. 1987.Métodosmodernosde análisisquímico.
Ed.Limusa,México.
Reyes-Dorantes, A., M. L. Escamilla-Hurtado y J. R. Verde-Calvo. 1992.
Enología VolI. Elaboración devinosde mesa.Universidad Autónoma
Metropolitana Iztapalapa, México.
Watty, M. 1989. Químicaanalítica.Ed. Alhambra Mexicana, México.
I. VISIBLE ULTRAVIOLETA
Los usos analíticos de la espectrofotometría en lazona del visible ultravioleta
son muchos y muy variados. El objeto de este capítulo es hacer mención de
algunas de estas aplicaciones, y que el alumno ponga en práctica los co-
nocimientos adquiridos en lateoría sobre la ley deLambert yBeer.
Cuando un compuesto o ion capaz de absorber luz es colocado en una cel-
da en un espectrofotómetro, cierta cantidad de luz monocromática será
absorbida por dicho compuesto yelresto saldrá de laceldapara ir aincidir so-
bre el fototubo que la detectará. Este comportamiento es aprovechado para
conocer la concentración de los compuestos.
La transmitancia, T,deuna disolución se define como la fracción de la in-
tensidad odelafuerza delaluzincidente,Po,quesetransmite verdaderamente
a través de la disolución. En donde P es la intensidad de la luz que sale de la
T = — o T = 100
Po Po)
La absorbancia,A, de una disolución es la luz que absorbe, no la que se
transmite,y sedefine como:
A = - logT = log —
La ley de Beer (también conocida como la ley de Bouguer-Beer o deLam-
bert y Beer) establece que: a una longitud de onda dada, la absorbencia es
proporcional a la concentración de la especie absorbente en una disolución,
como loindica la siguiente ecuación.
A = zbc
En donde b es el recorrido del haz de luz en la celda, c es la concentración
(moles/1) y la constante de proporcionalidad es la absortividad molar, e. Su
valor numérico depende de las unidades que se usen para expresar by c. Sib
está dada encmy cenmolespor litro, sele denomina coeficiente de extinción
molar o absortividad molar yrecibe el símbolo de e. Sila concentración seda
en g/1,solamente sellama coeficiente deextinción oabsortividad ysu símbolo
es"a" (paraobtenermayorinformación sobreestaleysepuedenleerlostrabajos
de Hughes, 1952,Liebhafsky, 1953,yLykos, 1992).
Una gran cantidad de compuestos absorbentes siguen bastante bien la leyde
Beer en soluciones diluidas,pero enalgunas sustancias lasabsorbancias varían
enforma nolinealrespecto delaconcentración. Estecomportamiento seconoce
como "desviación de la ley de Beer". Paratrabajar estos sistemas se requiere
una curva de calibración, trazada con valores de muestras de concentración
conocida, de este modo se puede conocer el intervalo de concentraciones en
el cual larelación es lineal. Sedebe tomar en cuenta que las desviaciones con
respecto aestaleypuedentenercausasdiversas:pormuestrasmuyconcentradas
omuydiluidas,porvariación delequilibrio químico delasustanciaqueabsorbe
yporlimitacionesdelinstrumentoutilizado.
Para tener el mínimo de problemas con las desviaciones, se recomienda
trabajar en el intervalo de concentraciones de 10'2
M a 10'6
M. Si seutilizauna
técnica poco reconocida, hay que cuidar el equilibrio químico poniendo espe-
cial atención en la fuerza iónica y en el pH del sistema, ya que hay muchos
compuestos cromóforos oquelatos quepresentanequilibriosparciales,enestos
casos hay que agregar un exceso de ligando para desplazar el equilibrio hasta
la formación del complejo conmayor número de coordinación.
También existenproblemas causadospor losequipos,como lasradiaciones
reflejadas dentro del aparato que llegan aldetector, loscambios de sensibilidad
del detector ylasfluctuacionesen lacorriente eléctrica queprovocan cambios
enlaintensidaddelaradiaciónyporendemodificaciones enlalecturaregistrada.
Un dato muy importantees que las mediciones espectrofotométricas sólo
sonconfiables convalores intermedios deabsorbancia, aproximadamente entre
0.187 y 0.824; o en % de T,entre 15 y 65; si se requiere, se puede ampliar
esta escala hasta 80% de 7, pero entonces se aumenta el error fotométrico
(valores de absorbancia para un espectro de un solo haz,utilizando la gráfica
de Ringbom. Servicios Centrales deInstrumentación, 1983).
La celda es un depósito transparente especialmente diseñado para contener la
disolución deprueba oel disolvente dereferencia (blanco) durante losestudios
espectrofotométricos. Existen celdas ocubetas de diversostamaños y formas
apropiadas para losdiferentes tipos deespectros comerciales (figura 3.1).Las
celdas más comunes para medir espectros en laregión del visible-ultravioleta
están fabricadas con cuarzo ytienen un paso de luz de 1.0 cm. Las celdas de
vidrio óptico son apropiadas sólopara mediciones en laregión del visible,ya
que absorben laradiación ultravioleta.
Generalmente las celdas son cuadradas con dos lados esmerilados,pero las
hay cilindricas enforma detubo deensayo para serutilizadas enel Spectronic
20. También existen las celdas de flujo que permiten la circulación continua
deuna disolución através de lacubeta. Sonútiles paramedir laabsorbancia de
disoluciones quefluyendeuna columna cromatográfica. También existen las
celdastérmicas conrecirculación de agua oalgún líquido quefluyeenuna ca-
misa para mantener el contenido de la celda a latemperatura deseada.
Lascaracterísticas detransmisión delasceldas envarias longitudes deonda
sonfunción delosmaterialesdefabricación. Porejemplo,elvidriopyrextransmite
en el intervalo de los 320 a los 2 500 nm. La figura 3.2 muestra las zonas de
absorción de losmateriales más comúnmente empleados en la fabricación de
celdas. Sepuedenutilizar vidrios oplásticos especiales enlaregióndelvisible.
Celda cilindrica para
Microcelda típica con
Figura 3.1 Diferentes tipos de celdas para espectrofotometria.
200 250 300 350 400 nm
1. Spectrosil
2. Sílice fundido
3. Cuarzo fundido
4. Vitreosil grado IR
5. Vidrio óptico especial
Figura 3.2 Espectro de transmisión para materiales utilizados en la
fabricación de celdas.
Resulta conveniente contar con una marca en el lado donde incida la luz, de
manera que la celda pueda siempre ser orientada en la misma posición para
permitir la reproducibilidad de los resultados.
7. Control de longitud de onda
2. Control de ajuste de 0% de
transmitancia o de absorbancia
3. Control de cero y de encendido
4. Portaceldas
El Spectronic 20 (figura 3.3) se enciende girando el control del cero, de la
perilla izquierda, enel sentido de lasmanecillas delreloj. Elaparato secalienta
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