Source: https://www.jove.com/video/55016/el-mtodo-chip-exo-la-identificacin-de-las-interacciones-protena-adn?language=Spanish
Timestamp: 2018-06-24 04:55:47+00:00

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The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision | Protocol (Translated to Spanish)
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP),utilizando Drosophila Tejido…
Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitationcromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)…
CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificarcromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias…
inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) es una herramienta indispensable en el campo de la epigenética y la regulación de genes específicos que aísla las interacciones proteína-ADN. ChIP acoplado a la secuenciación de alto rendimiento de (ChIP-seq) se usa comúnmente para determinar la localización genómica de las proteínas que interactúan con la cromatina. Sin embargo, el chip-ss se ve obstaculizada por una resolución relativamente baja mapeo de varios cientos de pares de bases y alta señal de fondo. El método de chip-exo es una versión refinada de chip-ss que mejora sustancialmente cuando se produzca tanto la resolución y el ruido. La distinción clave de la metodología chip-exo es la incorporación de la digestión de exonucleasa lambda en el flujo de trabajo de preparación de la biblioteca a la huella efectiva la izquierda y derecha 5 fronteras 'de ADN del sitio de entrecruzamiento de proteínas de ADN. Las bibliotecas de chip-exo se someten a secuenciación de alto rendimiento. Los datos resultantes se puede aprovechar para proporcionar una visión única y ultra-alta resolución en la organización funcional of genoma. A continuación, se describe el método de chip-exo que hemos optimizado y simplificado para los sistemas de mamíferos y de próxima generación de plataformas de secuenciación por síntesis.
inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) es un método potente para estudiar los mecanismos de la regulación de genes por enriquecer selectivamente para fragmentos de ADN que interactúan con una proteína dada en las células vivas. Los métodos de detección de fragmentos de ADN chip enriquecida han evolucionado a medida que la tecnología mejora, desde la detección de un solo locus (estándar chip-qPCR) para la hibridación de microarrays de ADN (chip-chip) a secuenciación de alto rendimiento (chip-ss) 1. Aunque el chip-ss ha visto amplia aplicación, la heterogeneidad de la cromatina y las interacciones no específicas de ADN han obstaculizado calidad de los datos que conduce a falsos positivos y la cartografía imprecisa. Para sortear estas limitaciones, el Dr. Frank Pugh desarrolló el método de chip-exo 2. La característica sobresaliente de chip-exo es que incorpora un 5 'a 3' exonucleasa, footprinting efectivamente factor de transcripción sitios de unión. Como resultado, la metodología chip-exo logra una resolución más alta, mayor rango dinámico de detection, y un menor ruido de fondo.
Aunque el chip-exo es técnicamente más difícil de dominar que el chip-ss, que está siendo ampliamente adoptado como estudios apuntan a obtener una visión única de ultra alta resolución utilizando diversos sistemas biológicos 3-8. De hecho, el chip-exo se ha aplicado con éxito a bacterias, levaduras, ratón, rata, y los sistemas de células humanas. Como prueba de principio, chip-exo fue originalmente utilizado para identificar el motivo de unión precisa para un puñado de la transcripción de levadura Factores 2. La técnica también se utilizó en la levadura para estudiar la organización del complejo de pre-iniciación de la transcripción, y para descifrar estructura subnucleosomal de diversas histonas 9,10. Más recientemente, hemos aprovechado chip-exo para resolver TFIIB adyacente y Pol II promotores de eventos en humanos vinculante, y demostramos que surge de la transcripción divergente generalizada de los distintos complejos de iniciación 11.
El flujo de trabajo que aquí se presenta se optimiza y streamlined de mamíferos chip-exo (Figura 1). En primer lugar, las células vivas de cultivo primario o de tejidos se tratan con formaldehído para preservar en las interacciones proteína-ADN in vivo a través de una reticulación covalente. Las células se lisan y la cromatina esquiladas a ~ 100 - 500 pares de bases de tamaño de los fragmentos. ChIP entonces enriquece selectivamente fragmentos de ADN para reticular para la proteína de interés. En este punto, las bibliotecas ChIP-seq son típicamente preparados, lo que limita inherentemente la resolución de detección para el tamaño medio de fragmento de unos pocos cientos de pares de bases. Sin embargo, el chip-exo supera esta limitación por el recorte de la derecha 5 fronteras 'de ADN del sitio de entrecruzamiento de proteínas de ADN con exonucleasa lambda e izquierdo. bibliotecas de secuenciación entonces se construyen a partir de ADN digerido exonucleasa como se detalla a continuación. Los anidados 5 'fronteras resultantes representan una huella in vivo de la interacción proteína-ADN (Figura 1, paso 14), y se detectan mediante secuenciación de alto rendimiento. altHough la metodología chip-exo es más complicado que el chip-ss, las transiciones entre la mayoría de los pasos requiere el lavado del grano simple, lo que minimiza la pérdida de muestra y la variabilidad experimental. Es importante destacar que, desde el chip-exo es una versión refinada de chip-ss, cualquier muestra que tiene éxito con chip-ss también debe tener éxito con chip-exo.
La huella in vivo de las interacciones proteína-ADN con resultados chip-exo en una estructura de datos fundamentalmente distinto del chip-ss. A pesar de que las personas que llaman comunes chip-ss pueden aplicarse a los datos de chip-exo, para obtener las llamadas pico más precisas se recomienda la bioinformática herramientas diseñadas específicamente con la estructura única de datos chip-exo en mente. Estos incluyen Genex, GEM, MACE, Peakzilla, y ExoProfiler 12-15.
Nota: Doble H2O destilada o equivalente grado molecular se recomienda para todos los tampones y las reacciones mezclas.
Día 0: Preparación del material y de las Pilas de cosecha
1. tampón de preparación de
Preparar lisis Buffers 1 - 3 (Tablas 1 - 3) y añadir 100 l de inhibidor de proteasa completo de la (CPI) a 50 ml de cada tampón justo antes del uso. Preparar IPC de stock de disolución de un comprimido en 1 ml de grado molecular H2O
Preparar chip Tampones (Tablas 4 - 7). Añadir 100 ml IPC acciones a 50 ml de Bloqueo y tampones RIPA. No agregue IPC de Tris y tampones de elución chip.
2. El recocido de oligonucleótidos adaptadores
Nota: Las secuencias de oligonucleótidos específicos pueden ser encontrados en la Sección de Información adicional.
Preparar mezclas de recocido adaptador (Tablas 8 - 9). Vortex para mezclar y brevementegirar los tubos para recoger contenidos. Alícuota de 100 l de cada mezcla en tubos de 0,5 ml.
Hibridar los oligonucleótidos mediante la ejecución del programa (Tabla 10) en el termociclador.
Tienda recocido oligonucleótidos a -80 ° C.
3. In Vivo de la cromatina de reticulación con formaldehído
NOTA: Para un experimento típico chip, material de partida debe contener aproximadamente 50 millones de células.
Añadir una solución de formaldehído de stock libre de metanol-37% fresco a salina tamponada con fosfato (PBS), se lavó el cultivo de células a una concentración final de 1% (v / v) y mezclar bien, y dejar reposar a temperatura ambiente durante 10 min.
NOTA: Por ejemplo, se suelen añadir 1,4 ml de 37% de formaldehído libre de metanol a las células en 50 ml de PBS temperatura ambiente. También, evitar el formaldehído entrecruzamiento en los medios de comunicación ya que las proteínas en los medios de comunicación apagarán algunos de formaldehído.
Se detiene la reacción de reticulación mediante la adición de 2,5 M glicinae para una concentración final de 125 mM. Mezclar bien.
Transferir las células a un tubo de 50 ml en hielo. Girar las células durante 5 minutos a 1000 xga 4 ° C. Decantar el sobrenadante.
Añadir 1 ml de hielo-frío 1x PBS para sedimento celular y resuspender con la pipeta. Traslado al tubo de 1,5 ml.
Girar las células durante 3 minutos a 2000 xga 4 ° C. Aspirar el sobrenadante.
Inmediatamente parpadear congelar sedimentos de células en tubos de 1,5 ml con nitrógeno líquido. Almacenar a -80 ° C. células reticuladas son estables indefinidamente a -80 ° C.
Día 1: lisis celular, sonicación, y el chip
4. Lisis Celular
NOTA: Durante todas las secciones de lisis celular, las muestras deberán ser mantenidos en hielo oa 4 ° C para minimizar la reversión de reticulación.
Brevemente descongelar sedimento celular reticulado. Minuciosamente resuspender cada pellet en 0,5 ml de tampón de lisis 1 y se combinan con 4,5 ml de tampón de lisis 1 en un tubo de poliestireno de 15 ml.
tubos de rock durante 10 minutos a 4 ° Cpara en una plataforma oscilante. Centrifugado durante 4 minutos a 2.000 xg a 4 ° C. Decantar el sobrenadante.
Minuciosamente resuspender cada pellet en 0,5 ml de tampón de lisis 2 y añadir 4,5 ml de tampón de lisis 2 una vez se volvieron a suspender.
Roca durante 5 min a 4 ° C en una plataforma oscilante. Centrifugado durante 5 minutos a 2000 xga 4 ° C. Se decanta el sobrenadante y golpear suavemente el exceso sobre una toalla de papel.
Minuciosamente resuspender cada pellet en 0,5 ml de tampón de lisis 3 y se añade 1 ml de tampón de lisis 3 una vez se volvieron a suspender. Mantenga lisados ​​nucleares en hielo e inmediatamente proceder a sonicación.
5. La sonicación de lisados ​​Nuclear
NOTA: Durante todas las secciones de sonicación, las muestras deberán ser mantenidos en hielo para minimizar la reversión de reticulación. El modelo específico de aparato de ultrasonidos usado en asociación con el protocolo a continuación se puede encontrar en la Tabla de Materiales. Los detalles sobre el uso de ultrasonidos específica y directrices para otros instrumentos se pueden encontrar en la Sección de Información adicional.
pladaptadores de resonancia de la ECA en 15 ml tubos de poliestireno que contienen extractos nucleares (la barra metálica no debe tocar la pared del tubo).
Los lisados ​​nucleares se somete a ultrasonidos en un baño de agua fría de hielo durante 2 x 15 min con sesiones de 30 s ON / OFF 30 seg a media potencia. sonicar Sólo dos tubos de 15 ml a la vez. Estos ajustes funcionan en una amplia gama de líneas de células y tipos celulares primaria, pero una mayor optimización pueden ser necesarios si cizallamiento cromatina es incompleta.
Para comprobar los resultados de sonicación, la transferencia de 2 x 10 l de lisado muestras en tubos de 1,5 ml.
Para invertir las reticulaciones, se combinan la primera parte alícuota de 10 l con 10 l TE-RNasa A y 0,2 l de proteinasa K. Incubar a 37 ° C durante 30 min. Añadir 4 tinte de ADN xileno l 6x.
Para preservar entrecruzamientos, combine la segunda alícuota de 10 l con 2 l de tinte de ADN xileno 6x.
Ejecutar ambas muestras en un gel de agarosa al 1,5% a 140 V durante aproximadamente 30 - 45 min hasta que el colorante de bromofenol en la escalera is ¾ del camino hacia abajo el gel.
Si sonicación era exitosas (la mayoría de los fragmentos de ADN cortados a 100 - 500 pb), la transferencia se sometió a ultrasonidos lisados ​​a tubos de 2 ml que contienen 150 ml de 10% de Triton X-100. Vórtice para mezclar.
Para sedimentar la cromatina insoluble y escombros, vuelta sonicó lisado nuclear durante 10 minutos a 20.000 xga 4 ° C.
Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml. Proceder de inmediato a muestras de astillas o almacenar a -80 ° C indefinidamente. extractos sometidos a ultrasonidos no se deben congelar y descongelar más de una vez.
6. Acoplamiento de anticuerpos a perlas
NOTA: Nunca vórtice o de congelación / descongelación perlas magnéticas ya que se romperá y aumentar la señal de fondo.
Después de mezclar a fondo de valores, alícuota Y l suspensión de perlas en 1,5 ml de tubo, donde Y = 1,1 x 2,5 l x (número de muestras de chip). capacidad de unión de 2,5 l suspensión de perlas es de hasta 13 mg de IgG. Se lavan los granos agrupados 3 veces con 1 ml de bloqueoBuffer.
Para alícuotas más coherente de los granos después de los lavados, volver a suspender las perlas en 10 veces el volumen original de suspensión (25 l / CHIP) con tampón de bloqueo. Alícuota de 25 l por muestra chip en tubos de 1,5 ml.
Añadir de 5 - 10 g de anticuerpo para alícuota de perlas de volver a suspender correspondiente. Llevar a un volumen final de hasta 250 l con tampón de bloqueo. Incubar las muestras durante 4 horas (alternativamente, durante la noche durante 16 horas) sobre una plataforma giratoria a 4 ° C.
Aspirar el sobrenadante. Para eliminar el anticuerpo no unido o en exceso, lavar perlas una vez con 1 ml de tampón de bloqueo.
Después de aspirar el último lavado, añadir inmediatamente 50 millones de células equivalentes de extractos sometidos a ultrasonidos (~ 1,6 ml) de anticuerpo: conjugados de talón. Si extractos sometidos a ultrasonidos no están listas, cuentas de volver a suspender en 100 l de tampón de bloqueo hasta que estén listos. Es muy importante no dejar nunca que los granos secos.
7. La inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
Para cada muestra de chip, se combinan 1,5 ml de sonicadod extractos con anticuerpos conjugados: talón de 1,5 ml o tubos de 2 ml.
Incubar los tubos en un rotador mini-tubo durante la noche (aproximadamente 16 horas) a una velocidad ajustada de 9 a 4 ° C. Compruebe después de unos pocos minutos para asegurar muestras no tengan fugas y se mezclan adecuadamente.
Día 2: Se lava y Chip on-resina reacciones enzimáticas
8. Los lavados de chip
NOTA: Para reducir al mínimo la contaminación cruzada, brevemente girar los tubos entre cada lavado. Por primera aspiración, cambiar las puntas entre cada muestra. Durante los lavados posteriores, la misma punta se puede utilizar siempre y cuando no tocó las perlas. Véase la Sección Información adicional para obtener instrucciones sobre el lavado de astillas apropiada.
Muy brevemente girar los tubos utilizando una microcentrífuga (~ 3 seg a 500 xg) para recoger el líquido en las tapas y colocar en la rejilla magnética durante 1 min. Mientras que todavía en la rejilla magnética, extracto de aspirado.
Añadir 0,75 ml tampón RIPA a cada tubo. Retire los tubos de rejilla magnéticae invierta varias veces para mezclar. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y se aspira el sobrenadante. Repetir 7x.
Añadir 0,75 ml 10 mM Tris HCl (pH 7,5) a cada tubo. Retire los tubos de rejilla magnética e invierta varias veces para mezclar. Vuelva a colocar los tubos en la rejilla magnética y se aspira el sobrenadante. Repetir 2x.
Después de aspirar el último lavado, proceder al pulido.
Nota: después de cada reacción de incubación en las secciones 9.3, 10.3, 11.3, 12.3, 13.3, 14.3, y 15.3, los tubos de centrifugado brevemente y lugar contra gradilla magnética durante 1 min y el sobrenadante aspirado. Lavar 2 veces con 0,75 ml tampón RIPA y 2 veces con 0,75 ml de Tris HCl (pH 7,5).
Reacción 9. Pulido
Rellene Pulido cálculos mezclas de reacción (Tabla 11). Hacer Pulido mezcla en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
Inmediatamente después del último lavado chip se aspira, se añaden 50 l de mezcla de pulido a cada muestra de resina mientras que todavía en la rejilla magnética. Se incuban las muestras durante 30 minutos a 3 xga 30 ° C en un Thermomixer.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, proceder a A-tizón.
Reacción 10. A-tizón
Rellene cálculos mezclas de reacción A-tizón (Tabla 12). Hacer un tizón-mezcla en un tubo de 1,5 ml en hielo. Pipeta para mezclar.
Inmediatamente después de la sección de pulido, se añaden 50 l de A-tizón mezcla de resina a cada muestra, mientras que todavía en la rejilla magnética. Incubar las muestras durante 30 minutos a 3 xg a 37ºC en un termomezclador.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, continúe con P7 adaptador ligadura.
Reacción 11. P7 adaptador de ligadura
Rellene cálculos de mezcla maestra ligadura (Tabla 13). Haga la ligadura de mezcla en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
Inmediatamente después de la sección A-tizón, añadir 48 l P7 ligadura mezcla maestra y 2 l de un adaptador diferente Índice to cada resina muestra, mientras que todavía en la rejilla magnética. Incubar las muestras durante 2 horas a 3 xga 25 ° C en un Thermomixer.
Nota: El uso de diferentes índices para cada muestra permitirá más muestras para ser secuenciados en una sola celda de flujo.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, proceder a Φ-29 Nick reparación.
12. Phi-29 Nick reacción de reparación
Rellene Φ-29 cálculos mezclas de reacción (Tabla 14). Hacer Φ-29 mezcla en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
P7 sección de ligadura Inmediatamente después, se añaden 50 l de Φ-29 a cada mezcla de resina de la muestra, mientras que todavía en la rejilla magnética. Incubar las muestras durante 20 minutos a 3 xga 30 ° C en un Thermomixer.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, proceder a Reacción de la quinasa.
Reacción 13. quinasa
Rellene quinasa cálculos de mezcla maestra (
Inmediatamente después de la sección Φ-29, se añaden 50 l de quinasa se mezclan para cada muestra de resina mientras que todavía en la rejilla magnética. Incubar las muestras durante 20 minutos a 3 xg a 37ºC en un termomezclador.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, proceder a la reacción Lambda exonucleasa.
Reacción 14. Lambda exonucleasa
Rellene cálculos de mezcla maestra Lambda exonucleasa (Tabla 16). Haz Lambda exonucleasa mezclar en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
Inmediatamente después de la sección de quinasa, añadir 50 l de Lambda exonucleasa se mezclan para cada muestra de resina mientras que todavía en la rejilla magnética. Incubar las muestras durante 30 minutos a 3 xg a 37ºC en un termomezclador.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, proceder a la reacción f RecJ.
15. f RecJLa reacción de la nucleasa
Rellene cálculos de mezcla RecJ f maestro (Tabla 17). Hacer RecJ mezcla f en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
Inmediatamente después de la sección Lambda exonucleasa, se añaden 50 l de mezcla RecJ f para cada muestra de resina mientras que todavía en la rejilla magnética. Incubar las muestras durante 30 minutos a 3 xg a 37ºC en un termomezclador.
Después de aspirar el último lavado como se describe en la nota después de la sección 8.4, continúe con el chip de elución.
16. La elución y Reversión Crosslink
Preparar la mezcla maestra: número de muestras x 1.1 x (200 l tampón de elución chip + 1 l de 20 mg / ml de proteinasa K) en 1,5 ml tubo. Añadir 200 l ChIP Elution Buffer + proteinasa K mezcla maestra a cada resina de la muestra.
Incubar las muestras durante la noche (aproximadamente 16 horas) a 3 x g a 65ºC en un Thermomixer con una tapa térmica para evitar la condensación.
Día 3: Extracto de ADNion y el adaptador de ligadura
17. La elución y Reversión Crosslink (continuación)
Después de la incubación durante la noche a 65 ° C, se centrifuga brevemente para recoger muestras de condensado. Colocar las muestras en la rejilla magnética durante 1 min.
Transferencia de 200 l sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml que contiene 200 l tampón TE (pH 7,5).
18. El fenol cloroformo alcohol isoamílico (PCIAA) Extracción
Añadir 400 l de fenol cloroformo alcohol isoamílico a cada muestra. Vortex para mezclar durante 20 s.
Centrifugar durante 10 min a 20.000 xg a temperatura ambiente (RT). transferir cuidadosamente 325 l de la capa acuosa superior a un tubo nuevo.
Nota: Tenga cuidado de no transferir cualquiera de la (capa inferior) orgánica en el nuevo tubo.
Añadir 1/10 volumen de 3 M NaOAc (pH 5,5) y 1 l 20 mg / ml de glucógeno a cada muestra. Para múltiples muestras, preparar una mezcla maestra.
Añadir 3 volúmenes de hielo frío de etanol 100% a cada muestra. Vórticepara mezclar. Incubar durante 15 minutos a -80 ° C.
Centrifugar durante 15 min a 20.000 xg a 4 ° C. decantar cuidadosamente el sobrenadante, asegurándose de no perturbar el sedimento.
añadir 500 l suavemente recién hechos de hielo frío al 70% de etanol, asegurándose de no perturbar el sedimento. Centrifugar durante 5 min a 20.000 xg a 4 ° C. Con cuidado, decantar el sobrenadante.
pellet seco durante aproximadamente 20 min (o hasta que esté seco) en el vacío velocidad a 45 ° C.
NOTA: Este es un punto de pausa en el protocolo. sedimentos de ADN seco se pueden almacenar a -20 ° C.
Volver a suspender las bolitas en 10 l ddH2O pipeta varias veces sobre el área donde el granulado de ADN, a pesar de que el precipitado seco no puede ser visto.
Transferir 10 l de cada muestra a un nuevo tubo de 0,3 ml PCR u 8-bastidor, dependiendo del número de muestras.
Reacción 19. P7 Primer Extension
Rellene P7 cebador de extensión cálculos mezclas de reacción (Tabla 18). Hacer una mezcla de extensión en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
Añadir 10 l de mezcla de Extensión (menos Φ-29 de la polimerasa) a cada muestra de 10 microlitros. Pipeta para mezclar.
Las muestras se ejecutan en el termociclador utilizando el programa (Tabla 19) para el cebador hibrida al molde hasta que el 30 C "tienen" un paso.
Añadir 1 l Φ-29 de la polimerasa durante la 30 ° C "mantener" paso en el programa. Pipeta para mezclar. Reanudar el resto del programa (tabla 19).
Reacción 20. A-tizón
Rellene cálculos mezclas de reacción A-tizón (Tabla 20). Hacer un tizón-mezcla en un tubo de 1,5 ml en hielo. Pipeta para mezclar.
Añadir 10 l de A-tizón mezcla a cada muestra. Pipeta para mezclar.
En el termociclador, se incuban las muestras durante 30 minutos a 37 ° C, y luego con calor inactiva durante 20 minutos a 75 ° C.
Reacción 21. P5 adaptador de ligadura
Fill cabo P5 adaptador de ligadura cálculos mezclas de reacción (Tabla 21). Haga la ligadura de mezcla en 1,5 ml tubo en hielo. Pipeta para mezclar.
Añadir 20 l de P5 La ligación se mezclan para cada muestra. Pipeta para mezclar.
En el termociclador, se incuban las muestras durante 2 horas a 25 ° C.
22. grano de limpieza
Nota: Por favor, véase la sección de Materiales para la información del fabricante sobre el cordón de limpiar.
Transferir cada muestra de 50 l a un nuevo tubo de 1,5 ml.
Volver a suspender limpiar las cuentas de un rotador mini-tubo a una velocidad ajustada de 15 a 15 minutos a temperatura ambiente. No deje que los granos se depositan antes de pipetear.
Añadir 60 l limpiar los granos de la muestra (1,2: 1 limpiar perlas para probar relación es crítica para eliminar el ADN que es más corta que 200 pares de bases). Pipetear para mezclar durante 20 s.
Volver a suspender limpiar las cuentas de un rotador mini-tubo a una velocidad ajustada de 15 durante 3 minutos a temperatura ambiente. Brevemente girar tubos.
Colocar los tubos en la rejilla magnética para 1 min.Pipetear y desechar el sobrenadante.
NOTA: No utilice la aspiración al vacío en esta sección porque va a absorber las perlas de limpieza.
Añadir 400 l de recién hecho RT etanol al 70% a cada muestra mientras se encuentran en la rejilla magnética. No mezclar. Aspirar el sobrenadante. Repetir 2x.
Se secan las perlas de limpieza durante 10 minutos a RT. El color de las perlas se volverá oscuro a marrón y grietas muy pequeñas de luz serán visibles en el gránulo de resina cuando los granos están secos.
Para eluir el ADN, añadir 40 l de 10 mM Tris (pH 7,5). A fondo pipeta para mezclar durante 20 seg.
Colocar las muestras en la rejilla magnética durante 1 min. Lentamente pipetear y transferir 36 l eluato directamente a 0,3 ml tubos de PCR.
Proceder directamente a la reacción de PCR o almacenar eluidos a -20 ° C.
Día 4: Análisis de PCR y Gel
Rellene cálculos PCR Master Mix (Tabla 22). Hacer mezcla de PCR. Pipetear muy suavemente para mezclar para evitarburbujas.
Añadir 14 l de mezcla de PCR a cada 36 l de la muestra de ADN. Pipeta para mezclar. Mantener las muestras en hielo hasta que esté listo para poner en termociclador.
Para el control positivo de PCR, incluir una biblioteca previamente preparada. Para el control negativo de PCR, incluir agua. Las muestras se ejecutan en el termociclador de PCR utilizando el programa (Tabla 23).
24. Preparación del gel, escisión del ADN, y Visualización
Limpiar a fondo y enjuague una caja de gel de tamaño apropiado con agua desionizada. Preparar un gel de agarosa al 1,5% (que contiene 0,5 mg / ml de bromuro de etidio) con espesor de peine, de todo el bien que puede contener de 60 l.
NOTA: El bromuro de etidio (EtBr) es un carcinógeno y debe manejarse con cuidado.
Centrifugar los tubos de muestra de PCR brevemente para recoger la condensación.
Añadir 1/5 volumen de 6x colorante de ADN xileno para muestra combinada. No utilice azul de bromofenol en tinte de ADN, ya que migra en la misma ubicación que el ADN de la muestra.
Cargar toda la muestra intO cada pocillo, preferiblemente con pozos vacíos entre las muestras.
Nota: Las bibliotecas con los mismos índices no se deben ejecutar en el mismo gel.
Cargar 7 l 100 pb escalera a ambos lados de las muestras. gel de funcionar a 140 V durante aproximadamente 30-45 minutos hasta tinte bromofenol en escalera es ¾ camino hacia abajo el gel.
Imagen y visualizar en gel en un transiluminador UV en un ajuste bajo. Escindir las secciones de agarosa que contiene fragmentos de ADN 200 - 500 pb. Tenga mucho cuidado para evitar cortar la banda adaptador de dímero que funciona a 125 pb.
Coloque cada porción de gel escindido en un tubo de 15 ml. peso neto registro de cada porción de gel. Escribe este peso directamente sobre el tubo.
Imagen, guardar y anotar en gel escindido confirmar rango de tamaño correcto seleccionado.
25. Gel Purificación
Se purifica ADN de rebanada de gel escindida de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con las siguientes modificaciones.
Disolver la capa de gel, meciendoa RT sobre la plataforma oscilante. Se tomará aproximadamente 20 minutos para disolver.
Para obtener ADN altamente purificado, columnas de lavado con 0,5 ml de tampón QG gel después de disuelto ha pasado a través de la columna.
Después de tampón de lavado PE, permiten columnas se sientan a TA durante 2 - 5 min. Girar durante 1 min a 13.000 xg a temperatura ambiente.
Para permitir espacio para la reacción de PCR Master Mix, las muestras se eluye con 40 l de tampón EB en un nuevo tubo de 1,5 ml.
26. Cuantificación de ADN
Preparar muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 24). medir las muestras en un instrumento especificado con tubos ópticos.
Una vez que las bibliotecas chip-exo se cuantifican, someter a secuenciación en una plataforma que utiliza la secuenciación por síntesis química 16 que es compatible con los adaptadores de ADN en este protocolo.
NOTA: Por lo general, 2 l de muestra es suficiente para la cuantificación, pero más puede ser necesario si la concentración de la muestra es inferior. ADN rendimientos típicosgama Ly entre 50 y 200 ng.
Después de la cuantificación, las muestras almacenadas a -20 ° C.
Las siguientes figuras ilustran los resultados representativos del chip de protocolo-exo que aquí se presenta. En contraste con las metodologías tradicionales de chip-ss con pocos pasos enzimáticos, chip-exo requiere once reacciones enzimáticas secuencialmente dependientes (Figura 1). Por lo tanto, se debe tener cuidado en cada paso para asegurarse de que cada componente de reacción se agrega a su respectiva mezcla maestra de reacción. Recomendamos la generación de una hoja de cálculo de fórmulas basadas en las Tablas de reacción para realizar automáticamente los cálculos de mezcla maestra de reacción, la impresión de las tablas resultantes, y después de comprobar cada artículo después de que se añade a la mezcla maestra.
Empleamos una serie de medidas de control de calidad durante todo el protocolo para garantizar resultados de la secuenciación de alta calidad (Figura 2). Cada reacción de chip contiene tres componentes básicos: 1) se sometió a ultrasonidos extracto de la cromatina de las células de interest, 2) un anticuerpo dirigido contra la proteína de interés, y 3) proteína G (o Proteína A) de resina para inmovilizar los complejos inmunes precipitados. La obtención de extractos de calidad sonicado altos de la cromatina (Figura 2A) puede ser bastante difícil ya que las condiciones de sonicación deben ser optimizados para cada tipo celular y el instrumento de ultrasonidos. Cabe tiempo para optimizar el gasto de este paso porque las bibliotecas más alta calidad comienzan con un resultado de sonicación que produce fragmentos de ADN entre 100 - 500 pb (Figura 2A, "+" carril). Desde entrecruzamientos de formaldehído son lábiles y formaldehído en sí tiene una vida útil limitada, utilizamos un ensayo de cambio de movilidad electroforética (Figura 2A, "-" carril) para verificar que los extractos sometidos a ultrasonidos contienen enlaces cruzados de proteínas de ADN intactas, evidente como super-cambio de los fragmentos de ADN. Para evaluar la señal de fondo que habitualmente realizamos un chip "simulacro" que omite anticuerpo a partir de la reacción de chip. Una alta calidad de chip-exo la preparación de la biblioteca tendrá muy poco, en su caso, la señal de fondo en el chip "mock" ( "-") en relación con el anticuerpo ChIP específico, en este caso dirigida contra Pol II. Como se ve en la figura 2B, las bibliotecas tradicionales chip-ss tienen sustancialmente más señal de fondo de chip-exo. Por último, antes de calidad biblioteca de secuenciación, chip-exo se evalúa en el Bioanalyzer (Figura 2 C - D). El análisis mide con precisión la distribución del tamaño de la biblioteca y detecta contaminantes dímeros adaptadores (denotado por la flecha) que se ejecutan en 125 pb. Si dímeros adaptadores están presentes, se reducirá el ancho de banda de secuenciación. Por lo tanto, se recomienda una limpieza del grano adicional que nos permite eliminar de manera eficiente fragmentos de ADN de menos de 200 pb.
Chip-exo es una poderosa técnica de genómica funcional, ya que es el único método capaz de resolver espacialmente divergentes, iniciando, se detuvo, y el alargamiento de la ARN polimerasa II ona genoma de gran escala (Figura 3) 11. Dado que estos eventos de unión adyacentes son decenas de pares de bases de diferencia, ChIP-seq es incapaz de distinguir estos eventos de unión con el poder de resolución de varios cientos de pares de bases.
Figura 1: Esquema chip-exo. Después de chip, el adaptador P7 se liga a las fronteras de sonicación. Lambda exonucleasa luego recorta DNA 5 'a 3' hasta el punto de reticulación, footprinting de ese modo la interacción proteína-ADN. Después de la elución y de reticulación reversión, la extensión del cebador se sintetiza ADN dúplex. Por último, la ligadura del adaptador P5 marca las fronteras exonucleasa izquierda y derecha y la biblioteca resultante se somete a secuenciación de alto rendimiento. Mapeo de los extremos 5 'de las etiquetas de secuencia con el genoma de referencia demarca la barrera exonucleasa y por lo tanto el sitio exacto de la proteína-DNAreticulación. Figura modificado a partir de Rhee y Pugh 17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Controles de Calidad chip-exo. Paneles AC muestran los resultados representativos de los experimentos no relacionados. (A) La calidad del extracto de la cromatina sonicado (de la línea celular de cáncer de mama humano HCC1806) se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa en extractos con (+) y sin (-) las reticulaciones invertido. entrecruzamientos intactas causarán proteínas de ADN para migrar más lento. Por lo tanto, el extracto de correr sin entrecruzamientos invertida (-) permite la calidad de los enlaces cruzados de formaldehído para ser evaluados, que son fundamentales para un chip éxito. (B) Comparación de un IP mock (-) unand Pol II (+) chip-exo y los preparativos de la biblioteca de chip-ss después de 21 ciclos de amplificación por PCR. Después de PCR, fragmentos de ADN de 200-500 pb se escinden (denotados por caja hash rojo) y se purificaron usando un kit de extracción de gel. (CD) En el panel C, el trazo superior representa una traza ideales de una biblioteca agrupada (P1), y la traza inferior muestra una biblioteca agrupada (P2) que contiene dímeros de adaptador. El panel D muestra el diagrama de densidad de ADN correspondiente a los restos de la biblioteca P1-2 desde el panel C (flecha se indica la banda de dímero adaptador). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: chip-exo Resuelve espaciales distintivos bidireccional transcripción Iniciación Complejos. (A) la distribución suavizada de hebra separated chip-exo etiqueta extremos 5 'de Pol II, TFIIB, y TBP en el gen humano RPS12 en la proliferación de las células K562. (B) con un promedio patrones chip-exo todo el RefSeq más cercano TSS. etiquetas pico de par fueron alineados con el gen-por-gen TSS, agrupada en intervalos de 10 pb en relación con la TSS, y luego el valor de pico media de par densidad que no se solapan en todas ocupada por TFIIB (n = 6.511) genes se representan como un porcentaje del total. Los "picos" de PDD y TFIIB son indiscernibles (vertical desplazado en el recuadro). (C) Modelo basado en datos de panel B, que ilustra distintos complejos de iniciación de transcripción se resolvieron mediante chip-exo (trazo negro). Pol II ocupaba dos ubicaciones separadas resolubles que coincidieron con los sitios de iniciación de la transcripción divergente ( "Divergente") y los sitios de "pausa". Esta separación espacial clara de complejos de pol II indica que surgen transcripciones divergentes de complejos de iniciación distintos. La gran mayoría Pol II abo reticulado ut 50 pb aguas abajo de la SAT en el sitio de "pausa", donde se espera para hacer una pausa después de iniciar la transcripción. Pol II se agota más 20 - 60 pb aguas arriba de la SAT en el que las formas previo a la iniciación complejo ( "PIC"), lo que indica que, en promedio, es probable que pase menos tiempo allí que en los sitios en pausa. Esto sugiere que en la mayoría (pero no necesariamente todos) de los casos, una vez que Pol II es reclutado, se aclara rápidamente el promotor y asume un estado de pausa de aproximadamente 30 - 50 pb aguas abajo de la SAT, en consonancia con la observación de que la liberación de Pol II pausa es un paso limitante de la velocidad en la transcripción. Estos complejos de iniciación adyacentes son irresolubles por chip-ss (ilustrado por traza relleno gris), ya que su resolución se limita a unos pocos cientos de pares de bases. Figura modificado a partir de Pugh y Venters 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
ontenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Archivo Suplementario 1:. Información adicional Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Reactivo Volumen (ml) [Final]
100% de glicerol 100 10%
ddH2O Llene hasta 1 L
Tabla 1. Receta para el tampón de lisis 1. Filtro usando 0,22 micras filtro. Almacenar en tubos de 50 ml a 4 ° C. Añadir 100 l CPI de stock a 50 ml de tampón justo antes del uso.
ddH2 O Llene hasta 1 L
Tabla 2. Receta para el tampón de lisis 2. Filtrar el uso de 0,22 micras filtro. Almacenar en tubos de 50 ml a 4 ° C. Añadir 100 l CPI de stock a 50 ml de tampón justo antes del uso.
10% desoxicolato 10 0,10%
Tabla 3. Receta para el tampón de lisis 3. Filtro usando 0,22 micras filtro. Almacenar en tubos de 50 ml a 4 ° C. Añadir 100 l CPI de stock a 50 ml de tampón justo antes del uso.
Albúmina de suero bovino 2,5 g 0,50%
ddH2O Llene hasta 500
Tabla 4. Receta para el bloqueo Buffer. Filtrar sobre 0,22 micras filtro. Almacenar en tubos de 50 ml a 4 ° C. Añadir 100 l CPI de stock a 50 ml de tampón justo antes del uso.
10% desoxicolato de sodio 35 0,70%
contenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-con-next.within-page =" always ">
Tabla 5. Receta para el tampón RIPA. Filtrar sobre 0,22 micras filtro. Almacenar en tubos de 50 ml a 4 ° C. Añadir 100 l CPI de stock a 50 ml de tampón justo antes del uso.
ddH2O Llene hasta 50
Tabla 6. Receta para el chip de tampón de elución. Filtrar sobre 0,22 micras filtro. Almacenar a temperatura ambiente.
Tabla 7. Receta de tampón TE. Filtrar sobre 0,22 micras filtro. Almacenar a 4 ° C.
Volumen (l) [Final]
100 M-IX ExA2 75 15 micras
100 M ExA2-33 75 15 micras
Volumen total 500
Tabla 8. mezcla P7 adaptador de recocido.
100 M ExA1-58 75 15 micras
100 M ExA1-13 75 15 micras
Tabla 9. mezcla P5 adaptador de recocido.
Temperatura (ºC) Hora
95 5 minutos
72 5 minutos
65-60 rampa disminución 5 minutos
55-50 rampa disminución 3 min
45-40 rampa disminución 3 min
4 Por sienpre
Tabla 10. Programa de recocido adaptador.
1x (l) [Final]
10x tampón de reacción 2 5 1x
100 mu M ATP 0,5 1 mM
dNTPs 3 mM 1.7 100 M
3 U / l T4 polimerasa 1 3 U
5 U / l de Klenow 1 5 U
10 U / l T4 polinucleótido quinasa 1 10 U
Volumen total de reacción 50
Tabla 11. Pulido mezcla maestra.
dATP 3 mM 1.7 100 M
exo menos 5 U / l de Klenow 3'-5 ' 1 5 U
Tabla 12. A-tizón mezcla maestra.
400 U / l T4 ADN LigPlaza bursátil norteamericana 1.5 600 U
Volumen de la mezcla de reacción 48
Adaptador Índice 15 mM 2 30 picomoles
Tabla 13. P7 adaptador ligadura de mezcla maestra.
dNTPs 3 mM 2.5 150 M
10 U / l Φ-29 de la polimerasa 1.5 15 U
Tabla 14. Φ-29 Nick mezcla maestra de reparación.
Tabla 15. quinasa mezcla maestra de reacción.
1x (y# 956; l) [Final]
Lambda 10x Buffer 5 1x
exonucleasa 5 U / l Lambda 2 10 U
Tabla 16. Lambda exonucleasa Reacción mezcla maestra.
30 U / l RecJ f exonucleasa 1 30 U
V reacción totalolumen 50
Tabla 17. RecJ f nucleasa mezcla maestra de reacción.
dNTP 3 mM 1.3 200 micras
20 M P7 cartilla 0.25 0,25 M
Volumen de la mezcla de reacción 10
EtOH prueba sedimentada 10
Volumen total de reacción 20
Tabla 18. P7Imprimación mezcla maestra de reacción de extensión.
sesenta y cinco 5 minutos
30 2 minutos
30 Mantenga hasta que se añade Φ-29
30 20 minutos
sesenta y cinco 10 minutos
Tabla 19. Programa P7 cebador de extensión.
dATP 3 mM 1 0.1 mM
5 U / l de Klenow 3 'a 5' menos exo 1 5 U
muestra de imprimación extendida 20
Volumen total de reacción 30
Tabla 20. A-tizón mezcla maestra.
10x T4 ligasa Buffer 5 1x
15 M ExA1-58 /13 adaptador 2 30 picomoles
400 U / l T4 ADN ligasa 1.5 600 U
Volumen de la mezcla de reacción 20
Una muestra de cola 30
Tabla 21. P5 adaptador ligadura de mezcla maestra.
5x PCR Buffer 10 1x (mM MgCl 2 2)
10 mM de cada dNTP 1 200 M cada uno
20 M P1.3 cartilla 1.25 0,5 M
20 M P2.1 cartilla 1.25 0,5 M
2 U / l Hot Start polimerasa 0,5 1 U
Volumen de la mezcla de reacción 14
Bead muestra eluida 36
Tabla 22. PCR.
Temperatura (ºC) Hora ciclos
98 30 segundos 1
98 10 sec 15-21 (dependiendo de la eficiencia CHIP)
52 30 segundos
<tr> 72 2 minutos 1
4 Por sienpre Sostener
Tabla 23. Programa de PCR.
Por estándar de ADN (l) Por muestra (l)
1: 200 diluida tampón / mezcla de tinte 190 198
patrones de ADN 10
Volumen total 200 200
Tabla 24. Cuantificación.
Se presenta un protocolo de genómica funcional para determinar la ubicación exacta de unión de la cromatina proteínas que interactúan de una manera imparcial, en todo el genoma a una resolución de pares de bases próximo. El paso más crítico para lograr la base cerca de una resolución de mapeo par es el tratamiento con exonucleasa de la ADN-chip enriquecido mientras que el inmunoprecipitado permanece en la resina magnética. Aparentemente, los complejos de proteínas potencialmente podrían bloquear la huella in vivo de cualquier subunidad dado (por ejemplo, complejos de remodelación de la cromatina o la partícula nucleosome de la base). Sin embargo, como se informó anteriormente 10, ya que el formaldehído es un reticulante ineficiente, se hace cada vez más improbable que múltiples subunidades de un complejo serían reticular al ADN y entre sí en la misma célula en el mismo locus. Por lo tanto, en la huella in vivo de las distintas subunidades de un complejo de proteínas, como las histonas subunidades individuales de un nucleosoma, es posible con chip-exo.
t "> Las ventajas más notables de chip-exo son su resolución de pares de bases de cerca y de bajo fondo. El ultra-alta resolución permite penetraciones estructurales y espaciales detallados que deben figurar en un genoma de gran escala que no están actualmente posible con cualquier otro método . Por otra parte, la limitación principal de chip-exo es que es una metodología de biología molecular técnicamente difícil de dominar. Además, las limitaciones generales de la etapa de chip también se aplican a los chip-exo (por ejemplo, la disponibilidad de anticuerpos comercial y especificidad , accesibilidad epítopo, y el número relativamente grande de células requeridas). escollos comunes incluyen extractos sometidos a ultrasonidos de baja calidad, utilizando un anticuerpo grado de no-chip, y no mantener las muestras en hielo tanto como sea posible. por lo tanto, las condiciones de sonicación deben ser cuidadosamente optimizadas y cada anticuerpo validado como se ha descrito previamente 18 para evitar los efectos perjudiciales de estos parámetros pueden tener sobre el resultado experimental.
Hastasecuenciación de profundidad para un factor de transcripción objetivo, que normalmente procuran por alrededor de 20 millones de alineado de forma única lecturas. Desde Pol II y modificaciones de las histonas se distribuyen de manera más amplia, nuestro objetivo de 30 a 50 millones lee. Es importante tener en cuenta que, dado que el chip-exo tiene sustancialmente menos el fondo de chip-ss, menos las lecturas se han requerido para alcanzar la profundidad de secuenciación similar.
La tecnología chip-exo está siendo ampliamente adoptado a pesar de sus desafíos técnicos, como las variaciones sólidos sobre el protocolo original continúan siendo publicados 17,19,20. En particular, una variación que puede resultar útil para difícil de proteínas de chip se denomina chip-nexo, que utiliza una sola etapa de ligación para aumentar la eficaz de la preparación de la biblioteca 20. En resumen, el chip-exo es una metodología cada vez más empleada y de gran alcance para el mapeo de ultra-alta resolución de la cromatina proteínas que interactúan en una escala global. Como la lista de hormiga disponibles comercialmente chip-gradoibodies sigue creciendo, las futuras aplicaciones de la metodología chip-exo estarán dirigidos a las redes reguladoras de genes desconocido de mapeo para entender la circuitería molecular de la célula en la ultra-alta resolución. Además, el chip-exo probablemente será más refinado y adaptado a la huella in vivo interacciones proteína-ARN con una resolución de pares de bases próximo.

References: resolución 
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